Summary
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إصلاح المواد النباتية لإضفاء الطابع المناعي على البروتينات والبكتين العربي ، وجزءًا من راتنج الأكريليك المائي ، المقطع والمثبت على الشرائح الزجاجية. نظهر سيتم الكشف عن epitopes جدار الخلية ذات الصلة مع الأجسام المضادة محددة.
Abstract
ويشمل تطوير النبات تعديلات ثابتة على تكوين جدار الخلية وهيكلها استجابة للمحفزات الداخلية والخارجية على حد سواء. وتتألف جدران الخلايا من السليلوز وغير السليلوزية السكريات جنبا إلى جنب مع البروتينات والمركبات الفينولية والماء. يتكون 90٪ من جدار الخلية من السكريات (مثل البكتين) وبروتينات أرابينوغالكاتا (AGPs). يبقى تحديد مكان المناعة الفلورية من أسطح جليكان محددة في أقسام النسيج النباتية أداة رئيسية للكشف عن إعادة عرض الشبكات السكاريد الجدار، والهيكل والمكونات.
هنا، نحن الإبلاغ عن إجراء تحسين المناعة الفلورية للكشف عن epitopes الجليكان من AGPs والبكتين في الأنسجة النباتية. وقد استخدم تثبيت Paraformaldehyde/glutaraldehyde جنبا إلى جنب مع LR-White تضمين عينات النبات، مما يسمح للحفاظ على نحو أفضل من بنية الأنسجة وتكوينها. واستخدمت أجزاء رقيقة من العينات المضمنة التي تم الحصول عليها مع microtome فائقة لlocalization المناعة مع الأجسام المضادة محددة. هذه التقنية تقدم دقة كبيرة، وخصوصية عالية، وفرصة للكشف عن عدة ظهارات الجليكان في نفس العينة. هذه التقنية تسمح توطين دون الخلية من الجليكان ويكتشف مستوى تراكمها في جدار الخلية. كما يسمح بتحديد الأنماط الزقتية -الزمنية لتوزيع البكتين و البكتين أثناء العمليات التطويرية. استخدام هذه الأداة قد توجه في نهاية المطاف اتجاهات البحوث وربط الجليكانات لوظائف محددة في النباتات. وعلاوة على ذلك، يمكن للمعلومات التي تم الحصول عليها أن تكمل الدراسات الكيميائية الحيوية ودراسات التعبير الجيني.
Introduction
جدران الخلايا النباتية هي هياكل معقدة تتألف من السكريات وبروكرينات الجليكو. جدران الخلية هي هياكل ديناميكية للغاية التي تختلف هندستها التنظيمية ، والتنظيم والتركيب وفقا لنوع الخلية ، والتوطين ، ومرحلة التنمية ، ومحفزات خارجية وداخلية1. تعتبر بروتينات أرابينوغالات (AGPs) والبكتين مكونات مهمة من جدار الخلايا النباتية. إن البروتينات والجليكوسيلات عالية البيرة والبكتين هي السكاريدات المثلية التي تختلف تكوينها وكميتها وبنيتها اختلافاً كبيراً خلال مراحل نمو النباتات المختلفة2،3،4. وقد كشفت الدراسات AGPs والبكتين مشاركتهم في العديد من العمليات النباتية مثل موت الخلايا المبرمجة، والاستجابة للضغوط اللاأحيائية، والتكاثر النباتي الجنسي، من بين أمور أخرى كثيرة5. وقد بدأت معظم هذه الدراسات بمعلومات تم الحصول عليها من دراسات نقل المناعة.
ونظرا لتعقيدها، فإن دراسة جدران الخلايا تتطلب العديد من الأدوات المختلفة. الكشف عن الظهارات الجليكان باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) هو نهج قيم لحل توزيع السكرياتيدات وجليكوبروتين على طول هذا الهيكل. هناك مجموعة كبيرة من mAbs المتاحة للكشف عن epitopes الجليكان ويتم تحسين خصوصية كل ماب بشكل مستمر وكذلك6. التقنية الموصوفة هنا قابلة للتطبيق على جميع أنواع النباتات، وهي أداة مثالية لتوجيه اتجاهات البحث المستقبلية التي قد تنطوي على تقنيات أكثر تكلفة وتعقيدا.
في هذه التقنية، يتم الاقتران مع أجسام مضادة محددة كيميائيا لأصباغ الفلورسنت مثل FITC (الفلوريسين ايزوثيوسانات)، TRITC (tetramethylrhodamine-5-(و 6)-isothiocyanate) أو عدة صبغات فلور اليكسا. يوفر الفلورسينت العديد من المزايا، مما يسمح بتعريب الخلايا دون الخلوية الواضحة والسريعة للجليكانات التي يمكن ملاحظتها مباشرة تحت مجهر الفلورانس. وهو محدد وحساس للغاية ، لأن إعداد العينة يمكن أن يحمي بشكل فعال الهيكل الطبيعي للمستضد ، حتى لو كان موجودًا بكميات أقل. فإنه يسمح للكشف عن مستضدات متعددة في نفس العينة والأهم من ذلك، ويقدم جودة عالية ونتائج جميلة بصريا. على الرغم من القوة العظمى التي تقدمها دراسات تحديد المواقع المناعية المفلورة ، فإنها غالبا ما تعتبر صعبة الأداء والتنفيذ على الأرجح بسبب عدم وجود بروتوكولات مفصلة تسمح بالتصور من مختلف خطوات الإجراء. هنا، ونحن نقدم بعض المبادئ التوجيهية البسيطة حول كيفية تنفيذ هذه التقنية وكيفية الحصول على صور ذات جودة عالية.
بالنسبة للبروتوكول المقدم هنا، يجب أولاً إصلاح العينات وإضمانها باستخدام المثبت الأكثر ملاءمة. على الرغم من اعتبارها تقنية مستهلكة للوقت ومملة نسبيًا ، فإن التثبيت السليم وتضمين عينة النبات هو المفتاح لضمان إجراء فحص مناعي ناجح. لهذا الغرض، فإن الأكثر شيوعا هو تثبيت المواد الكيميائية باستخدام المثبتات عبر الربط، مثل الألدهيدات. المثبتات المتبادلة الربط إنشاء الروابط الكيميائية بين جزيئات الأنسجة، وتحقيق الاستقرار وتصلب العينة. الفورمالديهايد والغلوتارالدهيد هي عبر ربط المثبتات، وأحيانا يتم استخدام مزيج من كل من المثبتات7. الفورمالديهايد يقدم الحفاظ الهيكلية كبيرة من الأنسجة لفترات طويلة من الزمن، وإنتاج تراجع الأنسجة الصغيرة ويجري متوافقة مع المناعة. الجلثارالدهيد هو تثبيت أقوى ومستقرة تستخدم عادة في تركيبة مع الفورمالديهايد. استخدام الجلوتارالدلديهايد لديه بعض العيوب التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار لأنه يقدم بعض المجموعات الألدهيد الحرة في الأنسجة الثابتة, التي قد تولد بعض العلامات غير محددة. أيضا الربط بين البروتينات والجزيئات الأخرى في بعض الأحيان قد تجعل بعض epitopes الهدف لا يمكن الوصول إليها للأجسام المضادة. لتجنب هذا، يجب تحديد كمية ومدة التثبيت بعناية.
بعد التثبيت، يتم تضمين عينات في الراتنج السليم لتصلب قبل الحصول على أقسام. لندن الراتنج (LR-الأبيض) الراتنج الاكريليك هو الراتنج المفضل لدراسات تخصيص المناعة. على عكس راتنجات أخرى، LR-White هو ماء، مما يسمح للأجسام المضادة للوصول إلى المستضدات الخاصة بهم، مع عدم الحاجة إلى أي علاج لتسهيل ذلك. LR-White لديها أيضا ميزة تقديم انخفاض فلورا لصناعة السيارات، مما يسمح للحد من الضوضاء الخلفية أثناء تصوير المناعة.
هناك العديد من تقنيات التلطيخ المتاحة للكشف عن مكونات مختلفة من جدار الخلية، مثل تلطيخ الأزرق ألسيان، تلطيخ الأزرق التلوويدين أو حمض الدورية شيف (PAS) تلطيخ. لا شيء من هذه تقدم قوة تحليل تخصيص المناعة8. هذا النهج يعطي قدرا أكبر من التحديد في الكشف عن الجليكان، وتقديم معلومات أوسع بشأن تكوين جدار الخلية وهيكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد العينة: التثبيت، والجفاف، وLR-الأبيض تضمين
- التثبيت والجفاف
ملاحظة: عملية التثبيت هامة للحفاظ على العينة; عن طريق الجزيئات crosslinking يتم إيقاف الأيض الخلوية، وضمان سلامة الخلوية ومنع الانتشار الجزيئي. يجب تعديل العوامل المثبت والتركيز المستخدم لهذا الغرض ، مما يترك المستضدات معرضة بما فيه الكفاية للتفاعل مع الأجسام المضادة. البروتوكول التالي يجمع بين القدرة تثبيت معتدل من ما قبلية، مع تأثير أقوى من الجلوتارالديهيد. تم تحسين نسبها لمكونات AGPs وجدار الخلية ، ولكنها مناسبة للبروتينات الأخرى وهياكل الخلايا. عملية الجفاف اللاحقة سوف تعد العينات لتضمين LR-الأبيض. واستخدمت في هذه التجربة الأنسجة النباتية من عدة أنواع نباتية. تم جمع عينات من الـ Quercus suber من الأشجار التي تمت زراعتها في الحقل. عينات الغمر Trithuria كانت تشارك التكرم معنا من قبل بولا Rudall (حدائق كيو، لندن، المملكة المتحدة).- زرع جميع النباتات العربية على التربة مباشرة وتنمو في منشأة نمو داخلية مع 60٪ الرطوبة النسبية ودورة نهار / ليلة من 16 ساعة ضوء في 21 درجة مئوية و 8 ح الظلام عند 18 درجة مئوية. حدد الأنسجة النباتية التي سيتم تحليلها، وتقليم العينات لتكون لا تزيد عن 16 ملم2 في الحجم.
- نقل على الفور العينة إلى قارورة الزجاج شغلها سابقا مع ما يكفي من محلول المثبت الباردة (2٪ الفورمالديهايد (ث / الخامس)، 2.5٪ glutaraldehyde (ث / الخامس)، 25 mM PIPES pH 7 و 0.001٪ توين-20 (الخامس / الخامس)) لغمر تماما العينات(الشكل 1A).
تنبيه: الفورمالديهايد والغلوثارالدهيد كلاهما عوامل تثبيت يمكن أن تكون ضارة عن طريق الاستنشاق والاتصال. قم بتنفيذ خطوة التثبيت على غطاء الدخان وارتداء الملابس الواقية الكافية وقفازات النتريل. جميع الحلول من هذه الخطوة فصاعدا، بما في ذلك سلسلة الكحول حتى 70٪، يجب أن يتم تخزينها لإزالة التلوث في وقت لاحق من قبل الموظفين المتخصصين. - بعد جمع كل العينات، تحديث المثبت.
- نقل قارورة إلى فراغ الغرفة، وتطبيق الفراغ ببطء. عند الوصول إلى -60 كيلو باسكال، سوف تبدأ المواد العائمة في الغرق إلى أسفل القارورة(الشكل 1B).
- تبقى تحت فراغ لا يزيد عن -80 كيلو باسكال لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- الإفراج ببطء الفراغ، وختم الزجاج القارورة ومكان بين عشية وضحاها في 4 °C.
- تجاهل أية عينات لم تغرق أثناء التثبيت بين عشية وضحاها. اغسل العينات المتبقية بـ 25 mM PBS pH 7 لمدة 10 دقائق ، تليها 20 دقيقة من الغسيل في 25 mM PIPES pH 7.2.
- تجفيف العينات في سلسلة الإيثانول (25٪ ، 35 ٪ ، 50 ٪ ، 70 ٪ ، 80 ٪ ، 90 ٪ ، و 3x 100 ٪ الإيثانول) لمدة 20 دقيقة لكل من. نقل عينات المجففة فورا إلى قارورة الزجاج المسمى لتضمين (الشكل 1C).
ملاحظة: يمكن إيقاف عملية الجفاف مؤقتاً عند خطوة الإيثانول بنسبة 70٪.
- LR-أبيض الراتنج تضمين
ملاحظة: LR-أبيض هو راتنج الاكريليك غير المائية مع اللزوجة منخفضة، مما يجعلها مثالية لاختراق الأنسجة مع العديد من جدران الخلايا سميكة الطبقات. LR-White يأتي أيضا في عدة درجات صلابة متوافقة لقطع معظم عينات النباتات. يرجى التأكد من أن الراتنج المستخدمة تم تزويدها بالفعل مع محفز مناسب مختلطة في، أو اتباع تعليمات المورد لإعداد الراتنج. عملية التضمين التالية بطيئة ولكن النتائج تبرر إلى حد كبير الوسائل.- اثقب العينات عن طريق احتضان الراتنج LR-White في سلسلة من تركيزات الهلال من الراتنج (1:3، 2: 3، 1: 1، 3: 2، 3: 1، 1: 0) في الإيثانول، في حضنة لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية في كل خطوة.
تنبيه: LR-الراتنج الأبيض هو الراتنج الاكريليك منخفضة السمية; ومع ذلك، قد يكون مصدر إزعاج للجلد عن طريق الاتصال والاستنشاق. ويوصى بشدة العمل في منطقة جيدة التهوية أو تحت غطاء الدخان مع ارتداء واقية مناسبة وقفازات نيتريل. - تحديث الراتنج LR-أبيض واحتضان لمدة 12 ساعة إضافية في 4 °C.
- إعداد كبسولات الجيلاتين التضمين الحجم المناسب (حجم 1 (0.5 مل) للعينات حتى 3 مم، 2 × 0.37 مل للعينات حتى 5 مم أو 3 × 0.3 مل للعينات حتى 8 مم، وعلامات الورق(الشكل 1D).
ملاحظة: حدد حجم الكبسولة ليكون أكبر قليلاً من العينة، بحيث يمكن وضع العينة بالكامل في الراتنج. أيضا، تذكر أن تسمية العلامات مع قلم رصاص، لأن القلم أو أحبار المطبوعة سوف تلوث الراتنج، وتدمير العينة. - تطبيق قطرة واحدة من الراتنج LR-أبيض جديد إلى الجزء السفلي من كل كبسولة.
- ضع عينة في كل كبسولة الجيلاتين وملء إلى أقصى حد ممكن مع الراتنج الطازج. ضع غطاء الكبسولة واضغط بلطف لتشكيل ختم محكم (الشكل 1E).
- البلمرة الراتنج لمدة 24 إلى 48 ساعة في 58 درجة مئوية، أو حتى تصلب تماما.
- تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: آخر البلمرة LR-الراتنج الأبيض خامل.
- اثقب العينات عن طريق احتضان الراتنج LR-White في سلسلة من تركيزات الهلال من الراتنج (1:3، 2: 3، 1: 1، 3: 2، 3: 1، 1: 0) في الإيثانول، في حضنة لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية في كل خطوة.
2. إعداد الشرائح
ملاحظة: يجب أن تكون الشرائح الزجاجية نظيفة وخالية من أي غبار أو شحوم أو أي ملوثات أخرى. حتى الشرائح الجديدة يجب تنظيفها لأن بعض الموردين يستخدمون الزيوت والمنظفات لمنع الشرائح من التمسك معا. أي الشحوم أو المنظفات سوف تتداخل مع التصاق القسم إلى الشريحة، حتى لو تعامل مع بولي-L-ليسين. الوبر والغبار سيؤثر على ملاحظات العينة وربما يفسد التجربة. شرائح تفلون المغلفة مع رد فعل الآبار هي مثالية لهذه المهمة. فهي بأسعار معقولة، قابلة لإعادة الاستخدام، ويقلل بشكل كبير من كمية حل الأجسام المضادة اللازمة. مع التنظيف السليم، يمكن إجراء ممتازة نوعية الفلورسنت المناعية بتكلفة معقولة جدا.
-
غسل الشرائح
- ضع الشرائح في رف تلطيخ وغطيها بمحلول التنظيف (0.1٪ SDS (ث / الخامس)، 1٪ حمض الخليك (v/v)، 10٪ الإيثانول (v/v)).
- الحفاظ على الانفعالات خفيفة لمدة 20 دقيقة.
- نقل رفوف تلطيخ إلى حمام ddH2O مع الانفعالات خفيفة لمدة 10 دقيقة. كرر 4 مرات.
- استصفي الرفوف بعناية قبل أن تغمس لفترة وجيزة في الإيثانول بنسبة 100٪، واترك الشرائح تجف في بيئة خالية من الغبار.
- يُخزن حتى الاستخدام.
-
بولي-L-ليسين طلاء (اختياري)
ملاحظة: عادة ما تلتصق الأقسام الصغيرة بشكل جيد جدًا بزلاقات الزجاج النظيف. هذه الخطوة هي فقط من المستحسن لأقسام أكبر (> 2 ملم2). أقسام أكبر تميل إلى أضعاف والتجاعيد، وليس من المستحسن. ومع ذلك، إذا لزم الأمر استخدام الشرائح رد فعل مع ثقوب أكبر. تنظيفها على النحو الوارد أعلاه والمضي قدما على النحو التالي.- ضع شرائح نظيفة في طبق بيتري مربع. Pipette 0.001٪ بولي-L-lysine حل (ث / الخامس) لتغطية ثقوب الشرائح، دون تفيض.
- دع الشرائح تجف بين عشية وضحاها عند 40 درجة مئوية في أطباق بيتري مغلقة.
ملاحظة: الشرائح المغلفة جاهزة للاستخدام الفوري ويمكن تخزينها في بيئة خالية من الغبار في درجة حرارة الغرفة، لعدة أشهر.
3. عينة التشذيب والقطع
-
عينة التشذيب
- مع شفرة حادة، تقليم كتل LR-الأبيض تحت stereomicroscope لتشكيل هيكل هرمي الشكل حيث قمة عمودي على منطقة اهتمام العينة(تكميلية الشكل 1A).
ملاحظة: حامل العينة فائقة الصغر هو أداة ممتازة لتأمين كتلة. إذا لم يكن الجهاز حامل عينة عالمية، استخدم واحد الأكثر ملاءمة للكميات المستديرة. - تقليم هيكل هرمي عن طريق إزالة شرائح غرامة من الراتنج الزائد عموديا على المحور الرئيسي الهرم.
- استمر حتى يتم الوصول إلى العينة لتشكيل سطح القطع. ضمن سطح القطع، يجب أن تكون العينة الهدف مُحاطة بشكل شبه منحرف.
ملاحظة: يمكن أن يتم تشذيب كتلة الراتنج في زاوية الشق لتقليل مساحة سطح القسم بشفرة حادة (الشكل 1F).
- مع شفرة حادة، تقليم كتل LR-الأبيض تحت stereomicroscope لتشكيل هيكل هرمي الشكل حيث قمة عمودي على منطقة اهتمام العينة(تكميلية الشكل 1A).
-
اقسام شبه رقيقة
ملاحظة: سيتم استخدام ميكروتوم مع السكاكين الزجاجية. قدرة الجسم المضاد على ربط epitope سوف شرط نجاح رد فعل مناعي. وسوف تسمح الطبيعة المائية من راتنج LR-الأبيض للاتصال جيدة من الأجسام المضادة مع أقسام العينة. سوف أرق المقاطع تقديم تلوين Calcofluor fainter التي سيتم استخدامها للمساعدة في تحديد موقع المقاطع والمساعدة في عملية التصوير. وينطبق الشيء نفسه على البقع الأخرى التي قد تطبق في وقت لاحق. كما أن سمك مفرط يؤثر على جودة الحصول على الصور. يمكن العثور على حل وسط جيد لسمك القسم بين 200 و 700 نانومتر ، اعتمادًا على خصائص الأنسجة. جبل كتل بإحكام على حامل العينة من microtome فائقة.- مع microtome فائقة، وجعل المقاطع بسماكة بين 200 و 700 نانومتر (الشكل 1G).
- تحقق من منطقة المقطع عن طريق نقل بعض المقاطع إلى قطرة ddH2O على شريحة زجاجية. ضع الشريحة على صفيحة ساخنة 50 درجة مئوية حتى يتبخر الماء. وضع وصمة عار قطرة 1٪ تولويدين الأزرق O (ث / الخامس) في 1٪ محلول حمض البوريك (ث / الخامس) على أقسام لمدة 30 ث. شطف ومراقبة تحت المجهر.
- عند العثور على الهيكل المطلوب، نقل واحد أو قسمين إلى كل قطرة من DdH2O وضعت سابقا على كل بئر من شريحة رد فعل نظيفة.
- ضع كل شريحة في طبق بتري مربع مغلق 10 سم واتركه جافًا عند 50 درجة مئوية.
- تخزين الشرائح في صندوق أرشيف نظيف حتى الاستخدام.
4- نقل المناعة
ملاحظة: يعتمد إجراء تخصيص الفلورسنت المناعي على الاستخدام المتسلسل لأجسامتين مضادتين. يتم رفع الأجسام المضادة الأولية ضد مستضد مستهدف محدد. يتم رفع الأجسام المضادة الثانوية على وجه التحديد ضد الأجسام المضادة الأولية ويتم الاقتران مع تقنيات الفلورسنت إلى الفلوروفور (FITC في هذا البروتوكول المحدد). سيتم استخدام الأجسام المضادة الأولية للكشف عن المستضد المستهدف في العينة، وسيتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية لتحديد الموقع حيث يتم توصيل الجسم المضاد الأساسي بالعينة بعد غسل الفائض من الأجسام المضادة الأولية. الضوابط هي جزء مهم من هذا الفحص ويجب دائما أن يتم تنفيذها لضمان دقة الملاحظات. يجب حجز بئر واحد على الشريحة للاستخدام كتحكم سلبي ، حيث سيتم تخطي علاج الأجسام المضادة الأولية ، وبالتالي لا ينبغي ملاحظة أي إشارة في نهاية التجربة. يجب أن تدرج سيطرة إيجابية في التجربة عن طريق معاملة واحدة بشكل جيد مع الأجسام المضادة التي وسم بالفعل معروفة ومؤكدة. يتم استخدام التحكم الإيجابي لتأكيد فعالية وسم الأجسام المضادة الثانوية وظروف التفاعل بينما يختبر التحكم السلبي خصوصية الأجسام المضادة الثانوية.
- إعداد غرفة الحضانة عن طريق وضع بعض المناشف الورقية المثبطة في الجزء السفلي من مربع نصائح ماصة والتفاف عليه مع رقائق القصدير(تكميلية الشكل 1B-1E). ضع الشرائح في غرفة الحضانة.
- Pipette قطرة 50 ميكرولتر لكل 8 مم جيدا من محلول منع (5٪ الحليب الجاف غير الدهنية (ث / الخامس) في 1 م PBS) واحتضان لمدة 10 دقيقة. إزالة حل حجب وغسل جميع الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- إعداد حلول الأجسام المضادة الأولية (انظر الجدول التكميلي 1)، 1:5 (v/v) الأجسام المضادة في حل الحجب؛ جعل تقدير حوالي 40 ميكرولتر لكل 8 ملم جيدا.
ملاحظة: يجب تعديل تركيز الأجسام المضادة وفقًا لبروتوكول التصنيع. - قم بإجراء غسل نهائي مع ddH2O لمدة 5 دقائق ، ولا تدع الآبار تجف تمامًا.
- الماصات الحل الأجسام المضادة الأولية لآبار رد الفعل. ماصة حظر حل لآبار التحكم.
- أغلق غرفة الحضانة ودع الوقوف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة متبوعة بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية. إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية، 1٪ في حل حظر (v/ الخامس) حوالي 40 ميكرولتر في البئر. يبقيه مغطاة مع احباط القصدير.
- اغسل جميع الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق ، تليها 10 دقائق إضافية مع ddH2O. تأكد من عدم وجود أثر لمحلول الحجب أو الرواسب مرئية على الآبار.
- الماصات حل الأجسام المضادة الثانوية لجميع الآبار. من الآن فصاعداً، احمي الشرائح من الضوء.
- احتضان لمدة 3-4 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- غسل جميع الآبار مرتين لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني تليها آخر غسل 10 دقيقة مع ddH2O.
- تطبيق قطرة من كالكوفلور (1:10,000 (ث / الخامس) الفلورسنت 28 أكثر إشراقا في برنامج تلفزيوني) إلى كل بئر. دون غسل، وتطبيق قطرة من المتوسط تصاعد (انظر جدول المواد)إلى كل بئر ووضع غطاء (الشكل 1H).
- مراقبة مع المجهر الفلوريس، ومجهزة 10x/0.45، 20x/0.75، 40x/0.95 و 100x/1.40 عدسة، واستخدام الأشعة فوق البنفسجية (لصبغة الكالفور) ومرشحات FITC، للكشف عن جدار الخلية وlocalization المناعي على التوالي(الشكل 1I). استخدم الأطوال الموجية التالية: الإثارة/الانبعاث (nm) 358/461 للأشعة فوق البنفسجية و485/530 لـ FITC.
- للحصول على تصور أفضل للنتائج تتداخل الصور مع ImageJ أو ما شابه ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تجربة ناجحة ، فإن الأجسام المضادة الثانوية تحديد موقع محدد من epitope في اللون الأخضر مشرق ، بطريقة متسقة ، مما يسمح لتوصيف تكوين جدار الخلية في مرحلة معينة من تطوير الخلية أو الأنسجة أو الجهاز. على سبيل المثال الأجسام المضادة LM6 له صلة عالية ل1,5-arabinan, مركب مع نوع-I rhamnogalacturonan التي يمكن العثور عليها بغزارة وسم جدار الخلية من النمو Quercus suber anther (الشكل 2A), مما يسمح باستنتاج أن هذا النوع من البكتين وفيرة وجزء من تكوين جدار الخلية الأولية. JIM5 لديه تقارب ل homogalacturonans بالكاد استرفيد التي توجد عادة في طرف الجذر من الجنين تحت فئة Quercus، وتحديد الخصائص الميكانيكية للجهاز(الشكل 2B). Xylogalacturonan هي نوع من البكتين الغنية في إكسيلوز المرتبطة بخلية الجدار تخفيف، وهي موجودة في الخلايا المتحللة. الجسم المضاد LM8 يعترف على وجه التحديد xylogalacturonans، في أعضاء النضج يمكن استخدامه للكشف عن الخلايا أو الأنسجة المتحللة، مثل الخلايا إندوسبيرم خلال المراحل النهائية من نضوج البلوط كوركوس الفرعي (الشكل 2C).
JIM13 لديه تقارب لAGPs وجدت على الهياكل ذات الصلة مع الاستنساخ، وخطوط الخلايا المتعلقة microgametogenesis في Arabidopsis thaliana (الشكل 2D). JIM8 يعترف أيضا epitopes من AGPs موجودة في الخلايا والأعضاء ذات الصلة إلى الإنجاب مثل الحليمات وصمة العار وmicropyle من اجماة أنجيوسبيرم Trithuria (الشكل 2E-2F). وقد اقترح كل من الأجسام المضادة لتكون علامات الجزيئية لخطوط الخلايا gametophytic في النباتات9.
من السهل عادةً اكتشاف الأخطاء الشائعة في هذا البروتوكول وتحديدها. عندما يتم تخطي يغسل أو يتم السماح لآبار رد الفعل لتجف، والأجسام المضادة الثانوية عادة ما تظهر كضغة غير محددة تغطي بشكل عشوائي على الخلايا والأنسجة والراتنج والشريحة (الشكل 3A). سوف تتكون مجاميع من الفلوروكرروم الأخضر إذا لم يتم غسلها بشكل صحيح الأجسام المضادة الأولية غير المقيدة (الشكل 3B). وثمة سبب آخر مشترك لفشل هذه التقنية يرتبط مع للطي و / أو مفرزة من المقاطع (الشكل 3C) ، مما يجعل التجربة عديمة الفائدة. عادةً ما ترتبط هذه المشكلة إما بالتصاق الفقراء من المقاطع إلى الشرائح، ربما بسبب استخدام الشرائح غير نظيفة، و / أو غسل العدوانية.
إعداد العينة هو أيضا خطوة حاسمة في هذا الإجراء. لحسن الحظ ، فإن القضايا الأكثر شيوعا المثبت وتضمينها هي سهلة على الفور (الشكل 3D). إذا سارت الأمور على ما يرام كتلة الراتنج ستكون خالية من الشقوق والعينة سوف تكون مرئية بوضوح مع اللون الأصفر الفاتح إلى اللون البني الفاتح(الشكل 3D-1). عينات جزءا لا يتجزأ من غير فعالة تظهر بقع أو مساحات بيضاء مسحوق(الشكل 3D-2). الحفاظ على حجم العينة تحت 8 ملم مهم لضمان اختراق الحل المثبت. عندما تكون العينات ثابتة بشكل سيئ ، ستظهر باللون البني الداكن تقريباً أسود (الشكل 3D-3). أيضا درجة حرارة البلمرة مهم لكل من الحفاظ على epitopes وتصلب السليم من الراتنج. يمكن أن تسبب درجة حرارة مفرطة الراتنج للقضاء مما يجعل من المستحيل تقسيم العينة(الشكل 3D-4).
الشكل 1- الـ 1 نظرة عامة على البروتوكول الكامل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج النموذجية لـ AGPs و Pectin immunolocalization في عينات النباتات. (A) LM6 وضع العلامات من قنين moiety من البكتين في البكتين في الميركوس suber anther في meiosis I. (B) وضع علامات محددة من البكتين الميثيل - إستريا في تلميح جذر الجنين من قبل QUERCUS suberer بواسطة JIM5. (C) Xylogalacturonan المسمى من قبل LM8 في الاندورفين انحسار من يوركوس الفرعية النضج البلوط. (D)JIM13 وضع العلامات من AGPs في tapetum و tetrads من ثالينا arabidopsis. (E)AGPs المسمى من قبل JIM8 في الحليمات وصمة عار من الغمر Trithuria. (F) JIM8 وضع العلامات على AGPs في micropyle (السهم الأبيض) من ابيضول اغمرة تريثوريا. ميكروسبور Meiotic (ماك), Tapetum (Tp), الجذر (R), الجذر تلميح (Rt), Testa (Ts), Endosperm (إد), الجنين (إم), البشرة (Ep), الحليمات وصمة العار (SP), Ovule (OV). أشرطة مقياس: 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الأخطاء والمشاكل الشائعة أثناء البروتوكول. (A)يتم تحديد فشل خطوات الغسيل من خلال وجود مسحة غير محددة من الأجسام المضادة الثانوية (+) على عينة الراتنج. (ب) سوء خصوصية أو فشل الغسيل للجسم المضاد الرئيسي ينتج عنه تكوين مجاميع FITC (+) غير المستعبدين إلى موقع معين. (C) طيات ومفرزة القسم غالبا ما تكون نتيجة لغسل العدوانية والشرائح غير نظيفة. (د)أمثلة على تثبيت العينات والتضمين؛ (1) الكمال حجم العينة وتضمين، (2) فشل تضمين، (3) فشل التثبيت عينة، (4) الراتنج تصلب الفشل. FITC المسمى الأجسام المضادة (الأخضر) و كالكفلورور الأبيض وصمة عار (الأزرق). أشرطة مقياس: 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1. (A) تمثيل تخطيطي للتسلسل التشذيب كتلة لإعداد العينة (كتلة صفراء) للقطع مع ultramicrotome. أولاً، تتم إزالة كبسولة الجيلاتين (1). ثم يتم تقليمها أولاً بزاوية 40 إلى 45 درجة إلى جوانب الكبسولة بشكل عرضي للعينة (2) ، ويتم إجراء قطع ثاني عند 90 درجة من الأول (3) يليه ثالث (4) والرابع يتبع نفس القاعدة (5). من هذه المرحلة الأولى من تقليم النتائج هيكل هرمي على شكل القمة التي تقع فوق العينة. وأخيرا، مع شفرة حادة يتم حلق القمة قبالة عموديا على محور كتلة الراتنج الرئيسية للوصول إلى عينة جزءا لا يتجزأ. يجب الحصول على سطح مربع أو شبه منحرف في نهاية الإجراء (6). (ب)الإمدادات اللازمة لإنشاء غرفة حضانة؛ احباط القصدير (1)، شريط لاصق مزدوج من جانب (2)، مناشف ورقية (3) وصندوق تلميح ماصة. (C) الخطوة الأولى، يتم إصلاح احباط القصدير إلى المربع مع الشريط اللاصق على الوجهين. (D) الخطوة الثانية، يتم إزالة حامل النصائح الماصة لوضع المناشف الورقية في الجزء السفلي من مربع. (E) الخطوة الثالثة، يتم تخميد المناشف الورقية بالماء ويتم وضع حامل النصائح الماصة مرة أخرى إلى العمل لديه صينية للشرائح. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: قائمة من الأجسام المضادة أحادية النسيلة مفيدة. ويمثل الجدول أعلاه مثالاً على الأجسام المضادة المتاحة، مع معلومات عن أهدافها ومكان شرائها. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة تحديد المواقع المناعية الفلورية في النباتات الموصوفة هنا ، في حين أنها واضحة بسلاسة ، تعتمد على نجاح العديد من الخطوات الصغيرة. الأول منها هو إعداد العينة واللصلح. خلال هذه الخطوة الأولى، يتم استخدام مزيج من الفورمالديهايد والغلوتارالدهيد لتقاطع التشابك غالبية مكونات الخلية. يوفر الفورمالديهايد في الحل تثبيتًا معتدلًا ويمكن عكسه بينما يوفر الجلوتاراللديهايد ارتباطًا أكثر دائمًا؛ التوازن بين اثنين من المثبتات يوفر المبلغ المناسب من crosslinking، مما يسمح التعرض للeptopes للرد مع الأجسام المضادة الأولية10. لكي يعمل الحل المثبت بشكل صحيح، يجب أن تكون العينة صغيرة. هياكل كبيرة أكثر من 7 مم في القطر من الصعب جدا لإصلاح وينبغي قص لضمان الاختراق المثبت.
بعد الجرح أو الإجهاد، تفرز بعض النباتات كميات كبيرة من العفص الذي يشكل رواسب الظلام التي قد تتفاعل مع الفورمالديهايد التدخل في عملية التثبيت. حفظ العينات على الجليد واستبدال الحل المثبت كلما أصبح غائما يساعد على الحد من هذا التأثير. يمكن أن تتداخل الهواء أيضا مع عملية التثبيت ولاحقا في تضمين وتصلب من الراتنج. وينبغي أن العلاج الفراغ المقترح إزالة معظم الهواء. للحصول على أنسجة مهوّة الهواء بشكل خاص، يمكن تمديد الخطوة فراغ أبعد من 2 ساعة، حتى لا يخرج الهواء من العينات وأنها تغرق إلى القاع. يجب تجاهل أي عينة تم العثور عليها عائمة بعد الخطوة المثبت بين عشية وضحاها. الراتنج التضمين يوفر الدعم لقطع العينة المحفوظة، وينبغي أن تكون صلادتها تقريبية للأنسجة جزءا لا يتجزأ10. LR-White يأتي في ثلاث درجات صلابة: من الصعب على الأنسجة الخشبية بشدة تصلب, متوسطة الصف للغالبية العظمى من الأنسجة من أوراق إلى حبوب اللقاح, والصف لينة للأنسجة أكثر حساسية. لتضمين الكمال، يجب أن الراتنج اختراق تماما العينة؛ هذا هو أفضل الحصول عليها مع تسلل بطيء وتدريجي. مع الاختبار المسبق، يمكن استخدام فترات حضانة أقصر. كبسولات الجيلاتين هي على حد سواء صغيرة وقابلة للتسرب بشكل خفي، مما يجعلها مثالية لعلاج الراتنج LR-الأبيض. لحجم 2 (0.37 مل), يجب أن يكون علاج كاملة بعد 24 ح في 58 درجة مئوية. بالنسبة لأحجام الكبسولات الأخرى ، يجب تعديل وقت المعالجة. وLR-الأبيض الشفاء الراتنج ينبغي أن تذهب من عديم اللون تقريبا إلى لون ذهبي / العنبر الخفيفة ويشعر من الصعب على الأظافر. يتطلب تقليم العينات واستخدام الميكرات الدقيقة للغاية ممارسة ولكنها ستنتج أرقامًا واضحة. سمك وحجم القسم مهم للتصوير و فحص المناعة. يجب أن يتم الاحتفاظ سمك القسم حوالي 500 نانومتر. المقاطع التي هي رقيقة جدا يؤدي إلى تلطيخ الفقراء والقسم سمك أكثر من 700 نانومتر سوف تتداخل مع الحصول على الصورة والقرار. طبيعة هيدروفيلية من راتنج LR-الأبيض يسمح للاستخدام المباشر للقسم في تلطيخ ومناعة دون إزالة الراتنج.
حل منع (5٪ الحليب الجاف غير الدهني في 1 م بي بي إس) يقلل من الربط غير محدد من الأجسام المضادة. كان الحليب الجاف غير الدهني بديلاً موثوقاً به لـ BSA أو غيرها من عوامل الحجب التقليدية، وهو أقل تكلفة بكثير. يجب تصفية حل الحجب من خلال فلتر ورق قبل الاستخدام، لتجنب الترسبات التي تشكل عصية على غسل المجاميع، والاحتفاظ بوالأجسام المضادة، وتسوية التجربة. وقد تم تحسين نسب الأجسام المضادة المقترحة وأوقات الحضانة وتطبيقها بنجاح على الأنواع المتنوعة في العديد من الدراسات9و11و12و13و14و15و16.
التبخر والمعرض للضوء هما قضيتان يجب تجنبهما أثناء إجراء نقل المناعة. غرفة حضانة رطبة وداكنة يحل كل من هذه المشاكل. ويمكن الاطلاع على البرنامج التعليمي حول كيفية جعل غرفة مظلمة في الشكل التكميلي 1B-1E. ويدعو بروتوكول تحديد المواقع المناعية هذا إلى استخدام جسم مضاد أولي موجه إلى الشعاع المستهدف بدون تسمية خاصة به، واجسام مضادة ثانوية مترافقة مع فلوفلوروكروم (FITC) الذي يتم رفعه ضد الجسم المضاد الرئيسي IgG. تقدم هذه الطريقة العديد من المزايا على استخدام نظام واحد للكشف عن الأجسام المضادة بسبب زيادة صرامة الكشف ، حيث أن الأجسام المضادة الثانوية ليس لها صلة مع أنواع العينة المستهدفة. هذا النظام يوفر إشارة متزايدة كما قد تستهدف جزيئات الأجسام المضادة الأولية من قبل عدة جزيئات من الأجسام المضادة الثانوية، كل تحمل الفلوروكروم17.
إن اضمحلال الفلوروكررومات عن طريق الضوء الشديد، أو تبييض الصور، هو مسألة مهمة في هذه التقنية. خاصة عند استكشاف إشارات محلية خافتة، قد تصبح الإشارة مفقودة بشكل لا رجعة فيه قبل التصوير. تصاعد المتوسطة يزيد كثيرا من الاستقرار وعمر الفلوروكرومات18; ومع ذلك، فمن المستحسن للغاية لاختبار تصاعد وسائل الإعلام، كما قد تتفاعل مع بعض وصمة عار و / أو الفلوروكروم، وتشكيل الرواسب وعدم وضوح الصورة. تكوين النظام البصري المستخدم لمراقبة وتسجيل مناعية من أهم الجوانب لنجاح هذه التجربة. بسبب انخفاض سمك المقاطع ، فإن فوائد استخدام المجهر confocal محدودة. الإعداد الأكثر نجاحا يتطلب المجهر epifluorescence تستقيم التقليدية مجهزة مصدر الضوء الفلورسنت، الصمام أو الزئبق لمبة19، مع أهداف الصف fluorescence كافية. كما أن مرشحات الضوء ذات النوعية الجيدة التي تم تعيينها للإثارة/الانبعاثات (nm) 358/461 للأشعة فوق البنفسجية و485/530 لـ FITC مطلوبة. للحصول على صورة الفلوريسين، الكاميرات الرقمية المبردة monochromatic ينصح نظرا لسرعتها العالية والحساسية، ولكن التضحية معلومات اللون الحقيقي20. الكاميرات متعددة الألوان توفر القدرة على فرز بسهولة من إشارة من الفلورسينس الخلفية ولكن أبطأ وأقل حساسية بكثير من نظرائهم أحادية اللون.
هذه الطريقة محدودة من قبل توافر الأجسام المضادة محددة. على الرغم من توافر مجموعة واسعة ومتوسعة من الأجسام المضادة التي تستهدف النباتات، من المفهوم أنه لا يتم تغطية جميع المركبات النباتية حتى الآن. أيضا الدهون تميل إلى أن تكون المستخرجة من طريقة التضمين الموصوفة، وبالتالي لا ينصح للأنسجة ذات محتوى الزيت عالية. قد يكون قسم Cryostat بديلاً، على الرغم من التضحية بدقة الصورة. قد درجة حرارة البلمرة راتنج LR-الأبيض في بعض الحالات تغيير epitopes أكثر حساسية. إذا كان الهدف epitope حساس لدرجة الحرارة، التبديل LR-أبيض ل الراتنج LR-الذهب. البلمرة في -25 درجة مئوية تحت الضوء الأبيض، LR-الذهب يقدم الحفاظ ممتازة من epitopes الحساسية الحرارية، ولكن سوف تتطلب الحصول على جهاز البوليمرة المتخصصة وقليلا أكثر سمية ثم LR-الأبيض.
وقد استخدمت هذه الطريقة عبر مجموعة واسعة من الأنواع والأنسجة. يسمح الوصول السريع إلى معلومات موثوقة عن توزيع epitope محددة. تقديم البيانات الداعمة للنماذج التطورية وتحديد العلامات والتعديلات المحددة في الخلايا والأنسجة مع توفير نتائج تحريضية بصريًا. استخدام الأجسام المضادة المقترنة مع fluorochromes على بيروكسيديز أو القلوية فوسفاتيز بدائلالاقتران 10، هو أقل استهلاكا للوقت ، وأقل عرضة بكثير للتحف المبالغة في رد الفعل ويوفر دقة واضحة دون الخلية من الصعب أن تتطابق مع أي تقنية أخرى. استخدام الأجسام المضادة محددة للبوليمرات جدار الخلية ذات الصلة يسمح نظرة ثاقبة في ترتيب المركبات في المجالات تقييد جدا. ومن شأن هذا الحل أن يكون صعباً الحصول عليه من الأدوات الكيميائية الحيوية التقليدية. مجموعة من الأجسام المضادة الأولية التي تتوسع باستمرار يوفر فرص اكتشاف جديدة ثابتة في الخلايا المصنعة الداخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ عن عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تلقى المؤلفون الدعم من مشروع الاتحاد الأوروبي 690946 'SexSeed' (الاستنساخ النباتي الجنسي – تكوين البذور) الممول من H2020-MSCA-RISE-2015 وSeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. تلقى مشروع AMP منحة من مشروع MSCA-IF-2016 التابع للاتحاد الأوروبي (رقم 753328). تلقت MC منحة من منحة دكتوراه FCT SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Absolute ethanol | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size should fit the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| Vacuum chamber | na | na | |
| Vacuum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
- Keegstra, K.
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K.
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. Boston, MA. (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
