Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

والكهربائية القائمة على القول بالبروتين MeCP2

Published: May 22, 2020 doi: 10.3791/61054
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1
1Institute of Medical Genetics, Center for Pathobiochemistry and Genetics, Medical University of Vienna (MUV), 2Murdoch Children's Research Institute and Department of Paediatrics, University of Melbourne, Discipline of Child & Adolescent Health, Sydney Medical School, 3Department of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University of Vienna

Summary

المناعة الكهربية chemiluminescence (ECLIA) هو نهج جديد للكشف الكمي من المتغيرات البروتين MeCP2 المحلية وتطبيقها خارجيًا ، والتي تنتج قياسات كمية ودقيقة وقابلة للاستنساخ مع خطأ منخفض داخل وبين القياس على نطاق عمل واسع. هنا، يتم وصف بروتوكول MeCP2-ECLIA في شكل 96-well.

Abstract

وECLIA هو طريقة متعددة الاستخدامات التي هي قادرة على تحديد كميات البروتين الذاتية والمؤتلفة في شكل 96 بئر. لإثبات كفاءة ECLIA، تم استخدام هذا القول لتحليل المستويات الجوهرية من MeCP2 في أنسجة الدماغ الماوس والاستيلاء على TAT-MeCP2 في الخلايا الليفية الجلدية البشرية. تنتج MeCP2-ECLIA قياسات دقيقة للغاية وقابلة للاستنساخ مع خطأ منخفض داخل وبين القياس. باختصار، قمنا بتطوير طريقة كمية لتقييم متغيرات البروتين MeCP2 التي يمكن استخدامها في شاشات عالية الإنتاجية.

Introduction

ويستند المناعة الكهربية (ECLIA) على عملية تستخدم التسميات المصممة لانبعاث الإنارة عندما يحفز كيميائيا. وهي تقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع للكشف الكمي عن الأدوية البيولوجية في الصناعة الأساسية والبحوث الأكاديمية وصناعة الأغذية وكذلك في التشخيص السريري1. عادة، يتم استخدام لوحة 96-جيدا يمكن التخلص منها مع أقطاب الحبر الكربون. تعمل هذه الأقطاب الكهربائية كناقل للمرحلة الصلبة للمناعة. يتم اقتران الأجسام المضادة الثانوية إلى تسمية electrochemiluminescent وعندما يتم تطبيق الكهرباء على النظام ، يتم تشغيل الانبعاثات الخفيفة للتسمية الكيميائية. جهاز عالي الضوضاء جداً (CCD) يسجل شدة الضوء التي تتناسب مباشرة مع المستضد المرتبط بالجسم المضاد لالتقاط مما أدى إلى التحديد الكمي للحازة المستهدفة للعينة2. بالمقارنة مع الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، تعتبر ECLIA مفيدة لأنها توفر حساسية وقابلية تكرار أعلى بالإضافة إلى أتمتة واتساق أفضل3.

هنا قمنا بتحليل البروتين الملزم الميثيل-CpG 2 (MeCP2) مستويات في عينات من أصل الإنسان والمورين، فضلا عن المتغيرات المختلفة من البروتين المؤتلف باستخدام نظام ECLIA وضعت حديثا. MecP2 هو بروتين حمض يجليد الحمض النووي المرتبط بـ X والمعروف بالتفاعل مع تسلسل الحمض النووي الميثيلي. وقد تورط هذا البروتين في تنظيم التعبير الجيني4,5. فقدان وظيفة الطفرات في الجين الذي ترميز هذا البروتين هي الجناة الرئيسيين المسببة لمتلازمة Rett (RTT), اضطراب النمو العصبي الشديد6. اضطراب آخر متعلق بMeCP2 ، متلازمة الازدواجية MECP2 ، يؤدي أيضًا إلى أعراض عصبية يمكن أن تتداخل مع أعراض RTT7. وتجدر الإشارة إلى أن الإناث يتأثرن في الغالب بـ RTT في حين أن الذكور يعانون في الغالب من متلازمة الازدواجية MECP2 6,7.

وترتبط هذه الاضطرابات مع مستويات MeCP2 غير كافية أو زائدة على التوالي في الجهاز العصبي المركزي (CNS). وبالتالي، فإن خيارات العلاج لRTT التي تنطوي على زيادة مستويات MeCP2 في الجهاز الوطني للدراسات الفضائية تحتاج إلى تجنب الآثار الضارة المرتبطة بفائض MeCP27. ونتيجة لهذه الحقيقة، فإن التحديد الكمي الشديد الحساسية والدقيق لمستويات البروتين MeCP2، كما يوفره نظام ECLIA، أمر بالغ الأهمية للنهوض بRTT وكذلك أبحاث متلازمة الازدواجية MECP2. القياسات الدقيقة لمستويات MeCP2 الذاتية والخارجية من خطوط الخلايا البشرية وعينات أنسجة الماوس وكذلك البروتين المؤتلف الذي يتكون من الإنسان MeCP2 isoform B (المعروف أيضا باسم isoform e1) ، والحد الأدنى N-المحطة HIV-TAT نقل المجال (TAT-MeCP2) التي لديها القدرة على عبور حاجز الدم في الدماغ8,9 وترد في هذا العمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على الموافقة على شراء خزعة الجلد لأغراض البحث من لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في مستشفى الأطفال في ويستميد، أستراليا. تم الحصول على الموافقة على التجارب على الحيوانات من الوزارة الاتحادية النمساوية للعلوم والبحوث والاقتصاد، والتي أجريت وفقا للوائح المحلية لرعاية الحيوان (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

ملاحظة: يتم تصوير مبدأ نظام ECLIA في الشكل 1.

1. اختيار الأجسام المضادة

  1. تقييم نسبة الإشارة إلى الضوضاء لمجموعة من مختلف الأجسام المضادة MeCP2 وتحديد أفضل قوة إشارة وأعلى خصوصية ضمن مزيج من الأجسام المضادة MCP2 أحادية اللون الماوس الأولية (استنساخ Mec-168) والأرنب polyclonal MeCP2 الكشف عن الأجسام المضادة (العرف). للجسم المضاد الثانوي، استخدم جسممضاد خاص بالنظام(جدول المواد)،والذي تم التحقق منه تجريبيًا أيضًا.
    ملاحظة: الجدول 1 يعطي نظرة عامة على جميع الأجسام المضادة التي تم التحقق منها أثناء تطوير MeCP2-ECLIA ونطاقات التخفيف التي تم اختبارها.
وظيفه اسم استنساخ التخفيف
الاساسي الماوس، مكافحة MeCP2 Mec-168 1:500−1:10,000
الاساسي الماوس، مكافحة MeCP2 4B6 1:250−1:4,000
الاساسي الماوس، مكافحة MeCP2 الرجال-8 1:500−1:4,000
الاساسي الماوس، مكافحة MeCP2 1B11 1:500−1:4,000
الاساسي أرنب، مضاد لـ MeCP2 D4F3 1:500−1:4,000
الثانويه أرنب، مضاد لـ MeCP2 متعدد الكلونات 1:2,000−1:20,000
الثانويه أرنب، مضاد لـ MeCP2 متعدد الكلونات 1:2,000−1:20,000
الكشف عن SULFO-TAG المسمى المضادة للأرنب متعدد الكلونات 1:500−1:1,000

الجدول 1: قائمة الأجسام المضادة والتخفيفات المستخدمة في العمل.

  1. بدلا من ذلك، استخدم كل زوج من الأجسام المضادة MeCP2 التي تعمل بشكل جيد مع ELISA التقليدية.

2. علاج HDFs مع بروتين الاندماج TAT-MeCP2

ملاحظة: تم التعبير عن TAT-MeCP2 بشكل مؤتلف في إشيريشيا القولونية وتنقيتها باستخدام تقنيات الكروماتوغرافية القياسية كما وصفت سابقا8 وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

  1. لوحة 1 × 106 خلايا الورم الليفي الجلدي البشري (HDF) في أطباق 100 مم وتنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تصل إلى حوالي 90٪ التقاء.
  2. إخراج قارورة واحدة من بروتين الاندماج TAT-MeCP2. تذوب على الجليد وتخلط بلطف.
  3. تمييع TAT-MeCP2 إلى تركيز نهائي من 500 nM في 50 مل من وسائل الإعلام ثقافة HDF.
  4. إزالة وسائل الإعلام من أطباق 100 ملم واحتضان الخلايا مع 500 nM TAT-MeCP2 في 37 درجة مئوية لفترات الحضانة المختلفة تصل إلى 24 ساعة.
  5. إزالة حل TAT-MeCP2 من الخلايا. اغسل الخلايا 2x مع مالين دولبكو العازلة للفوسفات (DPBS) المعقم مسبقًا.
  6. علاج الخلايا مع 2 مل من 0.05٪ trypsin-EDTA الحل لمدة 5 دقيقة في 37 درجة مئوية10.
  7. إضافة 6 مل من الوسائط الثقافية HDF لتعطيل التربسين وجمع الخلايا في أنابيب 15 مل.
  8. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. إزالة supernatant وغسل الخلايا 2x مع DPBS الجليد الباردة. تخزين بيليه على الجليد والمضي قدما مع إعداد العينة.

3. إعداد عينة

  1. HDF الليسات
    1. تحديد أعلى مستويات البروتين من MeCP2 باستخدام طريقة REAP للتقسيم تحت الخلية في المقصورات السيتوبلازمية والنووية تحت الخلية وفقا لسوزوكي وآخرون11. الحد من الكسور إلى ما لا يزيد عن ست عينات لكل تجربة.
  2. دماغ الفأر يلهي
    1. إعداد 100 مل من كل كاشف محلول الدمى الناقص التوتر والمخزن المؤقت لاستخراج.
      1. لكاشف محلول الدمى نقص التوتر، مزيج جيد 10 mM HEPES، 1.5 mM كلوريد المغنيسيوم و10 mM كلوريد البوتاسيوم.
      2. للاحتياطي استخراج, مزيج جيد 20 mM HEPES, 1.5 mm كلوريد المغنيسيوم, 0.42 M كلوريد الصوديوم, 0.2 mM EDTA, و 25% (v/v) الجلسرين.
      3. ضبط درجة الحموضة لكلا المخازن المؤقتة إلى 7.9.
      4. أضف 1 m m dithiothreitol (DTT) وكوكتيل مثبط البروتياز 1x إلى كل من المخازن المؤقتة طازجة. البرد على الجليد قبل الاستخدام.
    2. تعليق 100 ملغ من إجمالي دماغ الفأر (سلالة: C57BL/6J, نوع البري ة الذكور والإناث وB6.129P2 (C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous الذكور والإناث heterozygous; العمر: 4-8 أسابيع من العمر) في 1 مل من الثلج الباردة محلول الدموتوني كاشف.
    3. تجانس الدماغ مع الزمرة قبل المبردة جميع الأنسجة الزجاجية المتجانس من قبل 15 السكتات الدماغية من التجانس A (فضفاضة، لإزالة كبيرة) وB (ضيق، لإزالة الصغيرة)، على التوالي.
    4. نقل الخلايا المتجانسة إلى أنبوب نظيف والطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant (أو الاحتفاظ بها ككسر السيتوبلازمتيك لمزيد من الاستخدام).
    5. إعادة تعليق بيليه في 140 ميكرولتر من استخراج المخزن المؤقت لكل 100 ملغ من مواد البداية. ضع الأنبوب في كتلة حرارية مبردة مسبقًا واخلطبلطف لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    6. طرد مركزي الأنبوب في 16،000 غرام لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل supernatant (أي الكسر النووي) إلى أنبوب جديد مبردة مسبقا وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن تقييم تركيز البروتين من الليسات المشتقة من دماغ الماوس وHDFs من قبل فحص بروتين BCA.

4. MeCP2-ECLIA بروتوكول

  1. إعداد محلول الغسيل، ومنع العازلة وامتصاص حل المخفف (اليوم 1)
    1. إضافة 500 ميكرولتر من Tween 20 إلى 1 لتر من برنامج تلفزيوني لإعداد 0.05٪ Tween 20 في محلول PBS، مزيج بقوة والتسمية بأنها "حل الغسيل".
      ملاحظة: تأكد من استخدام مخزن الغسيل الطازج فقط.
    2. إعداد محلول حظر 3٪ مانع A(جدول المواد)في المالحة المخزنة مؤقتا الفوسفات (PBS). تخلط عن طريق التحريك لطيف، تصفية تعقيم والاحتفاظ بها في الثلاجة حتى استخدامها لمدة أقصاها أسبوعين.
    3. إضافة 5 مل من منع الحل إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني لإعداد حل توسعي ازان (1٪ مانع A في PBS).
  2. طلاء لوحات ربط عالية
    1. إخراج 96-بئر متعددة صفيف بقعة واحدة لوحة ربط عالية.
      ملاحظة: لوحات ربط عالية لديها قدرة أكبر ملزمة وبالتالي مجموعة ديناميكية أكبر من لوحات القياسية مع الأسطح الكارهة للماء.
    2. إذابة الماوس أحادي النسيلة المضادة MeCP2 الأجسام المضادة على الجليد وخلط 0.67 ميكرولتر من الأجسام المضادة مع 4 مل من برنامج تلفزيوني (1:6000 تخفيف الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني). دوامة حل الأجسام المضادة لخلط جيدا وتسمية الأنبوب بأنه "حل الطلاء".
    3. الاستغناء بعناية 25 ميكرولتر من محلول الطلاء في الزاوية السفلى من كل بئر باستخدام الأنابيب متعددة القنوات؛ وهذا ما يسمى طريقة طلاء الحل. اضغط على لوحة 96 بئر بلطف على كل جانب لضمان أن حل الطلاء يغطي الجزء السفلي من كل بئر.
    4. ختم لوحة مع احباط لاصق واحتضان لوحة في الثلاجة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها (12-16 ساعة).
  3. حظر (اليوم 2)
    1. أخرج يُخرج الصحن من الثلاجة وأزيل يُـمْل.
    2. إزالة حل طلاء الأجسام المضادة عن طريق النقر عليه في سلة النفايات واضغط على لوحة على منشفة ورقية لإزالة كل حل الطلاء من الآبار.
    3. إضافة 125 ميكرولتر من محلول الحجب لكل بئر. ختم لوحة مرة أخرى ووضعها على شاكر microplate المدارية.
    4. احتضان لوحة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر في 800 دورة في الدقيقة.
  4. إعداد المعايير والعينات
    1. خلال فترة الحضانة، قم بإعداد معايير البروتين MeCP2 و/أو TAT-MeCP2 والعينات المختلفة.
      ملاحظة: يجب أن يكون المخزن المؤقت تحلل المستخدمة لتخفيف القياسية نفس المستخدمة في العينات التي تم تحليلها.
    2. إخراج قارورة واحدة من MePC2 و / أو TAT-MeCP2 محلول مخزون البروتين (250 ميكروغرام / مل) ، وخلايا دماغ الماوس والبروتين HDF من -80 درجة مئوية. إذابتها على الجليد
    3. تمييع محلول المخزون القياسي (MeCP2 و/أو TAT-MeCP2) في أنابيب نظيفة وفقًا للجدول 2.
    4. تمييع العينات في المخزن المؤقت للتليس على النحو التالي: 1-20 ميكروغرام من مليس دماغ الماوس لكل 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للزلي، و0.25−1 ميكروغرام من الليفي ة عالية الوضوح لكل 25 ميكرولتر من العازلة اللين. إعداد حجم كاف من كل عينة لإجراء التحليل في ثلاثية.
القياسيه تركيز التخفيف
المعيار 1 1,800 نانوغرام/مل 1.08 ميكرون لتر محلول المخزون القياسي + 148.92 ميكرون لتر محلول الليسيس المؤقت
المعيار 2 600 نانوغرام/مل 50 ميكرولتر معيار 1 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 3 200 نانوغرام/مل 50 ميكرولتر قياسي 2 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 4 66.67 نانوغرام/مل 50 ميكرولتر قياسي 3 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 5 22.22 نانوغرام/مل 50 ميكرولتر قياسي 4 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 6 7.41 نانوغرام/مل 50 ميكرولتر قياسي 5 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 7 2.47 نانوغرام/مل 50 ميكرولتر قياسي 6 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 8 0.82 نانوغرام/مل 50 ميكرولتر قياسي 7 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 9 0.27 نانوغرام/مل 50 ميكرولتر قياسي 8 + 100 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت
المعيار 10 0 نانوغرام/مل 150 ميكرون لتر ليسيس المخزن المؤقت

الجدول 2: السلسلة القياسية من 0 إلى 800 1 نانوغرام/مل.

  1. إضافة العينات والحلول القياسية
    1. إزالة حل حظر عن طريق النقر عليه في سلة النفايات واضغط على لوحة على منشفة ورقية لإزالة كل حل حظر من الآبار.
    2. اغسل يُغسل الصفيحة 3x بمحلول الغسيل بـ 150 ميكرولتر بإضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور.
    3. إضافة 25 ul من المعايير والعينات إلى الزاوية السفلى من البئر باستخدام قناة واحدة pipette.
    4. ختم لوحة واحتضان لوحة لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر في 800 دورة في الدقيقة.
  2. الأجسام المضادة للكشف غير المسمى
    1. إذابة الأرنب متعدد الكلون المضادة MeCP2 الأجسام المضادة على الجليد. تمييع الأجسام المضادة 1:6,000 في حل مخفف.
    2. إزالة المعايير والعينات عن طريق النقر عليه في سلة النفايات واضغط على لوحة على منشفة ورقية.
    3. اغسل يُغسل الصفيحة 3x بمحلول الغسيل بـ 150 ميكرولتر بإضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور.
    4. أضف 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف غير المسمى إلى كل بئر مع البيكتور متعدد القنوات. ختم لوحة واحتضان لمدة 1 ساعة مع اهتزاز مستمر في 800 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. جسم مضاد مترافق محدد
    1. إخراج الأجسام المضادة الثانوية محددة(جدول المواد)من الثلاجة ووضعها على الجليد. تمييع الأجسام المضادة 1:666.67 في حل مخفف وتخلط بلطف.
    2. قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية المجانية غير المسماة عن طريق النقر عليه في سلة النفايات واضغط على الطبق على منشفة ورقية.
    3. اغسل يُغسل الصفيحة 3x بمحلول الغسيل بـ 150 ميكرولتر بإضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور.
    4. إضافة 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة مترافقة محددة(جدول المواد)إلى كل جيدا مع البيكتور متعدد القنوات. ختم لوحة واحتضان لمدة 1 ساعة مع اهتزاز مستمر في 800 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. قراءة لوحة
    1. إزالة الأجسام المضادة الحرة الزوجية(جدول المواد)عن طريق النقر عليه في سلة النفايات والاستفادة من لوحة على منشفة ورقية.
    2. اغسل يُغسل الصفيحة 3x بـ 150 ميكرولتر من محلول الغسيل.
    3. إضافة 150 ميكرولتر من 1x تريس القائم على الذهب قراءة المخزن المؤقت(جدول المواد)مع السطحي ة التي تحتوي على tripropylamine كتفاعل مشترك لتوليد الضوء إلى لوحة. تجنب أي فقاعات الهواء باستخدام تقنيات الأنابيب العكسي.
    4. ضع اللوحة على منصة الكشف عن اللوحة الدقيقة(جدول المواد)وابدأ القياس على الفور. استخدم الإعدادات للحصول على لوحة 96 بئرًا.
    5. التقط إشارات الكهركيميلوميناتسين بواسطة كاميرا مدمجة في CCD في نظام الكشف عن الكهركيميلوميناتسين(جدول المواد)وتسجيل أعداد الإشارات ، والتي تتوافق مع وحدات الضوء النسبية (RLU) وتتناسب مباشرة مع شدة الضوء.
      ملاحظة: عند التحفيز الكهروكيميائي، تنبعث من ملصق الروثينيوم المرتبط بقطب الكربون ضوء الإضاءة عند 620 نانومتر. تحليل البيانات باستخدام البرنامج المصاحب للأداة(جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد وصف لمبدأ نظام ECLIA في الشكل 1. يتم عرض المنحنيات القياسية لاثنين من متغيرات MeCP2 في الشكل 2. وكان من الممكن التحديد الكمي الدقيق على مدى مجموعة واسعة من التركيزات (1-800 1 نانوغرام/مل). في الشكل 3، تم تحليل مستويات MeCP2 من تحللات مشتقة من دماغ الماوس وHDFs. MeCP2 التعبير في الدماغ الليسات النووية من heterozygous، تمت مقارنة البرية والفئران بالضربة القاضية في الشكل 3A، في حين أنه في الشكل 3B لا البروتين MeCP2 تم الكشف عنها في الخلايا الليفية البشرية نقص MECP2 (c.806delG) باستخدام ECLIA. كما تم التحقيق في تناول TAT-MeCP2 بواسطة خط الخلية ناقص MECP2 (c.806delG) مع مرور الوقت(الشكل 4). وأخيراً، تم إظهار الدقة بين الأجزاء وداخلها كما هو مبين في الجدول 3.

Figure 1
الشكل 1: رسم بياني للاغواب ة التكتروية 2. وقد تم تكييف هذا الرقم من www.meso-scale.com. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: منحنى معيار MeCP2 المتولد من MeCP2 البشري في قياسات متعددة. الحد الأدنى للكشف (LLOD)، الذي يُعرَّف بأنه 2.5 انحرافات معيارية (SDs) فوق الفراغ، هو 1.00 نانوغرام/مل. يمكن قياس MeCP2 (Abnova) البشري المؤتلف بدقة على مدى 1.00 نانوغرام/مل (LLOD) إلى 1800 نانوغرام/مل (الحد الأعلى للكشف [ULOD]) مع R2 = 0.996. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي n = 3. وقد تم تعديل الرقم من شتاينكيلنر وآخرون8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مستويات MeCP2 في الدماغ الماوس وHDFs. (أ)تم قياس مستويات البروتين MeCP2 في الخلايا النووية في الدماغ من heterozygous (الرمادي، HET) والإناث الفئران نوع البرية (الأسود، البرية) (ن = 4) وواحد Mecp2-الماوس بالضربة القاضية (RTT)؛ (ب)تم إجراء الخلايا من خط الخلية الليفية المبرومة (c.806delG) المشتقة من مريض ذكر يعاني من اعتلال الدماغ الوليدي كنموذج لمتلازمة RTT لتقييم مستويات البروتين MeCP2 في البشر والتحكم الصحي (الأسود). البيانات المقدمة هي متوسط ± SD من الآبار ثلاثية المدى (ن = 3). لم يتم الكشف عن أي بروتين MeCP2 (تحت نطاق الكشف) في خطوط الخلايا المتحولة عن طريق الفلور المناعة أو باستخدام ECLIA ، مما يدل كذلك على أنه نظام حساس للغاية لمزيد من دراسات الشراء مع بروتينات TAT-fusion. وقد تم تعديل هذا الرقم من شتاينكيلنر وآخرون8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الاستفادة المعتمدة على الوقت من TAT-MeCP2. تم التعامل مع مستويات MeCP2 من الكسور النووية في FFs C.806delG مع 500 nM المؤتلف TAT-MeCP2 البروتين الانصهار. تم إجراء التحليل مع MeCP2-ECLIA. في النقاط الزمنية المنصوص عليها، تم غسل الخلايا مع DPBS واحتضنت مع 0.05٪ التربسين-EDTA لمدة 5 دقيقة للقضاء على خارج الخلية ملزمة TAT-MeCP2. تم إيقاف التبليسب عن طريق إضافة وسائل الإعلام مع المصل. تم طرد تعليق الخلية في 500 × ز لمدة 5 دقيقة. بعد غسل بيليه الخلية 2x مع DPBS الباردة الجليد، تم إعداد العينة لاستخراج جزء نووي كما هو موضح في قسم البروتوكول. وقد تم تعديل هذا الرقم من شتاينكيلنر وآخرون8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

داخل السب إنتر ساي
ng MeCP2 لكل بروتين مل ng MeCP2 لكل بروتين مل
كذلك 1 كذلك 2 كذلك 3 يعني SDأ SEMب %CVc يعني SDأ SEMب %CVc
الخلايا الليفية البشرية 6.42 6.30 6.45 6.39 0.08 0.05 1.24 6.61 0.64 0.37 9.71
الماوس الدماغ تليس 9.92 10.16 10.36 10.14 0.22 0.13 2.17 11.22 0.94 0.54 8.33
أ الانحراف المعياري، بمتوسط الخطأ القياسي، معامل الاختلاف

الجدول 3: تحديد دقة بين المقاسات في ثلاثة أيام متتالية من HDF والحيوانات الدماغية الماوس البري اليليس. وطبق لكل بئر 1-10 ميكروغرام من بروتين تحليل الخلايا. أ SD، الانحراف المعياري؛ ب SEM، يعني الخطأ القياسي؛ ج السيرة الذاتية، معامل الاختلاف. تم تعديل هذا الجدول من شتاينكيلنر وآخرون8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقياس MeCP2 الذاتية، المؤتلف ة MeCP2 وTAT-MeCP2 المستويات، تم تطوير لوحة 96 بئر ECLIA. وقد ثبت أن فقدان وظيفة البروتين MeCP2 يؤدي إلى متلازمة RTT6, العلاج الذي يقتصر حاليا على إدارة الأعراض والعلاج الطبيعي. أحد طرق العلاج الواعدة هو ما يسمى العلاج ببدائل البروتين ، حيث يمكن أن يتم تأنيب مستويات MeCP2 حتى تركيزها المطلوب12،13،14،15. وقد ثبت أن إمكانات البروتينات TAT الانصهار لعبور حاجز الدم في الدماغ لتكون ناجحة على مدى العقدين الماضيين12،13،14،15. على هذا النحو، قد تكون هذه الطريقة لتسليم MeCP2 مفيدة في سياق إدارة العلاج استبدال البروتين. من أجل تقييم إمكانات بروتينات TAT-الانصهار وغيرها من العلاجات لاستعادة مستويات البروتين MeCP2, تطوير كفاءة وبأسعار معقولة القول التي يمكن أن تحدد كميا لهم هو في غاية الأهمية. الاساهي ة الموصوفة في هذا العمل، ECLIA، قادرة على تحديد مستويات MeCP2 بدقة وكذلك باستمرار، مع قيم إيجابية داخل وبين ازى(الجدول 3).

لبروتوكول MeCP2-ECLIA التالي، تم استخدام أجهزة الدم الدماغية وHDFs الماوس كخلايا ذات فائدة. ومع ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع جميع أنواع الخلايا الأخرى من أصل الإنسان والمورين على الأقل. وعلاوة على ذلك، تم التعامل مع مركبات HDFs مع بروتين الاندماج TAT-MePC2 لإظهار قدرة هذا القول لقياس مختلف متغيرات البروتين MeCP2. أثناء إعداد العينة ، فإن تجنب أو تقليل العوامل المخفضة في المخزن المؤقت للتليس مثل DTT أو α-mercaptoethanol ، أمر بالغ الأهمية للحفاظ على كفاءة التقنية. الخطوات الحرجة الإضافية في هذه الطريقة تنطوي على طلاء لوحة مع الأجسام المضادة للفأرة MeCP2، لوحة حظر، وإضافة عينة، تليها حضانة 4 ح مع الأجسام المضادة لأرنب MeCP2 المضادة. الحضانة اللاحقة مع الأجسام المضادة الثانوية محددة(جدول المواد)وإضافة الكواشف اللازمة لرد فعل التألّوئ الذي يجب أن يحدث، وتشمل الخطوات الهامة النهائية لهذا الإجراء.

من أجل تحسين أداء ECLIA ، يمكن اتخاذ الخطوات التالية. يجب ألا يتجاوز الحد الأقصى للإخراج للإشارة لهذا الاحتساب مليون حساب. من أجل منع السائل من الانتشار خارج القطب ، يمكن استخدام تقنية تسمى طلاء البقعة لإدخال محلول الطلاء في البئر. تتطلب هذه التقنية توجيه الأنابيب عالي الدقة أو استخدام روبوت ماصة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون اختبار تركيزات الأجسام المضادة المختلفة مفيدًا لزيادة خصوصية الفحص وتقليل إشارة الخلفية. لمعالجة هذا الأخير، يمكن أيضا ً استخدام حاصرات مختلفة (مثل MSD، Blocker D-M) لتركيز نهائي بنسبة 0.1٪. من أجل تحسين جودة الإشارة ، يوصى باختبار أوقات الحضانة المختلفة (الهز عند أو فوق 300 دورة في الدقيقة). وأخيرا، لزيادة الانتعاش وتخفيف الخطي في وسائل الإعلام محددة مثل المصل والبلازما والبول أو السائل النخاعي، يمكن اختبار العديد من الديلوين.

وتستخدم عادة لطخة غربية شبه كمية ومتاحة تجاريا MeCP2-ELISA لدراسة مستويات البروتين MeCP2. مبدأ العمل وراء ELISA يشبه ذلك من ECLIA لدينا مع الفرق الملحوظ هو وضع الكشف. بالمقارنة مع هذه الأساليب ، فإن MeCP2-ECLIA أسرع وأكثر ملاءمة. تم استخدام ECLIA للمسح عن الأنواع البرية ، heterozygous وMecp2 -Knockout عينات الدماغ الماوس(الشكل 3A)، مع النتائج مقارنة مع كميات MeCP2 من نفس العينات التي تم الحصول عليها من النشاف الغربي (البيانات غير مبينة). ولوحظ اختلاف ملحوظ في مستويات MeCP2 من الإناث العينات من البذيب وعينات الدماغ الماوس heterozygous قياسها ECLIA التي لم يتم الكشف عن ذات دلالة إحصائية من قبل لطخة الغربية. يمكن أن تكون دقة فحص ECLIA الأعلى هذه مهمة في البحث عن المركبات الجديدة التي يمكن أن ترفع مستويات البروتين MeCP2.

وبالإضافة إلى ذلك، فإن MeCP2-ECLIA أقل تكلفة من نظيرتها MeCP2-ELISA ونظراً لنطاقها الديناميكي العالي من 1 نانوغرام/مل إلى 1800 نانوغرام/مل (R2 = 0.996)، يمكن استخدامها مع عينات تحتوي على كميات منخفضة من MeCP2. بالمقارنة مع جميع مجموعات ELISA المتاحة تجاريا، فإن ECLIA يتفوق عليها إلى حد كبير. تمتلك ECLIA نطاقًا ديناميكيًا أكثر ملاءمة من 1-1800 نانوغرام/مل مقارنة بنظيراتها في ELISA، والتي تبين أنها 0.312-20 نانوغرام/مل (الماوس، Cloud-Clone Corp.) و0.156−10 نانوغرام/مل (الإنسان، Cloud-Clone Corp.). ونظرالعدم وجود تعريف صريح للحد الأدنى من الكشف، فإن مقارنته المباشرة بين هاتين المنقالتين غير ممكنة لأغراض هذا العمل.

وباختصار، فقد تبين أن MeCP2-ECLIA يمكن أن تحدد بدقة كميات MeCP2 في الجسم الحي وفي المختبر. في حين تجديد مستويات البروتين MeCP2 في الخلايا العصبية للمرضى RTT المتضررة هو في الواقع وسيلة علاج واعدة, وجود MeCP2 المفرطة قد يؤدي أيضا إلى أعراض عصبية شديدة, المرتبطة متلازمة الازدواجية MECP216,,17,,18. على هذا النحو، يمكن أن تكون هذه الطريقة ذات أهمية لا تتجزأ في تحسين كمية MeCP2 التي أدخلت خارجيًا أثناء العلاج ببدائل البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ونحن ممتنون جدا للدكتورة بريجيت شتورم لدعمها مع صك ECLIA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D9779 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad Laboratories Inc. 500-0006 Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit Meso Scale Diagnostics R32AB-1 Antibody
Discovery workbench 4.0 Meso Scale Discovery Software
DMEM (1X) gibco by Life Technologies 41966-029 Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile) Sigma-Aldrich D8537-500ML Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA Sigma-Aldrich EDS Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F9665 Sample preperation
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant Meso Scale Diagnostics R92TG MeCP2 ECLIA protocol
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set Sigma-Aldrich D8938 Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) GFL 3014 MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) Sigma-Aldrich M2670 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) Abnova Corporation H00004204-P01 Cell treatment
Microseal B seal Bio-Rad Laboratories Inc. MSB1001 for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin Sigma-Aldrich M6818-100UL; RRID:AB_262075 Antibody, Coating solution
MSD Blocker A Meso Scale Diagnostics R93BA-4 Blocker
MSD SECTOR Imager 2400 Meso Scale Diagnostics I30AA-0 MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate Meso Scale Diagnostics L15XB-3/L11BX-3 MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin gibco by Life Technologies 15140122 Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit Eurogentec S.A. custom-designed Antibody
Potassium chloride (KCl) Merck KGaA 1049361000 Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) Sigma-Aldrich SAB1404063; RRID:AB_10737296 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) Sigma-Aldrich WH0004204M1; RRID:AB_1842411 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) Sigma-Aldrich M6818; RRID:AB_262075 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) Sigma-Aldrich M7443; RRID:AB_477235 Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) Cell Signaling Technology 3456S; RRID:AB_2143849 Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X) Sigma-Aldrich 8340 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 Eurogentec S.A. custom Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 Merck 07-013 Antibody
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014 Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) Meso Scale Diagnostics W0015528S Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein in-house production Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X) gibco by Life Technologies 25200-056 Cell treatment
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416 Washing solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
  3. Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
  4. Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
  5. Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
  6. Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
  7. Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
  8. Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
  9. Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
  10. Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
  11. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  12. Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
  13. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  14. Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
  15. Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
  16. Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
  17. Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
  18. Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 159، ECLIA، سولفو-تاغ، MeCP2، بروتين الاندماج TAT، TAT-MeCP2، متلازمة Rett، العلاج ببدائل البروتين
والكهربائية القائمة على القول بالبروتين MeCP2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steinkellner, H., Beribisky, A. V.,… More

Steinkellner, H., Beribisky, A. V., Mausberg, P., Christodoulou, J., Scheiber-Mojdehkar, B., Huber, A., Sarne, V., Laccone, F. An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants. J. Vis. Exp. (159), e61054, doi:10.3791/61054 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter