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Developmental Biology

संयंत्र ऊतकों की सेल दीवार में अरबिनोगालेक्टन प्रोटीन और पेक्टिन का फ्लोरोसेंट इम्यूनोलोकलाइजेशन

Published: February 27, 2021 doi: 10.3791/61034
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2
1Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, 2Laboratório Associado para a Química Verde, 3Dipartimento di Bioscienze, Universitá degli Studi di Milano

Summary

इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन किया गया है कि कैसे अरबिनोगालेक्टन प्रोटीन और पेक्टिन के इम्यूनोलोकलाइजेशन के लिए पौधे की सामग्री तय की जाती है, जो हाइड्रोफिलिक ऐक्रेलिक राल में एम्बेडेड होती है, कांच की स्लाइड पर अनुभागित और घुड़सवार होती है। हम दिखाते हैं कि सेल वॉल से संबंधित एपिटोप्स विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पाए जाएंगे।

Abstract

पौधे के विकास में आंतरिक और बाहरी दोनों उत्तेजनाओं के जवाब में सेल दीवार संरचना और संरचना का निरंतर समायोजन शामिल है। सेल की दीवारें सेल्यूलोज और नॉन-सेल्यूलोसिक पॉलीसैकराइड्स से मिलकर प्रोटीन, फेनोलिक यौगिकों और पानी से बनी होती हैं। सेल वॉल का 90% पॉलीसैकराइड्स (जैसे, पेक्टिन) और अरबिनोगालेक्टन प्रोटीन (एजीपीएस) से बना है। पौधे हिस्टोलॉजिकल वर्गों में विशिष्ट ग्लाइकन एपिटोप का फ्लोरोसेंट इम्यूनोलोकेलाइजेशन दीवार पॉलीसैकराइड नेटवर्क, संरचना और घटकों के रीमॉडलिंग को उजागर करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बना हुआ है।

यहां, हम पौधों के ऊतकों में एजीपी और पेक्टिन से ग्लाइकैन एपिटोप का पता लगाने के लिए एक अनुकूलित फ्लोरोसेंट इम्यूनोलोकेलाइजेशन प्रक्रिया की रिपोर्ट करते हैं। पौधे के नमूनों के एलआर-व्हाइट एम्बेडिंग के साथ पैराफॉर्मलडिहाइड/ग्लूटारल्डिहाइड फिक्सेशन का उपयोग किया गया था, जिससे ऊतक संरचना और संरचना के बेहतर संरक्षण की अनुमति मिली थी । अल्ट्रा-माइक्रोटॉम के साथ प्राप्त एम्बेडेड नमूनों के पतले वर्गों का उपयोग विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोलोकेलाइजेशन के लिए किया जाता था। यह तकनीक महान संकल्प, उच्च विशिष्टता और एक ही नमूने में कई ग्लाइकन एपिटोप का पता लगाने का मौका प्रदान करती है। यह तकनीक ग्लाइकन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की अनुमति देती है और सेल दीवार में उनके संचय के स्तर का पता लगाती है। यह विकास प्रक्रियाओं के दौरान एजीपी और पेक्टिन वितरण के स्थानिक-लौकिक पैटर्न के निर्धारण की भी अनुमति देता है। इस उपकरण का उपयोग अंततः अनुसंधान निर्देशों का मार्गदर्शन कर सकता है और पौधों में विशिष्ट कार्यों के लिए ग्लाइकन को लिंक कर सकता है। इसके अलावा, प्राप्त जानकारी जैव रासायनिक और जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के पूरक हो सकते हैं ।

Introduction

पौधे की कोशिका दीवारें पॉलीसैकराइड्स और ग्लाइकोप्रोटीन से बनी जटिल संरचनाएं हैं। सेल की दीवारें बेहद गतिशील संरचनाएं हैं जिनकी वास्तुकला, संगठन और संरचना सेल प्रकार, स्थानीयकरण, विकासात्मक चरण, बाहरी और आंतरिक उत्तेजनाओं1के अनुसार भिन्न होती है। अरबिनोगालेक्टन प्रोटीन (एजीपीएस) और पेक्टिन पौधे सेल दीवार के महत्वपूर्ण घटक हैं। एजीपी अत्यधिक ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन होते हैं और पेक्टिन होगोगलैक्टुरोन पॉलीसैकराइड होते हैं जिनकी संरचना, मात्रा और संरचना विभिन्न पौधों के विकास के चरणों2,3, 4 केदौरानबहुत भिन्न होती है। एजीपी और पेक्टिन अध्ययनों ने प्रोग्राम किए गए सेल मृत्यु, अजैविक तनावों की प्रतिक्रिया, यौन पौधे प्रजनन, कई अन्य5के बीच कई पौधों की प्रक्रियाओं में उनकी भागीदारी का खुलासा किया है। इनमें से अधिकांश अध्ययन इम्यूनोलोकेलाइजेशन अध्ययन से प्राप्त जानकारी के साथ शुरू हुए थे।

इसकी जटिलता को देखते हुए, सेल दीवारों के अध्ययन के लिए कई अलग-अलग उपकरणों की आवश्यकता होती है। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) का उपयोग करके ग्लाइकन एपिटोप का पता लगाना इस संरचना के साथ पॉलीसैकराइड और ग्लाइकोप्रोटीन वितरण को हल करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है। ग्लाइकन एपिटोप्स का पता लगाने के लिए एमएबी का एक बड़ा संग्रह उपलब्ध है और प्रत्येक एमएबी की विशिष्टता में लगातार सुधार किया जा रहाहै। यहां वर्णित तकनीक सभी पौधों की प्रजातियों पर लागू होती है, और भविष्य के अनुसंधान निर्देशों का मार्गदर्शन करने के लिए एक आदर्श उपकरण है जिसमें अधिक महंगी और जटिल तकनीकें शामिल हो सकती हैं।

इस तकनीक में, विशिष्ट एंटीबॉडी को फित्रोसेंट रंगों जैसे फिटक (फ्लोरोसेइन आइसोथियोसायनेट), ट्राइटीसी (टेट्रामेथाइलरोडमाइन-5-(और 6) या कई एलेक्सा फ्लोरर रंगों के लिए रासायनिक रूप से संयोजित किया जाता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस कई फायदे प्रदान करता है, जिससे ग्लाइकैन के स्पष्ट और त्वरित उपकोशिकीय स्थानीयकरण की अनुमति होती है जिसे सीधे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत देखा जा सकता है। यह अत्यधिक विशिष्ट और संवेदनशील है, क्योंकि नमूने की तैयारी प्रभावी रूप से एंटीजन की प्राकृतिक संरचना की रक्षा कर सकती है, भले ही कम मात्रा में मौजूद हो। यह एक ही नमूने में कई एंटीजन का पता लगाने की अनुमति देता है और सबसे महत्वपूर्ण, उच्च गुणवत्ता और नेत्रहीन सुंदर परिणाम प्रदान करता है। फ्लोरेसेंस इम्यूनोलोकेलाइजेशन अध्ययनों द्वारा पेश की जाने वाली महान शक्ति के बावजूद, उन्हें अक्सर प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के दृश्य की अनुमति देने वाले विस्तृत प्रोटोकॉल की कमी के कारण प्रदर्शन करना और लागू करना मुश्किल माना जाता है। यहां, हम इस तकनीक को कैसे करें और उच्च गुणवत्ता वाले चित्रों को प्राप्त करने के तरीके पर कुछ सरल दिशानिर्देश प्रदान करते हैं।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए, नमूनों को पहले सबसे उपयुक्त फिक्सेटिव का उपयोग करके तय और एम्बेडेड किया जाना चाहिए। हालांकि एक समय लेने वाली और अपेक्षाकृत थकाऊ तकनीक के रूप में माना जाता है, उचित निर्धारण और संयंत्र के नमूने के एम्बेडिंग एक सफल इम्यूनोलोकलाइजेशन परख सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस उद्देश्य के लिए, सबसे सामान्य रूप से एल्डिहाइड जैसे क्रॉसलिंकिंग फिक्सेटिव्स का उपयोग करके रासायनिक निर्धारण है। क्रॉस-लिंकिंग फिक्सेटिव ऊतक के अणुओं के बीच रासायनिक बांड स्थापित करते हैं, नमूने को स्थिर और सख्त करते हैं। फॉर्मलडिहाइड और ग्लूटारल्डिहाइड फिक्सेटिव्स को क्रॉस-लिंक करते हैं, और कभी-कभी दोनों फिक्सेटिव्स का मिश्रण 7 का उपयोग कियाजाताहै। फॉर्मलडिहाइड ऊतकों के महान संरचनात्मक संरक्षण और समय की विस्तारित अवधि के लिए, छोटे ऊतक रिऐक्शन का उत्पादन करता है और इम्यूनोशेटिंग के साथ संगत होता है। ग्लूटारल्डिहाइड एक मजबूत और स्थिर फिक्सेटिव है जो आमतौर पर फॉर्मलडिहाइड के संयोजन में उपयोग किया जाता है। ग्लूटारल्डिहाइड के उपयोग में कुछ नुकसान होते हैं जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए क्योंकि यह कुछ मुफ्त एल्डिहाइड समूहों को निश्चित ऊतक में पेश करता है, जो कुछ अविशिष्ट लेबलिंग उत्पन्न कर सकता है। इसके अलावा प्रोटीन और अन्य अणुओं के बीच क्रॉसलिंकिंग कभी-कभी एंटीबॉडी के लिए कुछ लक्षित एपिटोप को दुर्गम बना सकता है। इससे बचने के लिए, निर्धारण की मात्रा और अवधि को सावधानीपूर्वक परिभाषित किया जाना चाहिए।

निर्धारण के बाद, नमूनों को अनुभागों को प्राप्त करने से पहले कठोर करने के लिए उचित राल में एम्बेडेड किया जाता है। लंदन राल (एलआर-व्हाइट) ऐक्रेलिक राल इम्यूनोलोकलाइजेशन अध्ययन के लिए पसंद का राल है। अन्य रेजिन के विपरीत, एलआर-व्हाइट हाइड्रोफिलिक है, जिससे एंटीबॉडी को अपने एंटीजन तक पहुंचने की अनुमति देता है, जिसमें इसे सुविधाजनक बनाने के लिए किसी भी उपचार की कोई आवश्यकता नहीं होती है। एलआर-व्हाइट में कम ऑटो-फ्लोरेसेंस की पेशकश करने का लाभ भी है, जिससे इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के दौरान पृष्ठभूमि शोर में कमी की अनुमति है।

सेल वॉल के विभिन्न घटकों का पता लगाने के लिए कई धुंधला तकनीक उपलब्ध हैं, जैसे कि एल्सियन ब्लू स्टेनिंग, टोल्यूडीन ब्लू स्टेनिंग या आवधिक एसिड-शिफ (पीए) धुंधला। इनमें से कोई भी इम्यूनोलोकलाइजेशन की शक्ति8का विश्लेषण नहीं करता है । यह दृष्टिकोण ग्लाइकन का पता लगाने में अधिक विशिष्टता देता है, जो सेल वॉल संरचना और संरचना के बारे में विशाल जानकारी प्रदान करता है।

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Protocol

1. नमूना तैयारी: निर्धारण, निर्जलीकरण, और एलआर-व्हाइट एम्बेडिंग

  1. फिक्सेशन और डिहाइड्रेशन
    नोट: नमूने को संरक्षित करने के लिए निर्धारण प्रक्रिया महत्वपूर्ण है; अणुओं को क्रॉसलिंक करके सेलुलर मेटाबॉलिज्म बंद कर दिया जाता है, सेलुलर अखंडता सुनिश्चित करता है और आणविक प्रसार को रोकता है। फिक्सेटिव एजेंटों और उपयोग की गई एकाग्रता को उस उद्देश्य में समायोजित किया जाना चाहिए, जिससे एंटीजन एंटीबॉडी के साथ बातचीत करने के लिए पर्याप्त रूप से उजागर होते हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ग्लूटाराल्डिहाइड के मजबूत प्रभाव के साथ पैराफॉर्मल्डिहाइड की हल्के फिक्स्ड क्षमता को जोड़ती है। उनके अनुपात AGPs और सेल दीवार घटकों के लिए अनुकूलित किया गया, लेकिन यह अन्य प्रोटीन और सेल संरचनाओं के लिए उपयुक्त है। बाद में डिहाइड्रेशन की प्रक्रिया एलआर-व्हाइट एम्बेडिंग के लिए नमूने तैयार करेगी। इस प्रयोग में कई पौधों की प्रजातियों के पौधों के ऊतकों का उपयोग किया गया था। खेत में उगाए गए पेड़ों से क्वेरकस सबर के नमूने एकत्र किए गए। त्रितुरिया सबमर्सा नमूनों को पाउला रुडऑल (Kew Gardens, लंदन, ब्रिटेन) द्वारा हमारे साथ साझा किया गया ।
    1. सभी अरबीडोप्सिस पौधों को सीधे मिट्टी पर बोएं और 60% सापेक्ष आर्द्रता के साथ इनडोर विकास सुविधा में वृद्धि करें और 21 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे प्रकाश के एक दिन/रात चक्र और 18 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे अंधेरे में। विश्लेषण करने के लिए पौधे के ऊतकों का चयन करें, और नमूनों को आकार में 16मिमी से अधिक नहीं होना चाहिए।
    2. नमूने को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए पहले पर्याप्त ठंडे फिक्सेटिव समाधान (2% फॉर्मलडिहाइड (w/v), 2.5% ग्लूटारल्डिहाइड (w/v), 25 m M पाइप पीएच 7 और 0.001% ट्वीन-20 (v/v)) से भरे गिलास शीशी में तुरंत नमूने कोस्थानांतरितकरें।
      सावधानी: फॉर्मलडिहाइड और ग्लूटाराल्डिहाइड दोनों फिक्सेटिव एजेंट हैं जो साँस लेना और संपर्क से हानिकारक हो सकते हैं। एक धुएं हुड पर निर्धारण कदम प्रदर्शन और पर्याप्त सुरक्षात्मक कपड़े और नाइट्राइल दस्ताने पहनते हैं। इस कदम के बाद से सभी समाधान, शराब श्रृंखला सहित ७०% तक, विशेष कर्मचारियों द्वारा बाद में विसंदूषण के लिए संग्रहीत किया जाना चाहिए ।
    3. सभी नमूनों को इकट्ठा करने के बाद, फिक्सेटिव को ताज़ा करें।
    4. शीशियों को वैक्यूम चैंबर में स्थानांतरित करें, और धीरे-धीरे वैक्यूम लागू करें। -60 kPa तक पहुंचने पर, फ्लोटिंग सामग्री शीशी(चित्रा 1B)के नीचे तक डूबना शुरू हो जाएगी।
    5. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए -80 kPa से अधिक नहीं के एक निर्वात के तहत रखें।
    6. धीरे-धीरे वैक्यूम छोड़ें, कांच की शीशी को सील करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    7. रात भर निर्धारण के दौरान डूबने वाले किसी भी नमूने को त्यागें। शेष नमूनों को 10 मिनट के लिए 25 M PBS पीएच 7 के साथ धोएं, इसके बाद 25 एमएम पाइप बफर पीएच 7.2 में 20 मिनट की धुलाई करें।
    8. एक इथेनॉल श्रृंखला (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, और 3x 100% इथेनॉल) में नमूनों को 20 मिनट के लिए निर्जलित करें। तुरंत एम्बेडिंग(चित्रा 1C)के लिए लेबल ग्लास शीशियों के लिए निर्जलित नमूनों को स्थानांतरित करें।
      नोट: निर्जलीकरण प्रक्रिया को 70% इथेनॉल चरण पर रोका जा सकता है।
  2. एलआर-व्हाइट राल एम्बेडिंग
    नोट: एलआर-व्हाइट कम चिपचिपाहट के साथ एक गैर-हाइड्रोफोबिक ऐक्रेलिक राल है, जो इसे कई मोटी कोशिका दीवारों परतों के साथ ऊतकों को मर्मज्ञ बनाने के लिए आदर्श बनाता है। एलआर-व्हाइट भी कई कठोरता ग्रेड में सबसे संयंत्र के नमूनों को काटने के लिए संगत में आता है । कृपया सुनिश्चित करें कि इस्तेमाल किया राल पहले से ही उचित उत्प्रेरक में मिश्रित के साथ आपूर्ति की है, या राल तैयार करने के लिए आपूर्तिकर्ता निर्देशों का पालन करें । निम्नलिखित एम्बेडिंग प्रक्रिया धीमी है लेकिन परिणाम बहुत साधनों को न्यायोचित ठहराते हैं।
    1. इथेनॉल में राल (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) की वर्धमान एकाग्रता की एक श्रृंखला में एलआर-व्हाइट राल के साथ इनक्यूबेटिंग करके नमूनों को पर्फ्यूज करें, प्रत्येक चरण में 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटिंग करें।
      सावधानी: एलआर-व्हाइट राल एक कम विषाक्तता ऐक्रेलिक राल है; हालांकि, यह संपर्क और साँस लेने से त्वचा के लिए एक अड़चन हो सकती है। एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में या उचित सुरक्षात्मक पहनने और नाइट्राइल दस्ताने के साथ एक धुएं हुड के नीचे काम करना अत्यधिक अनुशंसित है।
    2. एलआर-व्हाइट राल को ताज़ा करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 12 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. 8 मिमी तक के नमूनों के लिए 3 मिमी, 2 x 0.37 एमएल तक के नमूनों के लिए 3 मिमी, 2 x 0.37 एमएल तक के नमूनों के लिए उचित आकार एम्बेडिंग जिलेटिन कैप्सूल (आकार1 (0.5एमएल) तैयार करें, और पेपर (चित्रा टैग 1D)।
      नोट: कैप्सूल आकार का चयन नमूने से थोड़ा बड़ा होने के लिए, ताकि नमूना पूरी तरह से राल में संलग्न किया जा सकता है। इसके अलावा, एक पेंसिल के साथ टैग लेबल करने के लिए याद है, क्योंकि कलम या मुद्रित स्याही राल दूषित होगा, नमूना बर्बाद कर ।
    4. प्रत्येक कैप्सूल के नीचे ताजा एलआर-सफेद राल की एक बूंद लागू करें।
    5. प्रत्येक जिलेटिन कैप्सूल में एक नमूना रखें और ताजा राल के साथ अधिकतम क्षमता को भरें। कैप्सूल कैप रखें और एक हर्मेटिक सील(चित्रा 1E)बनाने के लिए धीरे से दबाएं।
    6. 58 डिग्री सेल्सियस पर 24 से 48 घंटे के लिए राल को पॉलीमराइज करें, या पूरी तरह से कठोर होने तक।
    7. कमरे के तापमान पर नमूने स्टोर करें।
      नोट: पोस्ट पॉलीमराइजेशन एलआर-व्हाइट राल निष्क्रिय है।

2. स्लाइड तैयारी

नोट: ग्लास स्लाइड साफ होना चाहिए, किसी भी धूल, तेल या किसी अन्य प्रदूषक से मुक्त। यहां तक कि नई स्लाइडों को साफ किया जाना चाहिए क्योंकि कुछ आपूर्तिकर्ता स्लाइड को एक साथ चिपकाने से रोकने के लिए तेल और डिटर्जेंट का उपयोग करते हैं। कोई भी तेल या डिटर्जेंट स्लाइड के लिए अनुभाग आसंजन के साथ हस्तक्षेप करेगा, भले ही पॉली-एल-lysine के साथ इलाज किया जाए। लिंट और धूल नमूने की टिप्पणियों को प्रभावित करेगा और बहुत संभवतः प्रयोग को बर्बाद कर देगा। प्रतिक्रिया कुओं के साथ Teflon लेपित स्लाइड इस कार्य के लिए एकदम सही हैं। वे सस्ती, पुन: प्रयोज्य हैं और आवश्यक एंटीबॉडी समाधान की मात्रा को काफी कम करते हैं। उचित सफाई के साथ, उत्कृष्ट गुणवत्ता वाले फ्लोरोसेंट इम्यूनोलोकेलाइजेशन को बहुत सस्ती कीमत पर किया जा सकता है।

  1. स्लाइड वाशिंग
    1. स्लाइड्स को एक धुंधला रैक में रखें और सफाई समाधान के साथ कवर करें (0.1% एसडीएस (w/v), 1% एसिटिक एसिड (v/v), 10% इथेनॉल (v/v)) ।
    2. 20 मिनट के लिए एक हल्के आंदोलन बनाए रखें।
    3. धुंधला रैक को 10 मिनट के लिए हल्के आंदोलन के साथ डीएच2ओ स्नान में स्थानांतरित करें। 4 बार दोहराएं।
    4. ध्यान से 100% इथेनॉल में संक्षेप में सूई से पहले रैक नाली और स्लाइड एक धूल मुक्त वातावरण में सूखी चलो।
    5. उपयोग तक स्टोर करें।
  2. पॉली-एल-लिसिन कोटिंग (वैकल्पिक)
    नोट: छोटे वर्ग आमतौर पर ग्लास स्लाइड को साफ करने के लिए बहुत अच्छी तरह से चिपके रहते हैं। यह कदम केवल बड़े वर्गों (>2 मिमी2)के लिए अनुशंसित है। बड़े वर्ग गुना और शिकन करते हैं, और उचित नहीं हैं। फिर भी, अगर जरूरत बड़े छेद के साथ प्रतिक्रिया स्लाइड का उपयोग करें। उन्हें ऊपर की तरह साफ करें और इस प्रकार आगे बढ़ें।
    1. एक वर्ग पेट्री डिश में साफ स्लाइड रखें। पिपेट 0.001% पॉली-एल-लिसिन समाधान (w/v) स्लाइड के छेद को कवर करने के लिए, बिना बहए।
    2. स्लाइड्स में है बंद पेट्री डिश में 40 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सूखी।
      नोट: लेपित स्लाइड तत्काल उपयोग के लिए तैयार हैं और कई महीनों के लिए कमरे के तापमान पर धूल मुक्त वातावरण में संग्रहीत किया जा सकता है।

3. नमूना ट्रिमिंग और सेक्शनिंग

  1. नमूना ट्रिमिंग
    1. एक तेज रेजर ब्लेड के साथ, पिरामिड के आकार की संरचना बनाने के लिए एलआर-व्हाइट ब्लॉक को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे ट्रिम करें जहां शीर्ष नमूने के ब्याज के क्षेत्र में लंबवत है(पूरक चित्रा 1A)।
      नोट: अल्ट्रा-माइक्रोटॉम नमूना धारक ब्लॉक को सुरक्षित करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है। यदि डिवाइस में सार्वभौमिक नमूना धारक नहीं है, तो गोल ब्लॉकों के लिए सबसे फिट का उपयोग करें।
    2. पिरामिड प्रमुख धुरी के लिए लंबवत अतिरिक्त राल के ठीक स्लाइस को हटाकर पिरामिड संरचना ट्रिम करें।
    3. जब तक नमूना काटने की सतह बनाने तक पहुंच जाता है तब तक आगे बढ़ें। काटने की सतह के भीतर, लक्ष्य नमूना आदर्श रूप से एक ट्रैपेज़ाइड आकार में संलग्न होना चाहिए।
      नोट: राल ब्लॉक को एक तेज ब्लेड(चित्रा 1F)के साथ अनुभाग सतह क्षेत्र को कम करने के लिए एक भट्ठा कोण पर और छंटनी की जा सकती है।
  2. अर्ध-पतली खंड
    नोट: कांच चाकू के साथ एक माइक्रोटॉम का इस्तेमाल किया जाएगा । एपिटोप से बांधने की एंटीबॉडी की क्षमता इम्यूनोलेबेलिंग प्रतिक्रिया सफलता को कंडीशन करेगी। एलआर-व्हाइट राल की हाइड्रोफिलिक प्रकृति नमूना वर्गों के साथ एंटीबॉडी के अच्छे संपर्क के लिए अनुमति देगी। पतले वर्ग बेहोश कैलकोफ्लोर रंगाई पेश करेंगे जिसका उपयोग वर्गों का पता लगाने और इमेजिंग प्रक्रिया के साथ सहायता करने में मदद करने के लिए किया जाएगा। वही अन्य दाग के लिए सच है जिसे बाद में लागू किया जा सकता है। इसके अलावा अत्यधिक मोटाई छवि अधिग्रहण की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा। ऊतक विशेषताओं के आधार पर अनुभाग मोटाई के लिए एक अच्छा समझौता 200 और 700 एनएम के बीच पाया जा सकता है। अल्ट्रा-माइक्रोटॉम के नमूना धारक पर कसकर ब्लॉक माउंट करें।
    1. अल्ट्रा-माइक्रोटॉम के साथ, 200 और 700 एनएम(चित्रा 1G)के बीच मोटाई वाले अनुभाग बनाएं।
    2. एक ग्लास स्लाइड पर एक ddH2O ड्रॉप करने के लिए कुछ वर्गों को स्थानांतरित करके अनुभाग क्षेत्र की जांच करें । स्लाइड को 50 डिग्री सेल्सियस गर्म प्लेट पर तब तक रखें जब तक पानी वाष्पित न हो जाए। दाग 30 s के लिए वर्गों पर 1% बोरिक एसिड समाधान (w/v) में 1% Toluidine ब्लू ओ (w/v) की एक बूंद रखने । माइक्रोस्कोप के नीचे कुल्ला और निरीक्षण करें।
    3. वांछित संरचना खोजने पर, पहले एक साफ प्रतिक्रिया स्लाइड के प्रत्येक कुएं पर रखे गए डीडीएच2ओ की प्रत्येक बूंद में एक या दो अनुभाग स्थानांतरित करें।
    4. प्रत्येक स्लाइड को बंद साफ 10 सेमी स्क्वायर पेट्री डिश में रखें और इसे 50 डिग्री सेल्सियस पर सूखने दें।
    5. उपयोग होने तक एक साफ संग्रह बॉक्स में स्लाइड स्टोर करें।

4. इम्यूनोलोकलाइजेशन

नोट: फ्लोरोसेंट इम्यूनोलोकलाइजेशन प्रक्रिया दो एंटीबॉडी के अनुक्रमिक उपयोग पर निर्भर करती है। प्राथमिक एंटीबॉडी एक विशिष्ट लक्ष्य एंटीजन के खिलाफ उठाया जाता है। माध्यमिक एंटीबॉडी को विशेष रूप से प्राथमिक एंटीबॉडी के खिलाफ उठाया जाता है और फ्लोरोसेंट तकनीकों के लिए फ्लोरोफोर (इस विशिष्ट प्रोटोकॉल में फिटसी) के लिए संयुग्म किया जाता है। प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग नमूने में लक्ष्य एंटीजन का पता लगाने के लिए किया जाएगा, और माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग उस स्थान को चिह्नित करने के लिए किया जाएगा जहां प्राथमिक एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी की अधिकता को धोने के बाद नमूने से जुड़ा हुआ है। नियंत्रण इस परख का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं और हमेशा टिप्पणियों की सटीकता का बीमा करने के लिए किया जाना चाहिए। स्लाइड पर एक अच्छी तरह से एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए आरक्षित किया जाना चाहिए, जहां प्राथमिक एंटीबॉडी उपचार छोड़ दिया जाएगा, और इसलिए प्रयोग के अंत में कोई संकेत नहीं देखा जाना चाहिए । एक सकारात्मक नियंत्रण प्रयोग में एक एंटीबॉडी जो लेबलिंग पहले से ही जाना जाता है और कुछ के साथ एक अच्छी तरह से इलाज के द्वारा शामिल किया जाना चाहिए । सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग माध्यमिक एंटीबॉडी लेबलिंग प्रभावशीलता और प्रतिक्रिया स्थितियों की पुष्टि करने के लिए किया जाता है जबकि नकारात्मक नियंत्रण माध्यमिक एंटीबॉडी विशिष्टता का परीक्षण करता है।

  1. एक पिपेट टिप्स बॉक्स के नीचे कुछ विमंदित पेपर तौलिए रखकर और इसे टिन फॉयल(पूरक चित्रा 1B-1E)के साथ लपेटकर एक इनक्यूबेशन कक्ष तैयार करें। स्लाइड्स में इनक्यूबेशन चैंबर में रखें।
  2. पिपेट अवरुद्ध समाधान (1 एम पीबीएस में 5% नॉनफैट ड्राई मिल्क (डब्ल्यू/वी) और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट के प्रति 8 मिमी अच्छी तरह से 50 माइक्रोल ड्रॉप। अवरुद्ध समाधान निकालें और 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार सभी कुओं को धोएं।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें (समाधान को अवरुद्ध करने में पूरक तालिका 1),1:5 (v/v) एंटीबॉडी देखें; 8 मिमी अच्छी तरह से लगभग 40 माइक्रोल का अनुमान लगाएं।
    नोट: एंटीबॉडी की एकाग्रता निर्माण के प्रोटोकॉल के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए ।
  4. 5 मिनट के लिए डीडीएच2ओ के साथ अंतिम धोने का प्रदर्शन करें, कुओं को पूरी तरह से सूखने न दें।
  5. प्रतिक्रिया कुओं के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान पिपेट। पिपेट नियंत्रण कुओं के समाधान को अवरुद्ध करता है।
  6. इनक्यूबेशन कक्ष बंद करें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए खड़े हो जाओ और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के बाद । माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें, अवरुद्ध समाधान में 1% (v/v) के बारे में ४० μL प्रति अच्छी तरह से । इसे टिन फॉयल से ढककर रखें।
  7. 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार सभी कुओं को धोएं, इसके बाद डीडीएच2ओ के साथ 10 अतिरिक्त मिनट सुनिश्चित करें कि कुओं पर अवरुद्ध समाधान या जमा का कोई निशान दिखाई नहीं दे रहा है।
  8. सभी कुओं के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान पिपेट। अब से, प्रकाश से स्लाइड्स को सुरक्षित रखें।
  9. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 3-4 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  10. पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए दो बार सभी कुओं को धोएं और इसके बाद डीडीएच2ओ के साथ 10 मिनट का एक और धोना ।
  11. प्रत्येक कुएं में कैल्सोफलूर (1:10,000 (w/v) फ्लोरोसेंट उज्जवल 28) की एक बूंद लागू करें। धोने के बिना, प्रत्येक अच्छी तरह से बढ़ते माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें) की एक बूंद लागू करें और एक कवरलिप(चित्रा 1H) रखें।
  12. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ निरीक्षण करें, जो क्रमशः सेल वॉल और इम्यूनोलोकलाइजेशन(चित्र 1आई)का पता लगाने के लिए 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 और 100x/1.40 लेंस से लैस है, यूवी (कैलकोफ्लोर स्टेन के लिए) और फिटसी फिल्टर का उपयोग करें । निम्नलिखित तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें: यूवी के लिए उत्तेजन/उत्सर्जन (एनएम) 358/461 और फिटसी के लिए 485/530 ।
  13. परिणामों के बेहतर दृश्य के लिए इमेजजे या इसी तरह की दोनों छवियों को ओवरलैप करें।

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Representative Results

एक सफल प्रयोग में, माध्यमिक एंटीबॉडी विशेष रूप से उज्ज्वल हरे रंग में विशिष्ट एपिटोप के स्थान को एक सुसंगत तरीके से इंगित करेगा, जिससे कोशिका, ऊतक या अंग के एक निश्चित विकास चरण में सेल दीवार संरचना के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति मिलेगी। उदाहरण के लिए LM6 एंटीबॉडी में 1,5-अरबिन के लिए एक उच्च आत्मीयता है, जो टाइप-I राइनोगैक्टुरोआन के साथ एक यौगिक है जिसे विकासशील क्वेरकस सबर एंथर(चित्रा 2 ए)की सेल दीवार को बहुतायत से लेबल करते हुए पाया जा सकता है, इस प्रकार यह निष्कर्ष निकालने की अनुमति देता है कि इस प्रकार का पेक्टिन प्रचुर मात्रा में है और प्राथमिक सेल दीवार संरचना का हिस्सा है। JIM5 में होगोगलैक्टुरोन के लिए आत्मीयता है जो शायद ही एस्टरिफाइड होते हैं जो आमतौर पर क्वेरकस सबर भ्रूण के मूल सिरे पर पाए जाते हैं, जो अंग के यांत्रिक गुणों को निर्दिष्ट करते हैं(चित्रा 2B)। जाइलोलॉजिकलेक्टुरोन एक प्रकार का पेक्टिन होता है जो कोशिका की दीवार ढीला से जुड़े जाइलोस से समृद्ध होता है, वे विकृत कोशिकाओं में पाए जाते हैं। एंटीबॉडी एलएम 8 विशेष रूप से xylogalacturonans को पहचानता है, परिपक्व अंगों में इसका उपयोग क्वेरकस सबर एकोर्न परिपक्वता(चित्रा 2 सी)के अंतिम चरणों के दौरान एंडोस्पर्म कोशिकाओं की तरह अपक्षय कोशिकाओं या ऊतकों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

JIM13 में प्रजनन से संबंधित संरचनाओं, अरबीडोप्सिस थैलियाना (चित्रा 2डी)में माइक्रोगेमेटोजेनेसिस से संबंधित सेल लाइनों से संबंधित संरचनाओं पर पाए जाने वाले एजीपी के लिए आत्मीयता है। JIM8 कोशिकाओं और प्रजनन से संबंधित अंगों जैसे बालाल एंजियोस्पर्म त्रिथुरिया सबमर्सा (चित्रा 2ई-2F)के कलंकित पैपिले और माइक्रोपाइल जैसे प्रजनन से संबंधित एजीपी के एपिटोप्स को भी पहचानता है। दोनों एंटीबॉडी कोपौधोंमें गेमोफाइटिक सेल लाइनों के लिए आणविक मार्कर होने का सुझाव दिया गया है ।

इस प्रोटोकॉल के लिए आम गलतियों का पता लगाने और पहचान करने के लिए आम तौर पर आसान कर रहे हैं । जब वॉश को छोड़ दिया जाता है या प्रतिक्रिया कुओं को सूखने दिया जाता है, तो माध्यमिक एंटीबॉडी आमतौर पर कोशिकाओं, ऊतकों, राल और स्लाइड(चित्रा 3A)पर अंधाधुंध कवर करने वाले एक अविशिष्ट धब्बा के रूप में दिखाई देगा। यदि असीम प्राथमिक एंटीबॉडी को ठीक से नहीं धोया गया है(चित्रा 3B)हरे फ्लोरोक्रोम के समुच्चय होंगे। इस तकनीक की विफलता के लिए एक और आम कारण तह और/या वर्गों की टुकड़ी(चित्रा 3C)के साथ संबंधित है, प्रयोग बेकार प्रतिपादन । यह समस्या आमतौर पर स्लाइड करने के लिए वर्गों के या तो गरीब आसंजन के साथ संबंधित है, शायद अशुद्ध स्लाइड के उपयोग के कारण, और/

नमूना तैयार करना भी इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। सौभाग्य से, सबसे आम फिक्स्ड और एम्बेडिंग मुद्दे(चित्र 3 डी)को स्पॉट करना आसान है। यदि सब कुछ ठीक हो जाता है तो राल ब्लॉक दरारों से मुक्त हो जाएगा और नमूना हल्के भूरे रंग के रंग(चित्रा 3डी-1)के साथ एक पीला पीला रंग के साथ स्पष्ट रूप से दिखाई देगा। अकुशल एम्बेडेड नमूनों में पाउडर सफेद धब्बे या क्षेत्र(चित्रा 3डी-2)दिखाई देंगे। नमूना आकार को 8 मिमी के नीचे रखना फिक्सेटिव समाधान के प्रवेश की गारंटी देने के लिए महत्वपूर्ण है। जब नमूने खराब हो जाते हैं, तो वे गहरे भूरे रंग के लगभग काले(चित्रा 3डी-3)दिखाई देंगे। इसके अलावा पॉलीमराइजेशन का तापमान एपिटोप के संरक्षण और राल के उचित सख्त होने दोनों के लिए महत्वपूर्ण है। एक अत्यधिक तापमान राल को नमूना की धारा को असंभव(चित्रा 3 डी-4)बनाने के लिए क्रैक कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1. पूर्ण प्रोटोकॉल का अवलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पौधों के नमूनों में एजीपी और पेक्टिन इम्यूनोलोकलाइजेशन के विशिष्ट परिणाम। (A)जिम5 द्वाराक्वेरकस सबर भ्रूण रूट टिप में कम मिथाइल-एस्टेरिफाइड पेक्टिन की विशिष्ट लेबलिंग में क्वेरकस सबर एंथर एंथर में पेक्टिन की अरबिन मोदित्य की एलएम6 लेबलिंग । (ग) क्वेरकस सबर परिपक्व बलूत का फल के घटते एंडोस्पर्म में एलएम8 द्वारा लेबल किए गए जाइलोजालैक्टुरोआन। (घ)एक अरबीडोप्सिस थैलियाना एंथर के टेपटम और टेट्राड में एजीपी की JIM13 लेबलिंग । (ई) एजुरिया सबमर्सा के कलंकित पैपिली में JIM8 द्वारा लेबल किया गया एजीपी।(एफ)JIM8 लेबलिंग एजीपी एक त्रिथुरिया सबमर्सा ओव्यूल के माइक्रोपायल (सफेद तीर) पर । मेयोटिक माइक्रोस्पोर (एमसी), टेप्टम (टीपी), रूट (आर), रूट टिप (आरटी), टेस्टा (टीएस), एंडोस्पर्म (एड), भ्रूण (Em), एपिडर्मिस (Ep), कलंकित पैपिली (एसपी), ओवुले (OV) । स्केल बार: 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रोटोकॉल के दौरान आम गलतियों और समस्याओं। (क)धोने के चरणों की विफलता की पहचान नमूना राल के ऊपर माध्यमिक एंटीबॉडी के अविशिष्ट धब्बा(+)की उपस्थिति से की जाती है । (ख)प्राथमिक एंटीबॉडी की खराब विशिष्टता या धोने की विफलता के परिणामस्वरूप फिटसी समुच्चय (+) किसी विशिष्ट स्थान के गठन में बंधुआ नहीं होता है । (ग)सिलवटों और अनुभाग टुकड़ी अक्सर आक्रामक धोने और अशुद्ध स्लाइड का परिणाम हैं । (घ)नमूना निर्धारण और एम्बेडिंग के उदाहरण; (1) सही नमूना आकार और एम्बेडिंग, (2) एम्बेडिंग विफलता, (3) नमूना निर्धारण विफलता, (4) राल सख्त विफलता। फिटसी ने एंटीबॉडी (ग्रीन) और कैल्सोफलूर-सफेद दाग (नीला) लेबल किया। स्केल बार: 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1. (ए)अल्ट्रामाइक्रोटोम के साथ सेक्शनिंग के लिए नमूना (येलो ब्लॉक) तैयार करने के लिए ब्लॉक ट्रिमिंग सीक्वेंस का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। सबसे पहले, जिलेटिन कैप्सूल (1) को हटा दिया जाता है। फिर उन्हें पहले कैप्सूल के पक्षों में 40 डिग्री से 45 डिग्री कोण पर नमूना (2) के लिए छंटनी की जाती है, एक दूसरी कटौती पहले (3) के 90 डिग्री पर की जाती है और उसके बाद एक तिहाई (4) और चौथे एक ही नियम (5) का पालन किया जाता है। ट्रिमिंग के इस पहले चरण से एक पिरामिड आकार की संरचना होती है जो शिखर सम्मेलन नमूने के ऊपर स्थित है। अंत में, एक तेज ब्लेड के साथ शिखर सम्मेलन को एम्बेडेड नमूने तक पहुंचने के लिए राल ब्लॉक प्रमुख धुरी के लिए लंबवत रूप से मुंडा जाता है। प्रक्रिया (6) के अंत में एक वर्ग या ट्रैपेज़ाइड सतह प्राप्त की जानी चाहिए। (ख)एक इनक्यूबेशन चैंबर बनाने के लिए आवश्यक आपूर्ति; टिन पन्नी (1), डबल तरफा डक्ट टेप (2), पेपर टॉवेल (3) और एक पिपेट टिप बॉक्स। (ग)पहला कदम, टिन पन्नी दो तरफा डक्ट टेप के साथ बॉक्स के लिए तय की है । (घ)दूसरा कदम, पिपेट टिप्स होल्डर को बॉक्स के नीचे पेपर टॉवेल रखने के लिए हटा दिया जाता है । (ई)तीसरा कदम, कागज तौलिए पानी के साथ नम कर रहे है और पिपेट युक्तियां धारक वापस अधिनियम के लिए रखा जाता है स्लाइड के लिए एक ट्रे है । इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: उपयोगी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की सूची। उपरोक्त तालिका उपलब्ध एंटीबॉडी के एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करती है, जिसमें उनके लक्ष्यों के बारे में जानकारी होती है और उन्हें कहां खरीदा जा सकता है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां पौधों में फ्लोरोसेंट इम्यूनोलोकलाइजेशन विधि का वर्णन किया गया है, जबकि मूल रूप से सीधा, कई छोटे चरणों की सफलता पर निर्भर करता है। जिनमें से पहला नमूना तैयार करना और निर्धारण है। इस पहले चरण के दौरान, सेल घटकों के बहुमत को क्रॉसलिंक करने के लिए फॉर्मेल्डिहाइड और ग्लूटाराल्डिहाइड के मिश्रण का उपयोग किया जाता है। समाधान में फॉर्मलडिहाइड एक हल्के और रिवर्सिबल फिक्सेशन प्रदान करता है जबकि ग्लूटाराल्डिहाइड एक मजबूत अधिक स्थायी लिंकेज प्रदान करता है; दो फिक्सेटिव्स के बीच संतुलन क्रॉसलिंकिंग की उचित मात्रा प्रदान करता है, एपिटोप के एक्सपोजर प्राथमिक एंटीबॉडी10के साथ प्रतिक्रिया करने की अनुमति . ठीक से काम करने के लिए फिक्सेटिव समाधान के लिए, नमूना छोटा होना चाहिए। व्यास में 7 मिमी से अधिक बड़ी संरचनाएं ठीक करना बहुत मुश्किल है और फिक्सेटिव प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए काटा जाना चाहिए।

घायल होने या तनाव के बाद, कुछ पौधे बड़ी मात्रा में टैनिन को स्रावित करते हैं जो अंधेरे उपजी बनाते हैं जो फिक्स्डेटिव प्रक्रिया में हस्तक्षेप करने वाले फॉर्मलडिहाइड के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं। बर्फ पर नमूनों को रखने और जब भी यह बादल हो जाता है फिक्सेटिव समाधान की जगह इस प्रभाव को कम करने में मदद करता है । वायु भी सुधारात्मक प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकती है और बाद में राल के एम्बेडिंग और सख्त में। प्रस्तावित वैक्यूम उपचार हवा के अधिकांश हटा देना चाहिए। विशेष रूप से हवादार ऊतकों के लिए, वैक्यूम कदम को 2 घंटे से आगे बढ़ाया जा सकता है, जब तक कि कोई और हवा नमूनों से बाहर नहीं आती है और वे नीचे तक डूब जाते हैं। रात भर फिक्सेटिव स्टेप के बाद तैरते पाए गए किसी भी नमूने को छोड़ दिया जाना चाहिए। राल एम्बेडिंग संरक्षित नमूने को काटने के लिए समर्थन प्रदान करता है, और इसकी कठोरता एम्बेडेड ऊतकों10से अनुमानित होनी चाहिए। एलआर-व्हाइट तीन कठोरता ग्रेड में आता है: वुडी भारी स्क्लेरिफाइड ऊतकों के लिए मुश्किल, पत्तियों से पराग कणों तक ऊतकों के विशाल बहुमत के लिए मध्यम ग्रेड, और अधिक नाजुक ऊतकों के लिए नरम ग्रेड। एक परिपूर्ण एम्बेडिंग के लिए, राल को पूरी तरह से नमूने में प्रवेश करना होगा; यह एक धीमी और क्रमिक घुसपैठ के साथ बेहतर प्राप्त किया जाता है। पूर्व परीक्षण के साथ, कम इनक्यूबेशन अवधि का उपयोग किया जा सकता है। जिलेटिन कैप्सूल छोटे और हर्मेटिकली सील करने योग्य दोनों होते हैं, जो उन्हें एलआर-व्हाइट राल के इलाज के लिए एकदम सही बनाता है। आकार 2 (0.37 एमएल) के लिए, इलाज 24 घंटे के बाद 58 डिग्री सेल्सियस पर पूरा होना चाहिए। अन्य कैप्सूल आकारों के लिए, इलाज के समय को समायोजित किया जाना चाहिए। एलआर-व्हाइट ठीक राल को लगभग बेरंग से हल्के सुनहरे/एंबर कलर में जाना चाहिए और नाखूनों के लिए मुश्किल महसूस करना चाहिए । नमूना ट्रिमिंग और अल्ट्रा माइक्रोटोम के उपयोग के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है लेकिन स्पष्ट आंकड़े पेश करेंगे। सेक्शन की मोटाई और आकार इमेजिंग और इम्यूनोलोकलाइजेशन परख के लिए महत्वपूर्ण है। खंड की मोटाई 500 एनएम के आसपास रखी जानी चाहिए। जो वर्ग बहुत पतले हैं, उनके परिणामस्वरूप खराब धुंधला हो जाएगा और 700 एनएम से अधिक खंड मोटाई छवि अधिग्रहण और संकल्प में हस्तक्षेप करेगी। एलआर-व्हाइट राल की हाइड्रोफिलिक प्रकृति राल को हटाने के बिना धुंधला और इम्यूनोलोकेलाइजेशन में वर्गों के प्रत्यक्ष उपयोग के लिए अनुमति देती है।

अवरुद्ध समाधान (1 एम पीबीएस में 5% नॉनफैट ड्राई मिल्क) एंटीबॉडी के अविशिष्ट बाध्यकारी को कम करता है। नॉनफैट सूखा दूध बीएसए या अन्य अधिक पारंपरिक अवरुद्ध एजेंटों के लिए एक विश्वसनीय विकल्प रहा है, और काफी कम महंगा है। अवरुद्ध समाधान का उपयोग करने से पहले एक कागज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाना चाहिए, इससे बचने के लिए कि दूर समुच्चय धोने के लिए मुश्किल फार्म, एंटीबॉडी बनाए रखने, और प्रयोग समझौता । प्रस्तावित एंटीबॉडी अनुपात और इनक्यूबेशन समय को अनुकूलित किया गया है और कई अध्ययनों में विविध प्रजातियों पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है9,11,12,13,14,15,16.

वाष्पीकरण और प्रकाश के लिए प्रदर्शनी दो मुद्दे हैं जिन्हें इम्यूनोलोकलाइजेशन प्रक्रिया के दौरान टाला जाना चाहिए। एक आर्द्र और अंधेरा इनक्यूबेशन कक्ष इन दोनों समस्याओं को हल करता है। कैसे एक अंधेरे कक्ष बनाने के लिए पर एक ट्यूटोरियल पूरक चित्रा 1B-1Eमें पाया जा सकता है । यह इम्यूनोलोकलाइजेशन प्रोटोकॉल अपने स्वयं के लेबल के साथ लक्षित एपिटोप को निर्देशित प्राथमिक एंटीबॉडी के उपयोग के लिए कहता है, और प्राथमिक एंटीबॉडी आईजीजी के खिलाफ उठाए गए फ्लोरोक्रोम (एफटीसी) के लिए एक माध्यमिक एंटीबॉडी का संयुग्म किया जाता है। यह विधि पता लगाने की बढ़ी हुई स्ट्रिंग के कारण एकल एंटीबॉडी डिटेक्शन सिस्टम के उपयोग पर कई फायदे प्रदान करती है, क्योंकि माध्यमिक एंटीबॉडी में लक्ष्य नमूना प्रजातियों के लिए कोई लगाव नहीं है। यह प्रणाली वृद्धि का संकेत प्रदान करती है क्योंकि प्राथमिक एंटीबॉडी अणुओं को माध्यमिक एंटीबॉडी के कई अणुओं द्वारा लक्षित किया जा सकता है, प्रत्येक फ्लोरोक्रोम17ले जाता है।

तीव्र प्रकाश, या फोटो ब्लीचिंग द्वारा फ्लोरोक्रोम का क्षय, इस तकनीक में एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। विशेष रूप से जब बेहोश स्थानीय संकेतों के लिए खोज, संकेत अपरिवर्तनीय इमेजिंग से पहले खो सकता है । बढ़ते माध्यम से फ्लोरोक्रोम18की स्थिरता और उम्र बहुत बढ़ जाती है . हालांकि, बढ़ते मीडिया का परीक्षण करना अत्यधिक उचित है, क्योंकि कुछ दाग और/या फ्लोरोक्रोम के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं, जो छवि को तेज़ और धुंधला करते हैं । इम्यूनोलोकलाइजेशन को देखने और पंजीकृत करने के लिए उपयोग की जाने वाली ऑप्टिकल प्रणाली का विन्यास इस प्रयोग की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक है। वर्गों की कम मोटाई के कारण, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लाभ सीमित हैं। सबसे सफल सेटअप के लिए पर्याप्त फ्लोरेसेंस ग्रेड उद्देश्यों के साथ फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत, एलईडी या पारा प्रकाश बल्ब19से लैस एक पारंपरिक ईमानदार एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। इसके अलावा यूवी के लिए एक्सटिटेशन/एमिशन (एनएम) 358/461 और फिटसी के लिए 485/530 के लिए अच्छी क्वालिटी के लाइट फिल्टर्स सेट करने की जरूरत है । फ्लोरेसेंस छवि अधिग्रहण के लिए, उनकी उच्च गति और संवेदनशीलता के कारण प्रशीतित मोनोक्रोमेटिक डिजिटल कैमरों की सिफारिश की जाती है, लेकिन सही रंग की जानकारी20का बलिदान करते हैं। पॉलीक्रोमेटिक कैमरे पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस से आसानी से संकेत को सुलझाने की क्षमता प्रदान करते हैं लेकिन उनके मोनोक्रोमेटिक समकक्षों की तुलना में धीमे और बहुत कम संवेदनशील होते हैं।

विधि विशिष्ट एंटीबॉडी की उपलब्धता से सीमित है। पौधों के एपिटोप्स के उद्देश्य से एंटीबॉडी के विशाल और विस्तार संग्रह की उपलब्धता के बावजूद, जाहिर है कि सभी पौधों के यौगिकों को अभी तक कवर नहीं किया गया है। इसके अलावा लिपिड वर्णित एम्बेडिंग विधि द्वारा निकाले जाते हैं, और इसलिए उच्च तेल सामग्री वाले ऊतकों के लिए अनुशंसित नहीं है। इमेज रिजॉल्यूशन का त्याग करने के बावजूद क्रायोस्टेट सेक्शन एक विकल्प हो सकता है। एलआर-व्हाइट राल बहुलकीकरण का तापमान कुछ मामलों में अधिक संवेदनशील एपिटोप्स को बदल सकता है। यदि लक्ष्य एपिटोप तापमान संवेदनशील है, तो एलआर-गोल्ड राल के लिए एलआर-व्हाइट स्विच करें। सफेद प्रकाश के तहत -25 डिग्री सेल्सियस पर बहुलक, एलआर-गोल्ड थर्मोसेंसिटिव एपिटोप का एक उत्कृष्ट संरक्षण प्रदान करता है, लेकिन एक विशेष बहुलक उपकरण के अधिग्रहण की आवश्यकता होगी और थोड़ा अधिक विषाक्त तो एलआर-व्हाइट है।

इस विधि का उपयोग प्रजातियों और ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला में किया गया है। यह विशिष्ट एपिटोप वितरण पर विश्वसनीय जानकारी तक तेजी से पहुंच की अनुमति देता है। विकासवादी मॉडल के लिए सहायक डेटा की पेशकश करना और नेत्रहीन मोहक परिणाम प्रदान करते हुए कोशिकाओं और ऊतकों में मार्कर और विशिष्ट अनुकूलन की पहचान करना। पेरोक्सिडेज या क्षारीय फॉस्फेटेस कंजूगेशन विकल्प10पर फ्लोरोक्रोम के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग, कम समय लेने वाला है, अतिप्रतिक्रिया कलाकृतियों के लिए काफी कम प्रवण है और किसी भी अन्य तकनीक के साथ मैच करने के लिए एक स्पष्ट उपकोशिकीय संकल्प प्रदान करता है। सेल वॉल से संबंधित पॉलिमर के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग यौगिकों की व्यवस्था में बहुत प्रतिबंधित डोमेन में अंतर्दृष्टि की अनुमति देता है। इस तरह के संकल्प पारंपरिक जैव रासायनिक उपकरणों से प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण होगा । प्राथमिक एंटीबॉडी उपलब्ध का कभी विस्तार सेट संयंत्र सेल आंतरिक कामकाज में लगातार नई खोज के अवसर प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

लेखकों को एच2020-एमएससीए-राइज-2015 और सीडव्हील्स एफसीटी पीटीडीसी/बीआईए-एफबीटी/27839/2017 द्वारा वित्तपोषित यूरोपीय संघ परियोजना 690946 'सेक्ससीड' (सेक्सुअल प्लांट रिप्रोडक्शन - सीड फॉर्मेशन) से समर्थन प्राप्त हुआ। एएमपी को यूरोपियन यूनियन की एमएससीए-आईएफए-2016 परियोजना (नंबर 753328) से अनुदान मिला था। एमसी को एफसीटी पीएचडी ग्रांट एसएफआरएच/बीडी/111781/2015 से ग्रांट मिली।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25% (w/v) Gluteraldehyde Agar Scientific AGR1010 aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides Marinfeld MARI1216750 other brands may be used
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT Sigma-Aldrich F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm Marinfeld MARI0100222 The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used 
ddH2O na na
Absolute ethanol na na
Fluorescent brightner 28 Sigma-Aldrich F-6259
Gelatin capsules Agar scientific AGG29211 The capsule size should fit the size of the sample.
Glass vials na na Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused. 
LR-white medium grade, embdeding resin Agar Scientific AGR1281 LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin.
Non fat dry milk Nestlé na any non fat dry milk is adequate
Oven na na generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square na na
PIPES Sigma Aldrich P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body Plant probes na Several antibodies that recognize cell wall components are
available at both the Complex Carbohydrate research center
(CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul
Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of
some commonly used MABS and where they can be purchased
is presented in Supplemental Table 1
Razor blades na na regular razor blades
SDS Sigma-Aldrich L6026
Toluidine Blue-O Agar Scientific AGR1727
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Ultramicrotome Leica Microsystems UC7
Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters Leica Mycrosistems DMLb
Vacuum chamber na na
Vacuum pump na na
Vectashield vecta Labs T-1000 Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 168 अरबिनोगालेक्टन प्रोटीन सेल की दीवारें फ्लोरोसेंट इम्यूनोलोकलाइजेशन हिस्टोलॉजी इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री एलआर-व्हाइट राल एम्बेडिंग पेक्टिन प्लांट सेल प्लांट टिश्यू
संयंत्र ऊतकों की सेल दीवार में अरबिनोगालेक्टन प्रोटीन और पेक्टिन का फ्लोरोसेंट इम्यूनोलोकलाइजेशन
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Costa, M., Pereira, A. M., Coimbra,… More

Costa, M., Pereira, A. M., Coimbra, S. Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues. J. Vis. Exp. (168), e61034, doi:10.3791/61034 (2021).

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