Summary
이 프로토콜은 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 면역지역화를 위한 식물 물질이 어떻게 고정되는지, 친수성 아크릴 수지에 내장되어, 단면화및 유리 슬라이드에 장착되는지 자세히 설명합니다. 우리는 세포벽 관련 전형이 특정 항체로 검출될 것임을 보여준다.
Abstract
식물 발달은 내부 및 외부 자극에 대한 응답으로 세포벽 조성 및 구조의 지속적인 조정을 포함한다. 세포벽은 단백질, 페놀 화합물 및 물과 함께 셀룰로오스 및 비 셀룰로오스 다당류로 구성됩니다. 세포벽의 90%는 다당류(예를 들어, 펙틴) 및 아라비노갈락탄 단백질(AGP)으로 구성된다. 식물 조직학적 섹션에서 특정 글리칸 에피토프의 형광 면역 국소화는 벽 다당류 네트워크, 구조 및 구성 요소의 리모델링을 발견하는 핵심 도구로 남아 있습니다.
여기서, 우리는 식물 조직에서 AGPs와 펙틴에서 글리칸 에피토프를 검출하기 위해 최적화 된 형광 면역 국소화 절차를보고합니다. 파라포름알데히드/글루타랄데히드 고정은 식물 샘플의 LR-White 포함과 함께 사용되어 조직 구조 및 조성물의 더 나은 보존을 가능하게 하였다. 초미세토메로 수득된 임베디드 샘플의 얇은 섹션은 특정 항체를 이용한 면역지역화를 위해 사용되었다. 이 기술은 뛰어난 해상도, 높은 특이성 및 동일한 샘플에서 여러 글리칸 에피토프를 감지 할 수있는 기회를 제공합니다. 이 기술은 글리칸의 세포 세포 소중화를 허용하고 세포벽에 축적의 그들의 수준을 검출합니다. 또한 발달 과정에서 AGP 및 펙틴 분포의 현수체 패턴의 결정을 허용합니다. 이 도구의 사용은 궁극적으로 연구 방향을 안내하고 식물의 특정 기능에 글리칸을 연결할 수 있습니다. 더욱이, 얻어진 정보는 생화학적 및 유전자 발현 연구를 보완할 수 있다.
Introduction
식물 세포벽은 다당류와 당단백질로 구성된 복잡한 구조입니다. 세포벽은 세포유형, 국소화, 발달단계, 외부 및 내부 자극1에따라 건축, 조직 및 구성이 변화하는 매우 역동적인 구조이다. 아라비노갈락탄 단백질(AgPs)과 펙틴은 식물 세포벽의 중요한 성분입니다. AGP는 매우 글리코화 단백질이며펙틴은 상이한 식물 발달 단계2,3,4동안 조성물, 양 및 구조가 크게 변화하는 균질균투로난 다당류이다. AgPs와 펙틴 연구는 프로그램 된 세포 죽음, 무생물 스트레스에 대한 반응, 성적 식물 번식, 많은 다른 사람의 사이에서5와같은 여러 식물 프로세스에 참여한 것으로 나타났습니다. 이 연구의 대부분은 면역 지역화 연구 결과에서 얻은 정보로 시작했습니다.
복잡성을 감안할 때 세포벽연구에는 다양한 도구가 필요합니다. 단일 클론 항체 (mAbs)를 사용하여 글리칸 에피토페를 검출하는 것은이 구조를 따라 다당류 및 당단백질 분포를 해결하는 귀중한 접근 방식입니다. 글리칸 에피토프를 검출할 수 있는 mAbs의 큰 컬렉션이 있으며 각 mAb의 특이성은지속적으로6개뿐만 아니라 지속적으로 개선되고 있다. 여기에 설명 된 기술은 모든 식물 종에 적용 할 수 있으며, 더 비싸고 복잡한 기술을 포함 할 수있는 미래의 연구 방향을 안내하는 완벽한 도구입니다.
이 기술에서, 특정 항체는 FITC (형광이소 이소티오네이트), TRITC (테트라메틸로다민-5-(및 6)-이소티오카네이트) 또는 몇몇 알렉사 플루오르 염료와 같은 형광염염에 화학적으로 공해된다. 면역 형광은 형광 현미경으로 직접 관찰 할 수있는 글리칸의 명확하고 빠른 세포 전산화를 허용하는 몇 가지 장점을 제공합니다. 시료의 제조가 항원의 자연적인 구조를 효과적으로 보호할 수 있기 때문에, 더 낮은 양으로 존재하는 경우에도 매우 특이적이고 민감하다. 그것은 동일한 샘플에서 여러 항원검출을 허용하고 가장 중요한, 높은 품질과 시각적으로 아름다운 결과를 제공합니다. 형광 면역 지역화 연구에 의해 제공되는 큰 힘에도 불구하고, 그들은 종종 절차의 다른 단계의 시각화를 허용하는 상세한 프로토콜의 부족으로 인해 수행하고 구현하기 어려운 것으로 간주됩니다. 여기에서는 이 기술을 수행하는 방법과 고품질 이미지를 얻는 방법에 대한 몇 가지 간단한 지침을 제공합니다.
여기에 제시된 프로토콜의 경우 가장 적절한 고정을 사용하여 샘플을 먼저 수정하고 포함시켜야 합니다. 시간이 많이 걸리고 비교적 지루한 기술로 간주되지만 식물 샘플의 적절한 고정 및 포함은 성공적인 면역 지역화 분석법을 보장하는 열쇠입니다. 이 목적을 위해, 가장 일반적인 알데히드 처럼 교차 고정제를 사용 하 여 화학 고정. 교차 연결 고정제 조직의 분자 사이의 화학 결합을 설정, 안정화 및 샘플을 경화. 포름알데히드와 글루타랄데히드는 교차 연결 고정제이며, 때로는 두 고정제의 혼합이7을사용한다. 포름알데히드는 조직의 훌륭한 구조적 보존을 제공하고 오랜 시간 동안 작은 조직 후퇴를 생성하고 면역 염색과 호환됩니다. 글루타랄데히드는 포름알데히드와 함께 일반적으로 사용되는 강하고 안정적인 고정제입니다. 글루타랄데히드의 사용은 일부 특이한 라벨을 생성할 수 있는 고정 된 조직에 일부 무료 알데히드 그룹을 도입할 때 고려해야 할 몇 가지 단점이 있습니다. 또한 단백질과 다른 분자 사이의 교차 연결은 때때로 항체를 위해 접근할 수 없는 몇몇 표적 전형체를 렌더링할 수 있습니다. 이를 방지하려면 고정의 수량과 기간을 신중하게 정의해야 합니다.
고정 후 샘플을 적절한 수지에 내장하여 단면을 얻기 전에 경화합니다. 런던 수지 (LR-화이트) 아크릴 수지는 면역 지역화 연구를위한 선택의 수지입니다. 다른 수지와는 달리, LR-White는 친수성, 항원에 도달 하는 항 원을 허용, 그것을 용이 하 게 어떤 치료의 필요 없이. LR-White는 또한 낮은 자동 형광을 제공하여 면역 형광 이미징 중 배경 소음을 줄이는 장점이 있습니다.
알시안 블루 스테인링, 토루이딘 블루 스테인링 또는 주기적인 산-쉬프(PAS) 염색과 같은 세포벽의 다양한 성분을 검출할 수 있는 많은 염색 기술이 있다. 이들 중 어느 것도 면역 지역화 분석8의힘을 제공하지 않습니다. 이 접근법은 글리칸 검출에 더 큰 특이성을 제공하여 세포벽 조성 및 구조에 관한 광범위한 정보를 제공합니다.
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Protocol
1. 샘플 준비 : 고정, 탈수 및 LR-화이트 포함
- 고정 및 탈수
참고: 고정 프로세스는 샘플을 보존하는 데 중요합니다. 분자를 교차 연결하 여 세포 대사 중단, 세포 무결성 보장 하 고 분자 확산을 방지. 고정제 및 사용된 농도는 그 목적에 맞게 조정되어야 하며, 항원이 항체와 상호 작용하기에 충분히 노출되어야 한다. 다음 프로토콜은 파라포름알데히드의 온화한 고정 능력과 글루타랄데히드의 더 강한 효과를 결합합니다. 그들의 비율은 AGPs 및 세포벽 분대에 최적화되었습니다, 그러나 그밖 단백질 및 세포 구조물에 적합합니다. 후속 탈수 공정은 LR-White 포함시 샘플을 준비합니다. 여러 식물 종에서 식물 조직은이 실험에 사용되었다. 퀘르쿠스 스터스터 샘플은 들판에서 자란 나무에서 수집되었습니다. 트리투리아 잠수함 샘플은 폴라 루달 (큐 가든, 런던, 영국)에 의해 친절하게 우리와 함께 공유되었다.- 모든 애기독시스 식물을 토양에 직접 뿌리고 실내 성장 시설에서 60%의 상대 습도와 16h의 16h 빛, 18°C에서 8시간 의 어둠을 가진 실내 성장 시설에서 자랍니다. 분석할 식물 조직을 선택하고 샘플을 16mm2 크기로 트리밍합니다.
- 샘플을 즉시 충분한 냉간 고정 용액(2% 포름알데히드(w/v), 2.5% 글루타랄데히드(w/v), 25m PIPES pH 7 및 0.001% Tween-20(v/v)으로 채워진 유리 유리병으로 즉시 전송하여 샘플을 완전히 침수시합니다(그림1A).
주의: 포름알데히드와 글루타랄데히드는 흡입과 접촉으로 인해 해로울 수 있는 고정작용제입니다. 연기 후드에 고정 단계를 수행하고 적절한 보호 복과 니트릴 장갑을 착용. 70%까지 알코올 계열을 포함한 이 단계이후의 모든 솔루션은 나중에 전문 직원에 의해 오염 제거를 위해 저장되어야 합니다. - 모든 샘플을 수집한 후 고정을 새로 고칩니다.
- 바이알을 진공 챔버로 옮기고 진공을 천천히 적용합니다. -60 kPa에 도달하면 부동 재료가 바이알(도1B)의바닥으로 가라앉기 시작합니다.
- 실온에서 2 시간 동안 -80 kPa 이하의 진공 상태에서 유지하십시오.
- 천천히 진공을 해제 유리 유리 유리 병을 밀봉하고 4 ° C에서 하룻밤 배치합니다.
- 하룻밤 고정 중에 가라앉지 않은 샘플을 폐기합니다. 나머지 샘플을 25m PBS pH 7로 10분 동안 세척한 다음 25m PIPES 버퍼 pH 7.2에서 20분 세척합니다.
- 에탄올 계열(25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 3x 100% 에탄올)에서 각각 20분 동안 샘플을 탈수한다. 탈수된 샘플을 임베드용 유리 바이알로 즉시이송합니다(그림 1C).
참고: 탈수 과정은 70% 에탄올 단계에서 일시 중지될 수 있습니다.
- LR-화이트 수지 포함
참고: LR-white는 점도가 낮은 비소수성 아크릴 수지이므로 두꺼운 세포벽 층이 많은 조직을 관통하는 데 이상적입니다. LR-White는 또한 대부분의 식물 샘플을 절단하기 위해 호환되는 여러 경도 등급에 있습니다. 사용된 수지는 이미 혼합된 적절한 촉매와 함께 공급되고 있는지 확인하거나 공급 업체의 지침을 따라 수지를 준비하십시오. 다음 포함 과정은 느리지만 결과는 크게 수단을 정당화.- 에탄올에서 일련의 초승달 농도(1:3, 2:3, 1:1, 3:1, 1:0)에서 LR-화이트 수지로 배양하여 샘플을 침투시키고, 각 단계에서 4°C에서 24시간 동안 배양한다.
주의: LR-화이트 수지는 독성이 낮은 아크릴 수지; 그러나, 접촉 및 흡입에 의해 피부에 자극이 될 수 있다. 통풍이 잘 되는 지역이나 적절한 보호복과 니트릴 장갑을 착용한 연기 후드 아래에서 작업하는 것이 좋습니다. - LR-화이트 수지와 4°C에서 12시간 추가로 배양한다.
- 최대 3mm의 시료에 적합한 크기 포함 젤라틴 캡슐(크기 1(0.5mL)을 준비하여 최대 5mm 또는 최대 3 x 0.3mL의 시료를 위한 2 x 0.37mL, 종이태그(그림 1D)를준비한다.
참고: 표본을 수지에 완전히 동봉할 수 있도록 캡슐 크기를 샘플보다 약간 더 크게 선택합니다. 또한 펜이나 인쇄된 잉크가 수지를 오염시키고 샘플을 파괴하기 때문에 태그를 연필로 레이블을 지정해야 합니다. - 각 캡슐의 바닥에 신선한 LR-화이트 수지 1방울을 바치면 됩니다.
- 각 젤라틴 캡슐에 샘플을 넣고 신선한 수지로 최대 용량으로 채웁니다. 캡슐 캡을 놓고 부드럽게 눌러 밀폐씰(그림 1E)을형성합니다.
- 수지는 58°C에서 24~48시간 또는 완전히 경화될 때까지 중합한다.
- 실온에서 샘플을 저장합니다.
참고: 포스트 폴리머화 LR-화이트 수지는 불활성이다.
- 에탄올에서 일련의 초승달 농도(1:3, 2:3, 1:1, 3:1, 1:0)에서 LR-화이트 수지로 배양하여 샘플을 침투시키고, 각 단계에서 4°C에서 24시간 동안 배양한다.
2. 슬라이드 준비
참고: 유리 슬라이드는 먼지, 그리스 또는 기타 오염 물질이 없는 깨끗해야 합니다. 일부 공급업체는 오일과 세제를 사용하여 슬라이드가 함께 달라붙지 않도록 하기 때문에 새로운 슬라이드도 청소해야 합니다. 모든 그리스 또는 세제는 폴리 L-리신으로 처리하더라도 슬라이드에 대한 섹션 접착을 방해합니다. 보풀과 먼지는 표본의 관측에 영향을 미치고 실험을 망칠 가능성이 매우 높습니다. 반응 우물테플론 코팅 슬라이드는이 작업에 적합합니다. 그들은 저렴 한, 재사용 하 고 크게 필요한 항체 용액의 양을 줄일 수 있습니다. 적절한 세척을 통해 우수한 품질의 형광 면역 지역화는 매우 저렴한 비용으로 수행 될 수 있습니다.
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슬라이드 세척
- 슬라이드를 스테닝 랙에 놓고 클리닝 용액(0.1% SDS(w/v), 1% 아세트산(v/v), 10% 에탄올(v/v)으로 덮습니다.
- 20 분 동안 가벼운 동요를 유지합니다.
- 염색 랙을 10분 동안 가벼운 교반으로 ddH2O 욕조로 옮긴다. 4번 반복합니다.
- 100% 에탄올에 잠깐 담그기 전에 랙을 조심스럽게 배출하고 먼지가 없는 환경에서 슬라이드를 건조시키십시오.
- 사용할 때까지 보관하십시오.
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폴리 L-리신 코팅(선택 사항)
참고: 작은 섹션은 일반적으로 유리 슬라이드를 청소하는 데 매우 잘 붙어 있습니다. 이 단계는 더 큰 섹션(>2mm 2)에만 권장됩니다. 더 큰 섹션은 접기와 주름경향이 있으며, 바람직하지 않습니다. 그럼에도 불구하고 필요한 경우 더 큰 구멍이있는 반응 슬라이드를 사용하십시오. 위와 같이 청소하고 다음과 같이 진행하십시오.- 깨끗한 슬라이드를 광장 페트리 접시에 놓습니다. 파이펫 0.001% 폴리 L-리신 용액(w/v)이 오버플로하지 않고 슬라이드의 구멍을 덮습니다.
- 닫힌 페트리 접시에서 40 °C에서 밤새 슬라이드를 건조시키십시오.
참고: 코팅된 슬라이드는 즉시 사용할 수 있으며 실온에서 몇 달 동안 먼지가 없는 환경에 보관할 수 있습니다.
3. 샘플 트리밍 및 단면
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샘플 트리밍
- 날카로운 면도날로, 스테레오 현미경으로 LR-화이트 블록을 트림하여 정점이 시료의 관심 영역에 수직인 피라미드 모양의 구조를 형성한다(보충도 1A).
참고: 초미세항편 홀더는 블록을 보호하는 훌륭한 도구입니다. 장치에 범용 표본 홀더가 없는 경우 원형 블록에 가장 적합한 시편 홀더를 사용합니다. - 피라미드 의 주요 축에 수직으로 초과 수지의 미세 조각을 제거하여 피라미드 구조를 트림.
- 시료가 절단 표면을 형성할 때까지 진행합니다. 절단 표면 내에서 대상 샘플은 이상적으로 사다리꼴 모양으로 동봉되어야 합니다.
참고: 수지 블록은 슬릿 각도로 더 트리밍하여 날카로운블레이드(그림 1F)로단면 표면적을 줄일 수 있습니다.
- 날카로운 면도날로, 스테레오 현미경으로 LR-화이트 블록을 트림하여 정점이 시료의 관심 영역에 수직인 피라미드 모양의 구조를 형성한다(보충도 1A).
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반박단면
참고: 유리 칼이 있는 마이크로토메가 사용됩니다. 에피토프에 결합하는 항체의 능력은 면역 라벨링 반응성공을 조건화할 것이다. LR-White 수지의 친수성 특성은 샘플 섹션과 항체의 좋은 접촉을 허용합니다. 얇은 섹션은 섹션을 찾고 이미징 프로세스를 지원하는 데 사용되는 희미한 Calcofluor 착색을 제시합니다. 나중에 적용될 수 있는 다른 얼룩도 마찬가지입니다. 또한 과도한 두께는 이미지 수집 품질에 영향을 미칩니다. 단면 두께에 대 한 좋은 타협 사이 찾을 수 있습니다 200 그리고 700 nm, 조직 특성에 따라. 초미세토메의 시편 홀더에 블록을 단단히 장착합니다.- 초미세토메로 두께가 200~700nm(그림1G)로단면을 만듭니다.
- 일부 섹션을 유리 슬라이드의 ddH2O 드롭으로 전송하여 단면을 확인합니다. 물이 증발 할 때까지 50 °C 핫 플레이트에 슬라이드를 놓습니다. 스테인은 30s의 섹션에 1 % Toluidine Blue O (w /v)를 1 % boric acid 솔루션 (w /v)에 떨어 뜨립니다. 헹구고 현미경으로 관찰하십시오.
- 원하는 구조를 찾으면 이전에 깨끗한 반응 슬라이드의 각 웰에 배치 된 ddH2O의 각 드롭에 하나 또는 두 개의 섹션을 전송합니다.
- 각 슬라이드를 10cm 정사각형 페트리 접시에 놓고 50°C에서 건조시하십시오.
- 슬라이드를 사용할 때까지 깨끗한 아카이브 상자에 보관합니다.
4. 면역 현지화
참고: 형광 면역 국소화 절차는 2개의 항체의 순차적인 사용에 의존합니다. 1차 항체는 특정 표적 항원에 대해 제기된다. 이차 항체는 1차 항체에 대하여 특별히 제기되고 형광 기술에 대한 형광 기술에 대한 (이 특정 프로토콜에서 FITC). 1차 항체는 시료에서 표적 항원을 검출하는 데 사용되며, 이차 항체는 1차 항체의 과잉을 씻어낸 후 시료에 연결된 1차 항체가 위치를 표시하는 데 사용될 것이다. 컨트롤은 이 분석의 중요한 부분이며 관측값의 정확성을 보장하기 위해 항상 수행해야 합니다. 슬라이드에 잘 1 개의 잘 부정적인 대조군으로 사용 하기 위해 예약 해야 합니다., 어디 기본 항체 처리 건너뛰기 됩니다., 따라서 어떤 신호 실험의 끝에 관찰 해야 합니다. 긍정적인 대조군은 이미 알려져 있고 확실하다는 항체로 잘 치료함으로써 실험에 포함되어야 한다. 상기 양성 조절은 이차 항체 의 특이성을 테스트하는 동안 이차 항체 라벨링 효과 및 반응 상태를 확인하는 데 사용된다.
- 파이펫 팁 박스 의 바닥에 젖은 종이 타월을 넣고 주석 호일(보충 도 1B-1E)로포장하여 인큐베이션 챔버를 준비하십시오. 슬라이드를 인큐베이션 챔버에 놓습니다.
- 파이펫은 블로킹 용액8mm당 50 μL 드롭(1M PBS의 무지방 건조 우유(w/v)을 5% 떨어뜨리고 10분 동안 배양합니다. 블로킹 용액을 제거하고 PBS로 모든 우물을 10 분 동안 두 번 씻으시면됩니다.
- 1차 항체 용액 준비(보충표 1참조), 1:5 (v/v) 차단 용액에서 항체; 8mm당 약 40μL의 추정치를 잘 확인합니다.
참고: 항체의 농도는 제조 프로토콜에 따라 조정되어야 합니다. - 5 분 동안 ddH2O로 마지막 세척을 수행하고 우물이 완전히 건조시키지 마십시오.
- 파이펫은 반응 웰에 대한 1 차 적인 항체 용액. 제어 우물에 대한 파이펫 차단 솔루션.
- 인큐베이션 챔버를 닫고 실온에서 2 시간 동안 방치한 다음 4 °C에서 하룻밤을 버티십시오. 이차 항체 용액을 준비, 1% 차단 용액 (v/v) 약 40 μL 당 우물 당. 주석 호일로 덮여 보관하십시오.
- PBS로 10분 동안 모든 우물을 두 번 씻고 ddH2O.로 10분 추가로 세척하여 우물에서 블로킹 용액이나 예금의 흔적이 보이지 않도록 하십시오.
- 모든 우물에 이차 항체 용액을 피펫. 이제부터 슬라이드를 빛으로부터 보호합니다.
- 실온에서 어둠 속에서 3-4 시간 동안 배양하십시오.
- PBS로 10분 동안 모든 우물을 두 번 씻고 ddH2O로 10분 간 세척합니다.
- 각 웰에 calcofluor (1:10,000 (w /v) 형광 밝은 28)를 적용합니다. 세탁하지 않고, 각 웰에 마운팅 매체(재료표 참조)를적용하고 커버슬립(그림1H)을놓습니다.
- 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 및 100x/1.40 렌즈가 장착된 형광 현미경으로 관찰하여 UV(칼코플루어 얼룩용) 및 FITC 필터를 사용하여 각각 세포벽과 면역국화를 감지합니다(그림1I). 다음 파장을 사용하십시오: 엑아지/배출(nm) 358/461 UV용, FITC의 경우 485/530.
- 결과를 더 잘 시각화하려면 두 이미지가 ImageJ 또는 이와 유사한 이미지와 겹칩니다.
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Representative Results
성공적인 실험에서, 이차 항체는 특히 밝은 녹색의 특정 에피토프의 위치를 일관되게, 세포, 조직 또는 기관의 특정 발달 단계에서 세포벽 조성물의 특성화를 가능하게 할 것이다. 예를 들어 LM6 항체는 1,5-아라비난에 대한 높은 친화성을 가지며, 개발 중인 퀘르쿠스 스터버 개미(그림2A)의세포벽을 풍부하게 라벨링하는 것을 발견할 수 있는 타입-I rhamnogalacturonan을 가진 화합물을 가지며, 따라서 이러한 유형의 펙틴이 풍부하고 1차 세포벽 조성물의 일부임을 결론지을 수 있다. JIM5는 일반적으로기관(도 2B)의기계적 특성을 지정하는 퀘르쿠스 스터배아의 루트 끝에서 발견되는 동균균투로난에 대한 친화력을 가지고 있다. Xylogalacturonan는 세포벽 느슨해지는 것과 관련되었던 자일로오스에 풍부한 펙틴의 모형입니다, 그(것)들은 퇴행성 세포에서 있습니다. 항체 LM8은 특히 자생 기관에서 크릴로갈락투로난을 인식하며, 성숙 기관에서 는 퀘르쿠스 스터버 도토리 성숙의 최종 단계 동안 내정자 세포와 같은 퇴행성 세포 또는 조직을 검출하는 데 사용될 수 있다(도2C).
JIM13은 생식과 관련된 구조에서 발견되는 AGP에 대한 친화력을 가지며, 아라비도시스 탈리아나에서 의 미세게임토발생과 관련된 세포주(도2D). JIM8은 또한 기저 혈관 정자 트리투리아 잠수함의 낙인 유두 및 미세 피와 같은 생식과 관련된 세포 및 장기에 존재하는 AGPs의 전형체(도 2E-2F)를인식합니다. 두 항체 모두 식물9에서게임토피틱 세포주를 위한 분자 마커로 제안되었다.
이 프로토콜의 일반적인 실수는 일반적으로 쉽게 감지하고 식별할 수 있습니다. 세차를 건너뛰거나 반응 우물이 건조하게 되면, 이차 항체는 일반적으로 세포, 조직, 수지 및슬라이드(도 3A)를통해 무차별적으로 덮는 특이한 얼룩으로 나타납니다. 녹색 불소크롬의 골재는 무한한 1차 항체가 제대로 세척되지 않은 경우 형성됩니다(도3B). 이 기술의 실패에 대한 또 다른 일반적인 원인은 섹션의 접기 및 /또는 분리와 관련이 있습니다(도 3C),실험을 쓸모없게 렌더링. 이 문제는 일반적으로 슬라이드에 섹션의 가난한 접착과 관련이, 아마도 때문에 부정 슬라이드의 사용, 또는 공격적인 세척.
샘플 준비는 또한 이 절차에서 중요한 단계입니다. 다행히도 가장 일반적인 고정 및 포함 문제는 쉽게 발견 할 수 있습니다(그림 3D). 모든 잘 되면 수지 블록균열이 없고 샘플은 옅은 노란색에서 밝은 갈색색(그림3D-1)으로명확하게 볼 수 있습니다. 비효율적으로 내장된 샘플은 분말백색 반점 또는영역(그림 3D-2)을표시합니다. 시료 크기를 8mm 미만으로 유지하는 것은 고정 솔루션의 침투를 보장하는 것이 중요합니다. 샘플이 제대로 고정되지 않으면 어두운 갈색이 거의 검은 색(그림 3D-3)으로나타납니다. 또한 중합의 온도는 전형체의 보존과 수지의 적절한 경화 모두에 중요하다. 과도한 온도로 인해 수지가 균열되어 시료의 단면이 불가능해질 수있습니다(도 3D-4).
그림 1. 전체 프로토콜의 개요입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 식물 샘플에서 AgPs 및 펙틴 면역 지역화의 전형적인 결과. (A)LM6 는 meiosis I.(B)JIM5에 의한 퀘르쿠스 스터바이스 배아 루트 팁에서 낮은 메틸 에스테란펙틴의 특정 라벨링에 펙틴의 아라비난 모에티라벨링. (C)LM8에 의해 표지된 Xylogalacturonan은 퀘르쿠스 구불 구불 한 도토리의 후퇴 내정자에. (D)기만상염 탈리아나 앤터의 테이퍼와 테트라드에서 AGPs의 JIM13 라벨링. (E) 트라이투리아 잠수함의 낙인 유두에 JIM8에 의해 표지된 AGPs.(F)JIM8 은 트리투리아 잠수의 마이크로파일(흰색 화살표)에서 AGPs를 라벨링한다. 메이오틱 현미경 (맥), 테이텀 (Tp), 루트 (R), 루트 팁 (Rt), 테스타 (Ts), 내정자 (에드), 배아 (엠), 표피 (Ep), 낙인 유두 (SP), Ovule (OV). 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 프로토콜 중 일반적인 실수와 문제. (A)세척 단계의 실패는 시료 수지 위에 이차 항체(+)의특이하지 않은 얼룩의 존재에 의해 식별된다. (b)1차 항체의 특이성 또는 세척 실패는 FITC 골재(+)의 형성을 특정 위치로 접합하지 않는 결과를 낳는다. (C)주름 및 단면 분리는 종종 공격적인 세척 및 부정한 슬라이드의 결과입니다. (D)샘플 고정 및 포함의 예; (1) 완벽한 샘플 크기 및 포함, (2) 임베딩 고장, (3) 샘플 고정 실패, (4) 수지 경화 고장. FITC는 항체(녹색) 및 칼코플루어-화이트 얼룩(파란색)으로 표시하였다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1. (A)초미세토메로 단면하기 위한 시료(Yellow block)를 준비하기 위한 블록 트리밍 서열의 회로도 표현. 첫째, 젤라틴 캡슐은 제거된다 (1). 그런 다음 먼저 캡슐의 측면에 40° ~ 45° 각도로 트리밍되어 샘플(2)에 접선으로, 두 번째 절단은 첫 번째 (3)의 90°에서 만들어지고 세 번째(4)와 같은 규칙(5)에 따라 네 번째컷이 만들어집니다. 트리밍의 첫 번째 단계에서 는 정상이 샘플 위에 있는 피라미드 모양의 구조를 생성합니다. 마지막으로, 날카로운 블레이드로 정상은 임베디드 샘플에 도달하기 위해 수지 블록 주요 축에 수직으로 면도된다. 정사각형 또는 사다리꼴 표면은 절차의 끝에 얻어져야 한다(6). (B)인큐베이션 챔버를 만들기 위해 필요한 소모품; 주석 호일 (1), 양면 덕트 테이프 (2), 종이 타월 (3) 및 파이펫 팁 박스. (C)첫 번째 단계, 주석 호일은 양면 덕트 테이프로 상자에 고정됩니다. (D)두 번째 단계, 파이펫 팁 홀더는 상자의 하단에 종이 타월을 배치하기 위해 제거됩니다. (E)3단계, 종이 타월은 물로 감축되고 파이펫 팁 홀더는 슬라이드용 트레이를 가지고 작동하도록 다시 배치됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 유용한 단일 클론 항체 목록. 위의 표는 그들의 표적및 어디에서 구입할 수 있는지에 대한 정보를 가진 유효한 항체의 예를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 식물의 형광 면역 지역화 방법은 원활하게 간단하면서도 여러 개의 작은 단계의 성공에 의존합니다. 첫 번째는 샘플 준비 및 고정입니다. 이 첫 번째 단계 동안, 포름알데히드와 글루타랄데히드의 혼합물은 세포 성분의 대부분을 교차 연결하는 데 사용된다. 용액의 포름알데히드는 부드럽고 뒤집을 수 있는 고정을 제공하며 글루타랄데히드는 더 영구적인 연결을 제공합니다. 두 고정제 사이의 균형은 적정량의 교차 연결을 제공하여 에피토프의 노출이 1차항체(10)와반응할 수 있도록 한다. 고정 솔루션이 제대로 작동하려면 샘플이 작아야 합니다. 직경이 7mm 이상인 대형 구조물은 고치기가 매우 어렵고 고정 침투를 보장하기 위해 잘립니다.
상처 나 스트레스 후, 일부 식물은 고정 과정을 방해하는 포름알데히드와 반응 할 수있는 어두운 침전을 형성하는 탄닌의 다량을 분비. 샘플을 얼음에 보관하고 흐려질 때마다 고정 솔루션을 교체하면 이 효과를 줄이는 데 도움이 됩니다. 공기는 또한 고정 프로세스를 방해할 수 있으며 나중에 수지의 포함 및 경화에 방해할 수 있습니다. 제안된 진공 처리는 공기의 대부분을 제거해야 합니다. 특히 통풍이 좋은 조직의 경우, 더 이상 공기가 샘플에서 나오지 않고 바닥으로 가라앉을 때까지 진공 단계는 2시간 이상 연장될 수 있습니다. 하룻밤 고정 단계 후에 떠있는 것으로 밝혀진 모든 샘플을 폐기해야 합니다. 수지 포함은 보존된 시료절단을 지원하고, 경도는 내장된조직(10)에근사되어야 한다. LR-White는 우디 무심도 조직을 위한 단단한, 잎에서 꽃가루 곡물에 이르는 대부분의 조직에 대한 중간 등급, 더 섬세한 조직을 위한 부드러운 등급의 세 가지 경도 등급으로 제공됩니다. 완벽한 포함을 위해 수지는 샘플을 완전히 관통해야합니다. 이것은 더 느리고 점진적인 침투로 더 잘 얻습니다. 이전 테스트를 사용하면 잠복기가 짧을 수 있습니다. 젤라틴 캡슐은 작고 밀폐밀봉가능하므로 LR-White 수지 경화에 적합합니다. 크기 2(0.37 mL)의 경우 58°C에서 24시간 후에 경화를 완료해야 합니다. 다른 캡슐 크기의 경우 경화 시간을 조정해야합니다. LR-White 경화 수지는 거의 무색에서 밝은 황금색/호박색으로 이동하여 손톱에 딱딱함을 느껴야 합니다. 샘플 트리밍 및 초미세 토메의 사용은 연습이 필요하지만 명확한 수치를 생성합니다. 단면도의 두께 및 크기는 화상 진찰 및 면역 국소화 분석에 중요합니다. 단면 두께는 약 500 nm를 유지해야합니다. 너무 얇은 섹션은 얼룩이 좋지 않고 700nm 이상의 단면 두께가 이미지 수집 및 해상도를 방해합니다. LR-White 수지의 친수성 특성은 수지를 제거하지 않고 염색 및 면역 지역화에서 섹션을 직접 사용할 수 있게 합니다.
차단 용액(1M PBS에서 5% 무지방 건조 우유)은 항체의 특이하지 않은 결합을 감소시킵니다. 무지방 건조 우유는 BSA 또는 다른 전통적인 차단 제에 대 한 신뢰할 수 있는 대안 되었습니다., 그리고 훨씬 저렴 한. 블로킹 용액은 골재를 씻어내고 항체를 유지하며 실험을 손상시키기 어려운 침전을 피하기 위해 사용하기 전에 종이 필터를 통해 필터링되어야 합니다. 제안된 항체 비 및 배양 시간은 여러 연구에서 다양한 종에 최적화되고 성공적으로 적용되어9,11,12,13,14,15,16.
빛에 증발 및 박람회는 면역 지역화 절차 도중 피해야 하는 두 가지 문제입니다. 습하고 어두운 인큐베이션 챔버는 이러한 두 가지 문제를 모두 해결합니다. 어두운 챔버를 만드는 방법에 대한 자습서는 보충 도 1B-1E에서찾을 수 있습니다. 이러한 면역현지화 프로토콜은 자체 라벨이 없는 표적 에피토프로 향하는 1차 항체의 사용을 요구하며, 1차 항체 IgG에 대해 제기된 플루오로크롬(FITC)에 공인하는 이차 항체를 요구한다. 이 방법은 이차 항체가 표적 샘플 종에 대한 친화력이 없기 때문에 검출의 증가된 문자열로 인해 단일 항체 검출 시스템의 사용에 비해 몇 가지 이점을 제공한다. 본 계통은 1차 항체 분자가 이차 항체의 몇몇 분자에 의해 표적으로 할 수 있기 때문에 증가한 신호를 제안합니다, 각각 불소크롬을운반하는 17.
강렬한 빛, 또는 사진 표백에 의해 불소 크롬의 붕괴는이 기술에 중요한 문제입니다. 특히 희미한 국소화 된 신호를 탐험 할 때, 신호는 이미징 전에 돌이킬 수 없게 손실 될 수 있습니다. 장착 매체는 형광크롬18의안정성과 수명을 크게 증가시킨다. 그러나, 일부 사람들이 얼룩 및/또는 형광과 반응하여 침전을 형성하고 이미지를 흐리게 하기 때문에 장착 매체를 테스트하는 것이 매우 좋습니다. 면역 지역화를 관찰하고 등록하는 데 사용되는 광학 시스템의 구성은 이 실험의 성공을 위한 가장 중요한 측면 중 하나입니다. 섹션의 감소 된 두께로 인해 공초점 현미경을 사용하는 이점이 제한됩니다. 가장 성공적인 설정은 적절한 형광 등급 목표를 가진 형광원, LED 또는 수은 전구19를갖춘 기존의 직립 형광 현미경이 필요합니다. 또한 엑아쥬/배출(nm) 358/461용과 FITC용 485/530에 설정된 양질의 라이트 필터도 필요합니다. 형광 이미지 획득을 위해 냉장 된 단색 디지털 카메라는 고속 과 감도로 인해 권장되지만 진정한 색상 정보(20)를희생하십시오. 다색 카메라는 배경 형광에서 신호를 쉽게 정렬 할 수있는 기능을 제공하지만 단색 대응보다 느리고 훨씬 덜 민감합니다.
이 방법은 특정 항체의 가용성에 의해 제한됩니다. 식물 에피토프를 겨냥한 항체의 광대하고 확장적인 수집의 가용성에도 불구하고, 당연히 모든 식물 화합물이 아직 덮여 있지 않습니다. 또한 지질은 기술된 임베딩 방법에 의해 추출되는 경향이 있으며, 따라서 오일 함량이 높은 조직에는 권장되지 않는다. Cryostat 섹션은 이미지 해상도를 희생에도 불구하고 대안이 될 수 있습니다. LR-백색 수지 중합의 온도는 어떤 경우에는 더 민감한 전형을 변경할 수 있습니다. 대상 에피토프가 온도에 민감한 경우 LR-골드 수지를 위해 LR-White를 전환합니다. 백색광 하에서 -25°C에서 중합, LR-Gold는 열민감성 에피토프의 우수한 보존을 제공하지만, 특수 중합 장치의 획득이 필요하며 약간 더 독성이 있는 LR-White.
이 방법은 종과 조직의 넓은 범위에 걸쳐 사용되었습니다. 이를 통해 특정 에피토프 분포에 대한 신뢰할 수 있는 정보에 빠르게 액세스할 수 있습니다. 시각적으로 유혹적인 결과를 제공하면서 진화 모델에 대한 지원 데이터를 제공하고 세포 와 조직의 마커 및 특정 적응을 식별합니다. 과산화효소 또는 알칼리인인스파아제 컨쥬게이션대안(10)을통해 불소크롬으로 접합된 항체의 사용은 시간이 적게 걸리고, 과잉 반응 아티팩트에 비해 훨씬 적게 걸리며, 다른 기술과 일치하기 어려운 명확한 세포 분해능을 제공한다. 세포벽 관련 폴리머에 특이적인 항체를 사용하면 매우 제한적인 도메인으로 화합물의 배열에 대한 통찰력을 허용합니다. 이러한 해결은 전통적인 생화학 적 도구에서 얻기 어려울 것입니다. 사용 가능한 1 차 적인 항체의 계속 확장 세트는 식물 세포 내부 작동에 일정한 새로운 발견 기회를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 H2020-MSCA-RISE-2015및 종자 바퀴 FCT PTDC / BIA-FBT / 27839 /2017에 의해 투자 된 EU 프로젝트 690946 '섹스 시드'(성적 식물 재생 - 종자 형성)로부터 지원을받았다. AMP는 유럽 연합의 MSCA-IF-2016 프로젝트(No. 753328)로부터 보조금을 받았습니다. MC는 FCT 박사 과정 보조금 SFRH/BD/111781/2015로부터 교부금을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Absolute ethanol | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size should fit the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| Vacuum chamber | na | na | |
| Vacuum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
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