Summary
Vi præsenterer en protokol til at mærke og analysere pyramideformede neuroner, som er afgørende for at evaluere potentielle morfologiske ændringer i neuroner og dendritiske pigge, der kan ligge til grund for neurokemiske og adfærdsmæssige abnormiteter.
Abstract
Det er blevet rapporteret, at størrelsen og formen af dendritiske pigge er relateret til deres strukturelle plasticitet. For at identificere den morfologiske struktur af pyramideformede neuroner og dendritiske pigge, en ballistisk mærkning teknik kan udnyttes. I den nuværende protokol, pyramideformede neuroner er mærket med DilC18 (3) farvestof og analyseres ved hjælp af neuronal rekonstruktion software til at vurdere neuronal morfologi og dendritiske pigge. At undersøge neuronal struktur, dendritic forgrening analyse og Sholl analyse udføres, så forskerne til at drage slutninger om dendritic forgrening kompleksitet og neuronal arbor kompleksitet, henholdsvis. Evalueringen af dendritiske pigge udføres ved hjælp af en automatisk assisteret klassificering algoritme integreret i genopbygningen software, som klassificerer pigge i fire kategorier (dvs. tynd, champignon, stubby, filopodia). Desuden vælges der yderligere tre parametre (dvs. længde, hoveddiameter og volumen) for at vurdere ændringer i dendritisk rygsøjlemorfologi. For at validere potentialet i bred anvendelse af den ballistiske mærkningsteknik blev pyramideformede neuroner fra in vitro-cellekultur med succes mærket. Samlet set er den ballistiske mærkningsmetode unik og nyttig til visualisering af neuroner i forskellige hjerneregioner hos rotter, som i kombination med sofistikeret rekonstruktionssoftware giver forskerne mulighed for at belyse de mulige mekanismer, der ligger til grund for neurokognitiv dysfunktion.
Introduction
I 2000 beskrev Gan et al. en hurtig mærkningsteknik for individuelle neuroner og glia i nervesystemet, der kombinerede forskellige lipofile farvestoffer, hvilket gav mulighed for samtidig mærkning af mange hjerneceller med forskellige farver1,2. For nylig, en ballistisk mærkning teknik blev beskrevet af Seabold et al.3, der indførte fluorescerende farvestoffer (Dil) i neuroner af hjerneskiver. En alsidig farvning teknik, ballistiskmærkning er værdsat for sin evne til at blive udnyttet i flere dyrearter og på tværs af en bred vifte af aldre. Desuden kan det kombineres med immunfarvning for at identificere delpopulationer af hjerneceller3. Sammenlignet med traditionelle teknikker (f.eks Golgi-Cox sølv imprægnering, mikroinjektion)4, ballistiske mærkning giver mulighed for at mere klart skelne morfologiske egenskaber, herunder dendritiske pigge, en funktion, der er afgørende for at drage slutninger om neuronal kompleksitet og synaptisktilslutningsmuligheder 5.
Excitatoriske pyramideformede neuroner er karakteriseret ved en enkelt, stor apilogisk dendrite, flere kortere basal dendritter, og tusindvis af dendritiske pigge6. Pyramideformede neuroner findes i flere hjerneregioner relateret til højere orden kognitiv behandling, herunder den præfrontale cortex (PFC) og hippocampus. I PFC observeres pyramideformede neuroner i lag II/III og lag V, hvor hver udviser unik morfologi. Specifikt pyramideformede neuroner i lag II/III af PFC har en kortere apilogisk dendrite og mindre forgrening end pyramideformede neuroner i lag V6. Inden for hippocampus, pyramideformede neuroner er placeret i både CA1 og CA3 regioner, med hver viser forskellige morfologier. Specifikt, pyramideformede neuroner i CA1 regionen udviser en mere karakteristisk apitisk dendrite, med forgrening forekommer længere fra soma, i forhold til CA3 regionen6.
Dendritiske pigge på pyramideformede neuroner i både PFC og hippocampus er det primære sted for excitatoriske synapser7. Morfologiske egenskaber af dendritiske pigge, som er klassisk karakteriseret i tre primære kategorier (dvs. tynde, stubby, eller champignon8), har været relateret til størrelsen af excitatoriske synapse9. Tynde pigge, karakteriseret ved en lang, tynd hals, lille løgformet hoved, og mindre postsynaptiske tætheder, er mere ustabile og udvikle svagere forbindelser. Men svampe pigge, som har en større dendritisk rygsøjlen hoved, er anerkendt for at danne stærkere synaptiske forbindelser, en effekt som følge af deres større størrelse. I skarp kontrast, stubby pigge er blottet for en rygsøjle hals, udviser en omtrent lige hoved og hals volumen forhold8. Inden for hippocampus, forgrenede pigge kan også observeres, hvorved rygsøjlen har flere hoveder, der kommer ud af samme dendritiske rygsøjlen hals10. Derfor kan de morfologiske ændringer af dendritiske pigge afspejle funktionalitet og strukturel kapacitet. Desuden har undersøgelser vist, at størrelsen og formen af dendritiske pigge vedrører deres strukturelle plasticitet, hvilket fører til tanken om, at små pigge er involveret i læring og opmærksomhed, mens større, mere stabile pigge, er involveret i langsigtede processer, herunder hukommelse11. Desuden kan fordelingen af dendritiske pigge langs dendrite være forbundet med synaptisktilslutning5,12.
Således den nuværende metodiske papir har tre mål: 1) Præsenter vores protokol for ballistiskmærkning, som er blevet udnyttet med en succesrate (dvs. neuroner opfylder udvælgelseskriterier og passende til analyse) på 83,3%5,12,13 og på tværs af flere hjerne regioner (dvs. PFC, kerne accumbens, hippocampus); 2) Demonstrere generaliserbarheden af teknikken og dens anvendelse på neuroner dyrket in vitro; 3) Nærmere oplysninger om den metode, der anvendes i neuronal genopbygning software og de slutninger, der kan drages af sådanne data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprotokoller blev gennemgået og godkendt af Animal Care and Use Committee ved University of South Carolina (federal assurance number: D16-00028).
1. Fremstilling af DiI/Wolfram perle slange
- 100 mg polyvinylpyrrolidon (PVP) opløses med 10 ml ddH2O. Vortex pvp-opløsningen let.
- Fyld slangen med PVP-opløsningen (se Materialebordet) og lad den være i 20 min. Udvis derefter PVP-opløsningen gennem den anden ende af slangen med en 10 ml sprøjte.
- Kombiner 170 mg wolfram mikrocarrier perler med 250 μL af methylenchlorid. Vortex wolfram perle suspension grundigt.
- Kombiner 6 mg lipofile DilC18(3) farvestof med 300 μL af methylenchlorid. Vortex dilC18(3) farveopløsningen grundigt.
BEMÆRK: Udfør trin 1.3-1.4 i en røghætte. - Pipette 250 μL af wolfram perle suspension på et glas dias. Vent på, at affjedringen lufttørres (~3 min. ).
- Der tilsættes 300 μL dilC18(3) farveopløsning på toppen af wolframperleophængslaget. Bland DiIC18(3) farveopløsning og wolfram perle suspension grundigt med en pipette spids og lad blandingen lufttørre (~ 3 min).
- Når det er tørret, skal du bruge et barberblad til at opdele blandingen i to 1,5 ml centrifugerør. Fyld rørene med vand.
- Sonikere i et vandbad (Amp I, 100%) indtil homogen (~5 min. ). Sørg for, at spidsen af sonikeren ligger direkte på rørene med perlesuspensionen.
- Kombiner de to 1,5 ml homogeniseret blanding i et konisk 15 ml rør. Sonikere blandingen i yderligere 3 min.
- Tegn wolfram perler-DilC18 (3) farvestof blandingen i PVP-belagt slange ved hjælp af en 10 ml sprøjte. Før slangen ind i forberedelsesstationen (se Materialetabel).
- Drej i 1 min på forberedelsesstationen. Fjern forsigtigt alt vandet fra slangen med en 10 ml sprøjte.
- Tænd for nitrogengassen, og juster kvælstofstrømmen til ca. 0,5 liter pr. minut (LPM), slangen roteres i klargøringsstationen og tørres med nitrogen i 30 min.
- Tag slangen ud af forberedelsesstationen og skåret i 13 mm længder (svarende til patronens lastestørrelse) med en slangeskærer. Hold 13 mm længderne i scintillationhætteglas i mørke.
2. Forberedelse af hjernesektioner
BEMÆRK: Voksne mandlige F344/N rotter blev parret opstaldet i et kontrolleret miljø under en 12/12 lys: mørk cyklus med ad libitum adgang til mad og vand. Alle dyr blev passet på de retningslinjer, der er fastlagt af National Institutes of Health i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr.
- Dybt bedøve rotter ved hjælp af 5% sevofluran.
- Fortsæt til følgende trin, når rotterne ikke reagerer på skadelige stimuli og reflekser er fraværende.
- Fastgør rotten i en supine position inde i en kemisk røghætte.
- Lav et snit gennem huden langs brystkassen midterlinjen. Adskil mellemgulvet og åbn brystet med en saks. Stik en 20 G × 25 mm nål ind i venstre hjertekammer.
- Skær straks det højre atrium med en saks. Perfuse 50 ml 100 mM PBS med 5 ml/min strømningshastighed. Perfuse 100 ml 4% paraformaldehyd buffered i 100 mM PBS.
- Fjern hele rotte hjernen lige efter perfusion.
- Postfix hele hjernen i 10 min med 4% paraformaldehyd.
BEMÆRK: Postfiks ender ikke i 4% paraformaldehyd i mere end 30 min, da det vil påvirke mærkningen. - Skær 500 μm tykke koronale sektioner ved hjælp af en rotte hjerne matrix (se Tabel over materialer). Tag det første snit og hold klingen på plads. Lav et andet snit med en anden klinge og fjern lodret den første klinge, så vævet på klingens overflade holdes.
- Placer hjerneskiverne i en 24 brøndplade med 1 ml 100 mM PBS i hver brønd. Gentag denne proces, indtil alle udsnit er skåret over.
3. Ballistisk mærkning og visualisering af hjernesektioner
- Fjern PBS fra hver målrettet godt.
- Læg patronen i med et stykke DiI/Wolfram perleslange og læg den i applikatoren.
- Sæt et stykke filterpapir mellem to maskeskærme. Tilslut applikatoren til heliumslangen. Juster udgangstrykket af helium til 90 pounds per kvadrattomme (psi).
- Anbring applikatoren lodret i hånden på midten af målbrønden i en afstand af 1,5 cm mellem prøven og maskeskærmen. Brand DiI / Wolfram perler slanger.
BEMÆRK: Sørg for at fjerne alle PBS fra de målrettede brønde før optagelse. - Læg patronen i med den næste DiI/Wolfram perleslange. Tænd kontinuerligt DiI/Wolfram perlerne fra slangen på de resterende skiver.
- Fyld 24 brøndpladen med 100 mM PBS. Vaskes med 500 μL frisk 100 mM PBS 3x. Lad ikke skiverne vende, mens vask med PBS.
- Der tilsættes 500 μL frisk 100 mM PBS, og skiverne holdes ved 4 °C i mørke i 3 timer.
- Overfør hjerneskiverne på glasglidere ved hjælp af en fin børste.
BEMÆRK: Tre hjernesektioner kan overføres til hver glasrutsjebane. - Tilsættes straks 1 ml antifademonteringsmedium til hver sektion. Anbring en 22 mm x 50 mm dæksel over hjernesektionerne. Tør glasgliderne i mørke i 2 dage.
- Tænd for det konfokale mikroskopsystem, og skift til et mål på 60×.
- Det konfokale mikroskopsystem indstilles til en forstørrelse på 60× (A/1.4, olie) og et Z-planinterval på 0,15 μm (pinhole størrelse 30 μm, tilbageprojiceret pinhole radius 167 nm). Brug en 543 nm bølgelængde til at erhverve billeder af neuroner af interesse.
- Få Z-stack billeder til den målrettede neuron type baseret på hjernen region grænser og morfologiske egenskaber af neuroner.
BEMÆRK: Erhverve mindst tre billeder fromm hvert dyr.
4. Anvendelse af metoden sammen med cellekultur
- Isoler primære kortikale neuroner fra F344/N rotter på postnatal dag ét ved hjælp af tidligere rapporteret metode14.
- Kultur primære kortikale neuroner i en 35 mm glas bund skål i en uge. Skift halvdelen af kulturmediet med frisk neuron vækstmedium på tredje dag efter isolation. Vask glasbundsskålen 2x med 1 ml 100 mM PBS.
- Fastgør med 4% paraformaldehyd i 15 min ved stuetemperatur. Gentag trin 3.2-3.6 for at mærke cellerne på ballistisk vis.
- Vask med 1 ml 100 mM PBS 3x. Der tilsættes 500 μL frisk 100 mM PBS og opbevares ved 4 °C i mørke i 3 timer.
- Der tilsættes 200 μL antifademonteringsmedium.
- Få Z-stack billeder for hver målrettet neuron ved hjælp af parametrene i trin 3.10.
5. Neuronal analyse og dendritisk rygsøjlen kvantificering
- Blinde neuroner ved hjælp af kodenumre for at forhindre eksperimentator bias.
- Etablere udvælgelseskriterier for neuroner baseret på hjernen region af interesse.
BEMÆRK: Udvælgelseskriterier for neuroner omfatter kontinuerlig dendritisk farvning, lav baggrund, ingen farvestof klynger inde i cellerne, minimal diffusion af DiI farvestof i det ekstracellulære rum, korrekt morfologi af pyramideformede neuroner (Figur 1). - Åben neuronal rekonstruktion software (Se vedlagte Video 1).
- Indlæs en billedfil ved at klikke på billedet "Filmappe" i øverste venstre hjørne.
- Klik på "Soma" og marker soma af neuroner på billedet.
- Klik på "Træ" , og vælg "Brugerstyret".
- Spor alle dendritiske grene af interesse.
BEMÆRK: For pyramideformede neuroner, som er karakteriseret ved en apiisk dendrite og flere basilar dendritter, er det kun den apikale dendrite spores. Sørg for, at alle forbindelsesgrene er fastgjort til hinanden. - Klik på "Ryg ".
- Definer registreringsparametre, og klik på "Registrer alle".
BEMÆRK: For hjerneskiver er de konsekvente parametre, der anvendes på tværs af hjerneområder: 2,0 (Ydre område), 0,3 (Minimum Højde), 100% (Detektorfølsomhed) og 10 (Minimum Count). For cellekultur er det nødvendigt at øge detektorfølsomheden og reducere minimumsantallet. - Klassificere pigge ved at vælge "Klassificere alle".
BEMÆRK: Dendritiske pigge er klassificeret ved hjælp af en algoritme integreret i neuronal rekonstruktion software15. - Gem sporing ved at vælge Diskbilledet i øverste venstre hjørne.
- Udfør neuronale og dendritiske rygsøjlen morfologiske analyser.
- Åben neuronal rekonstruktion kvantitativ analyse software (Se vedlagte Video 2).
- Indlæs billedet ved at klikke på "Filer" og "Åbn datafil".
- Klik på "Analyse" og "Forgrenet strukturanalyse" for at analysere neuronal morfologi og dendritisk rygsøjlemorfologi.
- For neuronal morfologi skal du klikke på "Tree Totals" og markere feltet for "Dendrite Totals".
- For dendritisk rygsøjlemorfologi skal du klikke på "Pigge" og derefter markere feltet for "Rygdetaljer".
- Gem output som en tekstfil (.txt) ved at højreklikke på outputtabellen og vælge "Gem i fil".
- Klik på "Analysér" og "Sholl-analyse".
- Startradiussen indstilles til 10 μm og radiusforøgelsen til 10 μm.
- Klik på feltet "Dendritter" , og klik på "Vis".
- Gem output som en tekstfil (.txt) ved at højreklikke på outputtabellen og vælge "Gem i fil".
6. Analyse af data
- Analysere neuronal morfologi (dvs. dendritic forgrening kompleksitet) data.
- Tilføj antallet af dendritter i hver grenrækkefølge, og divider med det samlede antal dendritter. Multiplicer med 100 for at beregne de relative frekvenser for antallet af dendritter i hver grenrækkefølge.
- Analysere Sholl analyse data til at undersøge neuronal arbor kompleksitet og dendritiske rygsøjlen tilslutningsmuligheder.
- Beregn middelværdien og standardfejlen for middelværdien for antallet af vejkryds ved hver radius.
- Summen af antallet af pigge, der er afhængige af rygsøjlens type (dvs. tynde, stumpede svampe) ved hver radius og dividere med det samlede antal pigge for den pågældende rygsøjletype. Gang med 100 for at beregne de relative frekvenser for antallet af pigge ved hver radius.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2A, de typiske pyramideformede neuroner i hippocampal regionen i rotte hjernen sektioner blev identificeret ved ballistiske mærkning teknologi, karakteriseret ved en stor apilogisk dendrite og flere mindre basal dendritter omkring soma. Figur 2B viser neuron i neuronal rekonstruktion kvantitative analyse software efter soma blev opdaget, dendritiske grene blev sporet, og pigge blev opdaget. Efterfølgende blev dataene analyseret ved hjælp af neuronal rekonstruktion kvantitativ analyse software, som gav mulighed for at vurdere dendritiske forgrening kompleksitet (Figur 2C) og neuronal arbor kompleksitet (Figur 2D).
I figur 2C,vi udnyttede centrifugalgren bestilling metode, indsamlet fra "Tree Totals" output, at tælle antallet af segmenter gennemkøres langs hver dendrite og tildelt filial orden. Den relative hyppighed af segmenter ved hver afdelingsordre blev undersøgt for afdelingsordrer 1-15. Når der blev observeret ændringer i fordelingen af dendritiske grene mellem grupper, kunne ændringer i dendritisk forgreningskompleksitet udledes. Desuden blev der foretaget en Sholl-analyse som et supplerende mål for neuronal arbor-kompleksiteten, hvorved antallet af dendritiske skæringspunkter, der forekommer hver 10 μm fra soma, blev kvantificeret i hvert prøveafsnit (figur 2D). Når ændringer i antallet af dendritiske skæringspunkter blev observeret mellem grupper, ændringer i neuronal arbor kompleksitet kunne udledes.
Morfologiske ændringer i dendritiske pigge kan vurderes ved hjælp af længde (μm), hoveddiameter (μm) og volumen (μm3),som det ses i figur 3A–B. Desuden blev pigge klassificeret ved hjælp af det automatiske assisterede klassifikationssystem i neuronal rekonstruktionssoftwaren. Den relative hyppighed af antallet af pigge mellem hver radius blev undersøgt for tynde, champignon, og stumpet pigge. I betragtning af vores forståelse af, hvilke rygsøjlen typer danner stærkere synaptiske forbindelser (dvs. champignon i forhold til stumpet) og neurotransmitter afferentes, skift i fordelingen af pigge langs neuron kan indikere synaptiske tilslutningsmuligheder.
Desuden validerede vi nytten af den ballistiske mærkningsteknik på en primær pyramideformet neuron i cellekulturen. For det første dyrkede vi primære hippocampale neuroner ved postnatal D1 (dag 1) på en cellekulturplade belagt med poly-L-lysin i 2 uger eller indtil ca. 70% sammenflydende. Derefter blev prøverne fikseret med 4% PFA i 15 min og vaskede 2x med PBS. Begyndende ved trin 3.1 i den nuværende protokol, vi ballistisk mærket og afbildet den primære pyramideformede neuroner fra hippocampus. Data viste stabiliseret mærkning og identificerede pyramideformede neuroner baseret på trekanten form af soma og store apikale dendrite (Figur 4A). Udnyttelse af neuronal rekonstruktion software til at undersøge dendritiske pigge af primære pyramideformede neuroner dyrket i cellekultur giver muligheder svarende til dem i rotte hjernen. Eksempler på resultater illustreres for fordelingen af tynde dendritiske pigge (figur 4B) og dendritisk rygsøjlelængde målt i μm (figur 4C). Men det er bemærkelsesværdigt, at de primære pyramideformede neuroner dyrket i cellekultur havde mindre dendritic forgrening, udelukker vurderingen, i det mindste i dette eksempel, af dendritiske forgrening kompleksitet og neuronal arbor kompleksitet.
Figur 1: Udvælgelseskriterier, der anvendes til pyramideformede neuroner i den mediale præfrontale cortex mærket ved hjælp af ballistisk mærkningteknologi. (A) Et repræsentativt konfokalbillede (60x) af en velmærket pyramideformet neuron fra den mediale præfrontale cortex. En enkelt pyramideformet neuron med en klar soma og apikal dendrite inkluderet kontinuerlig, lyse dendritiske farvning med lav baggrund. (B–C) Et repræsentativt konfokalbillede (60x) af en pyramideformet neuron fra den mediale præfrontale cortex med lys, der når på de mere distale grene (B) og høj baggrund (C). (D) Et repræsentativt konfokalbillede (60x) af en mærket neuron fra den mediale præfrontale cortex (baseret på Bregma-koordinater), der har fejlbehæftede morfologiske egenskaber. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mærkning af pyramideformede neuroner i hippocampus (HIP) ved hjælp af ballistisk mærkningteknologi og neuroanatomiske vurderinger. (A) Tre repræsentative konfokale billeder (60x) af pyramideformede neuroner mærket af ballistiske wolfram perler. (B) Vurdering af neuronal morfologi: dendritisk gren orden analyse og Sholl analyse. Det sporede billede af dendritiske rygsøjlen, hvor rygsøjlen morfologi blev også identificeret ved hjælp af dendritiske rygsøjlen analyse software. (C) Branch order analyser anvendes til at undersøge den relative hyppighed af dendritiske filialer på forskellige filial ordrer. (D) Antallet af dendritiske skæringspunkter hver 10 μm fra soma blev vurderet ved hjælp af Sholl analyse som et mål for neuronal arbor kompleksitet. Data beskrives som relative frekvenser af hele datasættet (C) eller passer med 95 % konfidensintervaller (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Vurderingen af dendritisk rygsøjlen morfologi. (A–B) Fordelingen af dendritiske pigge illustreret som en funktion af rygsøjlen type (dvs. tynd, stumpet, champignon). Yderligere dendritiske rygsøjlen parametre blev også analyseret (dvs. længde, volumen, hoved diameter) som en vurdering af dendritiske rygsøjlen morfologi. Data illustreres som relative frekvenser af hele datasættet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Mærkningaf primær kortikal neuron in vitro ved hjælp af ballistisk mærkning teknologi. (A) Repræsentative konfokale billeder (60x) af primære kortikale neuroner mærket af ballistiske wolfram perler in vitro. Eksempel resultater svarende til dem, der er erhvervet fra ballistiskmærkning i hjerneskiver er vist til fordeling af tynde dendritiske pigge (B) og længde (C). Data illustreres som relative frekvenser af hele datasættet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Procedurer for neuronal sporing og dendritisk rygsøjlen afsløring. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Video 2: Procedurer for dataindsamling og -output med henblik på kvantitativ analyse. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol beskriver vi en alsidig mærkningsteknik til neuroner fra både rottehjernen og dem, der dyrkes in vitro. Desuden rapporterer vi metoden til at udnytte neuronal rekonstruktion software og neuronal rekonstruktion kvantitative analyse software til at vurdere neuronal morfologi og dendritiske pigge. Vurderingen af neuronal morfologi og dendritiske pigge giver mulighed for at bestemme ændringer i dendritisk forgrening kompleksitet, neuronal arbor kompleksitet, dendritiske rygsøjlen morfologi, og synaptiske tilslutningsmuligheder.
Når du gennemfører protokollen, forskere bør være særligt opmærksomme på et par skridt. Først, efter fastsættelse i 4% PFA for længe vil skade integriteten af lipofile membran og forårsage farvestoffet til at lække uden for cellerne. For det andet, sammenlignet med specificiteten af ballistiske mærkning i hjernen skiver, som kun er rettet mod neuroner, mærkning af primære kortikale neuroner in vitro introducerer uspecifik mærkning af glia, fordi ballistiskmærkning i hjernen skiver ikke er specifik for en type neuron (dvs. pyramideformet neuron, medium spiny neuron, granulat celle). Bregma-koordinater, morfologiske vurderinger eller specifikke cellemarkører bør derfor kombineres med den ballistiske mærkningsmetode. For det tredje kan tykkelsen af hjerneskiverne være mellem 200-500 μm; for de bedste resultater, bør det optimeres. For det fjerde er effektiviteten af mærkning og farvestof penetration relateret til mange faktorer, såsom helium tryk, inkubatorigange efter ballistiske anvendelse, DiI / Wolfram perler, afstanden mellem mesh skærmen og overfladen af hjernen skiver, osv. Protokollen bør optimeres for hver undersøgelse. Femte, store klumper eller klynger af ballistiske farvestof belagt wolfram perler under forberedelse skal undgås, fordi klumper ikke ville tillade individuelle neuroner, der skal skelnes. Vi har også fastslået, at DiI spreder sig mere fuldstændigt i de enkelte neuroner end DiO i denne ballistiske metode.
Sammenlignet med traditionelle mærkningsmetoder4gør den ballistiske mærkningsteknik ikke desto mindre konfokale billeddannelse med høj opløsning mulig, hvilket gør det muligt at vurdere neuronal og dendritisk rygsøjlemorfologi. Desuden anvender neuronal rekonstruktionssoftware en algoritme til automatisk assisteret klassificering af dendritiske pigge (dvs. tynd, champignon, stubby), grenbestillingsmålinger, klassisk Sholl-analyse og måling af morfologiske træk ved dendritiske pigge, såsom længde (μm), hoveddiameter (μm) og volumen (μm3). Kvantificeringen af flere neuronale parametre giver mulighed for bedre at forstå de mekanismer, der ligger til grund for neurokognitiv dysfunktion.
Samlet set tillader den ballistiske mærkningsmetode visualisering af neuronale strukturer i forskellige hjerneregioner af rotten og i cellekulturen, hvilket er vigtigt at belyse de mulige mekanismer, der ligger til grund for neurokognitiv dysfunktion. I denne undersøgelse præsenterer vi en metode til at mærke pyramideformede neuroner ved hjælp af en ballistisk mærkningsteknik. Desuden, kombineret med neuronal rekonstruktion software, vi viste evnen til at undersøge neuronal og dendritic rygsøjlen morfologi i hippocampal pyramideformede neuroner. Gruppeforskelle i neuronal og/eller dendritisk rygsøjlemorfologi giver mulighed for at forstå de mekanismer, der ligger til grund for neurokognitiv dysfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud HD043680, MH106392, DA013137, og NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
