Summary
Este protocolo describe en detalle cómo se fija el material vegetal para la inmunolocalización de proteínas y pectinas arabinogalactanas, incrustado en una resina acrílica hidrófila, seccionado y montado en toboganes de vidrio. Mostramos que los epítopos relacionados con la pared celular se detectarán con anticuerpos específicos.
Abstract
El desarrollo de la planta implica ajustes constantes de la composición y estructura de la pared celular en respuesta a estímulos internos y externos. Las paredes celulares se componen de celulosa y polisacáridos no celulósicos junto con proteínas, compuestos fenólicos y agua. El 90% de la pared celular se compone de polisacáridos (por ejemplo, pectinas) y proteínas arabinogalactanas (AGPs). La inmunolocalización fluorescente de epítopos glicanos específicos en secciones histológicas vegetales sigue siendo una herramienta clave para descubrir la remodelación de redes, estructura y componentes de polisacáridos de pared.
Aquí, informamos de un procedimiento optimizado de inmunolocalización fluorescente para detectar epitopos glicanos de AGPs y pectinas en tejidos vegetales. Se utilizó la fijación de paraformaldehído/glutaraldehído junto con la incrustación LR-White de las muestras de la planta, lo que permite una mejor preservación de la estructura y composición del tejido. Secciones delgadas de las muestras incrustadas obtenidas con un ultra-microtome se utilizaron para la inmunolocalización con anticuerpos específicos. Esta técnica ofrece una gran resolución, alta especificidad y la posibilidad de detectar múltiples epítopos glicanos en la misma muestra. Esta técnica permite la localización subcelular de glicanos y detecta su nivel de acumulación en la pared celular. También permite la determinación de patrones espacio-temporales de distribución de AGP y pectina durante los procesos de desarrollo. El uso de esta herramienta puede, en última instancia, guiar las instrucciones de investigación y vincular glicanos a funciones específicas en las plantas. Además, la información obtenida puede complementar estudios bioquímicos y de expresión génica.
Introduction
Las paredes de células vegetales son estructuras complejas compuestas de polisacáridos y glicoproteínas. Las paredes celulares son estructuras extremadamente dinámicas cuya arquitectura, organización y composición varían según el tipo de celda, localización, etapa de desarrollo, estímulos externos e internos1. Las proteínas arabinogalactan (AGPs) y las pectinas son componentes importantes de la pared celular vegetal. Los AGPs son proteínas y pectinas altamente glicosiladas son polisacáridos homogalacturonan cuya composición, cantidad y estructura varían mucho durante diferentes etapas de desarrollo vegetal2,3,4. Agps y estudios de pectina han revelado su participación en varios procesos vegetales como la muerte celular programada, respuesta a tensiones abióticas, reproducción de plantas sexuales, entre muchos otros5. La mayoría de estos estudios comenzaron con información obtenida de estudios de inmunolocalización.
Dada su complejidad, el estudio de las paredes celulares requiere muchas herramientas diferentes. La detección de epítopos glicanos utilizando anticuerpos monoclonales (mAbs) es un enfoque valioso para resolver la distribución de polisacáridos y glicoproteínas a lo largo de esta estructura. Hay una gran colección de mAbs disponibles para detectar epítopos glicanos y la especificidad de cada mAb se está mejorando continuamente, así como6. La técnica aquí descrita es aplicable a todas las especies vegetales, y es una herramienta perfecta para guiar futuras direcciones de investigación que podrían implicar técnicas más costosas y complejas.
En esta técnica, anticuerpos específicos se conjugan químicamente a tintes fluorescentes como FITC (isothiocyanato de fluoresceína), TRITC (tetrametilrhodamina-5-(y 6)-isothiocyanato) o varios tintes Alexa Fluor. La inmunofluorescencia ofrece varias ventajas, permitiendo una localización subcelular clara y rápida de glicanos que se pueden observar directamente bajo un microscopio de fluorescencia. Es altamente específico y sensible, ya que la preparación de la muestra puede proteger eficazmente la estructura natural del antígeno, incluso si está presente en cantidades más bajas. Permite la detección de múltiples antígenos en la misma muestra y lo más importante, ofrece resultados de alta calidad y visualmente hermosos. A pesar de la gran potencia que ofrecen los estudios de inmunolocalización de fluorescencia, a menudo se consideran difíciles de realizar e implementar muy probablemente debido a la falta de protocolos detallados que permitan la visualización de los diferentes pasos del procedimiento. Aquí, proporcionamos algunas directrices simples sobre cómo realizar esta técnica y cómo obtener imágenes de alta calidad.
Para el protocolo presentado aquí, las muestras primero deben ser fijas e incrustadas utilizando el fijador más adecuado. Aunque se considera como una técnica lenta y relativamente tediosa, la fijación e incrustación adecuada de la muestra vegetal es la clave para garantizar un ensayo de inmunolocalización exitoso. Para ello, lo más habitual es la fijación química mediante fijadores de enlace cruzado, como los aldehídos. Los fijadores de enlace cruzado establecen vínculos químicos entre moléculas del tejido, estabilizando y endureciendo la muestra. Formaldehído y glutaraldehído son fijadores de enlace cruzado, y a veces se utiliza una mezcla de ambos fijadores7. El formaldehído ofrece una gran preservación estructural de los tejidos y durante largos períodos de tiempo, produciendo pequeñas retracciones tisulares y siendo compatible con el inmunostaining. El glutaraldehído es un fijador más fuerte y estable que se utiliza generalmente en combinación con formaldehído. El uso de glutaraldehído tiene algunas desventajas que deben tenerse en cuenta ya que introduce algunos grupos de aldehído libre en el tejido fijo, lo que puede generar algún etiquetado inespecífico. También el reticulamiento entre proteínas y otras moléculas ocasionalmente puede hacer que algunos epítopos objetivo sean inaccesibles para los anticuerpos. Para evitar esto, la cantidad y la duración de la fijación deben definirse cuidadosamente.
Después de la fijación, las muestras se incrustan en la resina adecuada para endurecer antes de obtener las secciones. La resina acrílica london resina (LR-White) es la resina preferida para estudios de inmunolocalización. A diferencia de otras resinas, LR-White es hidrófilo, permitiendo que los anticuerpos alcancen sus antígenos, sin necesidad de ningún tratamiento para facilitarlo. LR-White también tiene la ventaja de ofrecer baja fluorescencia automática, permitiendo una reducción en el ruido de fondo durante las imágenes de inmunofluorescencia.
Hay muchas técnicas de tinción disponibles para detectar diferentes componentes de la pared celular, tales como manchas azules alcian, tinción azul toluidina o tinción periódica ácido-Schiff (PAS). Ninguno de ellos ofrece el poder de los análisis de inmunolocalización8. Este enfoque proporciona una mayor especificidad en la detección de glicanos, ofreciendo información más vasta sobre la composición y estructura de la pared celular.
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Protocol
1. Preparación de la muestra: fijación, deshidratación e incrustación LR-White
- Fijación y deshidratación
NOTA: El proceso de fijación es fundamental para conservar la muestra; cruzando moléculas el metabolismo celular se detiene, asegurando la integridad celular y evitando la difusión molecular. Los agentes fijadores y la concentración utilizada deben ajustarse a tal fin, dejando los antígenos suficientemente expuestos para interactuar con los anticuerpos. El siguiente protocolo combina la suave capacidad fijativa del paraformaldehído, con el efecto más fuerte del glutaraldehído. Sus proporciones fueron optimizadas para AGPs y componentes de pared celular, pero es adecuado para otras proteínas y estructuras celulares. El proceso de deshidratación posterior preparará las muestras para la incrustación LR-White. En este experimento se utilizaron tejidos vegetales de varias especies vegetales. Las muestras de suber quercus fueron recogidas de árboles cultivados en el campo. Las muestras de trithuria submersa fueron amablemente compartidas con nosotros por Paula Rudall (Kew Gardens, Londres, Reino Unido).- Sembrar todas las plantas de Arabidopsis directamente en el suelo y crecer en una instalación de crecimiento interior con un 60% de humedad relativa y un ciclo de día / noche de 16 h de luz a 21 °C y 8 h oscuridad a 18 °C. Seleccione los tejidos vegetales que desea analizar y recorte las muestras para que no sean más de 16 mmy 2 de tamaño.
- Transfiera inmediatamente la muestra a un vial de vidrio previamente lleno de suficiente solución fija en frío (2% formaldehído (w/v), 2,5% glutaraldehído (w/v), 25 mM PIPES pH 7 y 0,001% Tween-20 (v/v)) para sumergir completamente las muestras (Figura 1A).
PRECAUCIÓN: El formaldehído y el glutaraldehído son agentes fijativos que pueden ser dañinos por inhalación y contacto. Realice el paso de fijación en una capucha de humo y use ropa protectora adecuada y guantes de nitrilo. Todas las soluciones a partir de este paso, incluidas las series de alcohol hasta el 70%, deben ser almacenadas para su posterior descontaminación por personal especializado. - Después de recopilar todos los ejemplos, actualice el fijador.
- Transfiera los viales a una cámara de vacío y aplique lentamente el vacío. Al alcanzar -60 kPa, el material flotante comenzará a hundirse en la parte inferior del vial (Figura 1B).
- Mantener bajo un vacío de no más de -80 kPa para 2 h a temperatura ambiente.
- Suelte lentamente el vacío, selle el vial de vidrio y colóquelo durante la noche a 4 °C.
- Deseche las muestras que no se hundieron durante la fijación durante la noche. Lave las muestras restantes con 25 mM PBS pH 7 durante 10 min, seguido de un lavado de 20 minutos en 25 mM PIPES buffer pH 7.2.
- Deshidratar las muestras de una serie de etanol (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% y 3x 100% etanol) durante 20 minutos cada una. Transfiera inmediatamente las muestras deshidratadas a viales de vidrio etiquetados para su incrustación(Figura 1C).
NOTA: El proceso de deshidratación se puede pausar en el paso del etanol del 70%.
- Incrustación de resina LR-White
NOTA: LR-white es una resina acrílica no hidrofóbica con baja viscosidad, por lo que es ideal para penetrar tejidos con muchas capas gruesas de paredes celulares. LR-White también viene en varios grados de dureza compatibles para cortar la mayoría de las muestras de plantas. Asegúrese de que la resina utilizada ya se suministra con el catalizador adecuado mezclado, o siga las instrucciones del proveedor para preparar la resina. El siguiente proceso de incrustación es lento, pero los resultados justifican en gran medida los medios.- Perfundir las muestras incubando con la resina LR-White en una serie de concentraciones crecientes de resina (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) en etanol, incubando durante 24 h a 4 °C en cada paso.
PRECAUCIÓN: La resina LR-Blanca es una resina acrílica de baja toxicidad; sin embargo, puede ser un irritante para la piel por contacto e inhalación. Se recomienda trabajar en un área bien ventilada o debajo de una campana de humo con un desgaste protector adecuado y guantes de nitrilo. - Refresque la resina LR-blanca e incubar durante 12 h adicionales a 4 °C.
- Preparar cápsulas de gelatina de incrustación de tamaño adecuado (tamaño 1 (0,5 ml) para muestras de hasta 3 mm, 2 x 0,37 ml para muestras de hasta 5 mm o 3 x 0,3 ml para muestras de hasta 8 mm, y etiquetas de papel (Figura 1D).
NOTA: Seleccione el tamaño de la cápsula para que sea ligeramente mayor que la muestra, de modo que la muestra pueda estar completamente encerrada en la resina. Además, recuerda etiquetar las etiquetas con un lápiz, porque la pluma o las tintas impresas contaminarán la resina, arruinando la muestra. - Aplique una gota de resina fresca LR-blanca en la parte inferior de cada cápsula.
- Coloque una muestra en cada cápsula de gelatina y llene al máximo la capacidad con resina fresca. Coloque la tapa de la cápsula y presione suavemente para formar un sello hermético(Figura 1E).
- Polimerizar la resina de 24 a 48 h a 58 °C, o hasta que esté completamente endurecida.
- Almacene muestras a temperatura ambiente.
NOTA: La resina LR-blanca post polimerización es inerte.
- Perfundir las muestras incubando con la resina LR-White en una serie de concentraciones crecientes de resina (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) en etanol, incubando durante 24 h a 4 °C en cada paso.
2. Preparación de diapositivas
NOTA: Las toboganes de vidrio deben estar limpias, libres de polvo, grasa o cualquier otro contaminante. Incluso las nuevas diapositivas deben limpiarse, ya que algunos proveedores utilizan aceites y detergentes para evitar que las diapositivas se mantengan juntas. Cualquier grasa o detergente interferirá con la adherencia de la sección a la diapositiva, incluso si se trata con poli-L-lisina. La pelusa y el polvo afectarán las observaciones del espécimen y muy posiblemente arruinarán el experimento. Los toboganes recubiertos de teflón con pozos de reacción son perfectos para esta tarea. Son asequibles, reutilizables y reducen drásticamente la cantidad de solución de anticuerpos necesaria. Con una limpieza adecuada, la inmunolocalización fluorescente de excelente calidad se puede realizar a un costo muy asequible.
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Lavado de diapositivas
- Coloque las diapositivas en un estante de tinción y cubra con solución de limpieza (0,1% SDS (w/v), 1% ácido acético (v/v), 10% etanol (v/v)).
- Mantenga una agitación leve durante 20 minutos.
- Transfiera los estantes de tinción a un baño ddH2O con agitación leve durante 10 minutos. Repita 4 veces.
- Escurrir cuidadosamente los estantes antes de sumergirse brevemente en etanol al 100% y dejar que las diapositivas se sequen en un ambiente libre de polvo.
- Conservar hasta su uso.
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Recubrimiento de poli-L-lisina (opcional)
NOTA: Las secciones pequeñas suelen pegarse muy bien a los toboganes de vidrio limpio. Este paso solo es recomendable para secciones más grandes (>2 mm2). Las secciones más grandes tienden a plegarse y arrugarse, y no son recomendables. Sin embargo, si es necesario, utilice diapositivas de reacción con agujeros más grandes. Límpielos como se ha mencionado anteriormente y proceda de la siguiente manera.- Coloque toboganes limpios en una placa cuadrada de Petri. Pipeta 0.001% solución de poli-L-lisina (w/v) para cubrir los agujeros de las diapositivas, sin desbordarse.
- Deje que los toboganes se sequen durante la noche a 40 °C en platos cerrados de Petri.
NOTA: Las toboganes recubiertas están listas para su uso inmediato y se pueden almacenar en un ambiente libre de polvo a temperatura ambiente, durante varios meses.
3. Recorte y seccionamiento de muestras
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Recorte de muestras
- Con una cuchilla de afeitar afilada, recorta los bloques LR-White bajo un estereomicroscopio para formar una estructura en forma de pirámide donde el ápice es perpendicular al área de interés de la muestra(Figura Suplementaria 1A).
NOTA: El soporte de la muestra ultra-microtome es una excelente herramienta para asegurar el bloque. Si el dispositivo no tiene un soporte de muestra universal, utilice el más adecuado para bloques redondos. - Recorte la estructura piramidal eliminando finas rodajas del exceso de resina perpendicularmente al eje principal de la pirámide.
- Proceda hasta que se alcance la muestra formando la superficie de corte. Dentro de la superficie de corte, la muestra objetivo debe estar idealmente encerrada en una forma trapezoidal.
NOTA: El bloque de resina se puede recortar aún más en un ángulo de hendidura para reducir el área de superficie de sección con una hoja afilada (Figura 1F).
- Con una cuchilla de afeitar afilada, recorta los bloques LR-White bajo un estereomicroscopio para formar una estructura en forma de pirámide donde el ápice es perpendicular al área de interés de la muestra(Figura Suplementaria 1A).
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Seccionamiento semifino
NOTA: Se utilizará un microtome con cuchillos de vidrio. La capacidad del anticuerpo para unirse al epítopo condicionará el éxito de la reacción inmunoetiquedora. La naturaleza hidrófila de la resina LR-White permitirá un buen contacto de los anticuerpos con las secciones de la muestra. Las secciones más delgadas presentarán una coloración calcofluor más débil que se utilizará para ayudar a localizar las secciones y ayudar con el proceso de imagen. Lo mismo ocurre con otras manchas que luego se pueden aplicar. También el espesor excesivo afectará a la calidad de adquisición de imágenes. Un buen compromiso para el espesor de la sección se puede encontrar entre 200 y 700 nm, dependiendo de las características del tejido. Monte los bloques firmemente en el soporte de la muestra del ultra-microtome.- Con un ultra-microtome, hacer secciones con un espesor entre 200 y 700 nm (Figura 1G).
- Compruebe el área de la sección transfiriendo algunas secciones a una caída de ddH2O en una diapositiva de vidrio. Coloque el tobogán sobre una placa caliente de 50 °C hasta que el agua se evapore. Mancha colocando una gota de 1% Toluidine Blue O (w/v) en 1% solución de ácido bórico (w/v) sobre las secciones durante 30 s. Enjuague y observe bajo el microscopio.
- Al encontrar la estructura deseada, transfiera una o dos secciones a cada gota de ddH2O colocada previamente en cada pozo de una diapositiva de reacción limpia.
- Coloque cada tobogán en una placa de Petri cuadrada cerrada de 10 cm y déjela secar a 50 °C.
- Almacene las diapositivas en un cuadro de archivo limpio hasta su uso.
4. Inmunolocalización
NOTA: El procedimiento de inmunolocalización fluorescente se basa en el uso secuencial de dos anticuerpos. El anticuerpo primario se eleva contra un antígeno objetivo específico. El anticuerpo secundario se eleva específicamente contra el anticuerpo primario y para las técnicas fluorescentes se conjuga a un fluoróforo (FITC en este protocolo específico). El anticuerpo principal se utilizará para detectar el antígeno objetivo en la muestra, y el anticuerpo secundario se utilizará para marcar la ubicación donde el anticuerpo primario conectado a la muestra después de lavar el exceso de anticuerpo primario. Los controles son una parte importante de este ensayo y siempre deben realizarse para asegurar la precisión de las observaciones. Un pozo en la diapositiva debe reservarse para su uso como control negativo, donde se omitirá el tratamiento de anticuerpos primarios, y por lo tanto no se debe observar ninguna señal al final del experimento. En el experimento debe incluirse un control positivo tratando un pozo con un anticuerpo cuyo etiquetado ya es conocido y cierto. El control positivo se utiliza para confirmar la eficacia secundaria del etiquetado de anticuerpos y las condiciones de reacción, mientras que el control negativo prueba la especificidad secundaria de anticuerpos.
- Prepare una cámara de incubación colocando algunas toallas de papel humedecidas en la parte inferior de una caja de puntas de pipeta y envolviéndola con papel de aluminio(Figura suplementaria 1B-1E). Coloque los portaobjetos en la cámara de incubación.
- Pipeta una caída de 50 μL por pozo de 8 mm de solución de bloqueo (5% leche seca sin grasa (w/v) en 1 M PBS) e incubar durante 10 min. Retire la solución de bloqueo y lave todos los pozos dos veces con PBS durante 10 minutos.
- Preparar las soluciones principales de anticuerpos (véase la Tabla Suplementaria 1),anticuerpo 1:5 (v/v) en solución de bloqueo; hacer una estimación de aproximadamente 40 μL por pozo de 8 mm.
NOTA: La concentración del anticuerpo debe ajustarse de acuerdo con el protocolo de la fabricación. - Realice un lavado final con ddH2O durante 5 minutos, nunca deje que los pozos se sequen por completo.
- Pipetear la solución principal de anticuerpos a los pozos de reacción. Solución de bloqueo de pipetas a los pozos de control.
- Cierre la cámara de incubación y deje pararse durante 2 h a temperatura ambiente seguido de la noche a la mañana a 4 °C. Preparar la solución secundaria de anticuerpos, 1% en solución de bloqueo (v/v) de aproximadamente 40 μL por pozo. Manténgalo cubierto con papel de aluminio.
- Lave todos los pozos dos veces con PBS durante 10 minutos, seguido de 10 minutos adicionales con ddH2O. Asegúrese de que ningún rastro de la solución de bloqueo o depósitos sea visible en los pozos.
- Pipetear la solución secundaria de anticuerpos a todos los pozos. A partir de ahora, proteja las diapositivas de la luz.
- Incubar durante 3-4 h en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Lave todos los pozos dos veces durante 10 minutos con PBS seguido de otro lavado de 10 minutos con ddH2O.
- Aplique una gota de calcofluor (1:10.000 (w/v) fluorescente más brillante 28 en PBS) a cada pozo. Sin lavar, aplique una gota de medio de montaje (ver Tabla de materiales)a cada pozo y coloque un tapa-cubierta (Figura 1H).
- Observe con un microscopio de fluorescencia, equipado con lente 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 y 100x/1.40, utilice filtros UV (para mancha de calcofluor) y FITC, para detectar la pared celular y la inmunolocalización respectivamente(Figura 1I). Utilice las siguientes longitudes de onda: excitación/emisión (nm) 358/461 para UV y 485/530 para FITC.
- Para una mejor visualización de los resultados se superponen ambas imágenes con ImageJ o similar.
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Representative Results
En un experimento exitoso, el anticuerpo secundario identificará específicamente la ubicación del epítopo específico en verde brillante, de manera consistente, permitiendo la caracterización de la composición de la pared celular en una cierta etapa de desarrollo de la célula, tejido u órgano. Por ejemplo, el anticuerpo LM6 tiene una alta afinidad por 1,5-arabinan, un compuesto con rhamnogalacturonan tipo I que se puede encontrar etiquetando abundantemente la pared celular del anéter quercus suber en desarrollo(Figura 2A),permitiendo así concluir que este tipo de pectina es abundante y parte de la composición primaria de la pared celular. JIM5 tiene afinidad por homogalacturonans apenas esterificados que se encuentran típicamente en la punta raíz del embrión suber Quercus, especificando las propiedades mecánicas del órgano (Figura 2B). Xylogalacturonan son un tipo de pectina rica en xilosa asociada con el aflojamiento de la pared celular, se encuentran en células degenerantes. El anticuerpo LM8 reconoce específicamente a los xylogalacturonans, en órganos de maduración se puede utilizar para detectar células o tejidos degenerantes, como las células endospermas durante las etapas finales de la maduración de bellota de suber quercus (Figura 2C).
JIM13 tiene afinidad por los AGPs encontrados en estructuras relacionadas con la reproducción, líneas celulares relacionadas con la microgametogénesis en Arabidopsis thaliana (Figura 2D). JIM8 también reconoce los epítopos de agps presentes en células y órganos relacionados con la reproducción como el papila estigmatizado y la micropile del Sumersa Basal Angiosperm Trithuria(Figura 2E-2F). Ambos anticuerpos han sido sugeridos para ser marcadores moleculares para las líneas celulares gametofíticas en las plantas9.
Los errores comunes en este protocolo suelen ser fáciles de detectar e identificar. Cuando se saltan los lavados o se dejan secar los pozos de reacción, el anticuerpo secundario generalmente aparecerá como un frotis inespecífico que cubre indiscriminadamente sobre las células, los tejidos, la resina y el deslizamiento(Figura 3A). Se formarán agregados de fluorocromo verde si el anticuerpo primario sin límites no se ha lavado correctamente(Figura 3B). Otra causa común de fracaso de esta técnica está relacionada con el plegado y/o desprendimiento de las secciones(Figura 3C),haciendo inútil el experimento. Este problema generalmente está relacionado con la mala adherencia de las secciones a las diapositivas, probablemente debido al uso de diapositivas sucias, y / o lavado agresivo.
La preparación de la muestra también es un paso crítico en este procedimiento. Afortunadamente, los problemas de fijación e incrustación más comunes son fáciles de detectar (Figura 3D). Si todo va bien, el bloque de resina estará libre de grietas y la muestra será claramente visible con un color amarillo pálido a marrón claro(Figura 3D-1). Las muestras incrustadas ineficientemente mostrarán manchas o áreas blancas polvorientas(Figura 3D-2). Mantener el tamaño de la muestra por debajo de 8 mm es importante para garantizar la penetración de la solución fija. Cuando las muestras están mal fijas, aparecerán de color marrón oscuro casi negro(Figura 3D-3). También la temperatura de polimerización es importante tanto para la preservación de los epítopos como para el endurecimiento adecuado de la resina. Una temperatura excesiva puede hacer que la resina se agriete haciendo imposible la sección de la muestra(Figura 3D-4).
Figura 1. Descripción general del protocolo completo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados típicos de agps e inmunolocalización de pectina en muestras de plantas. (A) LM6 etiquetado de la mitad arabinana de pectinas en un anéter de suber Quercus en meiosis I. (B) Etiquetado específico de pectinas bajo metil-esterificados en una punta raíz de embrión de suber Quercus por JIM5. (C) Xylogalacturonan etiquetado por LM8 en el endospermo en retroceso de un suber Quercus madurando bellota. (D) Jim13 etiquetado de AGPs en el tapetum y tetrads de un anther Arabidopsis thaliana. (E) AGPs etiquetados por JIM8 en la papila estigmatizada de Trithuria submersa. (F) JIM8 etiquetando AGPs en el micropyle (flecha blanca) de un ovul de Trithuria submersa. Microspora meiotica (Mc), Tapetum (Tp), Raíz (R), Punta de raíz (Rt), Testa (Ts), Endosperm (Ed), Embrión (Em), Epidermis (Ep), Papilas estigmatizas (SP), Ovule (OV). Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Errores y problemas comunes durante el protocolo. (A) El fallo de los pasos de lavado se identifica por la presencia de un frotis inespecífico de anticuerpo secundario (+) sobre la resina de muestra. (B) La escasa especificidad o fallo de lavado del anticuerpo primario da lugar a la formación de agregados FITC (+) no unidos a una ubicación específica. (C) Los pliegues y el desprendimiento de sección son a menudo el resultado de un lavado agresivo y toboganes sucios. (D) Ejemplos de fijación e incrustación de muestras; (1) tamaño de muestra e incrustación perfectos, (2) fallo de incrustación, (3) fallo de fijación de muestras, (4) fallo de endurecimiento de la resina. Fitc etiquetado anticuerpo (verde) y calcofluor-mancha blanca (azul). Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1. (A) Representación esquemática de la secuencia de recorte de bloques para preparar la muestra (bloque amarillo) para la sección con el ultramicrotome. En primer lugar, se retira la cápsula de gelatina (1). Luego se recortan primero en un ángulo de 40° a 45° a los lados de la cápsula tangencialmente a la muestra (2), un segundo corte se hace a 90° del primero (3) seguido de un tercero (4) y cuarto siguiendo la misma regla (5). A partir de esta primera fase de recorte resulta una estructura en forma piramidal que la cumbre se encuentra por encima de la muestra. Por último, con una hoja afilada, la cumbre se afeita perpendicularmente al eje principal del bloque de resina para llegar a la muestra incrustada. Al final del procedimiento se debe obtener una superficie cuadrada o trapezoide (6). (B) Suministros necesarios para hacer una cámara de incubación; papel de aluminio (1), cinta adhesiva de doble cara (2), toallas de papel (3) y una caja de punta de pipeta. (C) Primer paso, la lámina de estaño se fija a la caja con la cinta adhesiva de doble cara. (D) Segundo paso, se retira el soporte de puntas de pipeta para colocar toallas de papel en la parte inferior de la caja. (E) Tercer paso, las toallas de papel se humedece con agua y el soporte de las puntas de la pipeta se coloca de nuevo para actuar tiene una bandeja para los toboganes. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 1: Lista de anticuerpos monoclonales útiles. La tabla anterior representa un ejemplo de anticuerpos disponibles, con información sobre sus objetivos y dónde se pueden comprar. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El método de inmunolocalización fluorescente en las plantas aquí descrito, aunque sin problemas sencillo, se basa en el éxito de varios pasos pequeños. El primero de los cuales es la preparación y fijación de muestras. Durante este primer paso, se utiliza una mezcla de formaldehído y glutaraldehído para reenlazar la mayoría de los componentes celulares. El formaldehído en la solución proporciona una fijación suave y reversible, mientras que el glutaraldehído proporciona una fuerte vinculación más permanente; el equilibrio entre los dos fijadores proporciona la cantidad adecuada de reticulación, permitiendo que la exposición de los epítopos reaccione con el anticuerpo primario10. Para que la solución fija funcione correctamente, la muestra debe ser pequeña. Las estructuras grandes de más de 7 mm de diámetro son muy difíciles de fijar y deben recortarse para garantizar la penetración fija.
Después de heridas o estrés, algunas plantas secretan grandes cantidades de taninos formando precipitados oscuros que pueden reaccionar con el formaldehído interfiriendo con el proceso fijador. Mantener las muestras en hielo y reemplazar la solución fija cada vez que se nubla ayuda a reducir este efecto. El aire también puede interferir con el proceso fijador y más adelante en la incrustación y endurecimiento de la resina. El tratamiento de vacío propuesto debe eliminar la mayor parte del aire. Para los tejidos particularmente ventilado, el paso de vacío puede extenderse más allá de 2 h, hasta que no salga más aire de las muestras y se hundan hasta la parte inferior. Cualquier muestra que se encuentre flotando después del paso fijador nocturno debe descartarse. La incrustación de resina proporciona soporte para cortar la muestra conservada, y su dureza debe ser aproximada a los tejidos incrustados10. LR-White viene en tres grados de dureza: difícil para los tejidos leñosos fuertemente eslerificados, grado medio para la gran mayoría de los tejidos, desde las hojas hasta los granos de polen, y grado suave para tejidos más delicados. Para una incrustación perfecta, la resina debe penetrar completamente en la muestra; esto se obtiene mejor con una infiltración lenta y gradual. Con las pruebas previas, se pueden utilizar períodos de incubación más cortos. Las cápsulas de gelatina son pequeñas y herméticamente sellables, lo que las hace perfectas para el curado de resina LR-White. Para una talla 2 (0,37 mL), el curado debe completarse después de 24 h a 58 °C. Para otros tamaños de cápsula, se debe ajustar el tiempo de curado. La resina curada LR-White debe pasar de ser casi incolora a un color dorado/ámbar claro y sentirse dura con las uñas. El recorte de muestras y el uso del ultramicoma requieren práctica, pero producirán cifras claras. El grosor y el tamaño de la sección son importantes para el ensayo de imágenes e inmunolocalización. El espesor de la sección debe mantenerse alrededor de 500 nm. Las secciones que son demasiado delgadas darán lugar a una tinción deficiente y espesores de sección superiores a 700 nm interferirán con la adquisición y resolución de la imagen. La naturaleza hidrófila de la resina LR-White permite el uso directo de las secciones en tinción e inmunolocalización sin eliminar la resina.
La solución de bloqueo (5% de leche seca sin grasa en 1 M PBS) reduce la unión inespecífica de anticuerpos. La leche seca sin grasa ha sido una alternativa fiable a BSA u otros agentes de bloqueo más tradicionales, y es significativamente menos costosa. La solución de bloqueo debe filtrarse a través de un filtro de papel antes de su uso, para evitar precipitados que se formen difíciles de lavar los agregados, retener anticuerpos y comprometer el experimento. Las ratios de anticuerpos y los tiempos de incubación propuestos han sido optimizados y aplicados con éxito a diversas especies en varios estudios9,11,12,13,14,15,16.
La evaporación y la exposición a la luz son dos problemas que deben evitarse durante el procedimiento de inmunolocalización. Una cámara de incubación húmeda y oscura resuelve ambos problemas. Un tutorial sobre cómo hacer una cámara oscura se puede encontrar en la figura suplementaria 1B-1E. Este protocolo de inmunolocalización exige el uso de un anticuerpo primario dirigido al epitopo objetivo sin etiqueta propia, y un anticuerpo secundario conjugado a un fluorocromo (FITC) que se eleva contra el anticuerpo primario IgG. Este método ofrece varias ventajas sobre el uso de un único sistema de detección de anticuerpos debido a una mayor stringencia de la detección, ya que el anticuerpo secundario no tiene afinidad con las especies de muestras objetivo. Este sistema ofrece una mayor señal, ya que las moléculas de anticuerpos primarios pueden ser blanco de varias moléculas del anticuerpo secundario, cada una con un fluorocromo17.
La descomposición de los fluorocromos por luz intensa, o blanqueamiento fotográfico, es un tema importante en esta técnica. Especialmente cuando se exploran señales localizadas débiles, la señal puede perderse irreversiblemente antes de la toma de imágenes. El medio de montaje aumenta en gran medida la estabilidad y la vida útil de los fluorocromos18; sin embargo, es muy recomendable probar los medios de montaje, ya que algunos pueden reaccionar con la mancha y/o el fluorocromo, formando precipitados y desenfocando la imagen. La configuración del sistema óptico utilizado para observar y registrar la inmunolocalización es uno de los aspectos más importantes para el éxito de este experimento. Debido al espesor reducido de las secciones, los beneficios de usar el microscopio confocal son limitados. La configuración más exitosa requiere un microscopio de epifluorescencia vertical convencional equipado con una fuente de luz fluorescente, LED o bombilla de mercurio19,con objetivos adecuados de grado de fluorescencia. También se requieren filtros de luz de buena calidad para excitación/emisión (nm) 358/461 para UV y 485/530 para FITC. Para la adquisición de imágenes de fluorescencia, se recomiendan cámaras digitales monocromáticas refrigeradas debido a su alta velocidad y sensibilidad, pero sacrifican la información de color verdadera20. Las cámaras policromáticas proporcionan la capacidad de ordenar fácilmente la señal de la fluorescencia de fondo, pero son más lentas y mucho menos sensibles que sus contrapartes monocromáticas.
El método está limitado por la disponibilidad de anticuerpos específicos. A pesar de la disponibilidad de una vasta y creciente colección de anticuerpos dirigidos a los epítopos de las plantas, es comprensible que no todos los compuestos vegetales estén todavía cubiertos. También los lípidos tienden a ser extraídos por el método de incrustación descrito, y por lo tanto no se recomienda para tejidos con un alto contenido de aceite. La sección Cryostat puede ser una alternativa, a pesar de sacrificar la resolución de la imagen. La temperatura de la polimerización de resina LR-White puede alterar en algunos casos los epítopos más sensibles. Si el epítopo objetivo es sensible a la temperatura, cambie LR-White por resina LR-Gold. Polimerización a -25 °C bajo luz blanca, LR-Gold ofrece una excelente preservación de los epitopos termosensibles, pero requerirá la adquisición de un aparato de polimerización especializado y es ligeramente más tóxico que LR-White.
Este método se ha utilizado en una amplia gama de especies y tejidos. Permite un acceso rápido a información fiable sobre la distribución específica del epítopo. Ofrecer datos de apoyo para modelos evolutivos e identificar marcadores y adaptaciones específicas en células y tejidos mientras proporciona resultados visualmente tentadores. El uso de anticuerpos conjugados con fluorocromos sobre las alternativas de conjugación de fosfatasa alcalina o peroxidasa10,consume menos tiempo, es significativamente menos propenso a la sobrerreacción de artefactos y proporciona una resolución subcelular clara difícil de igualar con cualquier otra técnica. El uso de anticuerpos específicos para polímeros relacionados con la pared celular permite una visión de la disposición de compuestos en dominios muy restringidos. Esa resolución sería difícil de obtener de las herramientas bioquímicas tradicionales. El conjunto cada vez mayor de anticuerpos primarios disponibles ofrece nuevas oportunidades constantes de descubrimiento en el funcionamiento interno de las células vegetales.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores recibieron el apoyo del proyecto de la UE 690946 'SexSeed' (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) financiado por H2020-MSCA-RISE-2015 y SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP recibió una subvención del proyecto MSCA-IF-2016 de la Unión Europea (núl. 753328). MC recibió una subvención de fct phD grant SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Absolute ethanol | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size should fit the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| Vacuum chamber | na | na | |
| Vacuum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
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