Summary
L'elettrochemiluminescenza immunoassay (ECLIA) è un nuovo approccio per il rilevamento quantitativo delle varianti della proteina MeCP2 endogene ed esogenamente applicate su un'ampia gamma di lavoro. Qui, viene descritto il protocollo per il MeCP2-ECLIA in un formato 96-well.
Abstract
L'ECLIA è un metodo versatile che è in grado di quantificare le quantità di proteine endogene e ricombinanti in un formato di 96 pozze. Per dimostrare l'efficienza dell'ECLIA, questo test è stato utilizzato per analizzare i livelli intrinseci di MeCP2 nel tessuto cerebrale del topo e l'assorbimento del TAT-MeCP2 nei fibroblasti dermici umani. Il MeCP2-ECLIA produce misurazioni altamente accurate e riproducibili con basso errore intra-e inter-ssay. In sintesi, abbiamo sviluppato un metodo quantitativo per la valutazione delle varianti proteiche MeCP2 che possono essere utilizzate in schermi ad alta velocità.
Introduction
L'elettrochemiluminescenza immunoassay (ECLIA) si basa su un processo che utilizza etichette progettate per emettere luminescenza quando stimolata elettrochimicamente. Si tratta di una tecnica ampiamente applicabile per il rilevamento quantitativo di analiti biologici nell'industria di base e nella ricerca accademica, nell'industria alimentare e nella diagnostica clinica1. Comunemente, viene utilizzata una piastra usa e getta 96 pozze con elettrodi di inchiostro di carbonio. Questi elettrodi agiscono come un vettore solido per l'immunoassay. Un anticorpo secondario viene coniugato a un'etichetta elettrochemiluminescente e quando l'elettricità viene applicata al sistema, viene attivata l'emissione di luce dell'etichetta chimica. Un dispositivo accoppiato a carica di rumore ultra-bassa (CCD) registra l'intensità della luce che è direttamente proporzionale all'antigene legato all'anticorpo di cattura con conseguente quantificazione dell'analita mirata del campione2. Rispetto all'analisi immunosorbente legata agli enzimi (ELISA), l'ECLIA è considerata vantaggiosa in quanto offre una maggiore sensibilità e riproducibilità, nonché una migliore automazione e coerenza3 .
Qui abbiamo analizzato i livelli di proteina legante metil-CpG 2 (MeCP2) in campioni di origine umana e murina, nonché diverse varianti della proteina ricombinante utilizzando il nuovo sistema ECLIA. MecP2 è una proteina legante all'acido nucleico legata all'X nota per interagire con sequenze di DNA metilato. Questa proteina è stata implicata nella regolazione dell'espressione genica4,5. Le mutazioni di perdita di funzione nel gene che codifica questa proteina sono i principali colpevoli della sindrome di Rett (RTT), un grave disturbo neurosviluppo6. Un altro disturbo correlato a MeCP2, la sindrome di duplicazione MECP2, porta anche a sintomi neurologici che possono sovrapporsi a quelli di RTT7. In particolare, le femmine sono per lo più colpite dalla RTT, mentre i maschi sono per lo più afflitti dalla sindrome di duplicazione MECP2 6,7.
Questi disturbi sono associati a livelli insufficiente o in eccesso di MeCP2 rispettivamente nel sistema nervoso centrale (SNC). Di conseguenza, le opzioni di trattamento per RTT che comportano l'aumento dei livelli di MeCP2 nel SNC dovrebbero evitare gli effetti dannosi associati all'eccesso di MeCP27. A causa di questo fatto, una quantificazione altamente sensibile e accurata dei livelli di proteina MeCP2, come previsto dal sistema ECLIA, è cruciale per il progresso della RTT e la ricerca sulla sindrome di duplicazione MECP2. Le misurazioni precise dei livelli endogeni ed esogeni di MeCP2 da linee cellulari umane e campioni di tessuto murino, nonché una proteina ricombinante costituita da isoformo B umano (noto anche come isoforme e1), e un dominio minimo di trasduzione HIV-TAT N-terminal (TAT-MeCP2) che ha il potenziale di attraversare il sangue-barriera cerebrale8,9 sono presentati in questo lavoro.
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Protocol
L'approvazione per l'approvvigionamento di biopsia cutanea a scopo di ricerca è stata ottenuta dal Comitato Etico della Ricerca Umana dell'Ospedale pediatrico di Westmead, Australia. Il consenso per gli esperimenti sugli animali è stato ottenuto dal Ministero federale austriaco della scienza, della ricerca e dell'economia, che sono stati effettuati in conformità con le normative locali sul benessere degli animali (G: 66.009/0218-II/3b/2015).
NOTA: il principio del sistema ECLIA è illustrato nella figura 1.
1. Selezione anticorpale
- Valutare il rapporto segnale-rumore per una gamma di vari anticorpi MeCP2 e identificare la migliore potenza del segnale e la massima specificità all'interno della combinazione di un anticorpo MeCP2 monoclonale del topo primario (clone Mec-168) e dell'anticorpo di rilevamento policlonale meCP2 del coniglio (fatto su misura). Per l'anticorpo secondario, utilizzare un anticorpo specifico del sistema (Tabella dei materiali), anch'esso verificato sperimentalmente.
NOTA: La tabella 1 fornisce una panoramica di tutti gli anticorpi verificati durante lo sviluppo MeCP2-ECLIA e delle loro gamme di diluizione testate.
| Funzione | Nome | Clone | Diluizione |
| Primario | Mouse, anti-MeCP2 | Mec-168 | 1:500-1:10.000 |
| Primario | Mouse, anti-MeCP2 | 4B6 (in inglese) | 1:250-1:4.000 |
| Primario | Mouse, anti-MeCP2 | Uomini-8 | 1:500-1:4.000 |
| Primario | Mouse, anti-MeCP2 | 1B11 (in tissuma | 1:500-1:4.000 |
| Primario | Coniglio anti-MeCP2 | D4F3 | 1:500-1:4.000 |
| Secondario | Coniglio anti-MeCP2 | Policlonale | 1:2,000-1:20.000 |
| Secondario | Coniglio anti-MeCP2 | Policlonale | 1:2,000-1:20.000 |
| Rilevamento | SulFO-TAG etichettato anti-coniglio | Policlonale | 1:500-1:1.000 |
Tabella 1: Elenco degli anticorpi e diluazioni di lavoro usate.
- In alternativa, utilizzare ogni coppia di anticorpi MeCP2 che funziona bene con ELISA convenzionale.
2. Trattamento delle MGIF con proteina di fusione TAT-MeCP2
NOTA: TAT-MeCP2 è stato espresso in ricombinante in Escherichia coli e purificato utilizzando tecniche cromatografiche standard come descritto in precedenza8 e conservato a -80 gradi centigradi.
- Piastra 1 x 106 cellule del fibroblasto dermico umano (HDF) in piatti da 100 mm e far crescere le cellule durante la notte a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 fino a raggiungere circa il 90% di confluenza.
- Estrarre una fiala di proteina di fusione TAT-MeCP2. Scongelare sul ghiaccio e mescolare delicatamente.
- Diluire TAT-MeCP2 ad una concentrazione finale di 500 nM in 50 mL di supporti di coltura HDF.
- Rimuovere il supporto da piatti da 100 mm e incubare le cellule con 500 nM TAT-MeCP2 a 37 gradi centigradi per vari periodi di incubazione fino a 24 h.
- Rimuovere la soluzione TAT-MeCP2 dalle celle. Lavare le cellule 2x con la salina preriscaldata di Dulbecco (DPBS).
- Trattare le cellule con 2 mL di 0.05% soluzione trypsin-EDTA per 5 min a 37 c10.
- Aggiungere 6 mL di supporti di coltura HDF per disattivare la trypsin e raccogliere le cellule in tubi da 15 mL.
- Pellet le cellule per centrifugazione a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere il supernatante e lavare le cellule 2x con DPBS ghiacciato. Conservare il pellet sul ghiaccio e procedere con la preparazione del campione.
3. Preparazione dei campioni
- Listi HDF
- Determinare i livelli proteici più alti di MeCP2 utilizzando il metodo REAP per la frazione subcellulare nei compartimenti subcellulari e citoplasmati secondo Suzuki et al.11. Limitare la frazione a non più di sei campioni per esperimento.
- Lismi cerebrali di topo
- Preparare 100 mL di ogni reagente ipotonico di lisi e buffer di estrazione.
- Per il reagente di lisi ipotonica, mescolare ben 10 mM HEPES, 1,5 mM di cloruro di magnesio e 10 mM di cloruro di potassio.
- Per il buffer di estrazione, mescolare bene 20 mM di clordino, 1,5 mM di cloruro di magnesio, 0,42 M di cloruro di sodio, 0,2 mM EDTA e 25% (v/v) glicerolo.
- Regolare il pH di entrambi i buffer su 7.9.
- Aggiungere 1 mM dithiothreitol (DTT) e 1x cocktail inibitore proteasi a entrambi i buffer al fresco. Raffreddare sul ghiaccio prima dell'uso.
- Sospendere 100 mg di cervello topo totale (ceppo: C57BL/6J, wildtype maschio e femmina e B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, maschio eterozigoo femmina; età: 4-8 settimane) in 1 mL di reagente lisi ipotonico freddo.
- Omogeneizzare il cervello con un omogenizzatore di tessuto di tessuto di vetro pre-freddo da 15 colpi di omogeneizzatore A (sciolto, per grande distanza) e B (stretto, per piccola distanza), rispettivamente.
- Trasferire le cellule omogeneizzate in un tubo pulito e centrifugare a 10.000 x g per 20 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante (o tenerlo come frazione citoplasmatica per un ulteriore uso).
- Risospendere il pellet in 140 : L di buffer di estrazione per 100 mg di materiale di partenza. Mettere il tubo in un termoblocco pre-raffreddato e mescolare delicatamente per 30 min a 4 gradi centigradi.
- Centrifugare il tubo a 16.000 g per 10 min a 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante (cioè la frazione nucleare) in un nuovo tubo pre-raffreddato e conservarlo a -80 gradi centigradi fino all'uso.
NOTA: La concentrazione proteica di lismi derivati dal cervello di topo e dall'HDF può essere valutata dall'analisi della proteina BCA.
- Preparare 100 mL di ogni reagente ipotonico di lisi e buffer di estrazione.
4. Protocollo MeCP2-ECLIA
- Preparazione della soluzione di lavaggio, blocco tampone e soluzione diluente di analisi (giorno 1)
- Aggiungere 500 l of Tween 20 a 1 L di PBS per preparare uno 0,05% Tween 20 in soluzione PBS, mescolare vigorosamente ed etichettare come "soluzione di lavaggio".
NOTA: Assicurarsi che venga utilizzato solo il buffer di lavaggio appena preparato. - Preparare una soluzione di blocco del blocco del 3% A (Tabella dei materiali) in salina con buffer fosfato (PBS). Mescolare mescolando delicatamente, filtrare sterilizzare e tenerli in frigo fino all'uso per un massimo di due settimane.
- Aggiungere 5 mL di soluzione di blocco a 10 mL di PBS per preparare la soluzione diluente di valutazione (1% blocco A in PBS).
- Aggiungere 500 l of Tween 20 a 1 L di PBS per preparare uno 0,05% Tween 20 in soluzione PBS, mescolare vigorosamente ed etichettare come "soluzione di lavaggio".
- Rivestimento di piastre ad alto legame
- Estrarre una piastra ad alto legame a punto singolo a 16-pozzetto.
NOTA: Le piastre ad alto legame hanno una maggiore capacità di rilegatura e quindi una gamma dinamica più ampia rispetto alle piastre standard con superfici idrofobiche. - Scongelare l'anticorpo monoclonale anti-MeCP2 sul ghiaccio e mescolare 0,67 l dell'anticorpo con 4 mL di PBS (1:6,000 di luidione anticorpo in PBS). Vorticare la soluzione anticorpale per mescolare bene ed etichettare il tubo come "soluzione di rivestimento".
- erogare con cura 25 - di soluzione di rivestimento nell'angolo inferiore di ogni pozzo utilizzando un pipettor multicanale; questo è chiamato il metodo di rivestimento della soluzione. Toccare delicatamente la piastra del 96 po' su ciascun lato per assicurarsi che la soluzione di rivestimento copra il fondo di ogni pozzo.
- Sigillare la piastra con un foglio adesivo e incubare la piastra in frigorifero a 4 gradi centigradi durante la notte (12-16 h).
- Estrarre una piastra ad alto legame a punto singolo a 16-pozzetto.
- Blocco (giorno 2)
- Estrarre il piatto dal frigorifero e rimuovere la pellicola.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento degli anticorpi sfogliandola nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere tutta la soluzione di rivestimento dai pozzetti.
- Aggiungere 125 l di soluzione di blocco per bene. Sigillare nuovamente la piastra e posizionarla su uno shaker di microplacca orbitale.
- Incubare la piastra per 90 min a temperatura ambiente con agitazione costante a 800 giri/m.
- Preparazione di norme e campioni
- Durante il periodo di incubazione, preparare gli standard proteici MeCP2 e/o TAT-MeCP2 e vari campioni.
NOTA: il buffer di lisi utilizzato per la diluizione standard deve essere lo stesso utilizzato nei campioni analizzati. - Estrarre una fiala della soluzione di stock proteica MePC2 e/o TAT-MeCP2 (250 g/mL), le talità cerebrali di topo e listi HDF da -80 gradi centigradi. Scongelarli sul ghiaccio.
- Diluire la soluzione standard (MeCP2 e/o TAT-MeCP2) in tubi puliti secondo la tabella 2.
- Diluire i campioni nel buffer di lisi come segue: 1,20 g di lisata cerebrale del topo per 25 , l'una del buffer di lisi, e 0,25,1 g di lisate HDF per 25 , luna di buffer di lisi. Preparare un volume sufficiente di ogni campione per eseguire l'analisi in triplice copia.
- Durante il periodo di incubazione, preparare gli standard proteici MeCP2 e/o TAT-MeCP2 e vari campioni.
| Standard | Concentrazione | Diluizione |
| Standard 1 | 1.800 ng/mL | Soluzione di stock standard 148,92 - buffer di lis |
| Standard 2 | 600 ng/mL | 50 - L Buffer di lisi |
| Standard 3 | 200 ng/mL | 50 - L Buffer di lisi |
| Standard 4 | 66,67 ng/mL | 50 - L Standard 3 - 100 buffer di lisi |
| Standard 5 | 22.22 ng/mL | 50 - L Standard 4 - 100 buffer di lisi |
| Standard 6 | 7.41 ng/mL | 50 - L Standard 5 - 100 buffer di lisi |
| Standard 7 | 2.47 ng/mL | 50 - L Standard 6 - 100 buffer di Lisi |
| Standard 8 | 0,82 ng/mL | 50 - L Standard 7 - 100 buffer di lisi |
| Standard 9 | 0,27 ng/mL | 50 - L Standard 8 - 100 buffer di lisi |
| Standard 10 | 0 ng/mL | Buffer di lisi da 150 l'l |
Tabella 2: Serie standard da 0 a 1.800 ng/mL.
- Aggiunta di esempi e soluzioni standard
- Rimuovere la soluzione di blocco facendola scorrere nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere tutta la soluzione di blocco dai pozzetti.
- Lavare la piastra 3 volte con 150 l di lavatrice aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.
- Aggiungere 25 ul di standard e campioni nell'angolo inferiore del pozzo utilizzando una pipetta a canale singolo.
- Sigillare la piastra e incubare la piastra per 4 h a temperatura ambiente con agitazione costante a 800 giri/min.
- Anticorpi di rilevamento senza etichetta
- Scongelare l'anticorpo anti-MeCP2 del coniglio policlonale sul ghiaccio. Diluire l'anticorpo 1:6,000 in soluzione diluente saggio.
- Rimuovere gli standard e i campioni sfogliandolo nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta.
- Lavare la piastra 3 volte con 150 l di lavatrice aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.
- Aggiungete 25 l di anticorpi di rilevamento senza etichetta in ogni pozzo con il pipettor multicanale. Sigillare la piastra e incubarla per 1 h con agitazione costante a 800 giri/min a temperatura ambiente.
- Anticorpo coniugato specifico
- Estrarre l'anticorpo secondario specifico (Tabella dei materiali) dal frigorifero e posizionarlo sul ghiaccio. Diluire l'anticorpo 1:666.67 nella soluzione diluente di analisi e mescolare delicatamente.
- Rimuovere l'anticorpo secondario gratuito senza etichetta facendolo scorrere nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta.
- Lavare la piastra 3 volte con 150 l di lavatrice aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.
- Aggiungere 25 l di anticorpo coniugato specifico (Tabella dei materiali) ad ogni pozzo con il pipettor multicanale. Sigillare la piastra e incubare per 1 h con agitazione costante a 800 giri/min a temperatura ambiente.
- Lettura della piastra
- Rimuovere l'anticorpo coniugato gratuito (Tabella dei materiali) facendolo scorrere nel cestino e toccare la piastra su un tovagliolo di carta.
- Lavare la piastra 3volte con 150 l di soluzione di lavaggio.
- Aggiungete 150 l di 1x buffer di lettura oro a base di Tris (Tabella dei materiali) con un surfactant contenente tripropylamine come co-reattore per la generazione di luce alla piastra. Evitare eventuali bolle d'aria utilizzando tecniche di reverse pipetting.
- Posizionare la piastra sulla piattaforma di rilevamento della micropiastra (Table of Materials) e avviare immediatamente la misurazione. Utilizzare le impostazioni per l'acquisizione di piastre di 96 pozze.
- Catturare i segnali di elettrochemiluminescenza da una telecamera CCD integrata in un sistema di rilevamento dell'elettrochemiluminescenza (Tabella dei materiali) e registrare i conteggi dei segnali, che corrispondono alle unità di luce relativa (RLU) e sono direttamente proporzionali all'intensità della luce.
NOTA: Dopo la stimolazione elettrochimica, l'etichetta del rutenio legata all'elettrodo di carbonio emette luce di luminescenza a 620 nm. Analizzare i dati con il software accompagnato dallo strumento (Tabella dei Materiali).
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Representative Results
Il principio del sistema ECLIA è descritto nella Figura 1. Le curve standard per due varianti MeCP2 sono mostrate nella Figura 2. La quantificazione accurata è stata possibile su un'ampia gamma di concentrazioni (1,800 ng/mL). Nella Figura 3,sono stati analizzati i livelli MeCP2 di lismi derivati dal cervello di topo e dall'HDF. Espressione MeCP2 in lisati nucleari cerebrali da topi eterozici, wildtype e knockout sono stati confrontati nella Figura 3A, mentre nella figura 3B non è stata rilevata alcuna proteina MeCP2 nei fibroblasti umani carenti di MECP2 (c.806delG) utilizzando l'ECLIA. È stata inoltre studiata nel tempo l'assorbimento del TAT-MeCP2 da parte della linea cellulare carente di MECP2 (c.806delG) (Figura4). Infine, è stata dimostrata la precisione tra e intra-qualità, come illustrato nella tabella 3.
Figura 1: Diagramma dell'elettrochemiluminescenza MeCP2. Questa cifra è stata adattata da www.meso-scale.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: curva standard MeCP2 generata dall'uomo MeCP2 in più misurazioni. Il limite inferiore di rilevamento (LLOD), definito come 2,5 deviazioni standard (SD) sopra lo spazio vuoto, è 1,00 ng/mL. Il MeCP2 umano ricombinante (Abnova) potrebbe essere quantificato con precisione su un intervallo da 1,00 ng/mL (LLOD) a 1.800 ng/mL (limite superiore di rilevamento [ULOD]) con R2 - 0,996. Le barre di errore rappresentano l'errore standard di n - 3. La figura è stata modificata da Steinkellner et al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Livelli di MeCP2 nel cervello del topo e negli HDF. (A) I livelli di proteine MeCP2 sono stati misurati in lismi nucleari cerebrali da topi eterozici (grigi, HET) e di tipo selvatico femminile (nero, wildtype) (n ) e un topo Mecp2-knockout (RTT); (B) Sono stati condotti lismi cellulari della linea cellulare fibroblasta carente di MeCP2 (c.806delG) derivati da un paziente maschio con encefalopatia neonatale come modello per la sindrome RTT per valutare i livelli di proteina MeCP2 nell'uomo e un controllo sano (nero). I dati presentati sono meschinamente : SD dei pozzi triplicati (n . 3). Nessuna proteina MeCP2 è stata rilevata (al di sotto dell'intervallo di rilevamento) nelle linee cellulari mutanti mediante immunofluorescenza o utilizzando l'ECLIA, dimostrando ulteriormente che si tratta di un sistema altamente sensibile per ulteriori studi di assorbimento con proteine tAT-fusione. Questa cifra è stata modificata da Steinkellner et al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Assorbimento dipendente dal tempo di TAT-MeCP2. I livelli meCP2 di frazioni nucleari nelle MFS c.806delg sono stati trattati con una proteina di fusione TAT-MeCP2 ricombinante da 500 nM. L'analisi è stata eseguita con il MeCP2-ECLIA. A punti temporali stabiliti, le cellule sono state lavate con DPBS e incubate con 0.05% trypsin-EDTA per 5 min per eliminare il TAT-MeCP2 extracellulare. La prova è stata interrotta aggiungendo supporti con siero. La sospensione cellulare è stata centrifugata a 500 x g per 5 min. Dopo aver lavato il pellet cellulare 2x con DPBS ghiacciato, il campione è stato preparato per l'estrazione della frazione nucleare come descritto nella sezione protocollo. Questa cifra è stata modificata da Steinkellner et al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| INTRA ASSAY | RAPPORTO DI RAPPORTO | ||||||||||
| ng MeCP2 per proteina mL | ng MeCP2 per proteina mL | ||||||||||
| Pozzo 1 | Pozzo 2 | Pozzo 3 | Significare | SDa | SEMb | %CVc | Significare | SDa | SEMb | %CVc | |
| Fibroblasti umani | 6.42 | 6.30 | 6.45 | 6.39 | 0.08 | 0.05 | 1.24 | 6.61 | 0.64 | 0.37 | 9.71 |
| Lisa topo cervello | 9.92 | 10.16 | 10.36 | 10.14 | 0.22 | 0.13 | 2.17 | 11.22 | 0.94 | 0.54 | 8.33 |
| un Deviazione standard, bMedia errore standard, cCoefficiente di Variazione | |||||||||||
Tabella 3: Determinazione della precisione tra i test in tre giorni consecutivi di lisci cerebrali di topo HDF e wildtype. Per pozzo è stata applicata una proteina di lismi cell. un SD, deviazione standard; b SEM, media di errore standard; c CV, coefficiente di variazione. Questa tabella è stata modificata da Steinkellner et al.8.
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Discussion
Per misurare i livelli endogeni MeCP2, ricombinanti MeCP2 e TAT-MeCP2, è stato sviluppato un ECLIA a 96 pozzetti. È stato dimostrato che la perdita della funzione della proteina MeCP2 porta alla sindrome RTT6, per la quale il trattamento è attualmente limitato alla gestione dei sintomi e alla terapia fisica. Un promettente viale di trattamento è la cosiddetta terapia sostitutiva delle proteine, dove i livelli di MeCP2 possono essere titolati fino alla loro concentrazione necessaria12,13,14,15. Il potenziale delle proteine TAT-fusione per attraversare la barriera emato-encefalica ha dimostrato di avere successo negli ultimi due decenni12,13,14,15. Come tale, questo metodo per la somministrazione di MeCP2 può essere utile nel contesto della somministrazione della terapia sostitutiva delle proteine. Al fine di valutare il potenziale delle proteine tAT-fusione e di altri trattamenti per ripristinare i livelli di proteine MeCP2, lo sviluppo di un saggio efficiente e conveniente che può quantificarli è della massima importanza. Il test descritto in questo lavoro, l'ECLIA, è in grado di determinare i livelli di MeCP2 in modo accurato e coerente, con valori intra e inter-assay favorevoli(tabella 3).
Per il seguente protocollo MeCP2-ECLIA, i lismi cerebrali e gli HDF del topo sono stati impiegati come cellule di interesse. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato con tutti gli altri tipi di cellule di origine almeno umana e murina. Inoltre, gli HDF sono stati trattati con una proteina di fusione TAT-MePC2 per mostrare la capacità di questo saggio di misurare varie varianti di proteine MeCP2. Durante la preparazione del campione, evitare o ridurre al minimo gli agenti che riducono la lisi nel buffer di lisi, come il DTT o il mercaptoetanolo, è fondamentale per preservare l'efficienza della tecnica. Ulteriori passaggi critici in questo metodo riguardano il rivestimento a piastre con un anticorpo anti-MeCP2 del topo, il blocco della piastra e l'aggiunta del campione, seguito da un'incubazione di 4 h con un anticorpo anti-MeCP2 del coniglio. La successiva incubazione con un anticorpo secondario specifico (Tabella dei materiali) e l'aggiunta di reagenti necessari per la reazione di luminescenza, costituiscono le fasi importanti finali di questa procedura.
Al fine di ottimizzare le prestazioni ECLIA, è possibile effettuare le seguenti operazioni. L'uscita massima per il segnale per questo saggio non deve superare un milione di conteggi. Al fine di evitare che il fluido si diffonda oltre l'elettrodo, una tecnica chiamata rivestimento spot può essere utilizzata per introdurre la soluzione di rivestimento nel pozzo. Questa tecnica richiede la pipettaggio ad alta precisione o l'uso di un robot pipetta. Inoltre, testare varie concentrazioni di anticorpi potrebbe essere utile sia per aumentare la specificità di analisi che per ridurre il segnale di fondo. Per affrontare quest'ultimo, vari bloccanti (come MSD, Blocker D-M) possono anche essere utilizzati per una concentrazione finale dello 0,1%. Al fine di ottimizzare la qualità del segnale, si consiglia di testare vari tempi di incubazione (agitazione a 300 rpm o superiore a 300 rpm). Infine, per aumentare il recupero e la linearità di diluizione in supporti specifici come siero, plasma, urina o liquido cerebrospinale, è possibile testare diversi diluenti.
Le macchie occidentali semi-quantitative e i MeCP2-ELISA disponibili in commercio sono normalmente utilizzati per studiare i livelli proteici MeCP2. Il principio di funzionamento dell'ELISA è simile a quello della nostra ECLIA, con la notevole differenza che è la modalità di rilevamento. Rispetto a questi metodi, il MeCP2-ECLIA è più veloce e più conveniente. L'ECLIA è stato utilizzato per la valutazione di campioni di cervelli di topo selvatici, eterozigoti e Mecp2 (Figura 3A), con risultati rispetto alle quantità MeCP2 dagli stessi campioni ottenuti dal gonfiore occidentale (dati non mostrati). Una marcata differenza è stata osservata nei livelli meCP2 di campioni di certo di topo femminili e eterozigoto misurati dall'ECLIA che non è stato rilevato come statisticamente significativo dalla macchia occidentale. Questa maggiore precisione di analisi ECLIA può essere importante nella ricerca di nuovi composti che possano elevare i livelli di proteine MeCP2.
Inoltre, il MeCP2-ECLIA è meno costoso della sua controparte MeCP2-ELISA e grazie alla sua elevata gamma dinamica da 1 ng/mL a 1.800 ng/mL (R2 - 996), può essere utilizzato con campioni contenenti basse quantità di MeCP2. Rispetto a tutti i kit ELISA disponibili in commercio, l'ECLIA li supera di gran parte. L'ECLIA possiede una gamma dinamica più favorevole da 1-1.800 ng/mL rispetto alle sue controparti ELISA, che si sono trovate per essere 0.312-20 ng/mL (mouse, Cloud-Clone Corp.) e 0.156-10 ng/mL (umano, Cloud-Clone Corp.). A causa dell'assenza di una definizione esplicita di un limite inferiore di rilevamento, il suo confronto diretto tra questi due saggi non è possibile ai fini di questo lavoro.
In sintesi, è stato dimostrato che il MeCP2-ECLIA è in grado di determinare con precisione gli importi MeCP2 in vivo e in vitro. Mentre il reintegro dei livelli di proteine MeCP2 nei neuroni dei pazienti affetti da RTT è infatti un promettente viale di trattamento, la presenza di MeCP2 eccessivo può anche provocare gravi sintomi neurologici, associati alla sindrome di duplicazione MECP216,17,18. Come tale, questo metodo può essere di fondamentale importanza nell'ottimizzazione della quantità di MeCP2 introdotto esogenamente durante la terapia di sostituzione della proteina.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo molto grati alla dott.ssa Brigitte Sturm per il suo sostegno con lo strumento ECLIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
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