Summary
Ce protocole décrit en détail comment le matériel végétal pour l’immunolocalisation des protéines arabinogalactan et des pectines est fixé, incorporé dans une résine acrylique hydrophilique, sectionné et monté sur des glissières en verre. Nous montrons que des épitopes liés à la paroi cellulaire seront détectés avec des anticorps spécifiques.
Abstract
Le développement des plantes implique des ajustements constants de la composition et de la structure de la paroi cellulaire en réponse à des stimuli internes et externes. Les parois cellulaires sont composées de cellulose et de polysaccharides non cellulosiques ainsi que de protéines, de composés phénoliques et d’eau. 90 % de la paroi cellulaire est composée de polysaccharides (p. ex., pectines) et de protéines arabinogalactan (APC). L’immunolocalisation fluorescente d’épitopes glycan spécifiques dans les sections histologiques végétales demeure un outil clé pour découvrir le remodelage des réseaux, de la structure et des composants de polysaccharide de mur.
Ici, nous rapportons une procédure optimisée d’immunolocalisation fluorescente pour détecter les épitopes glycan des ARG et des pectines dans les tissus végétaux. La fixation de paraformaldéhyde/glutaraldehyde a été employée avec l’intégration LR-White des échantillons de plante, permettant une meilleure conservation de la structure et de la composition de tissu. Des sections minces des échantillons incorporés obtenus avec un ultra-microtome ont été utilisées pour l’immunolocalisation avec des anticorps spécifiques. Cette technique offre une grande résolution, une grande spécificité et la possibilité de détecter plusieurs épitopes glycan dans le même échantillon. Cette technique permet la localisation subcellulaire des glycanes et détecte leur niveau d’accumulation dans la paroi cellulaire. Il permet également la détermination des modèles spatio-temporels de la distribution d’AGP et de pectine pendant des processus développementaux. L’utilisation de cet outil peut en fin de compte guider les orientations de recherche et relier les glycanes à des fonctions spécifiques chez les plantes. En outre, les informations obtenues peuvent compléter les études biochimiques et d’expression génique.
Introduction
Les parois cellulaires végétales sont des structures complexes composées de polysaccharides et de glycoprotéines. Les parois cellulaires sont des structures extrêmement dynamiques dont l’architecture, l’organisation et la composition varient selon le type de cellule, la localisation, le stade de développement, les stimuli externeset internes 1. Les protéines arabinogalactan (AGPs) et les pectines sont des composants importants de la paroi cellulaire végétale. Les APC sont des protéines fortement glycoylées et les pectines sont des polysaccharides homogalacturonan dont la composition, la quantité et la structure varient considérablement au cours des différents stades de développementvégétal 2,3,4. Les AIG et les études sur la pectine ont révélé leur implication dans plusieurs processus végétaux tels que la mort cellulaire programmée, la réponse aux stress abiotiques, la reproduction sexuelle des plantes, parmi beaucoupd’autres 5. La plupart de ces études ont commencé avec des informations obtenues à partir d’études d’immunolocalisation.
Compte tenu de sa complexité, l’étude des parois cellulaires nécessite de nombreux outils différents. La détection des épitopes glycan à l’aide d’anticorps monoclonaux (mAbs) est une approche précieuse pour résoudre la distribution du polysaccharide et de la glycoprotéine le long de cette structure. Il existe une grande collection de mAbs disponibles pour détecter les épitopes glycan et la spécificité de chaque mAb est continuellement améliorée ainsi6. La technique décrite ici s’applique à toutes les espèces végétales, et est un outil parfait pour guider les orientations futures de recherche qui pourraient impliquer des techniques plus coûteuses et complexes.
Dans cette technique, des anticorps spécifiques sont chimiquement conjugués à des colorants fluorescents tels que fitc (fluorescéine isothiocyanate), TRITC (tétramethylrhodamine-5-(et 6)-isothiocyanate) ou plusieurs colorants Alexa Fluor. L’immunofluorescence offre plusieurs avantages, permettant une localisation subcellulaire claire et rapide des glycans qui peut être directement observée au microscope à fluorescence. Il est très spécifique et sensible, puisque la préparation de l’échantillon peut effectivement protéger la structure naturelle de l’antigène, même s’il est présent en plus faibles quantités. Il permet la détection de plusieurs antigènes dans le même échantillon et le plus important, offre des résultats de haute qualité et visuellement belle. Malgré la grande puissance offerte par les études d’immunolocalisation de fluorescence, elles sont souvent considérées comme difficiles à exécuter et à mettre en œuvre très probablement en raison de l’absence de protocoles détaillés permettant la visualisation des différentes étapes de la procédure. Ici, nous fournissons quelques lignes directrices simples sur la façon d’effectuer cette technique et comment obtenir des images de haute qualité.
Pour le protocole présenté ici, les échantillons doivent d’abord être corrigés et intégrés à l’aide du fixatif le plus approprié. Bien que considérée comme une technique longue et relativement fastidieuse, la fixation et l’intégration appropriées de l’échantillon végétal sont la clé pour assurer un essai d’immunolocalisation réussi. À cette fin, le plus habituel est la fixation chimique à l’aide de fixatifs de liaison croisée, comme les aldéhydes. Les fixatifs croisés établissent des liaisons chimiques entre les molécules du tissu, stabilisant et durcissant l’échantillon. Le formaldéhyde et le glutaraldehyde sont des fixatifs de liaison croisée, et parfois un mélange des deux fixatifs est employé7. Le formaldéhyde offre une grande préservation structurelle des tissus et pendant de longues périodes de temps, produisant de petites rétractations tissulaires et étant compatible avec l’immunostaining. Le glutaraldehyde est un fixatif plus fort et stable habituellement utilisé en combinaison avec le formaldéhyde. L’utilisation du glutaraldehyde présente certains inconvénients qui doivent être pris en compte car il introduit certains groupes d’aldéhyde libre dans le tissu fixe, ce qui peut générer une certaine étiquetage non spécifique. En outre, le croisement entre les protéines et d’autres molécules peut parfois rendre certaines épitopes cibles inaccessibles pour les anticorps. Pour éviter cela, la quantité et la durée de la fixation doivent être soigneusement définies.
Après fixation, les échantillons sont incorporés dans la résine appropriée pour durcir avant d’obtenir les sections. La résine acrylique London Resin (LR-White) est la résine de choix pour les études d’immunolocalisation. Contrairement à d’autres résines, LR-White est hydrophile, permettant aux anticorps d’atteindre leurs antigènes, sans aucun traitement pour le faciliter. LR-White a également l’avantage d’offrir une faible fluorescence automatique, permettant une réduction du bruit de fond pendant l’imagerie par immunofluorescence.
Il existe de nombreuses techniques de coloration disponibles pour détecter différents composants de la paroi cellulaire, tels que la coloration bleue alcienne, la coloration bleue toluidine ou la coloration périodique de l’acide schiff (PAS). Aucun d’entre eux n’offre le pouvoir des analyses d’immunolocalisation8. Cette approche donne une plus grande spécificité dans la détection des glycanes, offrant des informations plus vastes concernant la composition et la structure des parois cellulaires.
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Protocol
1. Préparation de l’échantillon : fixation, déshydratation et intégration LR-Blanc
- Fixation et déshydratation
REMARQUE : Le processus de fixation est essentiel pour préserver l’échantillon; en croisant les molécules, le métabolisme cellulaire est arrêté, assurant l’intégrité cellulaire et empêchant la diffusion moléculaire. Les agents fixatifs et la concentration utilisée doivent être ajustés à cette fin, laissant les antigènes suffisamment exposés pour interagir avec les anticorps. Le protocole suivant combine la capacité fixative douce du paraformaldéhyde, avec l’effet plus fort du glutaraldehyde. Leurs proportions ont été optimisées pour les ARG et les composants de la paroi cellulaire, mais elles conviennent à d’autres protéines et structures cellulaires. Le processus de déshydratation ultérieur préparera les échantillons pour l’intégration LR-White. Des tissus végétaux de plusieurs espèces végétales ont été utilisés dans cette expérience. Des échantillons de suber quercus ont été prélevés sur des arbres cultivés dans le champ. Les échantillons de trithuria submersa nous ont été gentiment partagés par Paula Rudall (Kew Gardens, Londres, Royaume-Uni).- Sèmez toutes les plantes arabidopsis directement sur le sol et cultivez dans une installation de croissance intérieure avec 60% d’humidité relative et un cycle jour/nuit de 16 h de lumière à 21 °C et 8 h d’obscurité à 18 °C. Sélectionnez les tissus végétaux à analyser et coupez des échantillons d’une taille maximale de 16 mm2.
- Transférer immédiatement l’échantillon dans un flacon de verre préalablement rempli d’une solution fixative suffisamment froide (2 % de formaldéhyde (w/v), 2,5 % de glutaraldehyde (w/v), 25 mM pipes pH 7 et 0,001 % Tween-20 (v/v)) pour submerger complètement les échantillons (figure 1A).
ATTENTION : Le formaldéhyde et le glutaraldehyde sont tous deux des agents fixatifs qui peuvent être nocifs par inhalation et par contact. Effectuez l’étape de fixation sur une hotte de fumée et portez des vêtements de protection adéquats et des gants de nitrile. Toutes les solutions à partir de cette étape, y compris les séries d’alcool jusqu’à 70 %, devraient être stockées pour une décontamination ultérieure par du personnel spécialisé. - Après avoir recueilli tous les échantillons, rafraîchir le fixatif.
- Transférer les flacons dans une chambre à vide et appliquer lentement le vide. En atteignant -60 kPa, le matériau flottant commencera à couler au fond du flacon (Figure 1B).
- Garder sous vide d’au plus -80 kPa pendant 2 h à température ambiante.
- Relâchez lentement le vide, scellez le flacon de verre et placez-le toute la nuit à 4 °C.
- Jetez tous les échantillons qui n’ont pas coulé pendant la fixation de nuit. Laver les échantillons restants avec 25 mM PBS pH 7 pendant 10 min, suivi d’un lavage de 20 min dans 25 mM PIPES tampon pH 7,2.
- Déshydrater les échantillons d’une série d’éthanol (25 %, 35 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 3 x 100 % d’éthanol) pendant 20 minutes chacun. Transférez immédiatement les échantillons déshydratés sur des flacons de verre étiquetés pour l’intégration( figure 1C).
REMARQUE : Le processus de déshydratation peut être interrompu à l’étape de 70 % de l’éthanol.
- Intégration de résine LR-Blanc
REMARQUE : Le blanc LR est une résine acrylique non hydrophobe à faible viscosité, ce qui la rend idéale pour pénétrer les tissus avec de nombreuses couches épaisses de parois cellulaires. LR-White est également disponible en plusieurs qualités de dureté compatibles pour couper la plupart des échantillons de plantes. S’il vous plaît assurez-vous que la résine utilisée est déjà fourni avec le catalyseur approprié mélangé, ou suivez les instructions du fournisseur pour préparer la résine. Le processus d’intégration suivant est lent, mais les résultats justifient grandement les moyens.- Imprèdre les échantillons en couveant avec la résine LR-White dans une série de concentrations en croissant de résine (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) dans l’éthanol, incubant pendant 24 h à 4 °C à chaque étape.
AVERTISSEMENT : La résine LR-White est une résine acrylique à faible toxicité ; cependant, il peut être un irritant pour la peau par contact et inhalation. Il est fortement recommandé de travailler dans une zone bien ventilée ou sous une hotte fumigène avec une usure protectrice appropriée et des gants de nitrile. - Rafraîchissez la résine blanche LR et incubez pendant 12 h supplémentaires à 4 °C.
- Préparer des capsules de gélatine d’intégration de taille appropriée (taille 1 (0,5 mL) pour les échantillons jusqu’à 3 mm, 2 x 0,37 mL pour les échantillons jusqu’à 5 mm ou 3 x 0,3 mL pour les échantillons jusqu’à 8 mm, et les étiquettes en papier (figure 1D).
REMARQUE : Sélectionnez la taille de la capsule pour être légèrement plus grande que l’échantillon, de sorte que le spécimen puisse être complètement enfermé dans la résine. En outre, n’oubliez pas d’étiqueter les étiquettes avec un crayon, parce que le stylo ou les encres imprimées contamineront la résine, ruinant l’échantillon. - Appliquer une goutte de résine blanche LR fraîche au fond de chaque capsule.
- Placer un échantillon dans chaque capsule de gélatine et remplir au maximum de résine fraîche. Placez le capuchon de la capsule et appuyez doucement pour former un joint hermétique(figure 1E).
- Polymériser la résine de 24 à 48 h à 58 °C, ou jusqu’à ce qu’elle soit complètement durcie.
- Conserver les échantillons à température ambiante.
REMARQUE : La résine blanche LR post polymérisée est inerte.
- Imprèdre les échantillons en couveant avec la résine LR-White dans une série de concentrations en croissant de résine (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) dans l’éthanol, incubant pendant 24 h à 4 °C à chaque étape.
2. Préparation de diapositives
REMARQUE : Les glissières en verre doivent être propres, exemptes de poussière, de graisse ou de tout autre contaminant. Même les nouvelles glissières doivent être nettoyées car certains fournisseurs utilisent des huiles et des détergents pour empêcher les glissières de coller ensemble. Toute graisse ou détergent interfère avec l’adhérence de la section à la lame, même si elle est traitée avec de la poly-L-lysine. La peluche et la poussière affecteront les observations du spécimen et ruineront très probablement l’expérience. Les glissières recouvertes de téflon avec puits de réaction sont parfaites pour cette tâche. Ils sont abordables, réutilisables et réduisent considérablement la quantité de solution anticorps nécessaire. Avec un nettoyage adéquat, une immunolocalisation fluorescente d’excellente qualité peut être effectuée à un coût très abordable.
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Lavage de diapositives
- Placer les glissières dans une grille à taches et couvrir d’une solution de nettoyage (0,1 % de SDS (w/v), 1 % d’acide acétique (v/v), 10 % d’éthanol (v/v)).
- Maintenir une légère agitation pendant 20 min.
- Transférer les grilles de coloration dans un bain ddH2O avec une légère agitation pendant 10 min. Répétez 4 fois.
- Égoutter soigneusement les grilles avant de plonger brièvement dans 100% d’éthanol et laisser sécher les glissières dans un environnement exempt de poussière.
- Conserver jusqu’à utilisation.
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Revêtement poly-L-lysine (facultatif)
REMARQUE : Les petites sections collent généralement très bien pour nettoyer les glissières en verre. Cette étape n’est recommandable que pour les sections plus grandes (>2 mm2). Les sections plus grandes ont tendance à se plier et à se froisser, et ne sont pas conseillées. Néanmoins, si nécessaire utiliser des diapositives de réaction avec de plus grands trous. Nettoyez-les comme ci-dessus et procédez comme suit.- Placer les glissières propres dans une boîte de Pétri carrée. Pipette 0,001% solution poly-L-lysine (w/v) pour couvrir les trous des toboggans, sans débordement.
- Laisser sécher les toboggans toute la nuit à 40 °C dans des boîtes de Pétri fermées.
REMARQUE : Les glissières enduites sont prêtes à être utilisées immédiatement et peuvent être stockées dans un environnement exempt de poussière à température ambiante, pendant plusieurs mois.
3. Coupe et sectionnement d’échantillons
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Coupe d’échantillon
- À l’aide d’une lame de rasoir tranchante, taillez les blocs LR-White sous un stéréomicroscope pour former une structure pyramidale où l’apex est perpendiculaire à la zone d’intérêt del’échantillon (Figure supplémentaire 1A).
REMARQUE : Le porte-spécimen ultra-microtome est un excellent outil pour sécuriser le bloc. Si l’appareil n’a pas de porte-spécimen universel, utilisez celui qui convient le mieux aux blocs ronds. - Coupez la structure pyramidale en enlevant les fines tranches de l’excès de résine perpendiculairement à l’axe majeur de la pyramide.
- Procéder jusqu’à ce que l’échantillon soit atteint formant la surface de coupe. Dans la surface de coupe, l’échantillon cible doit idéalement être enfermé dans une forme trapézoïde.
REMARQUE : Le bloc de résine peut être coupé davantage à un angle de fente pour réduire la surface de la section à l’aide d’une lame tranchante (figure 1F).
- À l’aide d’une lame de rasoir tranchante, taillez les blocs LR-White sous un stéréomicroscope pour former une structure pyramidale où l’apex est perpendiculaire à la zone d’intérêt del’échantillon (Figure supplémentaire 1A).
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Sections semi-minces
REMARQUE : Une microtome avec des couteaux en verre sera utilisée. La capacité de l’anticorps à se lier à l’épitope conditionnera le succès de réaction d’immunolabeling. La nature hydrophilique de la résine LR-White permettra un bon contact entre les anticorps et les sections de l’échantillon. Les sections plus minces présenteront une coloration calcofluor plus faible qui sera utilisée pour aider à localiser les sections et aider au processus d’imagerie. Il en va de même pour d’autres taches qui peuvent être appliquées ultérieurement. L’épaisseur excessive affectera également la qualité d’acquisition d’image. Un bon compromis pour l’épaisseur de la section peut être trouvé entre 200 et 700 nm, selon les caractéristiques des tissus. Montez les blocs étroitement sur le porte-spécimen de l’ultra-microtome.- Avec un ultra-microtome, faire des sections d’une épaisseur comprise entre 200 et 700 nm (Figure 1G).
- Vérifiez la zone de la section en transférant certaines sections à une goutte ddH2O sur une glissière en verre. Déposer la lame sur une plaque chaude de 50 °C jusqu’à ce que l’eau s’évapore. Tache plaçant une baisse de 1% Toluidine Blue O (w/v) dans la solution d’acide borique de 1% (w/v) sur les sections pendant 30 s. Rincer et observer au microscope.
- Après avoir trouvé la structure désirée, transférez une ou deux sections à chaque goutte de ddH2O précédemment placée sur chaque puits d’une glissière de réaction propre.
- Placez chaque glissière dans une boîte de Pétri fermée de 10 cm carrés et laissez-la sécher à 50 °C.
- Rangez les diapositives dans une boîte d’archives propre jusqu’à utilisation.
4. Immunolocalisation
REMARQUE : La procédure d’immunolocalisation fluorescente repose sur l’utilisation séquentielle de deux anticorps. L’anticorps primaire est soulevé contre un antigène cible spécifique. L’anticorps secondaire est soulevé spécifiquement contre l’anticorps primaire et pour les techniques fluorescentes est conjugué à un fluorophore (FITC dans ce protocole spécifique). L’anticorps primaire sera utilisé pour détecter l’antigène cible dans l’échantillon, et l’anticorps secondaire sera utilisé pour marquer l’endroit où l’anticorps primaire connecté à l’échantillon après avoir lavé l’excès d’anticorps primaires. Les contrôles sont une partie importante de cet essai et doivent toujours être effectués pour assurer l’exactitude des observations. Un puits sur la glissière doit être réservé pour une utilisation comme un contrôle négatif, où le traitement primaire des anticorps sera ignoré, et donc aucun signal ne doit être observé à la fin de l’expérience. Un contrôle positif doit être inclus dans l’expérience en traitant un puits avec un anticorps dont l’étiquetage est déjà connu et certain. Le contrôle positif est utilisé pour confirmer l’efficacité de l’étiquetage secondaire des anticorps et les conditions de réaction pendant que le contrôle négatif teste la spécificité secondaire des anticorps.
- Préparez une chambre d’incubation en plaçant des serviettes en papier amorties au fond d’une boîte de bouts de pipette et en l’enveloppant avec du papierd’aluminium (figure supplémentaire 1B-1E). Placez les diapositives dans la chambre d’incubation.
- Pipette une baisse de 50 μL par puits de 8 mm de solution de blocage (5% de lait sec non gras (w/v) en 1 M PBS) et incuber pendant 10 min. Retirer la solution de blocage et laver tous les puits deux fois avec PBS pendant 10 min.
- Préparer les principales solutions d’anticorps (voir tableau supplémentaire 1), anticorps 1:5 (v/v) dans la solution de blocage; faire une estimation d’environ 40 μL par puits de 8 mm.
REMARQUE : La concentration de l’anticorps doit être ajustée selon le protocole de fabrication. - Effectuez un lavage final avec ddH2O pendant 5 min, ne laissez jamais les puits sécher complètement.
- Pipette la solution d’anticorps primaire aux puits de réaction. Pipette bloquant la solution aux puits de commande.
- Fermer la chambre d’incubation et laisser reposer 2 h à température ambiante suivie d’une nuit à 4 °C. Préparer la solution d’anticorps secondaire, 1% dans la solution de blocage (v/v) environ 40 μL par puits. Gardez-le couvert de papier d’étain.
- Lavez tous les puits deux fois avec pbs pendant 10 min, suivi de 10 minutes supplémentaires avec ddH2O. Assurez-vous qu’aucune trace de la solution de blocage ou des dépôts n’est visible sur les puits.
- Pipette la solution d’anticorps secondaire à tous les puits. Désormais, protégez les glissières de la lumière.
- Incuber de 3 à 4 h dans l’obscurité à température ambiante.
- Laver tous les puits deux fois pendant 10 min avec PBS suivi d’un autre lavage de 10 min avec ddH2O.
- Appliquer une goutte de calcofluor (1:10,000 (w/v) fluorescente plus lumineuse 28 dans PBS) à chaque puits. Sans lavage, appliquez une goutte de support de montage (voir Table of Materials)sur chaque puits et placez un coverslip (Figure 1H).
- Observez avec un microscope à fluorescence, équipé d’un objectif 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 et 100x/1.40, utilisez les filtres UV (pour les taches calcofluor) et FITC, pour détecter respectivement la paroi cellulaire et l’immunolocalisation (figure 1I). Utilisez les longueurs d’onde suivantes : excitation/émission (nm) 358/461 pour les UV et 485/530 pour fitc.
- Pour une meilleure visualisation des résultats se chevauchent les deux images avec ImageJ ou similaires.
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Representative Results
Dans une expérience réussie, l’anticorps secondaire identifiera spécifiquement l’emplacement de l’épitope spécifique en vert vif, d’une manière cohérente, permettant la caractérisation de la composition de la paroi cellulaire à un certain stade de développement de la cellule, du tissu ou de l’organe. Par exemple, l’anticorps LM6 a une forte affinité pour 1,5-arabinan, un composé avec type I rhamnogalacturonan qui peut être trouvé abondamment l’étiquetage de la paroi cellulaire de l’anthère quercus suber en développement (Figure 2A), permettant ainsi de conclure que ce type de pectine est abondante et fait partie de la composition de la paroi cellulaire primaire. Jim5 a une affinité pour les homogalacturonans à peine estérifiés qui se trouvent généralement à l’extrémité racine de l’embryon quercus suber, spécifier les propriétés mécaniques de l’organe (Figure 2B). Xylogalacturonan sont un type de pectine riche en xylose associée à des desserrage de la paroi cellulaire, ils se trouvent dans les cellules dégénérantes. L’anticorps LM8 reconnaît spécifiquement les xylogalacturonans, dans les organes de maturation, il peut être utilisé pour détecter les cellules dégénérantes ou les tissus, comme les cellules endosperme au cours des dernières étapes de la maturation du gland quercus suber (Figure 2C).
JIM13 a des affinités pour les APS trouvés sur les structures liées à la reproduction, les lignées cellulaires liées à la microgametogenèse dans Arabidopsis thaliana (Figure 2D). Jim8 reconnaît également les épitopes d’AGPs présents dans les cellules et les organes liés à la reproduction comme les papilles stigmatisantes et le micropyle de l’Angiosperm Basal Trithuria submersa (Figure 2E-2F). Les deux anticorps ont été suggérés pour être des marqueurs moléculaires pour les lignées cellulaires gametophytic dans les usines9.
Les erreurs courantes à ce protocole sont normalement faciles à détecter et à identifier. Lorsque les lavages sont ignorés ou que les puits de réaction sont laissés sécher, l’anticorps secondaire apparaît habituellement comme un frottis non spécifique couvrant sans discernement les cellules, les tissus, la résine et la glissière (figure 3A). Des agrégats de fluorochrome vert se formeront si l’anticorps primaire non lié n’a pas été correctement emporté(figure 3B). Une autre cause fréquente d’échec de cette technique est liée au pliage et/ou au détachement des sections (figure 3C), rendant l’expérience inutile. Ce problème est généralement lié soit à une mauvaise adhérence des sections aux diapositives, probablement en raison de l’utilisation de toboggans impurs, et / ou le lavage agressif.
La préparation de l’échantillon est également une étape cruciale de cette procédure. Heureusement, les problèmes fixatifs et d’intégration les plus courants sont faciles à repérer (Figure 3D). Si tout va bien, le bloc de résine sera exempt de fissures et l’échantillon sera clairement visible avec une couleur jaune pâle à brun clair (figure 3D-1). Les échantillons incrustés de façon inefficace montreront des taches blanches poudreuse ou deszones (figure 3D-2). Garder la taille de l’échantillon sous 8 mm est important pour garantir la pénétration de la solution fixative. Lorsque les échantillons sont mal fixés, ils apparaissent brun foncé presque noir (figure 3D-3). Aussi la température de polymérisation est importante à la fois pour la préservation des épitopes et le durcissement approprié de la résine. Une température excessive peut faire craquer la résine rendant impossible la sectionnement de l’échantillon (Figure 3D-4).
Figure 1. Vue d’ensemble du protocole complet. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Résultats typiques des ARG et de l’immunolocalisation de la pectine dans les échantillons de plantes. (A) LM6 étiquetage de moiety arabinan de pectines dans une anthère quercus suber dans la méiose I. (B) Étiquetage spécifique de faibles pectines méthylé-estérifiées dans une pointe de racine d’embryon quercus suber par JIM5. (C) Xylogalacturonan étiqueté par LM8 dans l’endosperme de recul d’un suber Quercus mûrissant gland. (D) Jim13 étiquetage des AGPs dans le tapetum et les tétrads d’une anthère Arabidopsis thaliana. (E) AGPs étiquetés par JIM8 dans les papilles stigmatisantes de Trithuria submersa. (F) JIM8 étiquetage AGPs au micropyle (flèche blanche) d’un ovule Trithuria submersa. Microspore méiotique (Mc), Tapetum (Tp), Racine (R), Pointe de racine (Rt), Testa (Ts), Endosperm (Ed), Embryon (Em), Epidermis (Ep), Papille stigmatique (SP), Ovule (OV). Barres d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Erreurs et problèmes courants pendant le protocole. (A) L’échec des étapes de lavage sont identifiés par la présence d’un frottis non spécifique d’anticorps secondaires (+ ) surla résine échantillon. (B) La faible spécificité ou la défaillance du lavage de l’anticorps primaire entraîne la formation d’agrégats FITC (+) non collés à un endroit spécifique. (C) Les plis et le détachement de section sont souvent le résultat d’un lavage agressif et de toboggans impurs. (D) Exemples de fixation et d’intégration d’échantillons; (1) taille et intégration parfaites de l’échantillon, (2) défaillance de l’intégration, (3) défaillance de fixation de l’échantillon, (4) défaillance du durcissement de la résine. Anticorps étiquetés FITC (vert) et calcofluor blanc tache (bleu). Barres d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1. (A) Représentation schématique de la séquence de coupe de bloc pour la préparation de l’échantillon (bloc jaune) pour la section avec l’ultramicrotome. Tout d’abord, la capsule de gélatine est enlevée (1). Ensuite, ils sont d’abord coupés à un angle de 40° à 45° sur les côtés de la capsule tangentiellement à l’échantillon (2), une seconde coupe est faite à 90° de la première (3) suivie d’une troisième (4) et quatrième suivant la même règle (5). De cette première phase de coupe résulte une structure pyramidale dont le sommet est situé au-dessus de l’échantillon. Enfin, avec une lame tranchante, le sommet est rasé perpendiculairement à l’axe principal du bloc de résine pour atteindre l’échantillon intégré. Une surface carrée ou trapézoïde doit être obtenue à la fin de la procédure (6). (B) Fournitures nécessaires pour faire une chambre d’incubation; papier d’aluminium (1), ruban adhésif à double face (2), essuie-tout (3) et une boîte à pointe pipette. (C) Première étape, le papier d’aluminium est fixé à la boîte avec le ruban adhésif à double face. (D) Deuxième étape, le porte-pointes pipette est enlevé pour placer des serviettes en papier au fond de la boîte. (E) Troisième étape, les serviettes en papier sont amorties avec de l’eau et le porte-pointes pipette est remis à agir a un plateau pour les diapositives. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Liste des anticorps monoclonaux utiles. Le tableau ci-dessus représente un exemple d’anticorps disponibles, avec des informations sur leurs cibles et où ils peuvent être achetés. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La méthode d’immunolocalisation fluorescente chez les plantes décrite ici, bien que parfaitement simple, repose sur le succès de plusieurs petits pas. Le premier est la préparation et la fixation de l’échantillon. Au cours de cette première étape, un mélange de formaldéhyde et de glutaraldehyde est utilisé pour croiser la majorité des composants cellulaires. Le formaldéhyde dans la solution fournit une fixation douce et réversible tandis que le glutaraldehyde fournit un lien plus fort et plus permanent ; l’équilibre entre les deux fixatifs fournit la quantité appropriée de liaison croisée, permettant à l’exposition des épitopes de réagir avec l’anticorps primaire10. Pour que la solution fixative fonctionne correctement, l’échantillon doit être petit. Les grandes structures de plus de 7 mm de diamètre sont très difficiles à fixer et doivent être coupées pour assurer une pénétration fixative.
Après une blessure ou un stress, certaines plantes sécrètent de grandes quantités de tanins formant des précipités foncés qui peuvent réagir avec le formaldéhyde interférer avec le processus fixatif. Garder les échantillons sur la glace et remplacer la solution fixative chaque fois qu’elle devient trouble contribue à réduire cet effet. L’air peut également interférer avec le processus fixatif et plus tard dans l’intégration et le durcissement de la résine. Le traitement sous vide proposé devrait éliminer la majeure partie de l’air. Pour les tissus particulièrement aérostés, l’étape du vide peut être prolongée de plus de 2 h, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’air qui sort des échantillons et qu’ils descendent vers le fond. Tout échantillon trouvé flottant après l’étape fixative de nuit doit être jeté. L’intégration de résine fournit le soutien pour couper l’échantillon préservé, et sa dureté devrait être approximative aux tissus incorporés10. LR-White est disponible en trois catégories de dureté: dur pour les tissus boisés fortement sclérifiés, de qualité moyenne pour la grande majorité des tissus des feuilles aux grains de pollen, et de qualité molle pour les tissus plus délicats. Pour une intégration parfaite, la résine doit pénétrer complètement l’échantillon; ceci est mieux obtenu avec une infiltration lente et progressive. Avec des tests préalables, des périodes d’incubation plus courtes peuvent être utilisées. Les capsules de gélatine sont à la fois petites et hermétiquement étanches, ce qui les rend parfaites pour le séchage en résine LR-White. Pour une taille 2 (0,37 mL), le séchage doit être complet après 24 h à 58 °C. Pour les autres tailles de capsules, le temps de séchage doit être ajusté. La résine durcie LR-White doit passer de presque incolore à une couleur dorée/ambrée légère et se sentir dur pour les ongles. La coupe d’échantillons et l’utilisation de l’ultra-microtome nécessitent de la pratique mais produiront des chiffres clairs. L’épaisseur et la taille de la section sont importantes pour l’analyse d’imagerie et d’immunolocalisation. L’épaisseur de la section doit être maintenue autour de 500 nm. Les sections trop minces entraîneront une mauvaise coloration et des épaisseurs de section de plus de 700 nm interféreront avec l’acquisition et la résolution de l’image. La nature hydrophilique de la résine LR-White permet une utilisation directe des sections dans la coloration et l’immunolocalisation sans enlever la résine.
La solution de blocage (5% de lait sec non gras en 1 M PBS) réduit la liaison non spécifique des anticorps. Le lait sec sans gras a été une alternative fiable à bsa ou à d’autres agents de blocage plus traditionnels, et est nettement moins cher. La solution de blocage doit être filtrée à travers un filtre à papier avant utilisation, afin d’éviter les précipités qui se forment dur pour laver les agrégats, retenir les anticorps, et compromettre l’expérience. Les ratios d’anticorps proposés et les temps d’incubation ont été optimisés et appliqués avec succès àdiverses espèces dans plusieurs études 9,11,12,13,14,15,16.
L’évaporation et l’exposition à la lumière sont deux questions qui doivent être évitées pendant la procédure d’immunolocalisation. Une chambre d’incubation humide et sombre résout ces deux problèmes. Un tutoriel sur la façon de faire une chambre sombre peut être trouvé dans la figure supplémentaire 1B-1E. Ce protocole d’immunolocalisation exige l’utilisation d’un anticorps primaire dirigé vers l’épitope cible sans étiquette propre, et d’un anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome (FITC) qui est soulevé contre l’anticorps primaire IgG. Cette méthode offre plusieurs avantages par rapport à l’utilisation d’un système unique de détection des anticorps en raison d’une rigueur accrue de la détection, car l’anticorps secondaire n’a aucune affinité avec l’espèce cible de l’échantillon. Ce système offre un signal accru car les molécules primaires d’anticorps peuvent être ciblées par plusieurs molécules de l’anticorps secondaire, chacune portant un fluorochrome17.
La décomposition des fluorochromes par la lumière intense, ou blanchiment photo, est une question importante dans cette technique. Surtout lors de l’exploration de signaux localisés faibles, le signal peut devenir irréversiblement perdu avant l’imagerie. Le milieu de montage augmente considérablement la stabilité et la durée de vie des fluorochromes18; cependant, il est fortement conseillé de tester le support de montage, car certains peuvent réagir avec la tache et /ou le fluorochrome, formant des précipités et brouillant l’image. La configuration du système optique utilisé pour l’observation et l’enregistrement de l’immunolocalisation est l’un des aspects les plus importants pour le succès de cette expérience. En raison de l’épaisseur réduite des sections, les avantages de l’utilisation du microscope confocal sont limités. La configuration la plus réussie nécessite un microscope conventionnel d’épifluorescence verticale équipé d’une source de lumière fluorescente, led ou ampoule aumercure 19, avec des objectifs adéquats de qualité fluorescence. Des filtres de lumière de bonne qualité réglés pour l’excitation/émission (nm) 358/461 pour UV et 485/530 pour fitc sont exigés. Pour l’acquisition d’image de fluorescence, les appareils photo numériques monochromes réfrigérés sont recommandés en raison de leur vitesse et sensibilité élevées, mais sacrifient l’information vraiede couleur 20. Les caméras polychromes offrent la possibilité de trier facilement le signal de la fluorescence de fond, mais sont plus lentes et beaucoup moins sensibles que leurs homologues monochromes.
La méthode est limitée par la disponibilité d’anticorps spécifiques. Malgré la disponibilité d’une vaste et croissante collection d’anticorps destinés aux épitopes végétaux, il est compréhensible que tous les composés végétaux ne soient pas encore couverts. En outre, les lipides ont tendance à être extraits par la méthode d’intégration décrite, et n’est donc pas recommandé pour les tissus à haute teneur en huile. La section Cryostat peut être une alternative, malgré le sacrifice de la résolution d’image. La température de la polymérisation de résine LR-White peut dans certains cas modifier des épitopes plus sensibles. Si l’épitope cible est sensible à la température, changez LR-Blanc pour la résine LR-Gold. Polymérisant à -25 °C sous lumière blanche, LR-Gold offre une excellente conservation des épitopes thermosensibles, mais nécessitera l’acquisition d’un appareil spécialisé de polymérisation et est légèrement plus toxique que LR-White.
Cette méthode a été utilisée dans un large éventail d’espèces et de tissus. Il permet un accès rapide à des informations fiables sur la distribution spécifique de l’épitope. Offrir des données à l’appui des modèles évolutifs et identifier des marqueurs et des adaptations spécifiques dans les cellules et les tissus tout en fournissant des résultats visuellement attrayants. L’utilisation d’anticorps conjugués à des fluorochromes sur des solutions de conjuguées à la peroxydose ou à la phosphatase alcaline10,prend moins de temps, est beaucoup moins sujette aux artefacts de surréaction et fournit une résolution subcellulaire claire difficile à assortir à toute autre technique. L’utilisation d’anticorps spécifiques aux polymères liés à la paroi cellulaire permet de mieux comprendre l’agencement des composés dans des domaines très restreints. Une telle résolution serait difficile à obtenir à partir d’outils biochimiques traditionnels. L’ensemble sans cesse croissant d’anticorps primaires disponibles offre de nouvelles possibilités constantes de découverte dans le fonctionnement interne des cellules végétales.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs ont reçu le soutien du projet de l’UE 690946 « SexSeed » (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) financé par H2020-MSCA-RISE-2015 et SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. Amp a reçu une subvention du projet MSCA-IF-2016 de l’Union européenne (n° 753328). MC a reçu une subvention de la FCT PhD grant SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Absolute ethanol | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size should fit the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| Vacuum chamber | na | na | |
| Vacuum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
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