Summary
Denne protokollen beskriver i detalj hvordan plantematerialet for immunolokalisering av arabinogalaktane proteiner og pektiner er fast, innebygd i en hydrofil akrylharpiks, seksjonert og montert på glasssklier. Vi viser celleveggrelaterte epitoper vil bli oppdaget med spesifikke antistoffer.
Abstract
Planteutvikling innebærer konstante justeringer av celleveggsammensetningen og strukturen som svar på både interne og eksterne stimuli. Cellevegger består av cellulose og ikke-cellulosiske polysakkarider sammen med proteiner, fenoliske forbindelser og vann. 90% av celleveggen består av polysakkarider (f.eks. pektiner) og arabinogalaktanproteiner (AgPs). Den fluorescerende immunolokaliseringen av spesifikke glykole epitoper i plante histologiske seksjoner er fortsatt et viktig verktøy for å avdekke ombygging av veggpolysakkaridnettverk, struktur og komponenter.
Her rapporterer vi en optimalisert fluorescerende immunolokaliseringsprosedyre for å oppdage glykole epitoper fra AgPs og pektiner i plantevev. Paraformaldehyd/glutaraldehyd fiksering ble brukt sammen med LR-White innebygging av planteprøvene, noe som gir bedre bevaring av vevsstrukturen og sammensetningen. Tynne deler av de innebygde prøvene oppnådd med en ultramikrotom ble brukt til immunolokalisering med spesifikke antistoffer. Denne teknikken gir god oppløsning, høy spesifisitet, og muligheten til å oppdage flere glykole epitoper i samme prøve. Denne teknikken tillater subcellulær lokalisering av glykomaner og oppdager deres akkumuleringsnivå i celleveggen. Det tillater også bestemmelse av spatio-temporale mønstre av AGP og pektindistribusjon under utviklingsprosesser. Bruken av dette verktøyet kan til slutt veilede forskningsretninger og knytte glyanser til bestemte funksjoner i planter. Videre kan informasjonen som er innhentet utfylle biokjemiske og genuttrykksstudier.
Introduction
Plantecellevegger er komplekse strukturer som består av polysakkarider og glykoproteiner. Cellevegger er ekstremt dynamiske strukturer hvis arkitektur, organisering og sammensetning varierer i henhold til celletype, lokalisering, utviklingsstadium, ytre og interne stimuli1. Arabinogalactan proteiner (AgPs) og pektiner er viktige komponenter i plantecelleveggen. AgPs er svært glykosylert proteiner og pektiner er homogalacturonan polysakkarider hvis sammensetning, mengde og struktur varierer sterkt under ulike planteutviklingsstadier2,3,4. AgPs og pektin studier har avslørt deres engasjement i flere planteprosesser som programmert celledød, respons på abiotiske påkjenninger, seksuell plantegjengivelse, blant mange andre5. De fleste av disse studiene startet med informasjon hentet fra immunolokaliseringsstudier.
Gitt sin kompleksitet krever studiet av cellevegger mange forskjellige verktøy. Påvisning av glykole epitoper ved hjelp av monoklonale antistoffer (mAbs) er en verdifull tilnærming for å løse polysakkarid og glykoproteindistribusjon langs denne strukturen. Det er en stor samling av mAbs tilgjengelig for å oppdage glykol epitoper og spesifisiteten til hver mAb blir kontinuerlig forbedret samt6. Teknikken som er beskrevet er gjeldende for alle plantearter, og er et perfekt verktøy for å veilede fremtidige forskningsretninger som kan innebære dyrere og komplekse teknikker.
I denne teknikken er spesifikke antistoffer kjemisk konjugert til fluorescerende fargestoffer som FITC (fluoresceinisotyocyanat), TRITC (tetrametylrhodamine-5-(og 6)-isothiocyanat) eller flere Alexa Fluor fargestoffer. Immunofluorescens gir flere fordeler, slik at en klar og rask subcellulær lokalisering av glykoler som kan observeres direkte under et fluorescensmikroskop. Det er svært spesifikt og følsomt, siden utarbeidelsen av prøven effektivt kan beskytte antigenets naturlige struktur, selv om det er tilstede i lavere mengder. Det gjør det mulig å oppdage flere antigener i samme prøve og viktigst, gir høy kvalitet og visuelt vakre resultater. Til tross for den store kraften som tilbys av fluorescens immunolocalization studier, de er ofte ansett som vanskelig å utføre og implementere mest sannsynlig på grunn av mangel på detaljerte protokoller slik at visualisering av de ulike trinnene i prosedyren. Her gir vi noen enkle retningslinjer for hvordan du utfører denne teknikken og hvordan du får bilder av høy kvalitet.
For protokollen som presenteres her, må prøvene først festes og bygges inn ved hjelp av det mest hensiktsmessige fikseringsmiddelet. Selv om det anses som en tidkrevende og relativt kjedelig teknikk, er riktig fiksering og innebygging av planteprøven nøkkelen for å sikre en vellykket immunolokaliseringsanalyse. For dette formålet er den vanligste kjemisk fiksering ved hjelp av kryssbindingsfikser, som aldehyder. Kryssbindingsfikser etablerer kjemiske bindinger mellom molekyler i vevet, stabiliserer og herder prøven. Formaldehyd og glutaraldehyd er krysskoblingsfikser, og noen ganger brukes en blanding av begge fikseringsmidler7. Formaldehyd tilbyr stor strukturell bevaring av vev og i lengre perioder, produserer små vev tilbaketrekking og være kompatibel med immunstaining. Glutaraldehyd er et sterkere og stabilt fikseringsmiddel som vanligvis brukes i kombinasjon med formaldehyd. Bruken av glutaraldehyd har noen ulemper som må tas i betraktning som det introduserer noen gratis aldehyd grupper i fast vev, som kan generere noen uspesifik merking. Også krysskobling mellom proteiner og andre molekyler av og til kan gjøre noen mål epitoper utilgjengelige for antistoffene. For å unngå dette må antallet og varigheten av fikseringen defineres nøye.
Etter fiksering er prøver innebygd i riktig harpiks for å herde før de får delene. London Harpiks (LR-White) akrylharpiks er harpiks av valget for immunolokalisering studier. I motsetning til andre harpikser er LR-White hydrofil, slik at antistoffene kan nå sine antigener, uten behov for behandling for å lette det. LR-White har også fordelen av å tilby lav auto-fluorescens, slik at en reduksjon i bakgrunnsstøy under immunofluorescensavbildning.
Det er mange farging teknikker tilgjengelig for å oppdage ulike komponenter i celleveggen, for eksempel Alcian blå flekker, toluidin blå flekker eller periodisk syre-Schiff (PAS) farging. Ingen av disse tilbyr kraften i immunlokaliseringsanalyser8. Denne tilnærmingen gir større spesifisitet i påvisning av glykomaner, og tilbyr større informasjon om celleveggsammensetning og struktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøveforberedelse: fiksering, dehydrering og LR-hvit innebygging
- Fiksering og dehydrering
MERK: Fikseringsprosessen er avgjørende for å bevare prøven. ved å kryssbinde molekyler stoppes cellulær metabolisme, noe som sikrer cellulær integritet og forhindrer molekylær diffusjon. Fikseringsmidler og konsentrasjonen som brukes må justeres til dette formålet, slik at antigenene er tilstrekkelig utsatt for å samhandle med antistoffene. Følgende protokoll kombinerer den milde fikseringsevnen til paraformaldehyd, med den sterkere effekten av glutaraldehyd. Deres proporsjoner ble optimalisert for AGPs og celleveggkomponenter, men det er egnet for andre proteiner og cellestrukturer. Den påfølgende dehydreringsprosessen vil forberede prøvene for LR-White-innebygging. Plantevev fra flere plantearter ble brukt i dette eksperimentet. Quercus suber prøver ble samlet inn fra trær dyrket i feltet. Trithuria submersa prøver ble vennlig delt med oss av Paula Rudall (Kew Gardens, London, STORBRITANNIA).- Så alle Arabidopsis planter direkte på jord og vokse i et innendørs vekstanlegg med 60% relativ fuktighet og en dag / natt syklus på 16 h lys ved 21 ° C og 8 h mørke ved 18 ° C. Velg plantevevet som skal analyseres, og trim prøver for å være ikke mer enn 16 mm2 i størrelse.
- Overfør prøven umiddelbart til et hetteglass med et hetteglass som tidligere var fylt med nok kald fikseringsmiddelløsning (2 % formaldehyd (w/v), 2,5 % glutaraldehyd (w/v), 25 mM RØR pH 7 og 0,001 % Tween-20 (v/v)) for å senke prøvene helt ned (figur 1A).
FORSIKTIG: Formaldehyd og glutaraldehyd er begge fikseringsmidler som kan være skadelige ved innånding og kontakt. Utfør fikseringstrinnet på en røykhette og bruk tilstrekkelig verneklær og nitrilhansker. Alle løsninger fra dette trinnet og utover, inkludert alkoholserier til 70%, bør lagres for senere dekontaminering av spesialiserte ansatte. - Etter å ha samlet alle prøvene, oppdater fikseringen.
- Overfør hetteglassene til et vakuumkammer, og påfør sakte vakuum. Når du når -60 kPa, vil det flytende materialet begynne å synke til bunnen av hetteglasset (figur 1B).
- Oppbevars under et vakuum på ikke mer enn -80 kPa i 2 timer ved romtemperatur.
- Slipp vakuumet langsomt, forsegle hetteglasset med glass og plasser over natten ved 4 °C.
- Kast eventuelle prøver som ikke synker under fikseringen over natten. Vask de resterende prøvene med 25 mM PBS pH 7 i 10 min, etterfulgt av en 20 min vask i 25 mM RØRbuffer pH 7.2.
- Dehydrere prøvene i en etanolserie (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, og 3x 100% etanol) i 20 min hver. Overfør umiddelbart de dehydrerte prøvene til merkede hetteglass for innebygging (figur 1C).
MERK: Dehydreringsprosessen kan settes på pause ved 70 % etanoltrinn.
- LR-Hvit harpiks innebygging
MERK: LR-hvit er en ikke-hydrofob akrylharpiks med lav viskositet, noe som gjør den ideell for gjennomtrengende vev med mange tykke cellevegger lag. LR-White kommer også i flere hardhetskvaliteter som er kompatible for å kutte de fleste planteprøver. Pass på at den brukte harpiksen allerede er levert med riktig katalysator blandet inn, eller følg leverandørinstruksjonene for å klargjøre harpiksen. Følgende innebyggingsprosess er treg, men resultatene rettferdiggjør sterkt midlene.- Viderefør prøvene ved å inkubere med LR-White harpiks i en rekke halvmånekonsentrasjon av harpiks (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) i etanol, inkubering i 24 t ved 4 ° C i hvert trinn.
FORSIKTIG: LR-hvit harpiks er en lav toksisitet akryl harpiks; Det kan imidlertid være irriterende for huden ved kontakt og innånding. Det anbefales sterkt å arbeide i et godt ventilert område eller under en røykhette med passende verneklær og nitrilhansker. - Oppdater den LR-hvite harpiksen og inkuber i ytterligere 12 timer ved 4 °C.
- Klargjør passende størrelse innebygging gelatin kapsler (størrelse 1 (0,5 ml) for prøver opp til 3 mm, 2 x 0,37 ml for prøver opp til 5 mm eller 3 x 0,3 ml for prøver opp til 8 mm, og papirkoder (figur 1D).
MERK: Velg kapselstørrelsen som skal være litt større enn prøven, slik at prøven kan være helt omsluttet av harpiksen. Husk også å merke kodene med en blyant, fordi penn eller trykt blekk vil forurense harpiksen, ødelegge prøven. - Påfør en dråpe fersk LR-hvit harpiks på bunnen av hver kapsel.
- Legg en prøve i hver gelatinkapsel og fyll til maksimal kapasitet med fersk harpiks. Plasser kapselhetten og trykk forsiktig for å danne en hermetisk forsegling (figur 1E).
- Polymeriser harpiksen i 24 til 48 timer ved 58 °C, eller til den er herdet.
- Oppbevar prøvene ved romtemperatur.
MERK: Etter polymerisering LR-hvit harpiks er inert.
- Viderefør prøvene ved å inkubere med LR-White harpiks i en rekke halvmånekonsentrasjon av harpiks (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) i etanol, inkubering i 24 t ved 4 ° C i hvert trinn.
2. Skyv klargjøring
MERK: Glasssklier må være rene, fri for støv, fett eller andre forurensninger. Selv nye sklier må rengjøres som noen leverandører bruker oljer og vaskemidler for å hindre lysbildene fra å stikke sammen. Fett eller vaskemiddel vil forstyrre seksjons vedheftet til lysbildet, selv om det behandles med poly-L-lysin. Lo og støv vil påvirke prøvens observasjoner og muligens ødelegge eksperimentet. Teflon belagte lysbilder med reaksjonsbrønner er perfekte for denne oppgaven. De er rimelige, gjenbrukbare og drastisk redusere mengden antistoffløsning som trengs. Med riktig rengjøring kan utmerket kvalitet fluorescerende immunlokalisering utføres til en svært rimelig pris.
-
Skyv vask
- Plasser lysbildene i et fargestativ og dekk med rengjøringsløsning (0,1 % SDS (w/v), 1 % eddiksyre (v/v), 10 % etanol (v/v)).
- Opprettholde en mild agitasjon i 20 min.
- Overfør fargestativene til et ddH2 O-badmed mild omrøring i 10 min. Gjenta 4 ganger.
- Tøm stativene forsiktig før du dypper kort i 100 % etanol og la lysbildene tørke i et støvfritt miljø.
- Oppbevares til bruk.
-
Poly-L-lysinbelegg (valgfritt)
MERK: Små seksjoner holder seg vanligvis veldig bra for å rengjøre glasssklier. Dette trinnet kan bare anbefales for større seksjoner (> 2 mm2). Større seksjoner har en tendens til å brette og rynke, og er ikke tilrådelig. Likevel, om nødvendig bruk reaksjon lysbilder med større hull. Rengjør dem som ovenfor og gå frem som følger.- Plasser rene lysbilder i en firkantet petriskål. Pipette 0,001% poly-L-lysinløsning (m/v) for å dekke hullene på lysbildene, uten å renne over.
- La lysbildene tørke over natten ved 40 °C i lukkede Petri-retter.
MERK: De bestrøkede skliene er klare til umiddelbar bruk og kan oppbevares i støvfritt miljø ved romtemperatur i flere måneder.
3. Prøvebeskjæring og snitting
-
Prøvebeskjæring
- Med et skarpt barberblad kan du trimme LR-White-blokkene under et stereomikroskop for å danne en pyramideformet struktur der toppunktet er vinkelrett på utvalgets interesseområde (Tilleggsfigur 1A).
MERK: Ultramikrotomprøveholderen er et utmerket verktøy for å feste blokken. Hvis enheten ikke har en universell prøveholder, bruker du den som passer best for runde blokker. - Trim pyramidestrukturen ved å fjerne fine skiver av overflødig harpiks vinkelrett på pyramidens hovedakse.
- Fortsett til prøven er nådd danner skjæreoverflaten. Innenfor skjæreoverflaten bør målprøven ideelt sett omsluttes i en trapesform.
MERK: Harpiksblokken kan trimmes ytterligere i en spaltevinkel for å redusere snittoverflaten med et skarpt blad (figur 1F).
- Med et skarpt barberblad kan du trimme LR-White-blokkene under et stereomikroskop for å danne en pyramideformet struktur der toppunktet er vinkelrett på utvalgets interesseområde (Tilleggsfigur 1A).
-
Semi-tynn snitting
MERK: En mikrotom med glasskniver vil bli brukt. Antistoffets evne til å binde seg til epitopen vil føre til immunolabelreaksjonssuksessen. Den hydrofile naturen til LR-White harpiks vil tillate god kontakt av antistoffene med prøveseksjonene. Tynnere seksjoner vil presentere svakere Calcofluor fargestoff som skal brukes til å lokalisere seksjonene og bistå med bildebehandlingsprosessen. Det samme gjelder for andre flekker som senere kan påføres. Også overdreven tykkelse vil påvirke bildeanskaffelseskvaliteten. Et godt kompromiss for seksjonstykkelse kan bli funnet mellom 200 og 700 nm, avhengig av vevsegenskapene. Monter blokkene tett på prøveholderen på ultramikrotomen.- Med en ultramikrotom, lag seksjoner med en tykkelse mellom 200 og 700 nm (figur 1G).
- Kontroller seksjonsområdet ved å overføre noen seksjoner til en ddH2O-dråpe på et glasssklie. Plasser skyv på en 50 °C kokeplate til vannet fordamper. Beiset plasserer en dråpe på 1 % Toluidin Blue O (m/v) i 1 % borsyreoppløsning (w/v) over seksjonene i 30 s. Skyll og observer under mikroskopet.
- Når du finner ønsket struktur, overfører du en eller to seksjoner til hver dråpe ddH 2 O som tidligere er plassert på hverbrønnav et rent reaksjonslysbilde.
- Plasser hvert lysbilde i en lukket ren 10 cm firkantet petriskål og la den tørke ved 50 °C.
- Lagre lysbilder i en ren arkivboks til bruk.
4. Immunolokalisering
MERK: Den fluorescerende immunlokaliseringsprosedyren er avhengig av sekvensiell bruk av to antistoffer. Det primære antistoffet er hevet mot et bestemt målantigen. Det sekundære antistoffet er hevet spesielt mot det primære antistoffet, og for fluorescerende teknikker konjugeres til en fluorofor (FITC i denne spesifikke protokollen). Det primære antistoffet vil bli brukt til å oppdage målantigenet i prøven, og det sekundære antistoffet vil bli brukt til å markere stedet der det primære antistoffet er koblet til prøven etter vask av overflødig primært antistoff. Kontroller er en viktig del av denne analysen og må alltid utføres for å sikre nøyaktigheten av observasjonene. En brønn på lysbildet bør reserveres for bruk som en negativ kontroll, hvor den primære antistoffbehandlingen vil bli hoppet over, og derfor bør det ikke observeres noe signal på slutten av forsøket. En positiv kontroll må inkluderes i forsøket ved å behandle en godt med et antistoff som merking allerede er kjent og sikkert. Den positive kontrollen brukes til å bekrefte den sekundære antistoffmerkingseffektiviteten og reaksjonsforholdene mens den negative kontrollen tester den sekundære antistoffspesifisiteten.
- Forbered et inkubasjonskammer ved å plassere noen dempede papirhåndklær nederst på en pipettespissboks og pakke den med tinnfolie (Tilleggsfigur 1B-1E). Plasser lysbildene i inkubasjonskammeret.
- Pipette en 50 μL dråpe per 8 mm brønn med blokkeringsløsning (5 % fettfri tørrmelk (w/v) i 1 M PBS) og inkuber i 10 min. Fjern blokkeringsløsningen og vask alle brønnene to ganger med PBS i 10 min.
- Klargjøre de primære antistoffløsningene (se tilleggstabell 1), 1:5 (v/v) antistoff i blokkeringsløsning; estimat på ca. 40 μL per 8 mm godt.
MERK: Konsentrasjonen av antistoffet må justeres i henhold til produsentens protokoll. - Utfør en siste vask med ddH2O i 5 min, la aldri brønnene tørke helt.
- Pipette den primære antistoffløsningen på reaksjonsbrønnene. Pipetteblokkeringsløsning til kontrollbrønnene.
- Lukk inkubasjonskammeret og la stå i 2 timer ved romtemperatur etterfulgt av over natten ved 4 °C. Forbered den sekundære antistoffløsningen, 1 % i blokkeringsløsning (v/v) ca. 40 μL per brønn. Hold den dekket med tinnfolie.
- Vask alle brønnene to ganger med PBS i 10 min, etterfulgt av 10 ekstra minutter med ddH2O. Kontroller at det ikke er spor etter blokkeringsløsningen eller avleiringene er synlige på brønnene.
- Pipette den sekundære antistoffløsningen til alle brønner. Fra nå av beskytter du lysbildene mot lys.
- Inkuber i 3–4 timer i mørket ved romtemperatur.
- Vask alle brønnene to ganger i 10 min med PBS etterfulgt av en annen vask på 10 min med ddH2O.
- Påfør en dråpe calcofluor (1:10,000 (w / v) fluorescerende lysere 28 i PBS) til hver brønn. Uten vask, påfør en dråpe monteringsmedium (se Materialtabell) på hver brønn og plasser en dekkslipp (figur 1H).
- Vær oppmerksom på et fluorescensmikroskop, utstyrt med objektivet 10x/0,45, 20x/0,75, 40x/0,95 og 100x/1.40, UV (for calcofluor stain) og FITC-filtre, for å oppdage henholdsvis cellevegg og immunolokalisering (figur 1I). Bruk følgende bølgelengder: eksitasjon/utslipp (nm) 358/461 for UV og 485/530 for FITC.
- For en bedre visualisering av resultatene overlapper begge bildene med ImageJ eller lignende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I et vellykket eksperiment vil det sekundære antistoffet spesifikt finne plasseringen av den spesifikke epitopen i lys grønn, på en konsekvent måte, noe som åpner for karakterisering av celleveggsammensetningen på et bestemt utviklingsstadium av cellen, vevet eller organet. For eksempel LM6 antistoffet har en høy affinitet for 1,5-arabinan, en forbindelse med type-I rhamnogalacturonan som kan bli funnet rikelig merking celleveggen av den utviklende Quercus suber anther (Figur 2A),og dermed tillater å konkludere med at denne typen pektin er rikelig og en del av den primære celle veggsammensetningen. JIM5 har affinitet for homogalacturonans knapt forestret som vanligvis finnes på roten spissen av Quercus suber embryo, spesifisere mekaniske egenskaper av orgelet (Figur 2B). Xylogalacturonan er en type pektin rik på xylose forbundet med celleveggløsning, de finnes i degenererende celler. Antistoffet LM8 gjenkjenner spesielt xylogalacturonans, i modningsorganer kan det brukes til å oppdage degenererende celler eller vev, som endpermcellene i sluttfasen av Quercus suber eikenøttmodning (figur 2C).
JIM13 har affinitet for AgPs funnet på strukturer relatert til reproduksjon, cellelinjer relatert til mikrogametogenesis i Arabidopsis thaliana (Figur 2D). JIM8 gjenkjenner også epitoper av AgPs tilstede i celler og organer relatert til reproduksjon som stigmatisk papillae og mikropyle av Basal Angiosperm Trithuria submersa (Figur 2E-2F). Begge antistoffene har blitt foreslått å være molekylære markører for gametophytic cellelinjer i planter9.
Vanlige feil i denne protokollen er normalt enkle å oppdage og identifisere. Når vaskene hoppes over eller reaksjonsbrønnene slippes, vil det sekundære antistoffet vanligvis vises som et uspesifikt smørebelegg ukritisk over celler, vev, harpiks og lysbilde (figur 3A). Aggregater av grønn fluorokrom vil dannes hvis det ubegrensede primære antistoffet ikke er riktig vasket bort (figur 3B). En annen vanlig årsak til svikt i denne teknikken er relatert til folding og / eller løsrivelse av seksjonene (Figur 3C), noe som gjør eksperimentet ubrukelig. Dette problemet er vanligvis relatert til enten dårlig vedheft av seksjonene til lysbildene, sannsynligvis på grunn av bruk av urene lysbilder, og / eller aggressiv vask.
Prøveklargjøring er også et kritisk trinn i denne prosedyren. Heldigvis er de vanligste fikserings- og innebyggingsproblemene enkle å oppdage (figur 3D). Hvis alt går bra, vil harpiksblokken være fri for sprekker og prøven vil være tydelig synlig med en blek gul til lysebrun farge (figur 3D-1). Prøver ineffektivt innebygd vil vise pulverhvite flekker eller områder (figur 3D-2). Å holde prøvestørrelsen under 8 mm er viktig for å garantere inntrengning av den fikseringsmiddelløsningen. Når prøvene er dårlig festet, vil de virke mørkebrune nesten svarte (Figur 3D-3). Også temperaturen på polymerisering er viktig for både bevaring av epitoper og riktig herding av harpiksen. En overdreven temperatur kan føre til at harpiksen sprekker, noe som gjør snittingen av prøven umulig (figur 3D-4).
Figur 1. Oversikt over hele protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Typiske resultater fra AgPs og Pectin immunolocalization i planteprøver. (A) LM6 merking av arabinan moiety av pektiner i en Quercus suber anther i meiosis I. (B) Spesifikk merking av lav metyl-forestret pektiner i en Quercus suber embryo rot tips av JIM5. (C) Xylogalacturonan merket av LM8 i den tilbakevendende endasperm av en Quercus suber modning eikenøtt. (D) JIM13 merking av AgPs i tapetum og tetrads av en Arabidopsis thaliana anther. (E) AgPs merket av JIM8 i stigmatisk papillae av Trithuria submersa. (F) JIM8 merking AgPs på micropyle (hvit pil) av en Trithuria submersa ovule. Meiotisk mikrospor (Mc), Tapetum (Tp), Root (R), Root tip (Rt), Testa (Ts), Endperm (Ed), Embryo (Em), Epidermis (Ep), Stigmatisk papillae (SP), Ovule (OV). Skala barer: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vanlige feil og problemer under protokollen. (A)Svikt i vasketrinn identifiseres ved tilstedeværelse av uspesifiske smøring av sekundært antistoff (+) over prøveharpiks. (B)Den dårlige spesifisiteten eller vaskesvikten til det primære antistoffet resulterer i dannelsen av FITC aggregater (+) ikke bundet til et bestemt sted. (C) Folder og seksjonsavløsning er ofte et resultat av aggressiv vask og urene lysbilder. (D)Eksempler på prøvefiksering og innebygging; (1) perfekt prøvestørrelse og innebygging, (2) innebyggingsfeil, (3) prøvefikseringsfeil, (4) harpiksherdingsfeil. FITC merket antistoff (grønn) og Calcofluor-hvit flekk (blå). Skala barer: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstall 1. (A)Skjematisk representasjon av blokkbeskjæringssekvensen for klargjøring av prøven (gul blokk) for snitting med ultramikrotom. For det første fjernes gelatinkapselen (1). Deretter trimmes de først i en 40° til 45° vinkel til sidene av kapselen tangentielt til prøven (2), et andre kutt er laget ved 90° av den første (3) etterfulgt av en tredjedel (4) og fjerde etter samme regel (5). Fra denne første fasen av trimming resultater en pyramideformet struktur som toppen ligger over prøven. Til slutt, med et skarpt blad toppen er barbert av vinkelrett til harpiks blokk hovedaksen for å nå den innebygde prøven. En firkantet eller trapesoverflate bør oppnås på slutten av prosedyren (6). (B) Nødvendige forsyninger for å lage et inkubasjonskammer; tinnfolie (1), dobbeltsidig teip (2), papirhåndklær (3) og en pipettespissboks. (C) Første trinn, tinnfolie er festet til boksen med dobbeltsidig duct tape. (D) Andre trinn, pipette tips holderen er fjernet for å plassere papirhåndklær nederst på esken. (E) Tredje trinn, papirhåndklærne er dempet med vann og pipette tips holderen er plassert tilbake for å handle har et brett for lysbildene. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Liste over nyttige monoklonale antistoffer. Tabellen ovenfor representerer et eksempel på tilgjengelige antistoffer, med informasjon om målene deres og hvor de kan kjøpes. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den fluorescerende immunolokaliseringsmetoden i planter her beskrevet, mens det er sømløst enkelt, er avhengig av suksessen til flere små trinn. Den første av disse er prøveforberedelse og fiksering. I løpet av dette første trinnet brukes en blanding av formaldehyd og glutaraldehyd til å kryssbinde flertallet av cellekomponentene. Formaldehyd i løsningen gir en mild og reversibel fiksering mens glutaraldehyd gir en sterk mer permanent kobling; balansen mellom de to fikseringene gir riktig mengde kryssbinding, slik at eksponering av epitopene kan reagere med det primæreantistoffet 10. For at den fikseringsløsningen skal fungere som den skal, må prøven være liten. Store strukturer mer enn 7 mm i diameter er svært vanskelig å fikse og bør klippes for å sikre fikseringsmiddel.
Etter såret eller stress utskiller noen planter store mengder tanniner som danner mørke bunnstoffer som kan reagere med formaldehyd som forstyrrer fikseringsprosessen. Å holde prøvene på is og erstatte den fikserte løsningen når den blir overskyet bidrar til å redusere denne effekten. Luft kan også forstyrre fikseringsprosessen og senere i innebygging og herding av harpiksen. Den foreslåtte vakuumbehandlingen bør fjerne det meste av luften. For spesielt luftete vev kan vakuumtrinnet utvides lenger enn 2 timer, til det ikke kommer mer luft ut av prøvene og de synker til bunnen. Enhver prøve funnet flytende etter natten fikseringsmiddel trinn bør kastes. Harpiksinnbygging gir støtte for å kutte den bevarte prøven, og dens hardhet bør være omtrentlig med det innebygdevevet 10. LR-White kommer i tre hardhetskvaliteter: vanskelig for treaktig tungt sclerified vev, middels klasse for de aller fleste vev fra blader til pollen korn, og myk karakter for mer delikat vev. For en perfekt innebygging må harpiksen helt trenge inn i prøven; dette oppnås bedre med en langsom og gradvis infiltrasjon. Ved tidligere testing kan kortere inkubasjonsperioder brukes. Gelatinskapslene er både små og hermetisk forseglede, noe som gjør dem perfekte for LR-White harpiksherding. For en størrelse 2 (0,37 ml) skal herding være fullført etter 24 timer ved 58 °C. For andre kapselstørrelser bør herdingstiden justeres. LR-White spekeharpiks skal gå fra nesten fargeløs til en lys gylden / gul farge og føles vanskelig for neglene. Prøve trimming og bruk av ultra-mikrotom krever praksis, men vil produsere klare tall. Tykkelsen og størrelsen på seksjonen er viktig for bilde- og immunlokaliseringsanalysen. Snitttykkelsen skal holdes rundt 500 nm. Seksjoner som er for tynne vil resultere i dårlig farging og seksjonstykkelser over 700 nm vil forstyrre bildeoppkjøp og oppløsning. Den hydrofile naturen til LR-White harpiks muliggjør direkte bruk av seksjonene i farging og immunolokalisering uten å fjerne harpiksen.
Blokkeringsløsningen (5 % fettfri tørrmelk i 1 M PBS) reduserer uspesifisert binding av antistoffer. Ikke-fett tørrmelk har vært et pålitelig alternativ til BSA eller andre mer tradisjonelle blokkeringsmidler, og er betydelig billigere. Blokkeringsløsningen må filtreres gjennom et papirfilter før bruk, for å unngå bunnsetter som dannes vanskelig å vaske bort aggregater, beholde antistoffer og kompromittere eksperimentet. De foreslåtte antistoffforholdene og inkubasjonstidene er optimalisert og vellykket brukt på ulike arter i flerestudier 9,11,12,13,14,15,16.
Fordampning og utstilling til lys er to problemer som må unngås under immunlokaliseringsprosedyren. Et fuktig og mørkt inkubasjonskammer løser begge disse problemene. En tutorial på hvordan du lager et mørkt kammer kan bli funnet i supplerende figur 1B-1E. Denne immunolokaliseringsprotokollen krever bruk av et primært antistoff rettet mot målepitopen uten egen etikett, og et sekundært antistoff konjugert til et fluorokrom (FITC) som er hevet mot det primære antistoffet IgG. Denne metoden gir flere fordeler ved bruk av et enkelt antistoffdeteksjonssystem på grunn av økt strenghet av deteksjonen, da det sekundære antistoffet ikke har noen affinitet til målprøveartene. Dette systemet gir økt signal som de primære antistoffmolekylene kan målrettes av flere molekyler av det sekundære antistoffet, som hver bærer en fluorokrom17.
Forfallet av fluorokromer ved intenst lys, eller fotobleking, er et viktig problem i denne teknikken. Spesielt når du utforsker for svake lokaliserte signaler, kan signalet bli irreversibelt tapt før avbildning. Monteringsmediet øker i stor grad stabiliteten og levetiden til fluorokromene18; Det er imidlertid svært tilrådelig å teste monteringsmediet, da noen kan reagere med flekken og/eller fluorokromen, og danner bunnsprater og uskarpe bildet. Konfigurasjonen av det optiske systemet som brukes til å observere og registrere immunolokaliseringen er en av de viktigste aspektene for suksessen til dette eksperimentet. På grunn av seksjonenes reduserte tykkelse er fordelene ved å bruke det konfokale mikroskopet begrenset. Det mest vellykkede oppsettet krever et konvensjonelt oppreist epifluorescencemikroskop utstyrt med en fluorescerende lyskilde, LED ellerkvikksølvlyspære 19, med tilstrekkelig fluorescensklassemål. Også lysfiltre av god kvalitet som er satt for eksitasjon/utslipp (nm) 358/461 for UV og 485/530 for FITC kreves. For fluorescens bilde oppkjøp, nedkjølt monokromatiske digitale kameraer anbefales på grunn av deres høye hastighet og følsomhet, men ofre sann fargeinformasjon20. Polykromatiske kameraer gir muligheten til enkelt å sortere ut signal fra bakgrunnsfluorescens, men er langsommere og langt mindre følsomme enn deres monokromatiske kolleger.
Metoden er begrenset av tilgjengeligheten av spesifikke antistoffer. Til tross for tilgjengeligheten av en stor og voksende samling av antistoffer rettet mot planter epitoper, forståelig nok ikke alle planteforbindelser er ennå dekket. Lipider har også en tendens til å bli ekstrahert ved den beskrevne innebyggingsmetoden, og anbefales derfor ikke for vev med høyt oljeinnhold. Cryostat-delen kan være et alternativ, til tross for å ofre bildeoppløsning. Temperaturen på LR-White harpiks polymerisering kan i noen tilfeller endre mer følsomme epitoper. Hvis målpitopen er temperaturfølsom, bytter du LR-White for LR-Gold-harpiks. Polymerisere ved -25 °C under hvitt lys, tilbyr LR-Gold en utmerket bevaring av termosensitive epitoper, men vil kreve oppkjøp av et spesialisert polymeriseringsapparat og er litt mer giftig enn LR-White.
Denne metoden har blitt brukt på tvers av et bredt spekter av arter og vev. Det gir rask tilgang til pålitelig informasjon om spesifikk epitopdistribusjon. Tilbyr støttedata for evolusjonære modeller og identifisere markører og spesifikke tilpasninger i celler og vev samtidig som det gir visuelt fristende resultater. Bruk av antistoffer konjugert med fluorokromer over peroksidase eller alkalisk fosfatase konjugering alternativer10, er mindre tidkrevende, betydelig mindre utsatt for overreaksjon artefakter og gir en klar subcellulær oppløsning vanskelig å matche med noen annen teknikk. Bruken av antistoffer som er spesifikke for celleveggrelaterte polymerer gir et innblikk i arrangement av forbindelser i svært begrense domener. En slik løsning ville være utfordrende å få fra tradisjonelle biokjemiske verktøy. Det stadig voksende settet med primære antistoffer tilgjengelig gir konstante nye oppdagelsesmuligheter inn i plantecelle indre arbeid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne fikk støtte fra EU-prosjektet 690946 'SexSeed' (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) finansiert av H2020-MSCA-RISE-2015 og SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP mottok et stipend fra Den europeiske unions MSCA-IF-2016-prosjekt (nr. 753328). MC mottok et stipend fra FCT PhD-stipend SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Absolute ethanol | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size should fit the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| Vacuum chamber | na | na | |
| Vacuum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
- Keegstra, K.
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K.
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. Boston, MA. (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
