Fluorescerende immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines in de celwand van plantenweefsels

Summary

Dit protocol beschrijft in detail hoe het plantaardige materiaal voor immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines is bevestigd, ingebed in een hydrofiele acrylhars, doorsneden en gemonteerd op glazen dia's. We laten zien dat celwandgerelateerde epitopen worden gedetecteerd met specifieke antilichamen.

Abstract

Plantontwikkeling omvat constante aanpassingen van de celwandsamenstelling en structuur als reactie op zowel interne als externe stimuli. Celwanden bestaan uit cellulose en niet-cellulosepolysachariden samen met eiwitten, fenolverbindingen en water. 90% van de celwand bestaat uit polysachariden (bijv. pectines) en arabinogalactan-eiwitten (APP's). De fluorescerende immunolocalisatie van specifieke glycanepotopen in histologische secties van planten blijft een belangrijk hulpmiddel om de renovatie van wandpolysaccharidenetwerken, structuur en componenten te ontdekken.

Hier rapporteren we een geoptimaliseerde fluorescerende immunolocalisatieprocedure om glycanepotopen van APP's en pectines in plantenweefsels te detecteren. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixatie werd gebruikt samen met LR-White inbedding van de plantenmonsters, waardoor een betere conservering van de weefselstructuur en samenstelling mogelijk was. Dunne delen van de ingebedde monsters verkregen met een ultra-microtome werden gebruikt voor immunolocalisatie met specifieke antilichamen. Deze techniek biedt een hoge resolutie, hoge specificiteit en de kans om meerdere glycan epitopen in hetzelfde monster te detecteren. Deze techniek maakt subcellulaire lokalisatie van glycanen mogelijk en detecteert hun accumulatieniveau in de celwand. Het maakt ook de bepaling van spatio-temporele patronen van AGP en pectineverdeling tijdens ontwikkelingsprocessen mogelijk. Het gebruik van deze tool kan uiteindelijk leidend zijn voor onderzoeksrichtingen en glycanen koppelen aan specifieke functies in planten. Bovendien kan de verkregen informatie een aanvulling vormen op biochemische en genexpressiestudies.

Introduction

Plantencelwanden zijn complexe structuren die bestaan uit polysachariden en glycoproteïnen. Celwanden zijn uiterst dynamische structuren waarvan de architectuur, organisatie en samenstelling variëren afhankelijk van celtype, lokalisatie, ontwikkelingsfase, externe en interne stimuli¹. Arabinogalactan-eiwitten (APP's) en pectines zijn belangrijke componenten van de plantencelwand. APP 's zijn sterk geglycosyleerde eiwitten en pectines zijn homogalacturonan polysachariden waarvan de samenstelling, hoeveelheid en structuur sterk variëren tijdens verschillende ontwikkelingsstadia^2,3,4. ASP's en pectinestudies hebben hun betrokkenheid bij verschillende plantprocessen aan het licht gebracht, zoals geprogrammeerde celdood, reactie op abiotische stress, seksuele plantenreproductie, en vele anderen⁵. De meeste van deze studies begonnen met informatie verkregen uit immunolocalisatiestudies.

Gezien de complexiteit vereist de studie van celwanden veel verschillende hulpmiddelen. Detectie van glycan epitopen met behulp van monoklonale antilichamen (mAbs) is een waardevolle aanpak om polysaccharide en glycoproteïne distributie langs deze structuur op te lossen. Er is een grote verzameling mAbs beschikbaar om glycan epitopen te detecteren en de specificiteit van elke mAb wordt ook voortdurend verbeterd⁶. De hier beschreven techniek is toepasbaar op alle plantensoorten en is een perfect hulpmiddel om toekomstige onderzoeksrichtingen te sturen die duurdere en complexere technieken met zich mee kunnen brengen.

In deze techniek worden specifieke antilichamen chemisch geconjugeerd aan fluorescerende kleurstoffen zoals FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat), TRITC (tetramethylrhodamine-5-(en 6)-isothiocyanaat) of verschillende Alexa Fluorkleurstoffen. Immunofluorescentie biedt verschillende voordelen, waardoor een duidelijke en snelle subcellulaire lokalisatie van glycanen mogelijk is die direct kan worden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop. Het is zeer specifiek en gevoelig, omdat de bereiding van het monster de natuurlijke structuur van het antigeen effectief kan beschermen, zelfs als het in lagere hoeveelheden aanwezig is. Het maakt de detectie van meerdere antigenen in hetzelfde monster mogelijk en het belangrijkste, biedt hoge kwaliteit en visueel mooie resultaten. Ondanks de grote kracht die wordt geboden door fluorescentie-immunolocalisatiestudies, worden ze vaak beschouwd als moeilijk uit te voeren en te implementeren, waarschijnlijk vanwege het ontbreken van gedetailleerde protocollen die de visualisatie van de verschillende stappen van de procedure mogelijk maken. Hier geven we enkele eenvoudige richtlijnen voor het uitvoeren van deze techniek en het verkrijgen van afbeeldingen van hoge kwaliteit.

Voor het protocol dat hier wordt gepresenteerd, moeten monsters eerst worden bevestigd en ingesloten met behulp van het meest geschikte fixatieve. Hoewel beschouwd als een tijdrovende en relatief vervelende techniek, is een goede fixatie en inbedding van het plantenmonster de sleutel om een succesvolle immunolocalisatietest te garanderen. Voor dit doel is chemische fixatie het meest gebruikelijk met behulp van crosslinking-fixatieven, zoals aldehyden. Cross-linking fixatieven vestigen chemische bindingen tussen moleculen van het weefsel, stabiliseren en verharden van het monster. Formaldehyde en glutaraldehyde zijn cross-linking fixatieven, en soms wordt een mix van beide fixatieven gebruikt⁷. Formaldehyde biedt een grote structurele conservering van weefsels en voor langere tijd, produceert kleine weefsel retracties en is compatibel met immunostaining. Glutaraldehyde is een sterker en stabiel fixatief dat meestal wordt gebruikt in combinatie met formaldehyde. Het gebruik van glutaraldehyde heeft enkele nadelen waarmee rekening moet worden gehouden, omdat het enkele vrije aldehydegroepen in het vaste weefsel introduceert, wat een aantal niet-specifieke etikettering kan genereren. Ook het kruisen tussen eiwitten en andere moleculen kan af en toe sommige doeleptopen ontoegankelijk maken voor de antilichamen. Om dit te voorkomen, moeten de hoeveelheid en duur van de fixatie zorgvuldig worden gedefinieerd.

Na fixatie worden monsters ingebed in de juiste hars om uit te harden voordat de secties worden verkregen. London Resin (LR-White) acrylhars is de hars bij uitstek voor immunolokalisatiestudies. In tegenstelling tot andere harsen is LR-White hydrofiel, waardoor de antilichamen hun antigenen kunnen bereiken, zonder dat er een behandeling nodig is om het te vergemakkelijken. LR-White heeft ook het voordeel dat het een lage autofluorescentie biedt, waardoor achtergrondgeluid tijdens immunofluorescentiebeeldvorming kan worden verkleind.

Er zijn veel kleuringstechnieken beschikbaar om verschillende componenten van de celwand te detecteren, zoals Alcaanse blauwe kleuring, toluidineblauwe kleuring of Periodieke acid-Schiff (PAS) kleuring. Geen van deze biedt de kracht van immunolocalisatieanalyses⁸. Deze aanpak geeft meer specificiteit in de detectie van glycanen en biedt uitgebreidere informatie over de samenstelling en structuur van de celwand.

Protocol

1. Monstervoorbereiding: fixatie, uitdroging en LR-White inbedding

1. Fixatie en uitdroging
   OPMERKING: Het fixatieproces is van cruciaal belang om het monster te behouden; door moleculen met elkaar te verbinden wordt het cellulaire metabolisme gestopt, waardoor de cellulaire integriteit wordt gewaarborgd en moleculaire diffusie wordt voorkomen. De fixatieve middelen en de gebruikte concentratie moeten daartoe worden aangepast, zodat de antigenen voldoende worden blootgesteld om met de antilichamen te interageren. Het volgende protocol combineert het milde fixatieve vermogen van paraformaldehyde, met het sterkere effect van glutaraldehyde. Hun verhoudingen werden geoptimaliseerd voor APP's en celwandcomponenten, maar het is geschikt voor andere eiwitten en celstructuren. Het daaropvolgende uitdrogingsproces bereidt de monsters voor op LR-White-inbedding. In dit experiment werden plantenweefsels van verschillende plantensoorten gebruikt. Quercus suber monsters werden verzameld van bomen gekweekt in het veld. Trithuria submersa monsters werden vriendelijk met ons gedeeld door Paula Rudall (Kew Gardens, Londen, VK).
   1. Zaai alle Arabidopsis planten direct op de grond en groei in een indoor groeifaciliteit met 60% relatieve luchtvochtigheid en een dag/nacht cyclus van 16 uur licht bij 21 °C en 8 uur duisternis bij 18 °C. Selecteer de te analyseren plantenweefsels en trim monsters om niet meer dan 16 mm² groot te zijn.
   2. Breng het monster onmiddellijk over naar een glazen flacon die eerder is gevuld met voldoende koude fixatieve oplossing (2% formaldehyde (w/v), 2,5% glutaraldehyde (w/v), 25 mM PIPES pH 7 en 0,001% Tween-20 (v/v)) om de monsters volledig onder te dompelen (figuur 1A).
      LET OP: Formaldehyde en glutaraldehyde zijn beide fixatieve middelen die schadelijk kunnen zijn bij inademing en contact. Voer de fixatiestap uit op een rookkap en draag voldoende beschermende kleding en nitrilhandschoenen. Alle oplossingen vanaf deze stap, inclusief alcoholreeksen tot 70%, moeten worden opgeslagen voor latere ontsmetting door gespecialiseerd personeel.
   3. Nadat u alle monsters hebt verzameld, vernieuwt u het fixatief.
   4. Breng de flacons over in een vacuümkamer en breng langzaam vacuüm aan. Bij het bereiken van -60 kPa begint het drijvende materiaal naar de bodem van de flacon te zinken (figuur 1B).
   5. Houd onder een vacuüm van niet meer dan -80 kPa gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
   6. Laat het vacuüm langzaam los, sluit de glazen flacon af en plaats 's nachts op 4 °C.
   7. Gooi alle monsters weg die niet zijn gezonken tijdens de nachtelijke fixatie. Was de resterende monsters met 25 mM PBS pH 7 gedurende 10 minuten, gevolgd door een wasbeurt van 20 minuten in 25 mM PIPES buffer pH 7,2.
   8. Droog de monsters uit in een ethanolreeks (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% en 3x 100% ethanol) gedurende elk 20 minuten. Breng de gedehydrateerde monsters onmiddellijk over naar gelabelde glazen flacons voor inbedding (figuur 1C).
      OPMERKING: Het uitdrogingsproces kan worden onderbroken bij de 70% ethanolstap.
2. LR-Witte hars inbedding
   OPMERKING: LR-wit is een niet-hydrofobe acrylhars met een lage viscositeit, waardoor het ideaal is voor het doordringen van weefsels met veel dikke celwandenlagen. LR-White is ook verkrijgbaar in verschillende hardheidsgraden die compatibel zijn voor het snijden van de meeste plantenmonsters. Zorg ervoor dat de gebruikte hars al wordt geleverd met de juiste katalysator gemengd, of volg de instructies van de leverancier om de hars te bereiden. Het volgende inbeddingsproces is traag, maar de resultaten rechtvaardigen de middelen aanzienlijk.
   1. Doordrenken de monsters door te incuberen met de LR-Witte hars in een reeks halvemaanconcentratie van hars (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) in ethanol, waarbij in elke stap gedurende 24 uur bij 4 °C wordt geïncubeerd.
      LET OP: LR-Witte hars is een acrylhars met een lage toxiciteit; het kan echter irriterend zijn voor de huid door contact en inademing. Werken in een goed geventileerde ruimte of onder een rookkap met passende beschermende slijtage en nitrilhandschoenen wordt ten zeerste aanbevolen.
   2. Ververs de LR-witte hars en incubeer gedurende nog eens 12 uur bij 4 °C.
   3. Bereid de juiste maat insluitbare gelatinecapsules (maat 1 (0,5 ml) voor monsters tot 3 mm, 2 x 0,37 ml voor monsters tot 5 mm of 3 x 0,3 ml voor monsters tot 8 mm en papieren tags (figuur 1D).
      OPMERKING: Selecteer de capsulegrootte om iets groter te zijn dan het monster, zodat het monster volledig in de hars kan worden ingesloten. Vergeet ook niet om de tags te labelen met een potlood, omdat pen of bedrukte inkten de hars zullen besmetten, waardoor het monster wordt geruïneerd.
   4. Breng één druppel verse LR-witte hars aan op de bodem van elke capsule.
   5. Plaats een monster in elke gelatinecapsule en vul tot maximale capaciteit met verse hars. Plaats de capsuledop en druk zachtjes aan om een hermetische afdichting te vormen (figuur 1E).
   6. Polymeriseer de hars gedurende 24 tot 48 uur bij 58 °C, of tot ze volledig uitgehard zijn.
   7. Bewaar monsters op kamertemperatuur.
      OPMERKING: Postpolymerisatie LR-witte hars is inert.

2. Diavoorbereiding

OPMERKING: Glazen glijbanen moeten schoon zijn, vrij van stof, vet of andere verontreinigingen. Zelfs nieuwe glijbanen moeten worden gereinigd, omdat sommige leveranciers oliën en reinigingsmiddelen gebruiken om te voorkomen dat de dia's aan elkaar plakken. Elk vet of reinigingsmiddel zal de sectiehechting op de dia verstoren, zelfs als het met poly-L-lysine wordt behandeld. Pluis en stof zullen de waarnemingen van het monster beïnvloeden en het experiment zeer waarschijnlijk verpesten. Teflon gecoate dia's met reactieputten zijn perfect voor deze taak. Ze zijn betaalbaar, herbruikbaar en verminderen drastisch de hoeveelheid antilichaamoplossing die nodig is. Met de juiste reiniging kan fluorescerende immunolocalisatie van uitstekende kwaliteit worden uitgevoerd tegen een zeer betaalbare prijs.

1. Dia wassen
   1. Plaats de glijbanen in een kleurrek en dek af met reinigingsoplossing (0,1% SDS (w/v), 1% azijnzuur (v/v), 10% ethanol (v/v)).
   2. Houd een milde agitatie gedurende 20 minuten.
   3. Breng de kleurrekken gedurende 10 minuten over in een ddH₂O bad met milde agitatie. Herhaal dit 4 keer.
   4. Laat de rekken voorzichtig uitlekken voordat u kort in 100% ethanol dompelt en laat de glijbanen drogen in een stofvrije omgeving.
   5. Bewaren tot gebruik.
2. Poly-L-lysine coating (optioneel)
   OPMERKING: Kleine secties plakken meestal heel goed om glazen dia's schoon te maken. Deze stap is alleen aan te bevelen voor grotere secties (>2 mm²). Grotere secties hebben de neiging om te vouwen en te rimpelen, en zijn niet aan te raden. Gebruik echter indien nodig reactieglijbanen met grotere gaten. Maak ze schoon zoals hierboven en ga als volgt te werk.
   1. Plaats schone glijbanen in een vierkante Petrischaal. Pipet 0,001% poly-L-lysineoplossing (w/v) om de gaten van de glijbanen te bedekken, zonder over te lopen.
   2. Laat de glijbanen 's nachts drogen bij 40 °C in gesloten Petrischaaltjes.
      OPMERKING: De gecoate glijbanen zijn klaar voor onmiddellijk gebruik en kunnen enkele maanden in een stofvrije omgeving bij kamertemperatuur worden bewaard.

3. Monster trimmen en snijden

1. Voorbeeld trimmen
   1. Knip met een scherp scheermesje de LR-Witte blokken af onder een stereomicroscoop om een piramidevormige structuur te vormen waarbij de top loodrecht staat op het interessegebied van het monster (Aanvullende figuur 1A).
      OPMERKING: De ultra-microtome monsterhouder is een uitstekend hulpmiddel om het blok te beveiligen. Als het apparaat geen universele monsterhouder heeft, gebruik dan de houder die het meest geschikt is voor ronde blokken.
   2. Trim de piramidale structuur door fijne plakjes van de overtollige hars loodrecht op de grote as van de piramide te verwijderen.
   3. Ga verder totdat het monster is bereikt en het snijoppervlak vormt. Binnen het snijoppervlak moet het doelmonster idealiter in een trapeziumvorm worden ingesloten.
      OPMERKING: Het harsblok kan verder worden bijgesneden onder een spleethoek om het doorsnedeoppervlak te verkleinen met een scherp mes (figuur 1F).
2. Halfdunne doorsnede
   OPMERKING: Er wordt een microtoma met glazen messen gebruikt. Het vermogen van het antilichaam om zich aan de epitoop te binden, zal het succes van de immunolabelingreactie conditioneren. Het hydrofiele karakter van de LR-Witte hars zorgt voor een goed contact van de antilichamen met de monstersecties. Dunnere secties zullen zwakkere Calcofluor-kleuring vertonen die zal worden gebruikt om de secties te lokaliseren en te helpen bij het beeldvormingsproces. Hetzelfde geldt voor andere vlekken die later kunnen worden aangebracht. Ook overmatige dikte heeft invloed op de kwaliteit van de beeldverwerving. Een goed compromis voor sectiedikte kan worden gevonden tussen 200 en 700 nm, afhankelijk van de weefselkenmerken. Monteer de blokken stevig op de monsterhouder van de ultramicrotome.
   1. Maak met een ultramicrotome secties met een dikte tussen 200 en 700 nm (figuur 1G).
   2. Controleer het sectiegebied door enkele secties over te brengen naar een ddH₂O-druppel op een glazen dia. Plaats de glijbaan op een kookplaat van 50 °C totdat het water verdampt. Vlek die een druppel van 1% Toluidine Blue O (w/v) in 1% boorzuuroplossing (w/v) gedurende 30 s over de secties plaatst. Spoel en observeer onder de microscoop.
   3. Breng bij het vinden van de gewenste structuur een of twee secties over naar elke druppel ddH₂O die eerder op elke put van een schone reactieschuif is geplaatst.
   4. Plaats elke glijbaan in een gesloten, schone vierkante petrischaal van 10 cm en laat deze drogen op 50 °C.
   5. Bewaar dia's in een schone archiefdoos tot ze worden gebruikt.

4. Immunolocalisatie

OPMERKING: De fluorescerende immunolocalisatieprocedure is gebaseerd op sequentiële gebruik van twee antilichamen. Het primaire antilichaam wordt verhoogd tegen een specifiek doelantigeen. Het secundaire antilichaam wordt specifiek tegen het primaire antilichaam verhoogd en voor fluorescerende technieken wordt geconjugeerd aan een fluorfore (FITC in dit specifieke protocol). Het primaire antilichaam zal worden gebruikt om het doelantigeen in het monster te detecteren en het secundaire antilichaam zal worden gebruikt om de locatie te markeren waar het primaire antilichaam dat op het monster is aangesloten na het afspoelen van het overtollige primaire antilichaam. Controles zijn een belangrijk onderdeel van deze test en moeten altijd worden uitgevoerd om de nauwkeurigheid van de waarnemingen te verzekeren. Een put op de dia moet worden gereserveerd voor gebruik als een negatieve controle, waarbij de primaire antilichaambehandeling wordt overgeslagen en daarom mag aan het einde van het experiment geen signaal worden waargenomen. Een positieve controle moet in het experiment worden opgenomen door een goed te behandelen met een antilichaam waarvan de etikettering al bekend en zeker is. De positieve controle wordt gebruikt om de effectiviteit en reactieomstandigheden van de secundaire antilichamenetikettering te bevestigen, terwijl de negatieve controle de secundaire antilichaamspecificatie test.

1. Bereid een incubatiekamer voor door wat gedempte papieren handdoeken aan de onderkant van een pipetpuntendoos te plaatsen en deze te verpakken met tinfolie(aanvullende figuur 1B-1E). Plaats de dia's in de incubatiekamer.
2. Pipetteer een druppel van 50 μL per 8 mm blokkeeroplossing (5% vetvrije droge melk (w/v) in 1 M PBS) en broed gedurende 10 minuten. Verwijder de blokkeringsoplossing en was alle putten twee keer met PBS gedurende 10 minuten.
3. Bereid de primaire antilichaamoplossingen voor (zie aanvullende tabel 1),1:5 (v/v) antilichaam in blokkerende oplossing; maak een schatting van ongeveer 40 μL per put van 8 mm.
   OPMERKING: De concentratie van het antilichaam moet worden aangepast volgens het protocol van de fabrikant.
4. Voer een laatste wasbeurt uit met ddH₂O gedurende 5 minuten, laat de putten nooit volledig drogen.
5. Pipetteer de primaire antilichaamoplossing voor de reactieputten. Pipet blokkerende oplossing voor de controleputten.
6. Sluit de incubatiekamer en laat 2 uur staan bij kamertemperatuur gevolgd door een nacht bij 4 °C. Bereid de secundaire antilichaamoplossing voor, 1% in de blokkeringsoplossing (v/v) ongeveer 40 μL per put. Houd het bedekt met tinfolie.
7. Was alle putten twee keer met PBS gedurende 10 minuten, gevolgd door 10 extra minuten met ddH₂O. Zorg ervoor dat er geen spoor van de blokkerende oplossing of afzettingen zichtbaar is op de putten.
8. Pipetteer de secundaire antilichaamoplossing voor alle putten. Bescherm de dia's vanaf nu tegen licht.
9. Incubeer gedurende 3-4 uur in het donker bij kamertemperatuur.
10. Was alle putten tweemaal gedurende 10 minuten met PBS gevolgd door nog een wasbeurt van 10 min met ddH₂O.
11. Breng een druppel calcofluor (1:10.000 (w/v) fluorescerend helderder 28 in PBS) aan op elke put. Breng zonder wassen een druppel montagemedium (zie Tabel met materialen)aan op elke put en plaats een afdeklip (figuur 1H).
12. Observeer met een fluorescentiemicroscoop, uitgerust met 10x/0,45, 20x/0,75, 40x/0,95 en 100x/1,40 lens, gebruik UV (voor calcofluorbeits) en FITC-filters om respectievelijk celwand- en immunolocalisatie te detecteren (figuur 1I). Gebruik de volgende golflengten: excitatie/emissie (nm) 358/461 voor UV en 485/530 voor FITC.
13. Voor een betere visualisatie van de resultaten overlappen beide afbeeldingen met ImageJ of iets dergelijks.

Representative Results

In een succesvol experiment zal het secundaire antilichaam specifiek de locatie van de specifieke epitoop in felgroen, op een consistente manier lokaliseren, waardoor de samenstelling van de celwand in een bepaald ontwikkelingsstadium van de cel, het weefsel of het orgaan kan worden gekarakteriseerd. Het LM6-antilichaam heeft bijvoorbeeld een hoge affiniteit voor 1,5-arabinan, een verbinding met type-I rhamnogalacturonan die overvloedig de celwand van de zich ontwikkelende Quercus-suber-ether (figuur 2A)kan labelen, waardoor kan worden geconcludeerd dat dit type pectine overvloedig is en deel uitmaakt van de primaire celwandsamenstelling. JIM5 heeft affiniteit met homogalacturonans die nauwelijks veresterd zijn en die meestal worden gevonden aan de wortelpunt van het suberembryo van Quercus, waarbij mechanische eigenschappen van het orgaan worden gespecificeerd (figuur 2B). Xylogalacturonan zijn een soort pectine rijk aan xylose geassocieerd met celwand losraken, ze worden gevonden in degenererende cellen. Het antilichaam LM8 herkent specifiek xylogalacturonans, in rijpende organen kan het worden gebruikt om degenererende cellen of weefsels te detecteren, zoals de endospermcellen tijdens de laatste stadia van de Quercus suber eikelrijping (figuur 2C).

JIM13 heeft affiniteit met APP's gevonden op structuren gerelateerd aan reproductie, cellijnen gerelateerd aan microgametogenese in Arabidopsis thaliana (Figuur 2D). JIM8 herkent ook epitopen van APP's die aanwezig zijn in cellen en organen die verband houden met reproductie, zoals de stigmatische papillae en micropyle van de Basale Angiosperm Trithuria submersa (Figuur 2E-2F). Beide antilichamen worden gesuggereerd als moleculaire markers voor de gametofytische cellijnen in planten⁹.

Veelgemaakte fouten in dit protocol zijn normaal gesproken gemakkelijk te detecteren en te identificeren. Wanneer de wasbeurten worden overgeslagen of de reactieputten worden laten drogen, zal het secundaire antilichaam meestal verschijnen als een niet-specifiek uitstrijkje dat lukraak over cellen, weefsels, hars en dia bedekt (figuur 3A). Aggregaten van groen fluorchroom vormen zich als het niet-gebonden primaire antilichaam niet goed is weggespoeld (figuur 3B). Een andere veel voorkomende oorzaak voor het falen van deze techniek is gerelateerd aan het vouwen en/of losmaken van de secties (figuur 3C), waardoor het experiment nutteloos wordt. Dit probleem is meestal gerelateerd aan ofwel slechte hechting van de secties aan de dia's, waarschijnlijk als gevolg van het gebruik van onreine dia's en / of agressief wassen.

De monstervoorbereiding is ook een cruciale stap in deze procedure. Gelukkig zijn de meest voorkomende fixatieve en insluitproblemen gemakkelijk te herkennen(figuur 3D). Als alles goed gaat, zal het harsblok vrij zijn van scheuren en zal het monster duidelijk zichtbaar zijn met een lichtgele tot lichtbruine kleur(figuur 3D-1). Monsters die inefficiënt zijn ingebed, vertonen poederwitte vlekken of gebieden(figuur 3D-2). Het is belangrijk om de monstergrootte onder de 8 mm te houden om de penetratie van de fixatieve oplossing te garanderen. Wanneer monsters slecht zijn bevestigd, zullen ze donkerbruin bijna zwart lijken (figuur 3D-3). Ook de temperatuur van polymerisatie is belangrijk voor zowel het behoud van de epitopen als de juiste verharding van de hars. Een te hoge temperatuur kan ervoor zorgen dat de hars barst waardoor het doorsneden van het monster onmogelijk wordt (figuur 3D-4).

Figuur 1. Overzicht van het volledige protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Typische resultaten van APP's en Pectine immunolocalisatie in plantenmonsters. (A) LM6-etikettering van arabinan moiety van pectines in een Quercus suber anther in meiose I. (B) Specifieke etikettering van laag methylveresterde pectines in een Quercus suber embryo wortelpunt door JIM5. (C) Xylogalacturonan gelabeld door LM8 in het terugtrekkende endosperm van een Quercus suber rijpende eikel. (D) JIM13 etikettering van AGV's in het tapetum en tetraden van een Arabidopsis thaliana anther. (E) AGV's die door JIM8 zijn geëtiketteerd in de stigmatische papillae van Trithuria submersa. (F) JIM8 die APP's labelt op de micropyle (witte pijl) van een Trithuria submersa ovule. Meiotische microspore (Mc), Tapetum (Tp), Root (R), Root tip (Rt), Testa (Ts), Endosperm (Ed), Embryo (Em), Epidermis (Ep), Stigmatische papillae (SP), Ovule (OV). Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Veelgemaakte fouten en problemen tijdens het protocol. (A) Het falen van wasstappen wordt geïdentificeerd door de aanwezigheid van een niet-specifiek uitstrijkje van secundair antilichaam (₊) over monsterhars. (B) De slechte specificiteit of wasfout van het primaire antilichaam resulteert in de vorming van FITC-aggregaten (+) die niet op een specifieke locatie zijn gebonden. (C) Plooien en sectieloslating zijn vaak het gevolg van agressieve was en onreine glijbanen. d) voorbeelden van monsterfixatie en inbedding; (1) perfecte monstergrootte en inbedding, (2) insluitfout, (3) monsterfixatiefout, (4) harsverhardingsfout. FITC gelabeld antilichaam (groen) en Calcofluor-witte vlek (blauw). Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1. (A) Schematische weergave van de blokafsnijdingsvolgorde voor het voorbereiden van het monster (geel blok) voor doorsneden met het ultramicrotoom. Ten eerste wordt de gelatinecapsule verwijderd (1). Vervolgens worden ze eerst in een hoek van 40° tot 45° ten opzichte van de zijkanten van de capsule tangentiaal aan het monster geknipt (2), een tweede snede wordt gemaakt op 90° van de eerste (3) gevolgd door een derde (4) en vierde na dezelfde regel (5). Vanaf deze eerste fase van het trimmen resulteert een piramidale structuur die zich boven het monster bevindt. Ten slotte wordt de top met een scherp mes loodrecht op de grote as van het harsblok geschoren om het ingebedde monster te bereiken. Aan het einde van de procedure (6) moet een vierkant of trapeziumvormig oppervlak worden verkregen. (B) Vereiste benodigdheden om een incubatiekamer te maken; tinfolie (1), dubbelzijdige duct tape (2), papieren handdoeken (3) en een pipet tip box. (C) Eerste stap, de tinfolie wordt bevestigd aan de doos met de dubbelzijdige duct tape. (D) Tweede stap, de pipet tips houder wordt verwijderd om papieren handdoeken te plaatsen aan de onderkant van de doos. (E) Derde stap, de papieren handdoeken worden bevochtigd met water en de pipet tips houder wordt terug geplaatst om te handelen heeft een dienblad voor de glijbanen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Lijst van nuttige monoklonale antilichamen. De bovenstaande tabel vertegenwoordigt een voorbeeld van beschikbare antilichamen, met informatie over hun doelen en waar ze kunnen worden gekocht. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De fluorescerende immunolocalisatiemethode in planten hier beschreven, hoewel naadloos eenvoudig, is gebaseerd op het succes van verschillende kleine stappen. De eerste is monstervoorbereiding en fixatie. Tijdens deze eerste stap wordt een mengsel van formaldehyde en glutaraldehyde gebruikt om de meerderheid van de celcomponenten te kruisen. De formaldehyde in de oplossing zorgt voor een milde en omkeerbare fixatie, terwijl de glutaraldehyde een sterke, meer permanente koppeling biedt; het evenwicht tussen de twee fixatieven zorgt voor de juiste hoeveelheid crosslinking, waardoor de blootstelling van de epitopen kan reageren met het primaire antilichaam¹⁰. Om de fixatieve oplossing goed te laten werken, moet het monster klein zijn. Grote structuren met een diameter van meer dan 7 mm zijn zeer moeilijk te bevestigen en moeten worden geknipt om fixatieve penetratie te garanderen.

Na verwonding of stress scheiden sommige planten grote hoeveelheden tannines af die donkere neerslagen vormen die kunnen reageren met het formaldehyde dat het fixatieve proces verstoort. Het in de ijskast houden van de monsters en het vervangen van de fixatieve oplossing wanneer deze troebel wordt, helpt dit effect te verminderen. Lucht kan ook interfereren met het fixatieve proces en later in de inbedding en verharding van de hars. De voorgestelde vacuümbehandeling moet het grootste deel van de lucht verwijderen. Voor bijzonder luchtige weefsels kan de vacuümstap verder dan 2 uur worden verlengd, totdat er geen lucht meer uit de monsters komt en ze naar de bodem zinken. Elk monster dat na de nachtelijke fixatieve stap wordt gevonden, moet worden weggegooid. Harsbedding biedt ondersteuning voor het snijden van het bewaarde monster en de hardheid ervan moet ongeveer zijn voor de ingebedde weefsels¹⁰. LR-White is verkrijgbaar in drie hardheidsgraden: hard voor houtachtig zwaar verschreven weefsels, medium grade voor de overgrote meerderheid van weefsels van bladeren tot pollenkorrels en zachte kwaliteit voor meer delicate weefsels. Voor een perfecte inbedding moet de hars volledig in het monster doordringen; dit wordt beter verkregen met een langzame en geleidelijke infiltratie. Bij voorafgaande tests kunnen kortere incubatieperioden worden gebruikt. De gelatinecapsules zijn zowel klein als hermetisch afsluitbaar, waardoor ze perfect zijn voor LR-White harsuitharding. Voor maat 2 (0,37 ml) moet de uitharding na 24 uur bij 58 °C zijn voltooid. Voor andere capsulematen moet de uithardingstijd worden aangepast. De LR-White gezouten hars moet van bijna kleurloos naar een licht goud/amber kleur gaan en hard aanvoelen voor de nagels. Monster trimmen en het gebruik van de ultra-microtome vereist oefening, maar zal duidelijke cijfers produceren. De dikte en grootte van de sectie is belangrijk voor de beeldvorming en immunolocalisatietest. De sectiedikte moet ongeveer 500 nm worden gehouden. Secties die te dun zijn, zullen resulteren in slechte kleuring en sectiediktes van meer dan 700 nm zullen de beeldverwerving en -resolutie verstoren. Het hydrofiele karakter van LR-White hars maakt direct gebruik van de secties in kleuring en immunolocalisatie mogelijk zonder de hars te verwijderen.

De blokkeringsoplossing (5% vetvrije droge melk in 1 M PBS) vermindert de aspecifieke binding van antilichamen. Vetvrije droge melk is een betrouwbaar alternatief geweest voor BSA of andere meer traditionele blokkeringsmiddelen en is aanzienlijk goedkoper. De blokkeringsoplossing moet vóór gebruik door een papierfilter worden gefilterd om neerslag te voorkomen die moeilijk te verwijderen aggregaten vormen, antilichamen vasthouden en het experiment in gevaar brengen. De voorgestelde antilichaamverhoudingen en incubatietijden zijn geoptimaliseerd en met succes toegepast op diverse soorten in verschillende studies^{9,11,12,13,14,15,16}.

Verdamping en expositie aan het licht zijn twee kwesties die moeten worden vermeden tijdens de immunolocalisatieprocedure. Een vochtige en donkere incubatiekamer lost beide problemen op. Een tutorial over het maken van een donkere kamer is te vinden in Aanvullende figuur 1B-1E. Dit immunolokalisatieprotocol vereist het gebruik van een primair antilichaam gericht op het doelepoop zonder eigen label, en een secundair antilichaam geconjugeerd aan een fluorchroom (FITC) dat wordt verhoogd tegen het primaire antilichaam IgG. Deze methode biedt verschillende voordelen ten opzichte van het gebruik van één antilichaamdetectiesysteem als gevolg van een verhoogde strengheid van de detectie, omdat het secundaire antilichaam geen affiniteit heeft met de doelmonstersoort. Dit systeem biedt een verhoogd signaal omdat de primaire antilichaammoleculen kunnen worden gericht door verschillende moleculen van het secundaire antilichaam, elk met een fluorchroom¹⁷.

Het verval van fluorchromen door intens licht, of het bleken van foto's, is een belangrijk probleem in deze techniek. Vooral bij het verkennen van zwakke gelokaliseerde signalen kan het signaal onomkeerbaar verloren gaan voordat het wordt beeldvorming. Montagemedium verhoogt de stabiliteit en levensduur van de fluorchromen aanzienlijk¹⁸; het is echter zeer raadzaam om de montagemedia te testen, omdat sommige kunnen reageren met de vlek en/of het fluorchrome, waardoor neerslag ontstaat en het beeld vervaagt. De configuratie van het optische systeem dat wordt gebruikt voor het observeren en registreren van de immunolocalisatie is een van de belangrijkste aspecten voor het succes van dit experiment. Vanwege de verminderde dikte van de secties zijn de voordelen van het gebruik van de confocale microscoop beperkt. De meest succesvolle opstelling vereist een conventionele rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een fluorescerende lichtbron, LED- of kwiklamp¹⁹, met adequate fluorescentiekwaliteitsdoelstellingen. Ook lichtfilters van goede kwaliteit voor excitatie/emissie (nm) 358/461 voor UV en 485/530 voor FITC zijn vereist. Voor de fluorescentiebeeldverwerving worden gekoelde monochromatische digitale camera's aanbevolen vanwege hun hoge snelheid en gevoeligheid, maar offeren echte kleurinformatie^{op 20}. Polychromatische camera's bieden de mogelijkheid om gemakkelijk signaal uit achtergrondfluorescentie te sorteren, maar zijn langzamer en veel minder gevoelig dan hun monochromatische tegenhangers.

De methode wordt beperkt door de beschikbaarheid van specifieke antilichamen. Ondanks de beschikbaarheid van een uitgebreide en groeiende verzameling antilichamen gericht op plantenepotopen, zijn begrijpelijkerwijs nog niet alle plantaardige verbindingen gedekt. Ook lipiden worden meestal geëxtraheerd volgens de beschreven inbeddingsmethode en worden daarom niet aanbevolen voor weefsels met een hoog oliegehalte. Cryostat-sectie kan een alternatief zijn, ondanks het opofferen van de beeldresolutie. De temperatuur van LR-Witte harspolymerisatie kan in sommige gevallen gevoeligere epitopen veranderen. Als de doelepoop temperatuurgevoelig is, schakelt u LR-White in voor LR-Gold-hars. Polymeriseren bij -25 °C bij wit licht, LR-Gold biedt een uitstekende conservering van de thermogevoelige epitopen, maar vereist de aanschaf van een gespecialiseerd polymerisatieapparaat en is iets giftiger dan LR-White.

Deze methode is gebruikt voor een breed scala aan soorten en weefsels. Het biedt snelle toegang tot betrouwbare informatie over specifieke epitoopdistributie. Het aanbieden van ondersteunende gegevens voor evolutionaire modellen en het identificeren van markers en specifieke aanpassingen in cellen en weefsels, terwijl het visueel verleidelijke resultaten oplevert. Het gebruik van antilichamen geconjugeerd met fluorchromen over peroxidase of alkalische fosfatase conjugatie alternatieven¹⁰, is minder tijdrovend, aanzienlijk minder vatbaar voor overreactie artefacten en biedt een duidelijke subcellulaire resolutie moeilijk te matchen met een andere techniek. Het gebruik van antilichamen die specifiek zijn voor celwandgerelateerde polymeren geeft inzicht in de rangschikking van verbindingen in zeer restrict-domeinen. Een dergelijke resolutie zou een uitdaging zijn om uit traditionele biochemische instrumenten te halen. De steeds groter wordende set primaire antilichamen die beschikbaar zijn, biedt constante nieuwe ontdekkingsmogelijkheden in de binnenwerking van de plantencel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Absolute ethanol	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size should fit the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
Vacuum chamber	na	na
Vacuum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)