Fluorescerende immunolocalisering af Arabinogalactan proteiner og pektiner i cellevæggen af plantevæv

Summary

Denne protokol beskriver i detaljer, hvordan plantematerialet til immunolocalisering af Arabinogalactan proteiner og pektiner er fastgjort, indlejret i en hydrofil akrylharpiks, sektionsopdelt og monteret på glasrutsjebaner. Vi viser cellevæg relaterede epitoper vil blive opdaget med specifikke antistoffer.

Abstract

Planteudvikling indebærer konstante justeringer af cellevæggens sammensætning og struktur som reaktion på både interne og eksterne stimuli. Cellevægge består af cellulose og ikke-celluloseiske polysaccharider sammen med proteiner, phenolforbindelser og vand. 90% af cellevæggen består af polysaccharider (f.eks. pectiner) og arabinogalactanproteiner (AGP). Den fluorescerende immunolocalisering af specifikke glycan epitoper i plante histologiske sektioner forbliver et vigtigt redskab til at afdække remodeling af vægpolysaccharidnetværk, struktur og komponenter.

Her rapporterer vi en optimeret fluorescerende immunolocaliseringsprocedure til påvisning af glycan epitoper fra AGP'er og pektiner i plantevæv. Paraformaldehyd/glutaraldehydfiksering blev anvendt sammen med LR-White indlejring af planteprøverne, hvilket giver mulighed for en bedre bevarelse af vævsstrukturen og sammensætningen. Tynde dele af de indlejrede prøver opnået med en ultramikromit blev brugt til immunolocalisering med specifikke antistoffer. Denne teknik giver stor opløsning, høj specificitet, og chancen for at opdage flere glycan epitoper i samme prøve. Denne teknik tillader subcellulær lokalisering af glycaner og registrerer deres akkumuleringsniveau i cellevæggen. Det giver også mulighed for at bestemme spatio-tidsmæssige mønstre af AGP og pectin distribution under udviklingsprocesser. Brugen af dette værktøj kan i sidste ende guide forskningsretninger og forbinde glycaner med specifikke funktioner i planter. Desuden kan de indhentede oplysninger supplere biokemiske undersøgelser og genekspressionsundersøgelser.

Introduction

Plantecellevægge er komplekse strukturer bestående af polysaccharider og glycoproteiner. Cellevægge er ekstremt dynamiske strukturer, hvis arkitektur, organisation og sammensætning varierer afhængigt af celletype, lokalisering, udviklingsstadium, eksterne og interne stimuli¹. Arabinogalactan proteiner (AGP) og pektiner er vigtige komponenter i plantecellevæggen. AGP'er er meget glykosylerede proteiner, og pektiner er homogalacturonan polysaccharider, hvis sammensætning, mængde og struktur varierer meget i forskellige planteudviklingsstadier^2,3,4. AGP'er og pektinundersøgelser har afsløret deres involvering i flere planteprocesser såsom programmeret celledød, reaktion på abiotiske belastninger, seksuel plantegengivelse, blandt mange andre⁵. De fleste af disse undersøgelser startede med oplysninger fra immunolocaliseringsundersøgelser.

I betragtning af dens kompleksitet kræver studiet af cellevægge mange forskellige værktøjer. Påvisning af glycan epitoper ved hjælp af monoklonale antistoffer (mAbs) er en værdifuld tilgang til at løse polysaccharid og glycoprotein distribution langs denne struktur. Der er en stor samling af mAb'er til rådighed til påvisning af glycan epitoper, og specificiteten af hver mAb forbedres løbende samt⁶. Teknikken her beskrevet gælder for alle plantearter, og er et perfekt værktøj til at guide fremtidige forskningsretninger, der kan involvere dyrere og komplekse teknikker.

I denne teknik er specifikke antistoffer kemisk konjugeret til fluorescerende farvestoffer som FITC (fluorescein isothiocyanat), TRITC (tetramethylrhodamin-5-(og 6)-isothiocyanat) eller flere Alexa Fluor farvestoffer. Immunofluorescens giver flere fordele, så en klar og hurtig subcellulær lokalisering af glycaner, der kan observeres direkte under et fluorescensmikroskop. Det er meget specifikt og følsomt, da forberedelsen af prøven effektivt kan beskytte antigenets naturlige struktur, selvom det er til stede i lavere mængder. Det gør det muligt at detektere flere antigener i samme prøve og vigtigst af alt, tilbyder høj kvalitet og visuelt smukke resultater. På trods af den store magt, der tilbydes af fluorescens immunolocalization undersøgelser, er de ofte betragtes som vanskelige at udføre og gennemføre sandsynligvis på grund af manglen på detaljerede protokoller gør det muligt at visualisering af de forskellige trin i proceduren. Her giver vi nogle enkle retningslinjer for, hvordan man udfører denne teknik, og hvordan man får billeder i høj kvalitet.

For den protokol, der præsenteres her, skal prøver først fastgøres og integreres ved hjælp af det mest passende fikseringsmiddel. Selvom det betragtes som en tidskrævende og relativt kedelig teknik, er korrekt fiksering og indlejring af planteprøven nøglen til at sikre en vellykket immunolocaliseringsanalyse. Til dette formål er den mest almindelige kemisk fiksering ved hjælp af crosslinking fikseringsmidler, som aldehyder. Krydssammenhængende fikseringsmidler etablerer kemiske bindinger mellem molekyler af vævet, stabiliserer og hærder prøven. Formaldehyd og glutaraldehyd er krydssammenhængende fikseringsmidler, og nogle gange anvendes en blanding af begge fikseringsmidler⁷. Formaldehyd giver stor strukturel bevarelse af væv og i længere tid, producerer små væv tilbagetrækninger og er forenelig med immunostaining. Glutaraldehyd er et stærkere og stabilt fikseringsmiddel, der normalt anvendes i kombination med formaldehyd. Brugen af glutaraldehyd har nogle ulemper, der skal tages i betragtning, da det introducerer nogle frie aldehydgrupper i det faste væv, hvilket kan generere en vis uspecifik mærkning. Også krydsfeltet mellem proteiner og andre molekyler lejlighedsvis kan gøre nogle mål epitoper utilgængelige for antistoffer. For at undgå dette skal fastgørelsens mængde og varighed defineres omhyggeligt.

Efter fiksering er prøver indlejret i den rigtige harpiks for at hærde, før de får sektionerne. London Harpiks (LR-White) akryl harpiks er harpiks valg for immunolocalization undersøgelser. I modsætning til andre harpikser er LR-White hydrofil, hvilket gør det muligt for antistofferne at nå deres antigener uden behov for nogen behandling for at lette det. LR-White har også den fordel, at tilbyde lav auto-fluorescens, så en reduktion i baggrundsstøj under immunfluorescens imaging.

Der er mange farvning teknikker til rådighed til at opdage forskellige komponenter i cellevæggen, såsom Alcian blå farvning, toluidin blå farvning eller Periodisk syre-Schiff (PAS) farvning. Ingen af disse giver kraften i immunolocaliseringsanalyser⁸. Denne tilgang giver større specificitet i påvisning af glykaner, der tilbyder langt mere information om cellevæg sammensætning og struktur.

Protocol

1. Prøveforberedelse: fiksering, dehydrering og LR-Hvid indlejring

1. Fiksering og dehydrering
   BEMÆRK: Fikseringsprocessen er afgørende for at bevare prøven. ved at krydslinke molekyler stoppes cellemetabolismen, hvilket sikrer cellulær integritet og forhindrer molekylær diffusion. Fikseringsmidlerne og den anvendte koncentration skal tilpasses dette formål, således at antigenet er tilstrækkeligt udsat for at interagere med antistofferne. Følgende protokol kombinerer den milde fikseringsevne af paraformaldehyd, med den stærkere effekt af glutaraldehyd. Deres proportioner blev optimeret til AGP'er og cellevægkomponenter, men det er velegnet til andre proteiner og cellestrukturer. Den efterfølgende dehydreringsproces vil forberede prøverne til LR-White indlejring. Plantevæv fra flere plantearter blev anvendt i dette eksperiment. Quercus suber prøver blev indsamlet fra træer dyrket i marken. Trithuria submersa prøver blev venligt delt med os af Paula Rudall (Kew Gardens, London, UK).
   1. Så alle Arabidopsis planter direkte på jorden og vokse i en indendørs vækstfacilitet med 60% relativ luftfugtighed og en dag / nat cyklus på 16 timers lys ved 21 °C og 8 timers mørke ved 18 °C. Vælg det plantevæv, der skal analyseres, og trim prøver, der ikke må være mere end 16 mm² i størrelse.
   2. Straks overføres prøven til et glasglas, der tidligere var fyldt med tilstrækkelig kold fikseringsopløsning (2% formaldehyd (w/v), 2,5% glutaraldehyd (w/v), 25 mM PIPES pH 7 og 0,001% Tween-20 (v/v)) for fuldstændigt at nedsænke prøverne (Figur 1A).
      ADVARSEL: Formaldehyd og glutaraldehyd er begge fikseringsmidler, der kan være skadelige ved indånding og kontakt. Udfør fikseringstrinnet på en røghætte og brug passende beskyttelsesbeklædning og nitrilhandsker. Alle løsninger fra dette trin og fremefter, herunder alkoholserier indtil 70%, bør opbevares til senere dekontaminering af specialiseret personale.
   3. Når du har samlet alle prøverne, skal du opdatere fikseringsmaterialet.
   4. Overfør hætteglassene til et vakuumkammer, og påfør langsomt vakuum. Når det flydende materiale når -60 kPa, begynder det at synke til bunden af hætteglasset (Figur 1B).
   5. Hold under et vakuum på højst -80 kPa i 2 timer ved stuetemperatur.
   6. Vakuumet slippes langsomt, glasglasset forsegles og placeres natten over ved 4 °C.
   7. Kassér eventuelle prøver, der ikke synkede under fikseringen natten over. De resterende prøver vaskes med 25 mM PBS pH 7 i 10 min. efterfulgt af en 20 minutters vask i 25 mM PIPES buffer pH 7.2.
   8. Dehydrere prøverne i en ethanol serie (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, og 3x 100% ethanol) i 20 min hver. Dehydrerede prøver overføres straks til mærkede glasglas til indlejring (Figur 1C).
      BEMÆRK: Dehydreringsprocessen kan sættes på pause ved 70% ethanoltrinnet.
2. LR-Hvid harpiks integrering
   BEMÆRK: LR-hvid er en ikke-hydrofobisk akrylharpiks med lav viskositet, hvilket gør den ideel til gennemtrængende væv med mange tykke cellevæggelag. LR-White kommer også i flere hårdhed kvaliteter kompatibel for at skære de fleste planteprøver. Sørg for, at den brugte harpiks allerede er forsynet med den rigtige katalysator blandet i, eller følg leverandørvejledningen for at forberede harpiksen. Følgende indlejring proces er langsom, men resultaterne berettiger i høj grad midlerne.
   1. Perfuse prøverne ved at inkubere med LR-White harpiks i en række halvmåne koncentration af harpiks (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) i ethanol, inkubation for 24 timer ved 4 °C i hvert trin.
      ADVARSEL: LR-White harpiks er en lav toksicitet akryl harpiks; Det kan dog være irriterende for huden ved kontakt og indånding. Det anbefales på det kraftigste at arbejde i et godt ventileret område eller under en røghætte med passende beskyttelsesslitage og nitrilhandsker.
   2. LR-hvid harpiksen genopfriskes og inkuberes i yderligere 12 timer ved 4 °C.
   3. Forbered passende størrelsesintegrering af gelatinekapsler (størrelse 1 (0,5 ml) til prøver op til 3 mm, 2 x 0,37 ml for prøver op til 5 mm eller 3 x 0,3 ml for prøver op til 8 mm og papirmærker (Figur 1D).
      BEMÆRK: Kapselstørrelsen skal være lidt større end prøven, så prøven kan være helt lukket inde i harpiksen. Husk også at mærke mærkerne med en blyant, fordi pen eller trykte trykfarver forurener harpiksen og ødelægger prøven.
   4. Påfør en dråbe frisk LR-hvid harpiks på bunden af hver kapsel.
   5. Læg en prøve i hver gelatine kapsel og fyld til maksimal kapacitet med frisk harpiks. Placer kapselhætten, og tryk forsigtigt for at danne en hermetisk forsegling (Figur 1E).
   6. Harpiksen polymeriseres i 24 til 48 timer ved 58 °C, eller indtil den er helt hærdet.
   7. Opbevar prøver ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Efter polymerisering er LR-hvid harpiks inert.

2. Forberedelse af dias

BEMÆRK: Glasrutsjebaner skal være rene, fri for støv, fedt eller andre forurenende stoffer. Selv nye dias skal rengøres, da nogle leverandører bruger olier og vaskemidler for at forhindre, at diasene klæber sammen. Enhver fedt eller vaskemiddel vil forstyrre afsnittet vedhæftning til diaset, selv om behandlet med poly-L-lysin. Fnug og støv vil påvirke prøvens observationer og muligvis ødelægge eksperimentet. Teflon belagt dias med reaktion brønde er perfekte til denne opgave. De er overkommelige, genanvendelige og reducerer drastisk mængden af antistofløsning, der er nødvendig. Med korrekt rengøring kan fluorescerende immunolocalisering af fremragende kvalitet udføres til en meget overkommelig pris.

1. Slide vask
   1. Placer lysbillederne i et farvningsstativ og dæksel med rengøringsopløsning (0,1% SDS (w/v), 1% eddikesyre (v/v), 10% ethanol (v/v)).
   2. Hold en mild omrøring i 20 min.
   3. Overfør farvningsstativerne til et ddH₂O-bad med mild omrøring i 10 minutter. Gentag 4 gange.
   4. Tøm forsigtigt stativerne, før du dypper kort i 100% ethanol, og lad rutsjebanerne tørre i et støvfrit miljø.
   5. Opbevares indtil brug.
2. Poly-L-lysinbelægning (valgfrit)
   BEMÆRK: Små sektioner holder sig normalt meget godt til rene glasrutsjebaner. Dette trin anbefales kun til større sektioner (>2 mm²). Større sektioner har tendens til at folde og rynke, og er ikke tilrådeligt. Ikke desto mindre, hvis det er nødvendigt bruge reaktion dias med større huller. Rengør dem som ovenfor og fortsæt som følger.
   1. Placer rene rutsjebaner i en firkantet petriskål. Pipette 0,001% poly-L-lysin opløsning (w/v) til at dække hullerne i dias, uden at flyde over.
   2. Lad rutsjebanerne tørre natten over ved 40 °C i lukkede petriskåle.
      BEMÆRK: De belagte rutsjebaner er klar til øjeblikkelig brug og kan opbevares i støvfrit miljø ved stuetemperatur i flere måneder.

3. Prøvetrimning og -afsnit

1. Prøvetrimning
   1. Med et skarpt barberblad skal du trimme LR-White-blokkene under et stereomikroskop for at danne en pyramideformet struktur, hvor spidsen er vinkelret på prøvens interesseområde (Supplerende figur 1A).
      BEMÆRK: Ultramikrtomprøveholderen er et fremragende værktøj til at fastgøre blokken. Hvis enheden ikke har en universel prøveholder, skal du bruge den, der passer bedst til runde blokke.
   2. Trim pyramidestrukturen ved at fjerne fine skiver af den overskydende harpiks vinkelret på pyramiden større akse.
   3. Fortsæt, indtil prøven er nået ud til skærefladen. Inden for skærefladen bør målprøven ideelt set være lukket i trapezform.
      BEMÆRK: Harpiksblokken kan trimmes yderligere i en spaltevinkel for at reducere sektionsoverfladearealet med et skarpt blad (Figur 1F).
2. Halvtynd sektion
   BEMÆRK: Der vil blive anvendt en mikrotome med glasknive. Antistoffets evne til at binde sig til epitopen vil betinget af immunolabelingsreaktionssuccesen. Den hydrofile karakter af LR-White harpiksen vil give mulighed for god kontakt med antistofferne med prøvesektionerne. Tyndere sektioner vil præsentere svagere Calcofluor farve, der vil blive brugt til at hjælpe med at finde de sektioner og hjælpe med billedbehandling proces. Det samme gælder for andre pletter, der senere kan anvendes. Også overdreven tykkelse vil påvirke billedopsamling kvalitet. Et godt kompromis for sektionstykkelse kan findes mellem 200 og 700 nm, afhængigt af vævskarakteristika. Monter blokkene tæt på prøveholderen på ultramikrtomen.
   1. Med en ultramikromite laves sektioner med en tykkelse mellem 200 og 700 nm (Figur 1G).
   2. Kontroller sektionsområdet ved at overføre nogle sektioner til en ddH₂O-dråbe på en glasrutsjebane. Placer rutsjebanen på en 50 °C kogeplade, indtil vandet fordamper. Plet, der placerer et fald på 1% Toluidin Blue O (w/v) i 1% borsyreopløsning (w/v) over sektionerne i 30 s. Skyl og observere under mikroskopet.
   3. Når du finder den ønskede struktur, skal du overføre en eller to sektioner til hver dråbe ddH₂O, der tidligere er placeret på hver brønd på et rent reaktionsdias.
   4. Placer hver rutsjebane i en lukket ren 10 cm firkantet petriskål og lad den tørre ved 50 °C.
   5. Gem dias i en ren arkivboks, indtil de bruges.

4. Immunolocalization

BEMÆRK: Den fluorescerende immunolocaliseringsprocedure er afhængig af sekventiel brug af to antistoffer. Det primære antistof hæves mod et specifikt målantigen. Det sekundære antistof hæves specifikt mod det primære antistof, og for fluorescerende teknikker konjugeres til en fluorophore (FITC i denne specifikke protokol). Det primære antistof vil blive anvendt til at påvise målantigenet i prøven, og det sekundære antistof vil blive anvendt til at markere det sted, hvor det primære antistof, der er forbundet med prøven efter vask af det overskydende primære antistof. Kontroller er en vigtig del af denne analyse og skal altid udføres for at sikre nøjagtigheden af observationerne. En brønd på rutsjebanen bør reserveres til brug som negativ kontrol, hvor den primære antistofbehandling springes over, og derfor bør der ikke observeres noget signal ved forsøgets afslutning. En positiv kontrol skal indgå i forsøget ved at behandle en brønd med et antistof, som mærkningen allerede er kendt og sikker på. Den positive kontrol anvendes til at bekræfte det sekundære antistofmærkningseffektivitet og reaktionsbetingelser, mens den negative kontrol tester det sekundære antistofspecifikitet.

1. Forbered en inkubation kammer ved at placere nogle dæmpede papirhåndklæder i bunden af en pipette tips boks og indpakning det med sølvpapir(Supplerende Figur 1B-1E). Placer rutsjebanerne i inkubationskammeret.
2. Der pipettes et 50 μL fald pr. 8 mm brønd af blokeringsopløsning (5% fedtfri tør mælk (w/v) i 1 M PBS) og inkuberes i 10 min. Fjern blokeringsopløsningen og vask alle brønde to gange med PBS i 10 minutter.
3. De primære antistofopløsninger fremstilles (se supplerende tabel 1),1:5 (v/v) antistof i blokeringsopløsning; foretage et skøn på ca. 40 μL pr. 8 mm brønd.
   BEMÆRK: Antistoffets koncentration skal justeres i overensstemmelse med fremstillingens protokol.
4. Udfør en sidste vask med ddH₂O i 5 min, lad aldrig brøndene tørre helt.
5. Pipetter den primære antistofopløsning på reaktionsbrøndene. Pipetteblokeringsopløsning til kontrolbrøndene.
6. Inkubationskammeret lukkes og stå i 2 timer ved stuetemperatur efterfulgt af natten over ved 4 °C. Den sekundære antistofopløsning fremstilles, 1% i blokeringsopløsning (v/v) ca. 40 μL pr. brønd. Hold det dækket med sølvpapir.
7. Vask alle brønde to gange med PBS i 10 minutter, efterfulgt af 10 ekstra minutter med ddH₂O. Sørg for, at der ikke er synlige spor af blokeringsopløsningen eller aflejringerne på brøndene.
8. Pipetter den sekundære antistofopløsning til alle brønde. Fra nu af skal du beskytte rutsjebanerne mod lys.
9. Inkuber i 3-4 timer i mørke ved stuetemperatur.
10. Vask alle brønde to gange i 10 minutter med PBS efterfulgt af en anden vask på 10 min med ddH₂O.
11. Påfør en dråbe calcofluor (1:10,000 (w/v) fluorescerende lysere 28 i PBS) på hver brønd. Uden vask påføres en dråbe monteringsmedium (se materialetabel)på hver brønd, og der anbringes en coverlip (Figur 1H).
12. Overhold med et fluorescensmikroskop, der er udstyret med 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 og 100x/1.40 linse, brug UV (til calcofluorplet) og FITC-filtre for at detektere henholdsvis cellevæg og immunolocalisering (Figur 1I). Brug følgende bølgelængder: excitation/emission (nm) 358/461 for UV og 485/530 for FITC.
13. For en bedre visualisering af resultaterne overlapper begge billeder med ImageJ eller lignende.

Representative Results

I et vellykket eksperiment vil det sekundære antistof specifikt lokalisere placeringen af den specifikke epitop i lysegrøn, på en ensartet måde, hvilket giver mulighed for karakterisering af cellevægsammensætningen i et bestemt udviklingsstadium i cellen, vævet eller organet. For eksempel LM6 antistof har en høj affinitet for 1,5-arabinan, en forbindelse med type-I rhamnogalacturonan, der kan findes rigeligt mærkning cellevæggen af den udviklende Quercus suber anther (Figur 2A), således at konkludere, at denne type pektin er rigelig og en del af den primære cellevæg sammensætning. JIM5 har affinitet for homogalacturonans næppe esterificeret, der typisk findes på rodspidsen af Quercus suber embryo, der angiver mekaniske egenskaber af organet (Figur 2B). Xylogalacturonan er en type pektin rig på xylose forbundet med cellevæg løsne, de findes i degenererende celler. Antistoffet LM8 genkender specifikt xylogalacturonans, i modningsorganer kan det bruges til at detektere degenererende celler eller væv, ligesom endospermcellerne i de sidste faser af Quercus suber acorn modning (Figur 2C).

JIM13 har affinitet for AGP'er fundet på strukturer relateret til reproduktion, cellelinjer relateret til mikrogametogenese i Arabidopsis thaliana (Figur 2D). JIM8 genkender også epitoper af AGP'er til stede i celler og organer relateret til reproduktion som den stigmatiske papiller og mikropyle af Basal Angiosperm Trithuria submersa (Figur 2E-2F). Begge antistoffer er blevet foreslået at være molekylære markører for gametofytiske cellelinjer i planter⁹.

Almindelige fejl i denne protokol er normalt nemme at opdage og identificere. Når vaskene springes over, eller reaktionsbrøndene tørres, vises det sekundære antistof normalt som et uspecifikt smøremiddel, der dækker vilkårligt over celler, væv, harpiks og dias (Figur 3A). Aggregater af grøn fluorochrom dannes, hvis det ubegrænsede primære antistof ikke er blevet vasket korrekt væk (Figur 3B). En anden almindelig årsag til svigt af denne teknik er relateret til foldning og / eller løsrivelse af sektioner (Figur 3C), hvilket gør eksperimentet ubrugeligt. Dette problem er normalt forbundet med enten dårlig vedhæftning af sektioner til dias, sandsynligvis på grund af brugen af urene dias, og / eller aggressiv vask.

Prøveforberedelsen er også et kritisk skridt i denne procedure. Heldigvis er de mest almindelige problemer med fiksering og indlejring nemme at få øje på (Figur 3D). Hvis alt går vel, vil harpiksblokken være fri for revner, og prøven vil være tydeligt synlig med en lysegul til lysebrun farve(Figur 3D-1). Prøver, der er ineffektivt indlejret, vil vise pulverformige hvide pletter eller områder(figur 3D-2). Det er vigtigt at holde prøvestørrelsen under 8 mm for at sikre indtrængen af fikseringsopløsningen. Når prøverne er dårligt fastgjort, vises de mørkebrune næsten sorte(Figur 3D-3). Også polymeriseringens temperatur er vigtig for både bevarelsen af epitoperne og korrekt hærdning af harpiksen. En for høj temperatur kan få harpiksen til at revne, hvilket gør det umuligt at dele prøven (Figur 3D-4).

Figur 1. Oversigt over den komplette protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Typiske resultater af AGP'er og Pectin immunolocalization i planteprøver. (A) LM6 mærkning af arabinan moiety af pektiner i en Quercus suber anther i meiosis I. (B) Specifik mærkning af lav methyl-esterificerede pektiner i en Quercus suber embryo rodspids af JIM5. (C) Xylogalacturonan mærket af LM8 i vigende endosperm af en Quercus suber modning agern. D) JIM13 mærkning af AGP'er i tapetummet og tetrads af en Arabidopsis thaliana anther. (E) AGP mærket af JIM8 i den stigmatiske papillae af Trithuria submersa. (F) JIM8 mærkning AGPs på mikropyle (hvid pil) af en Trithuria submersa ovule. Meiotisk mikrospore (Mc), Tapetum (Tp), Root (R), Root tip (Rt), Testa (Ts), Endosperm (Ed), Embryo (Em), Epidermis (Ep), Stigmatic papillae (SP), Ovule (OV). Skalalinjer: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Almindelige fejl og problemer under protokollen. (A) Manglende vasketrin identificeres ved tilstedeværelse af uspecifik smear af sekundært antistof (₊) over prøveharpiks. (B) Den dårlige specificitet eller vaskesvigt i det primære antistof resulterer i dannelsen af FITC-aggregater (+), der ikke er bundet til et bestemt sted. (C) Folder og sektion løsrivelse er ofte et resultat af aggressiv vask og urene dias. d)Eksempler på prøvefiksering og integrering (1) perfekt prøvestørrelse og indlejring, (2) indlejringsfejl, (3) prøvefikseringsfejl, (4) harpikshærdningsfejl. FITC mærket antistof (grøn) og Calcofluor-hvid plet (blå). Skalalinjer: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1. (A) Skematisk repræsentation af bloktrimningssekvensen til forberedelse af prøven (gul blok) til sektionsopbygning med ultramikrotomen. For det første fjernes gelatinekapslen (1). Derefter trimmes de først i en vinkel fra 40° til 45° til kapslens sider tangentielt til prøven (2), et andet snit foretages ved 90° af den første (3) efterfulgt af en tredje (4) og fjerde efter samme regel (5). Fra denne første fase af trimning resultater en pyramideformet struktur, som topmødet er placeret over prøven. Endelig, med en skarp klinge toppen er barberet ud vinkelret på harpiks blok større akse for at nå den indlejrede prøve. Der skal opnås en kvadratisk eller trapezformet overflade i slutningen af proceduren (6). b) paakrævede forsyninger til fremstilling af et inkubationskammer; tinfolie (1), dobbeltsidet gaffatape (2), papirhåndklæder (3) og en pipettespidsboks. (C) Første trin, tinfolie er fastgjort til kassen med dobbeltsidet gaffatape. (D) Andet trin, pipetten tips indehaveren er fjernet for at placere papirhåndklæder i bunden af kassen. (E) Tredje trin, papirhåndklæder er fugtet med vand og pipette tips indehaveren er placeret tilbage til at handle har en bakke til dias. Klik her for at hente denne fil.

Supplerende tabel 1: Liste over nyttige monoklonale antistoffer. Ovenstående tabel er et eksempel på tilgængelige antistoffer med oplysninger om deres mål, og hvor de kan købes. Klik her for at hente denne fil.

Discussion

Den fluorescerende immunolocalization metode i planter her beskrevet, mens problemfrit ligetil, er afhængig af succesen med flere små trin. Den første er prøveforberedelse og fiksering. I løbet af dette første trin anvendes en blanding af formaldehyd og glutaraldehyd til at krydse størstedelen af cellekomponenterne. Formaldehyd i opløsningen giver en mild og reversibel fiksering, mens glutaraldehyd giver en stærk mere permanent sammenkobling; balancen mellem de to fikseringsmidler giver en passende mængde krydslinking, hvilket gør det muligt for epitopernes eksponering at reagere med det primære antistof¹⁰. For at fikseringsopløsningen skal fungere korrekt, skal prøven være lille. Store konstruktioner med en diameter på over 7 mm er meget vanskelige at fiksere og bør klippes for at sikre fiksativ gennemtrængning.

Efter sår eller stress udskiller nogle planter store mængder tanniner, der danner mørke bundfald, der kan reagere med formaldehyd, der forstyrrer fikseringsprocessen. At holde prøverne på is og erstatte den fiksative løsning, når det bliver overskyet, hjælper med at reducere denne effekt. Luft kan også forstyrre fikseringsprocessen og senere i indlejring og hærdning af harpiksen. Den foreslåede vakuumbehandling bør fjerne det meste af luften. For særligt luftige væv kan vakuumtrinnet forlænges yderligere end 2 timer, indtil der ikke kommer mere luft ud af prøverne, og de synker til bunden. Enhver prøve, der findes flydende efter det fiksative trin natten over, skal kasseres. Harpiksintegrering understøtter skæring af den konserverede prøve, og dens hårdhed skal være omtrentlig med det indlejrede væv¹⁰. LR-White kommer i tre hårdhed kvaliteter: svært for woody stærkt sklerificeret væv, medium kvalitet for langt de fleste væv fra blade til pollenkorn, og blød kvalitet for mere sarte væv. For en perfekt indlejring skal harpiksen trænge helt ind i prøven; dette opnås bedre med en langsom og gradvis infiltration. Ved forudgående test kan der anvendes kortere inkubationsperioder. Gelatinekapslerne er både små og hermetisk forseglelige, hvilket gør dem perfekte til LR-White harpikshærdning. For en størrelse på 2 (0,37 mL) skal hærdningen være færdig efter 24 timer ved 58 °C. For andre kapselstørrelser skal hærdetiden justeres. LR-White hærdet harpiks bør gå fra næsten farveløs til en lys gylden / rav farve og føler hårdt for neglene. Prøve trimning og brugen af ultra-mikrotome kræver praksis, men vil producere klare tal. Tykkelsen og størrelsen af afsnittet er vigtig for billeddannelse og immunolocalization assay. Sektionstykkelsen skal holdes omkring 500 nm. Sektioner, der er for tynde, vil resultere i dårlig farvning, og sektionstykkelser over 700 nm vil forstyrre billederhvervelsen og opløsningen. Den hydrofile karakter af LR-White harpiks giver mulighed for direkte brug af sektioner i farvning og immunolocalization uden at fjerne harpiksen.

Blokeringsopløsningen (5% fedtfri tør mælk i 1 M PBS) reducerer uspecificeret binding af antistoffer. Fedtfri tørmælk har været et pålideligt alternativ til BSA eller andre mere traditionelle blokeringsmidler og er betydeligt billigere. Blokeringsopløsningen skal filtreres gennem et papirfilter inden brug for at undgå bundfald, der danner svært at vaske aggregater væk, bevare antistoffer og kompromittere forsøget. De foreslåede antistofforhold og inkubationstider er blevet optimeret og anvendt med succes på forskellige arter i flere undersøgelser^{9,11,12,13,14,15,16}.

Fordampning og udstilling til lys er to spørgsmål, der skal undgås under immunolocalization procedure. Et fugtigt og mørkt inkubationskammer løser begge disse problemer. Et selvstudium om, hvordan man laver et mørkt kammer, findes i supplerende figur 1B-1E. Denne immunolocalization protokol opfordrer til brug af et primært antistof rettet mod målet epitop uden etiket af sine egne, og et sekundært antistof konjugeret til en fluor (FITC), der er rejst mod den primære antistof IgG. Denne metode giver flere fordele i forhold til brugen af et enkelt antistofdetekteringssystem på grund af en øget strenghed af detektionen, da det sekundære antistof ikke har nogen affinitet til målprøvearten. Dette system giver øget signal som den primære antistof molekyler kan målrettes af flere molekyler af det sekundære antistof, hver bærer en fluorochrom¹⁷.

Henfaldet af fluorochromes ved intenst lys, eller foto blegning, er et vigtigt spørgsmål i denne teknik. Især når man udforsker for svage lokaliserede signaler, kan signalet gå uigenkaldeligt tabt før billeddannelse. Monteringsmedium øger i høj grad stabiliteten og levetiden for fluorkromerne^18; Det er dog meget tilrådeligt at teste monteringsmediet, da nogle kan reagere med pletten og/eller fluorkromet, danne bundfald og sløre billedet. Konfigurationen af det optiske system, der bruges til at observere og registrere immunolocaliseringen, er et af de vigtigste aspekter for dette eksperiments succes. På grund af sektionernes reducerede tykkelse er fordelene ved at bruge konfokalt mikroskop begrænset. Den mest succesfulde opsætning kræver et konventionelt opretstående epifluorescensmikroskop udstyret med en lysstofrørkilde, LED- eller kviksølvpære¹⁹med passende målsætninger for fluorescenskvalitet. Der kræves også lysfiltre af god kvalitet, der er indstillet til excitation/emission (nm) 358/461 for UV og 485/530 for FITC. Til erhvervelse af fluorescensbillede anbefales kølede monokromatiske digitale kameraer på grund af deres høje hastighed og følsomhed, men ofrer ægte farveoplysninger²⁰. Polykromatiske kameraer giver mulighed for nemt at sortere signal fra baggrund fluorescens, men er langsommere og langt mindre følsomme end deres monokromatiske kolleger.

Metoden er begrænset af tilgængeligheden af specifikke antistoffer. På trods af tilgængeligheden af en stor og ekspanderende samling af antistoffer rettet mod planter epitoper, forståeligt nok ikke alle planteforbindelser er endnu ikke dækket. Også lipider tendens til at blive ekstraheret af den beskrevne indlejring metode, og er derfor ikke anbefales til væv med et højt olieindhold. Cryostat sektion kan være et alternativ, på trods af at ofre billedopløsning. Temperaturen af LR-White harpiks polymerisering kan i nogle tilfælde ændre mere følsomme epitoper. Hvis målepopen er temperaturfølsom, skal du skifte LR-White til LR-Gold harpiks. Polymerisering ved -25 °C under hvidt lys, LR-Gold tilbyder en fremragende bevarelse af de termosensitive epitoper, men vil kræve erhvervelse af et specialiseret polymeriseringsapparat og er lidt mere giftigt end LR-White.

Denne metode er blevet anvendt på tværs af en bred vifte af arter og væv. Det giver hurtig adgang til pålidelige oplysninger om specifik epitopfordeling. Tilbyde understøttende data til evolutionære modeller og identificere markører og specifikke tilpasninger i celler og væv og samtidig give visuelt lokkende resultater. Brugen af antistoffer konjugeret med fluorochromes over peroxidase eller alkalisk fosfatase konjugation alternativer¹⁰, er mindre tidskrævende, betydeligt mindre tilbøjelige til overreaktion artefakter og giver en klar subcellulær opløsning svært at matche med enhver anden teknik. Brugen af antistoffer, der er specifikke for cellevægsrelaterede polymerer, giver et indblik i arrangementet af forbindelser i meget begrænsede domæner. En sådan løsning ville være udfordrende at opnå fra traditionelle biokemiske værktøjer. Den stadigt voksende sæt af primære antistoffer til rådighed tilbyder konstant nye opdagelse muligheder i anlægget celle indre arbejde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% (w/v) Gluteraldehyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, methanol free
8 wells Glass reaction slides	Marinfeld	MARI1216750	other brands may be used
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
cover slips, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used
ddH2O	na	na
Absolute ethanol	na	na
Fluorescent brightner 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gelatin capsules	Agar scientific	AGG29211	The capsule size should fit the size of the sample.
Glass vials	na	na	Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused.
LR-white medium grade, embdeding resin	Agar Scientific	AGR1281	LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin.
Non fat dry milk	Nestlé	na	any non fat dry milk is adequate
Oven	na	na	generic laboratory oven
Petri dish, 10 cm x 10 cm square	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Rat generated Monoclonal Anti-Body	Plant probes	na	Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1
Razor blades	na	na	regular razor blades
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters	Leica Mycrosistems	DMLb
Vacuum chamber	na	na
Vacuum pump	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.)