Summary
Bu protokol, Arabinogalactan proteinlerinin ve pektinlerinin immünolokalizasyonu için bitki materyalinin hidrofilik akrilik reçineye gömülü, bölümlenmiş ve cam slaytlara monte edilmiş nasıl sabitlendiğini ayrıntılı olarak açıklar. Hücre duvarı ile ilgili epitopların spesifik antikorlarla tespit edileceğini gösteriyoruz.
Abstract
Bitki gelişimi, hem iç hem de dış uyaranlara yanıt olarak hücre duvarı bileşiminin ve yapısının sürekli olarak ayarlanmasını içerir. Hücre duvarları proteinler, fenolik bileşikler ve su ile birlikte selüloz ve selülozik olmayan polisakkaritlerden oluşur. Hücre duvarının %90'ı polisakkaritler (örneğin pektinler) ve arabinogalactan proteinlerinden (AGP) oluşur. Bitki histolojik bölümlerindeki spesifik glikan epitoplarının floresan immünolocalizasyonu, duvar polisakkarit ağlarının, yapısının ve bileşenlerinin yeniden şekillendirilmesini ortaya çıkarmak için önemli bir araç olmaya devam etmektedir.
Burada, bitki dokularındaki AGP'lerden ve pektinlerden glikan epitopları tespit etmek için optimize edilmiş bir floresan immünolocalizasyon prosedürü rapor ediyoruz. Paraformaldehit/glutaraldehit fiksasyonu, bitki örneklerinin LR-White gömülmesi ile birlikte kullanıldı ve doku yapısının ve bileşiminin daha iyi korunmasını sağladı. Ultra mikrotom ile elde edilen gömülü örneklerin ince bölümleri spesifik antikorlarla immünokokalizasyon için kullanılmıştır. Bu teknik büyük çözünürlük, yüksek özgüllük ve aynı örnekte birden fazla glikan epitop tespit etme şansı sunar. Bu teknik glikanların hücre altı lokalizasyonunu sağlar ve hücre duvarındaki birikim düzeylerini algılar. Ayrıca gelişimsel süreçler sırasında AGP ve pektin dağılımının mekansal-zamansal paternlerinin belirlenmesine izin sağlar. Bu aracın kullanımı sonuçta araştırma yönlerine rehberlik edebilir ve glikanları bitkilerdeki belirli işlevlere bağlayabilir. Ayrıca elde edilen bilgiler biyokimyasal ve gen ekspresyon çalışmalarını tamamlayabilir.
Introduction
Bitki hücre duvarları polisakkaritler ve glikoproteinlerden oluşan karmaşık yapılardır. Hücre duvarları, mimarisi, organizasyonu ve bileşimi hücre tipine, lokalizasyona, gelişim aşamasına, dış ve iç uyaranlara göre değişen son derece dinamik yapılardır1. Arabinogalactan proteinleri (AGP'ler) ve pektinler bitki hücre duvarının önemli bileşenleridir. AGP'ler oldukça glikosillenmiş proteinlerdir ve pektinler, farklı bitki gelişim aşamalarında bileşimi, miktarı ve yapısı büyük ölçüde değişen homogalacturonan polisakkaritlerdir2,3,4. AGP'ler ve pektin çalışmaları, programlanmış hücre ölümü,biyotik streslere yanıt, cinsel bitki üremesi gibi çeşitli bitki süreçlerinde rollerini ortaya koydu5. Bu çalışmaların çoğu immünolokalizasyon çalışmalarından elde edilen bilgilerle başlamıştır.
Karmaşıklığı göz önüne alındığında, hücre duvarlarının incelenmesi birçok farklı araç gerektirir. Glikan epitoplarının monoklonal antikorlar (mAbs) kullanılarak saptanması, bu yapı boyunca polisakkarit ve glikoprotein dağılımını çözmek için değerli bir yaklaşımdır. Glikan epitoplarını tespit etmek için geniş bir mAb koleksiyonu vardır ve her mAb'nin özgüllüğü sürekli olarak iyileştirilmektedir6. Burada açıklanan teknik tüm bitki türleri için geçerlidir ve daha pahalı ve karmaşık teknikler içerebilecek gelecekteki araştırma yönlerine rehberlik etmek için mükemmel bir araçtır.
Bu teknikte spesifik antikorlar FITC (floresan izotiyosiyanat), TRITC (tetrametrinhodamin-5-(ve 6)-izotiyosiyanat) veya birkaç Alexa Fluor boyası gibi floresan boyalara kimyasal olarak konjuge edilir. İmmünoresans, floresan mikroskobu altında doğrudan gözlemlenebilen glikanların net ve hızlı bir hücre altı lokalizasyonuna izin veren çeşitli avantajlar sunar. Son derece spesifik ve hassastır, çünkü numunenin hazırlanması, daha düşük miktarlarda mevcut olsa bile antijenin doğal yapısını etkili bir şekilde koruyabilir. Aynı örnekte ve en önemlisi birden fazla antijenin tespit edilmesine izin verir, yüksek kaliteli ve görsel olarak güzel sonuçlar sunar. Floresan immünolocalizasyon çalışmalarının sunduğu büyük güce rağmen, genellikle prosedürün farklı adımlarının görselleştirilmesine izin eden ayrıntılı protokollerin olmaması nedeniyle yapılması ve uygulanması zor olarak kabul edilirler. Burada, bu tekniğin nasıl gerçekleştirilacağı ve yüksek kaliteli görüntülerin nasıl eldeılacağı hakkında bazı basit yönergeler sunuyoruz.
Burada sunulan protokol için, örneklerin öncelikle en uygun sabitleyici kullanılarak sabitlenilmesi ve gömülmesi gerekir. Zaman alıcı ve nispeten sıkıcı bir teknik olarak düşünülse de, bitki örneğinin uygun şekilde sabitlenmesi ve gömülmesi, başarılı bir immünolocalizasyon tahlilini sağlamanın anahtarıdır. Bu amaçla, en olağan olanı aldehitler gibi çapraz bağlama fiksatifleri kullanılarak kimyasal fiksasyondur. Çapraz bağlama fiksatifleri, doku molekülleri arasında kimyasal bağlar kurarak numuneyi stabilize eder ve sertleşir. Formaldehit ve glutaraldehit, fiksatifleri çapraz bağlar ve bazen her iki fiksatifin bir karışımı kullanılır7. Formaldehit, dokuların ve uzun sürelerin büyük yapısal korunmasını, küçük doku geri çekilmeleri üretilmesini ve immünostaining ile uyumlu olmasını sunar. Glutaraldehit, genellikle formaldehit ile birlikte kullanılan daha güçlü ve kararlı bir fiksatiftir. Glutaraldehit kullanımı, bazı serbest aldehit gruplarını sabit dokuya soktuğu için dikkate alınması gereken bazı dezavantajlara sahiptir, bu da bazı belirsiz etiketlemeler oluşturabilir. Ayrıca proteinler ve diğer moleküller arasındaki çapraz bağlantı bazen bazı hedef epitopları antikorlar için erişilemez hale getirebilir. Bunu önlemek için, fiksasyonun miktarı ve süresi dikkatlice tanımlanmalıdır.
Sabitlemeden sonra, numuneler bölümleri elde etmeden önce sertleştirmek için uygun reçineye gömülür. Londra Reçinesi (LR-White) akrilik reçine, immünolokalizasyon çalışmaları için tercih edilmesi olan reçinedir. Diğer reçinelerin aksine, LR-White hidrofiliktir ve antikorların antijenlerine ulaşmasını sağlar ve bunu kolaylaştırmak için herhangi bir tedaviye gerek yoktur. LR-White ayrıca düşük otomatik floresan sunma avantajına sahiptir ve immünoresans görüntülemesi sırasında arka plan gürültüsünde bir azalma sağlar.
Alcian mavisi boyama, toluidin mavisi boyama veya Periyodik asit-Schiff (PAS) lekeleme gibi hücre duvarının farklı bileşenlerini tespit etmek için birçok boyama tekniği mevcuttur. Bunların hiçbiri immünolokalizasyon analizlerinin gücünü sunmaz8. Bu yaklaşım glikanların tespitinde daha fazla özgüllük sağlar ve hücre duvarı bileşimi ve yapısı hakkında daha geniş bilgiler sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Örnek Hazırlama: fiksasyon, dehidrasyon ve LR-White gömme
- Fiksasyon ve dehidrasyon
NOT: Sabitleme işlemi örneği korumak için kritik öneme sahiptir; molekülleri çapraz bağlayarak hücresel metabolizma durdurulur, hücresel bütünlük sağlanır ve moleküler difüzyonu önler. Fiksatif ajanlar ve kullanılan konsantrasyon bu amaca göre ayarlanmalıdır ve antijenler antikorlarla etkileşime girmeye yeterince maruz kalmalıdır. Aşağıdaki protokol, paraformaldehitin hafif fiksatif yeteneğini glutaraldehitin daha güçlü etkisiyle birleştirir. Oranları AGP'ler ve hücre duvarı bileşenleri için optimize edilmiştir, ancak diğer proteinler ve hücre yapıları için uygundur. Sonraki dehidrasyon işlemi, numuneleri LR-White gömme için hazırlayacaktır. Bu deneyde birkaç bitki türünden bitki dokuları kullanılmıştır. Tarlada yetişen ağaçlardan Quercus suber örnekleri toplandı. Trithuria submersa örnekleri Paula Rudall (Kew Gardens, Londra, İngiltere) tarafından bizimle paylaşıldı.- Tüm Arabidopsis bitkilerini doğrudan toprağa ekin ve % 60 bağıl neme ve 21 ° C'de 16 saat ışık ve 18 ° C'de 8 saat karanlık olan bir iç mekan büyüme tesisinde yetişin. Analiz edilecek bitki dokularını seçin ve örnekleri en fazla 16 mm2 boyutunda olacak şekilde kırpın.
- Numuneyi hemen, numuneleri tamamen batırmak için daha önce yeterli soğuk fiksatif çözelti (%2 formaldehit (w/v), %2,5 glutaraldehit (w/v), 25 mM PIPES pH 7 ve %0,001 Ara-20 (v/v)) ile doldurulmuş bir cam şişeye aktarın (Şekil 1A).
DİkKAT: Formaldehit ve glutaraldehit hem soluma hem de temas yoluyla zararlı olabilecek fiksatif ajanlardır. Bir duman davlumbazında sabitleme adımını gerçekleştirin ve yeterli koruyucu giysiler ve nitril eldivenler giyin. Bu adımdan itibaren alkol serileri de dahil olmak üzere% 70'e kadar tüm çözümler, uzman personel tarafından daha sonra arındırılma için saklanmalıdır. - Tüm örnekleri topladıktan sonra, düzelticiyi yenileyin.
- Şişeleri bir vakum odasına aktarın ve yavaşça vakum uygulayın. -60 kPa'ya ulaştıktan sonra, yüzen malzeme şişenin dibine batmaya başlayacaktır (Şekil 1B).
- Oda sıcaklığında 2 saat boyunca -80 kPa'dan fazla olmayan bir vakum altında tutun.
- Vakumyu yavaşça bırakın, cam şişeyi kapatın ve gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin.
- Gece fiksasyonu sırasında batmayan örnekleri atın. Kalan numuneleri 25 mM PBS pH 7 ile 10 dakika yıkayın, ardından 25 mM PIPES tampon pH 7.2'de 20 dk yıkama.
- Numuneleri bir etanol serisinde (%25, %35, %50, %70, %80, %90 ve %3x %100 etanol) her biri 20 dakika susuz bırakır. Susuz kalmış numuneleri gömmek için etiketli cam şişelere hemen aktarın (Şekil 1C).
NOT: Dehidrasyon işlemi % 70 etanol adımında duraklatılabilir.
- LR-Beyaz reçine gömme
NOT: LR-beyaz, düşük viskoziteye sahip hidrofobik olmayan akrilik bir reçinedir, bu da onu birçok kalın hücre duvarı katmanına sahip dokulara nüfuz etmek için ideal hale getirir. LR-White ayrıca çoğu bitki örneğini kesmek için uyumlu çeşitli sertlik sınıflarında gelir. Lütfen kullanılmış reçinenin zaten uygun katalizörle birlikte sağlandığından emin olun veya reçineyi hazırlamak için tedarikçi talimatlarını izleyin. Aşağıdaki katıştırma işlemi yavaştır, ancak sonuçlar araçları büyük ölçüde haklı çıkarır.- Numuneleri, LR-White reçinesi ile bir dizi hilal reçine konsantrasyonunda (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) etanolde kuluçkaya yatırarak, her adımda 4 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırarak örnekleri etkisiz haline getirir.
DİkKAT: LR-Beyaz reçine düşük toksisiteli akrilik reçinedir; ancak temas ve teneffüs ile cilt için tahriş edici olabilir. uygun koruyucu aşınma ve nitril eldivenlerle iyi havalandırılmış bir alanda veya duman kaputunun altında çalışmanız şiddetle tavsiye edilir. - LR-beyaz reçineyi yenileyin ve 4 °C'de 12 saat daha kuluçkaya yaslanın.
- 3 mm'ye kadar numuneler için uygun boyutta gömme jelatin kapsülleri (boyut 1 (0,5 mL), 5 mm'ye kadar numuneler için 2 x 0,37 mL veya 8 mm'ye kadar numuneler için 3 x 0,3 mL ve kağıt etiketler(Şekil 1D) hazırlayın.
NOT: Numunenin reçineye tamamen kapatılabilmesi için kapsül boyutunu numuneden biraz daha büyük olacak şekilde seçin. Ayrıca, etiketleri bir kalemle etiketlemeyi unutmayın, çünkü kalem veya basılı mürekkepler reçineyi kirleterek numuneyi mahveder. - Her kapsülün altına bir damla taze LR-beyaz reçine uygulayın.
- Her jelatin kapsülüne bir örnek yerleştirin ve taze reçine ile maksimum kapasiteye doldurun. Kapsül kapağını yerleştirin ve hermetik bir conta oluşturmak için hafifçe bastırın (Şekil 1E).
- Reçineyi 58 °C'de 24 ila 48 saat veya tamamen sertleşene kadar polimerize edin.
- Numuneleri oda sıcaklığında saklayın.
NOT: Polimerizasyon sonrası LR-beyaz reçine inerttir.
- Numuneleri, LR-White reçinesi ile bir dizi hilal reçine konsantrasyonunda (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) etanolde kuluçkaya yatırarak, her adımda 4 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırarak örnekleri etkisiz haline getirir.
2. Slayt hazırlama
NOT: Cam kaydıraklar temiz olmalı, toz, gres veya diğer kirleticilerden arındırılmalıdır. Bazı tedarikçiler slaytların birbirine yapışmasını önlemek için yağlar ve deterjanlar kullandığından, yeni slaytlar bile temizlenmelidir. Herhangi bir gres veya deterjan, poli-L-lizin ile işlenmiş olsa bile, kaydırağın bölüm yapışmasını engeller. Tiftik ve toz numunenin gözlemlerini etkileyecek ve muhtemelen deneyi mahvedecektir. Reaksiyon kuyuları ile teflon kaplı slaytlar bu görev için mükemmeldir. Uygun fiyatlı, yeniden kullanılabilir ve ihtiyaç duyulan antikor çözeltisi miktarını büyük ölçüde azaltırlar. Uygun temizlik ile mükemmel kalitede floresan immünolocalizasyon çok uygun bir maliyetle yapılabilir.
-
Slayt yıkama
- Slaytları bir boyama rafı içine yerleştirin ve temizleme çözeltisi (%0,1 SDS (w/v), %1 asetik asit (v/v), %10 etanol (v/v) ile örtün.
- 20 dakika boyunca hafif bir ajitasyon sağlayın.
- Boyama raflarını 10 dakika boyunca hafif ajitasyonlu bir ddH2O banyosuna aktarın. 4 kez tekrarlayın.
- % 100 etanol içine kısa bir süre daldırılmadan önce rafları dikkatlice boşaltın ve slaytların tozsuz bir ortamda kurumasına izin verin.
- Kullanıma kadar saklayın.
-
Poli-L-lizin kaplama (isteğe bağlı)
NOT: Küçük bölümler genellikle cam slaytları temizlemek için çok iyi yapışır. Bu adım yalnızca daha büyük bölümler için tavsiye edilir (>2 mm2). Daha büyük bölümler katlama ve kırışma eğilimindedir ve tavsiye edilmez. Bununla birlikte, gerekirse daha büyük delikli reaksiyon slaytları kullanın. Yukarıdaki gibi temizleyin ve aşağıdaki gibi devam edin.- Temiz slaytları kare bir Petri kabına yerleştirin. Pipet 0.001% poli-L-lizin çözeltisi (w / v) taşmadan slaytların deliklerini kapatmak için.
- Kapalı Petri kaplarında slaytların gece boyunca 40 °C'de kurumasına izin verin.
NOT: Kaplamalı kaydıraklar hemen kullanıma hazırdır ve birkaç ay boyunca oda sıcaklığında tozsuz bir ortamda saklanabilir.
3. Örnek kırpma ve bölümleme
-
Örnek kırpma
- Keskin bir jiletle, apeksin numunenin ilgi alanına dik olduğu piramit şeklinde bir yapı oluşturmak için LR-White bloklarını stereomikroskop altında kesin (Ek Şekil 1A).
NOT: Ultra mikrotom numune tutucu, bloğu sabitlemek için mükemmel bir araçtır. Cihazın evrensel bir numune tutucusu yoksa, yuvarlak bloklar için en uygun olanı kullanın. - Fazla reçinenin ince dilimlerini piramit ana eksenine dik olarak çıkararak piramit yapısını kırpın.
- Kesme yüzeyini oluşturan numuneye ulaşılana kadar devam edin. Kesme yüzeyi içinde, hedef numune ideal olarak yamuk şeklinde kapatılmalıdır.
NOT: Reçine bloğu, kesit yüzey alanını keskin bir bıçakla azaltmak için yarık açıyla daha da kırpılabilir(Şekil 1F).
- Keskin bir jiletle, apeksin numunenin ilgi alanına dik olduğu piramit şeklinde bir yapı oluşturmak için LR-White bloklarını stereomikroskop altında kesin (Ek Şekil 1A).
-
Yarı ince kesitleme
NOT: Cam bıçaklı bir mikrotom kullanılacaktır. Antikorun epitopa bağlanma yeteneği immünolabeling reaksiyon başarısını şarta bağlayacaktır. LR-White reçinesinin hidrofilik doğası, antikorların numune bölümleriyle iyi temasını sağlayacaktır. Daha ince bölümler, bölümlerin bulunmasına ve görüntüleme işlemine yardımcı olmak için kullanılacak daha soluk Calcofluor renklendirmesi sunacaktır. Aynı durum daha sonra uygulanabilecek diğer lekeler için de geçerlidir. Ayrıca aşırı kalınlık görüntü alma kalitesini etkileyecektir. Doku özelliklerine bağlı olarak 200 ila 700 nm arasında kesit kalınlığı için iyi bir uzlaşma bulunabilir. Blokları ultra mikrotom numune tutucusuna sıkıca monte edin.- Ultra mikrotom ile 200 ila 700 nm(Şekil 1G)arasında kalınlıklarda bölümler yapın.
- Bazı bölümleri cam slayttaki ddH2O damlasına aktararak bölüm alanını kontrol edin. Su buharlaşana kadar kaydırağı 50 °C sıcak tabağa yerleştirin. Leke, 30 sn boyunca bölümlerin üzerine% 1 borik asit çözeltisine (w / v)% 1 Toluidin Mavi O (w / v) damlası yerleştirir. Mikroskop altında durulayın ve gözlemleyin.
- İstenen yapıyı bulduktan sonra, daha önce temiz bir reaksiyon slaydının her kuyusuna yerleştirilen her ddH2O damlasına bir veya iki bölüm aktarın.
- Her slaydı kapalı temiz 10 cm kare petri kabına yerleştirin ve 50 °C'de kurumasına izin verin.
- Slaytları kullanıma kadar temiz bir arşiv kutusunda saklayın.
4. İmmünolokalizasyon
NOT: Floresan immünolocalizasyon prosedürü iki antikorun sıralı kullanımına dayanır. Birincil antikor belirli bir hedef antijene karşı yükseltilir. sekonder antikor özellikle primer antikora karşı yetiştirilir ve floresan teknikleri için bir florofora (bu özel protokolde FITC) eşlenilir. Birincil antikor, numunedeki hedef antijeni tespit etmek için kullanılacak ve ikincil antikor, birincil antikorun fazlalığını yıkadıktan sonra numuneye bağlı birincil antikorun bulunduğu yeri işaretlemek için kullanılacaktır. Kontroller bu tahlilin önemli bir parçasıdır ve gözlemlerin doğruluğunu güvenceye almak için her zaman yapılmalıdır. Slayttaki bir kuyu, birincil antikor tedavisinin atlanacağı negatif kontrol olarak kullanılmak üzere rezerve edilmeli ve bu nedenle deneyin sonunda sinyal gözlenmemelidir. Etiketlemenin zaten bilinen ve kesin olan bir antikorla iyi tedavi edilerek pozitif bir kontrol deneye dahil edilmelidir. Pozitif kontrol, ikincil antikor etiketleme etkinliğini ve reaksiyon koşullarını doğrulamak için kullanılırken, negatif kontrol ikincil antikor özgüllüğünü test etmek için kullanılır.
- Pipet uçları kutusunun altına bazı sönümlenmiş kağıt havlular yerleştirerek ve teneke folyo ile sararak bir kuluçka odası hazırlayın(Ek Şekil 1B-1E). Slaytları kuluçka odasına yerleştirin.
- Pipet, 8 mm'lik blokaj çözeltisi başına 50 μL düşüş (1 M PBS'de% 5 yağsız kuru süt (w/ v) ve 10 dakika kuluçkaya yaslayın. Engelleme solüsyonını çıkarın ve tüm kuyuları PBS ile iki kez 10 dakika yıkayın.
- Blokaj çözeltisinde birincil antikor çözeltilerini hazırlayın (bkz. Ek Tablo1 ), 1:5 (v/v) antikor; 8 mm kuyu başına yaklaşık 40 μL tahminde bulunun.
NOT: Antikorun konsantrasyonu, imalat protokolüne göre ayarlanmalıdır. - 5 dakika boyunca ddH2O ile son bir yıkama gerçekleştirin, kuyuların tamamen kurumasına asla izin vermeyin.
- Pipet reaksiyon kuyularına birincil antikor çözeltisi. Kontrol kuyularına pipet engelleme çözümü.
- Kuluçka odasını kapatın ve oda sıcaklığında 2 saat bekletin ve ardından 4 ° C'de gece boyunca bekletin. İkincil antikor çözeltisini hazırlayın, blokaj çözeltisinde %1 (v/v) kuyu başına yaklaşık 40 μL. Teneke folyo ile kaplı tutun.
- Tüm kuyuları PBS ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın, ardından ddH2O ile 10 dakika daha yıkayın.
- Pipet tüm kuyulara ikincil antikor çözeltisi. Şu andan itibaren slaytları ışıktan koru.
- Oda sıcaklığında karanlıkta 3-4 saat kuluçkaya yatırın.
- PBS ile tüm kuyuları 10 dakika boyunca iki kez yıkayın ve ardından ddH2O ile 10 dakikalık başka bir yıkama.
- Her kuyuya bir damla calcofluor (PBS'de 1:10.000 (w/v) floresan daha parlak 28) uygulayın. Yıkamadan, her kuyuya bir damla montaj ortamı uygulayın (bkz. Malzeme Tablosu)ve bir kapak kılıfı yerleştirin (Şekil 1H).
- Hücre duvarını ve immünokokalizasyonu tespit etmek için sırasıyla 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 ve 100x/1.40 lens ile donatılmış bir floresan mikroskopla gözlemleyin, UV (calcofluor lekesi için) ve FITC filtreleri kullanın (Şekil 1I). Aşağıdaki dalga boylarını kullanın: UV için uyarma/emisyon (nm) 358/461 ve FITC için 485/530.
- Sonuçların daha iyi görselleştirilmesi için her iki görüntü de ImageJ veya benzeri görüntülerle çakışır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı bir deneyde, ikincil antikor özellikle hücre, doku veya organın belirli bir gelişim aşamasında hücre duvarı bileşiminin karakterize edilmesine izin vererek, belirli epitopun yerini parlak yeşil, tutarlı bir şekilde belirleyecektir. Örneğin LM6 antikoru, gelişmekte olan Quercus suber anther'in hücre duvarını bolca etiketleyen tip-I rhamnogalacturonan içeren bir bileşik olan 1,5-arabinan için yüksek bir benzeşime sahiptir (Şekil 2A), böylece bu tür pektinlerin bol olduğu ve birincil hücre duvarı bileşiminin bir parçası olduğu sonucuna varılmasına izin verir. JIM5, tipik olarak Quercus suber embriyosunun kök ucunda bulunan ve organın mekanik özelliklerini belirten homogalacturonans için az esterleşmiş benzeşime sahiptir (Şekil 2B). Ksylogalacturonan, hücre duvarının gevşemesiyle ilişkili ksiloz bakımından zengin bir pektin türüdir, dejenere hücrelerde bulunurlar. LM8 antikoru özellikle ksylogalacturonanları tanır, olgunlaşan organlarda, Quercus suber meşe palamudu olgunlaşmasının son aşamalarında endosperm hücreleri gibi dejenere hücreleri veya dokuları tespit etmek için kullanılabilir (Şekil 2C).
JIM13, üreme ile ilgili yapılarda bulunan AGP'lere, Arabidopsis thaliana'daki mikrogametogenez ile ilgili hücre hatlarına yakınlığa sahiptir (Şekil 2D). JIM8 ayrıca Bazal Angiosperm Trithuria submersasının stigmatik papillası ve mikropylesi gibi üreme ile ilgili hücre ve organlarda bulunan AGP'lerin epitoplarını tanır (Şekil 2E-2F). Her iki antikorun da bitkilerdeki gametofitik hücre çizgileri için moleküler belirteçler olduğu öne sürülmemiştir9.
Bu protokolde sık yapılan hataların algılanıp tanımlanması normalde kolaydır. Yıkamalar atlandığında veya reaksiyon kuyularının kurumasına izin verilirse, ikincil antikor genellikle hücreler, dokular, reçine ve slayt üzerinde ayrım gözetmeksizin kaplayan spesifik olmayan bir smear olarak görünecektir (Şekil 3A). Sınırsız primer antikor düzgün bir şekilde yıkanmamışsa yeşil florokrom agregaları oluşacaktır (Şekil 3B). Bu tekniğin başarısızlığının bir başka yaygın nedeni, bölümlerin katlanması ve/ veya dekupmenti ile ilgilidir (Şekil 3C), deneyi işe yaramaz hale getirir. Bu sorun genellikle bölümlerin slaytlara zayıf yapışıklıkları, muhtemelen temiz olmayan slaytların kullanılması ve / veya agresif yıkama nedeniyle ilgilidir.
Örnek hazırlama da bu prosedürde kritik bir adımdır. Neyse ki, en yaygın düzeltici ve gömme sorunlarını tespit etmek kolaydır (Şekil 3D). Her şey yolunda giderse reçine bloğu çatlaklardan arındırılacak ve örnek soluk sarıdan açık kahverengi renge(Şekil 3D-1)ile açıkça görülebilecektir. Verimsiz bir şekilde gömülü numuneler tozlu beyaz lekeler veya alanlar gösterecektir (Şekil 3D-2). Numune boyutunu 8 mm'nin altında tutmak, fiksatif çözeltinin nüfuz etmesini garanti etmek için önemlidir. Numuneler kötü sabitlendiğinde, koyu kahverengi neredeyse siyah görünecektir(Şekil 3D-3). Ayrıca polimerizasyonun sıcaklığı hem epitopların korunması hem de reçinenin uygun şekilde sertleştirilmesi için önemlidir. Aşırı bir sıcaklık, reçinenin çatlayarak numunenin kesitini imkansız hale gelmesine neden olabilir(Şekil 3D-4).
Şekil 1. Protokolün tamamına genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bitki örneklerinde AGP'lerin ve Pektin immünolocalizasyonunun tipik sonuçları. (A) LM6 bir Quercus suber anther in meiosis I. (B) Jim5 tarafından bir Quercus suber embriyo kök ucunda düşük metil esterleşmiş pektinlerin spesifik etiketlemesinde pektinlerin arabinan moiety etiketlemesi. (C) Bir Quercus suber olgunlaşan meşe palamudunun geri çekilen endosperminde LM8 tarafından etiketlenmiş kslogalacturonan. (D) Jim13 bir Arabidopsis thaliana anther tetutum ve tetrads AGP etiketleme. (E) Trithuria submersa'nın stigmatik papillasında JIM8 tarafından etiketlenen AGP'ler. (F) JIM8 trithuria submersa ovule mikropyle (beyaz ok) AGP'leri etiketleme. Meiotik mikrospore (Mc), Tapetum (Tp), Kök (R), Kök ucu (Rt), Testa (Ts), Endosperm (Ed), Embriyo (Em), Epidermis (Ep), Stigmatik papilla (SP), Ovule (OV). Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Protokol sırasında sık karşılaşılan hatalar ve sorunlar. (A) Yıkama adımlarının başarısızlığı, numune reçinesi üzerinde sekonder antikorun (+) spesifik olmayan smear varlığı ile tanımlanır. (B) Birincil antikorun zayıf özgüllüğü veya yıkama hatası, fitc agregalarının (+) belirli bir yere bağlanmamasına neden olur. (C) Kıvrımlar ve kesit müfrezesi genellikle agresif yıkama ve temiz olmayan slaytların sonucudur. (D) Örnek fiksasyon ve gömme örnekleri; (1) mükemmel numune boyutu ve gömme, (2) gömme hatası, (3) örnek sabitleme hatası, (4) reçine sertleştirme hatası. FITC etiketli antikor (yeşil) ve Calcofluor-beyaz leke (mavi). Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1. (A) Ultramikrotom ile kesit için numuneyi (Sarı blok) hazırlamak için blok kırpma sırasının şematik gösterimi. İlk olarak jelatin kapsülü çıkarılır (1). Daha sonra kapsülün kenarlarına 40 ° ila 45 ° açıyla numuneye (2) teğet olarak kırpılırlar, birincinin 90 ° 'sinde (3) ikinci bir kesim yapılır ve ardından üçüncü (4) ve dördüncü aynı kurala (5) uyulur. Kırpmanın bu ilk aşamasından itibaren, zirvenin numunenin üzerinde yer aldığı piramit şeklinde bir yapı elde edilir. Son olarak, keskin bir bıçak ile zirve, gömülü örneğe ulaşmak için reçine bloğu ana eksenine dik olarak tıraş edilir. İşlemin sonunda kare veya yamuk bir yüzey elde edilmelidir (6). (B) Kuluçka odası yapmak için gerekli malzemeler; kalay folyo (1), çift taraflı koli bandı (2), kağıt havlu (3) ve pipet ucu kutusu. (C) İlk adımda, kalay folyo çift taraflı koli bandı ile kutuya sabitlenir. (D) İkinci adımda, pipet uç tutucusu kutunun altına kağıt havlu yerleştirmek için çıkarılır. (E) Üçüncü adımda, kağıt havlular su ile sönümlenir ve pipet uç tutucusu hareket etmek için geri yerleştirilir slaytlar için bir tepsiye sahiptir. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 1: Yararlı monoklonal antikorların listesi. Yukarıdaki tablo, hedefleri ve nerede satın alınabilecekleri hakkında bilgi içeren mevcut antikorların bir örneğini temsil eder. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan bitkilerdeki floresan immünolocalizasyon yöntemi, sorunsuz bir şekilde basit olsa da, birkaç küçük adımın başarısına dayanır. Bunlardan ilki örnek hazırlama ve sabitlemedir. Bu ilk adım sırasında, hücre bileşenlerinin çoğunu çapraz bağlamak için formaldehit ve glutaraldehit karışımı kullanılır. Çözeltideki formaldehit hafif ve geri dönüşümlü bir fiksasyon sağlarken glutaraldehit daha kalıcı güçlü bir bağlantı sağlar; iki fiksatif arasındaki denge, epitopların maruz kalmasının birincil antikor10ile reaksiyona girmesine izin veren uygun miktarda çapraz bağlama sağlar. Fiksatif çözümün düzgün çalışması için numunenin küçük olması gerekir. Çapı 7 mm'den büyük yapıların düzeltilmesi çok zordur ve sabit penetrasyon sağlamak için kırpılmalıdır.
Yaralama veya stresten sonra, bazı bitkiler, formaldehitin fiksatif sürece müdahale etmesiyle reaksiyona girebilecek koyu çökeltiler oluşturan büyük miktarda tanen salgılar. Numunelerin buzda tutulması ve bulanıklaştığında fiksatif çözeltinin değiştirilmesi bu etkiyi azaltmaya yardımcı olur. Hava ayrıca fiksatif sürece ve daha sonra reçinenin gömülmesine ve sertleşmesine müdahale edebilir. Önerilen vakum tedavisi havanın çoğunu çıkarmalıdır. Özellikle havadar dokular için vakum adımı, numunelerden daha fazla hava çıkmayana ve dibe batana kadar 2 saatten daha fazla uzatılabilir. Gecelik sabitleme adımından sonra yüzen bulunan herhangi bir örnek atılmalıdır. Reçine gömme, korunmuş numunenin kesilmesi için destek sağlar ve sertliği gömülü dokulara yaklaşıkolmalıdır 10. LR-White üç sertlik derecesinde gelir: odunsu ağır sklere dokular için sert, yapraklardan polen tanelerine kadar dokuların büyük çoğunluğu için orta dereceli ve daha hassas dokular için yumuşak derece. Mükemmel bir gömme için, reçine numuneye tamamen nüfuz etmelidir; bu, yavaş ve kademeli bir infiltrasyonla daha iyi elde edilir. Önceden testlerde daha kısa kuluçka süreleri kullanılabilir. Jelatin kapsülleri hem küçük hem de hermetik olarak sızdırmazdır, bu da onları LR-White reçine kürleme için mükemmel hale getirir. 2 (0,37 mL) boyutu için kürleme 58 °C'de 24 saat sonra tamamlanmalıdır. Diğer kapsül boyutları için kürleme süresi ayarlanmalıdır. LR-White kürlenmiş reçine neredeyse renksizden açık altın / kehribar rengine geçmeli ve tırnaklara sert hissetmelidir. Numune kırpma ve ultra mikrotom kullanımı pratik gerektirir, ancak net rakamlar üretecektir. Bölümün kalınlığı ve büyüklüğü görüntüleme ve immünokokalizasyon tahlilleri için önemlidir. Kesit kalınlığı 500 nm civarında tutulmalıdır. Çok ince olan bölümler kötü lekelere neden olur ve 700 nm'nin üzerindeki kesit kalınlıkları görüntü alımını ve çözünürlüğü kesintiye uğratacaktır. LR-White reçinesinin hidrofilik yapısı, reçineyi çıkarmadan lekelenme ve immünolocalizasyonda bölümlerin doğrudan kullanılmasını sağlar.
Blokaj çözeltisi (1 M PBS'de% 5 yağsız kuru süt) antikorların spesifik olmayan bağlanmasını azaltır. Yağsız kuru süt, BSA veya diğer daha geleneksel engelleme maddelerine güvenilir bir alternatif olmuştur ve önemli ölçüde daha ucuzdur. Agregaları yıkamak, antikorları korumak ve deneyi tehlikeye atmak için zor oluşan çökeltileri önlemek için engelleme çözümü kullanılmadan önce bir kağıt filtreden filtrelenmelidir. Önerilen antikor oranları ve kuluçka süreleri optimize edilmiş ve çeşitli çalışmalarda çeşitli türlere başarıyla uygulanmıştır9, 11,12,13,14,15,16.
İmmünolokalizasyon işlemi sırasında buharlaşma ve ışığa maruz kalmak kaçınılması gereken iki konudur. Nemli ve koyu bir kuluçka odası bu sorunların her ikisini de çözer. Karanlık bir odanın nasıl yapılacağının bir öğreticisi Ek Şekil 1B-1E'de bulunabilir. Bu immünolokalizasyon protokolü, hedef epitopa yönlendirilmiş birincil bir antikorun kendi etiketi olmadan kullanılmasını ve birincil antikor IgG'ye karşı yükseltilen bir florokroma (FITC) konjuge edilen ikincil bir antikorun kullanılmasını gerektirir. Bu yöntem, ikincil antikorun hedef örnek türlere yakınlığı olmadığından, algılamanın artan sıkılığı nedeniyle tek bir antikor algılama sisteminin kullanımına göre çeşitli avantajlar sunar. Birincil antikor molekülleri, her biri florokrom17taşıyan ikincil antikorun birkaç molekülü tarafından hedeflenebileceğinden, bu sistem artan sinyal sunar.
Florokromların yoğun ışık veya fotoğraf ağartma ile çürümesi bu teknikte önemli bir konudur. Özellikle zayıf lokalize sinyalleri araştırırken, sinyal görüntülemeden önce geri döndürülemez bir şekilde kaybolabilir. Montaj ortamı florokromların stabilitesini ve ömrünü büyük ölçüde artırır18; bununla birlikte, montaj ortamını test etmek şiddetle tavsiye edilir, çünkü bazıları leke ve / veya florokrom ile reaksiyona girerek çökeltiler oluşturabilir ve görüntüyü bulanıklaştırır. İmmünolokalizasyonun gözlemlenmesi ve kaydedilmesi için kullanılan optik sistemin yapılandırılması, bu deneyin başarısı için en önemli yönlerden biridir. Bölümlerin kalınlığının azalması nedeniyle konfokal mikroskobu kullanmanın faydaları sınırlıdır. En başarılı kurulum, floresan ışık kaynağı, LED veya cıva ampulü19, yeterli floresan sınıfı hedefleri olan geleneksel bir dik epifluoresans mikroskobu gerektirir. Ayrıca UV için uyarlama/emisyon (nm) 358/461 ve FITC için 485/530 için ayarlanmış kaliteli ışık filtreleri gereklidir. Floresan görüntü alımı için, yüksek hızları ve hassasiyetleri nedeniyle soğumüş tek renkli dijital kameralar önerilir, ancak gerçek renk bilgilerini fedaedin 20. Polikromatik kameralar, arka plan floresanından gelen sinyali kolayca sıralama yeteneği sağlar, ancak monokromatik benzerlerinden daha yavaş ve çok daha az hassastır.
Yöntem, spesifik antikorların mevcudiyeti ile sınırlıdır. Bitki epitoplarını hedefleyen geniş ve genişleyen bir antikor koleksiyonunun mevcudiyetine rağmen, anlaşılabilir bir şekilde tüm bitki bileşikleri henüz kapsanmamaktadır. Ayrıca lipitler açıklanan gömme yöntemi ile ayıklanma eğilimindedir ve bu nedenle yüksek yağ içeriğine sahip dokular için önerilmez. Cryostat bölümü, görüntü çözünürlüğünden ödün verilmesine rağmen bir alternatif olabilir. LR-White reçine polimerizasyonunun sıcaklığı bazı durumlarda daha hassas epitopları değiştirebilir. Hedef epitop sıcaklığa duyarlıysa, LR-Gold reçinesi için LR-White'ı değiştirin. Beyaz ışık altında -25 °C'de polimerize olan LR-Gold, termositive epitopların mükemmel bir şekilde korunmasını sağlar, ancak özel bir polimerizasyon cihazının edinilmesini gerektirir ve LR-White'dan biraz daha zehirlidir.
Bu yöntem çok çeşitli tür ve dokularda kullanılmıştır. Belirli epitop dağılımı hakkında güvenilir bilgilere hızlı erişim sağlar. Evrimsel modeller için destekleyici veriler sunmak ve görsel olarak cazip sonuçlar sağlarken hücre ve dokulardaki belirteçleri ve spesifik adaptasyonları tanımlamak. Peroksidaz veya alkali fosfataz konjugasyon alternatifleri üzerinde florokromlarla konjuge edilen antikorların kullanımı10, daha az zaman alıcıdır, aşırı tepki veren eserlere önemli ölçüde daha az eğilimlidir ve başka herhangi bir teknikle eşleşmesi zor net bir hücre altı çözünürlük sağlar. Hücre duvarı ile ilgili polimerlere özgü antikorların kullanımı, bileşiklerin çok kısıtlanacak alanlara düzenlenmesi hakkında bir fikir verir. Bu tür bir çözümün geleneksel biyokimyasal araçlardan elde edilmesi zor olacaktır. Sürekli genişleyen birincil antikor seti, bitki hücresi iç işleyişine sürekli yeni keşif fırsatları sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Yazarlar, H2020-MSCA-RISE-2015 ve SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017 tarafından finanse edilen AB projesi 690946 'SexSeed' (Cinsel Bitki Üretimi - Tohum Oluşumu) tarafından destek aldı. AMP, Avrupa Birliği'nin MSCA-IF-2016 projesinden (no. 753328) hibe aldı. MC, FCT PhD hibesi SFRH/BD/111781/2015'ten hibe aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Absolute ethanol | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size should fit the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| Vacuum chamber | na | na | |
| Vacuum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
- Keegstra, K.
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K.
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. Boston, MA. (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
