Summary
L’immunoassay d’électrochimie (ECLIA) est une nouvelle approche pour la détection quantitative des variantes de protéines MeCP2 endogènes et exogènement appliquées, qui produit des mesures hautement quantitatives, précises et reproductibles avec une erreur intra- et inter-essais faible sur un large éventail de travail. Ici, le protocole pour le MeCP2-ECLIA dans un format de 96 puits est décrit.
Abstract
L’ECLIA est une méthode polyvalente qui est capable de quantifier les quantités de protéines endogènes et recombinantes dans un format de 96 puits. Pour démontrer l’efficacité d’ECLIA, cet essai a été employé pour analyser des niveaux intrinsèques de MeCP2 dans le tissu de cerveau de souris et l’absorption de TAT-MeCP2 dans les fibroblastes dermals humains. Le MeCP2-ECLIA produit des mesures très précises et reproductibles avec une faible erreur intra-analyse et inter-analyse. En résumé, nous avons développé une méthode quantitative pour l’évaluation des variantes de protéines MeCP2 qui peuvent être utilisées dans des écrans à haut débit.
Introduction
L’immunoassay d’électrochimie (ECLIA) est basé sur un processus qui utilise des étiquettes conçues pour émettre de la luminescence lorsqu’elles sont stimulées électrochimiquement. Il s’agit d’une technique largement applicable pour la détection quantitative des analytes biologiques dans l’industrie de base et la recherche universitaire, l’industrie alimentaire ainsi que dans le diagnostic clinique1. Généralement, une plaque jetable de 96 puits avec des électrodes en encre de carbone est utilisée. Ces électrodes agissent comme un porteur de phase solide pour l’immunoassay. Un anticorps secondaire est conjugué à une étiquette électrochimique et lorsque l’électricité est appliquée au système, l’émission de lumière de l’étiquette chimique est déclenchée. Un dispositif ultra-faible de charge de bruit (CCD) enregistre l’intensité lumineuse qui est directement proportionnelle à l’antigène lié à l’anticorps de capture ayant pour résultat la quantification de l’analyte ciblé de l’échantillon2. Par rapport à l’essai immunosorbent lié à l’enzyme (ELISA), ECLIA est considéré comme avantageux car il offre une plus grande sensibilité et reproductibilité ainsi qu’une meilleure automatisation et la cohérence3.
Ici, nous avons analysé les niveaux de protéine liant méthyle-CpG 2 (MeCP2) dans des échantillons d’origine humaine et trouble ainsi que différentes variantes de la protéine recombinante utilisant le système ECLIA nouvellement développé. MecP2 est une protéine nucléique liée à l’acide X connue pour interagir avec des séquences d’ADN méthylées. Cette protéine a été impliquée dans la régulation de l’expression génique4,5. Les mutations de perte de fonction dans le gène qui code cette protéine sont les principaux coupables causant le syndrome de Rett (RTT), un désordre neurodéveloppemental grave6. Un autre trouble lié à MeCP2, syndrome de duplication MECP2, conduit également à des symptômes neurologiques qui peuvent se chevaucher avec ceux de RTT7. Notamment, les femelles sont principalement affectées par RTT tandis que les mâles sont pour la plupart affligés par le syndrome de duplication MECP2 6,7.
Ces troubles sont associés à des niveaux insuffisants ou excessifs de MeCP2 respectivement dans le système nerveux central (SNC). Par conséquent, les options de traitement pour RTT qui impliquent l’augmentation des niveaux meCP2 dans le SNC devraient éviter les effets néfastes associés à l’excès de MeCP27. En raison de ce fait, une quantification très sensible et précise des niveaux de protéines MeCP2, tel que fourni par le système ECLIA, est crucial pour l’avancement de rtT ainsi que la recherche sur le syndrome de duplication MECP2. Les mesures précises des niveaux endogènes et exogènes meCP2 des lignées cellulaires humaines et des échantillons de tissu de souris ainsi qu’une protéine recombinante composée de l’isoforme B humaine MeCP2 (également connu sous le nom d’isoforme e1), et un domaine minimal de transduction N-terminal HIV-TAT (TAT-MeCP2) qui a le potentiel de traverser la barrière hémato-encéphalique8,,9 sont présentées dans ce travail.
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Protocol
L’approbation de l’approvisionnement en biopsie de la peau à des fins de recherche a été obtenue auprès du Comité d’éthique de la recherche humaine de l’Hôpital pour enfants de Westmead, en Australie. Le consentement pour les expériences animales a été obtenu auprès du Ministère fédéral autrichien des sciences, de la recherche et de l’économie, qui ont été effectués conformément aux règlements locaux sur le bien-être animal (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
REMARQUE : Le principe du système ECLIA est représenté à la figure 1.
1. Sélection d’anticorps
- Évaluez le rapport signal-bruit pour une gamme de divers anticorps MeCP2 et identifiez la meilleure force de signal et la plus grande spécificité dans la combinaison d’un anticorps monoclonal de souris primaire MeCP2 (clone Mec-168) et d’anticorps de détection polyclonal de lapin MeCP2 (fabriqué sur mesure). Pour l’anticorps secondaire, utilisez un anticorps spécifique au système(tableau des matériaux), qui a également été vérifié expérimentalement.
REMARQUE : Le tableau 1 donne un aperçu de tous les anticorps vérifiés pendant le développement de MeCP2-ECLIA et de leurs plages de dilution testées.
| Fonction | Nom | Clone | Dilution |
| Primaire | Souris, anti-MeCP2 | Mec-168 | 1:500-1:10,000 |
| Primaire | Souris, anti-MeCP2 | 4B6 | 1:250-1:4,000 |
| Primaire | Souris, anti-MeCP2 | Hommes-8 | 1:500-1:4,000 |
| Primaire | Souris, anti-MeCP2 | 1B11 | 1:500-1:4,000 |
| Primaire | Lapin, anti-MeCP2 | D4F3 | 1:500-1:4,000 |
| Secondaire | Lapin, anti-MeCP2 | Polyclonaux | 1:2,000-1:20,000 |
| Secondaire | Lapin, anti-MeCP2 | Polyclonaux | 1:2,000-1:20,000 |
| Détection | SULFO-TAG étiqueté anti-lapin | Polyclonaux | 1:500-1:1,000 |
Tableau 1 : Liste des anticorps et des dilutions de travail utilisées.
- Vous pouvez également utiliser chaque paire d’anticorps MeCP2 qui fonctionne bien avec l’ELISA classique.
2. Traitement des HDFs avec protéine de fusion TAT-MeCP2
REMARQUE : LE TAT-MeCP2 a été récombiné dans Escherichia coli et purifié à l’aide de techniques chromatographiques standard comme indiqué précédemment8 et stockés à -80 oC.
- Plaque 1 x 106 cellules de fibroblaste dermique humain (HDF) dans des plats de 100 mm et cultivez les cellules pendant la nuit à 37 oC avec 5 % de CO2 jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 90 % de confluence.
- Sortez une fiole de protéine de fusion TAT-MeCP2. Décongeler sur la glace et mélanger délicatement.
- Diluer TAT-MeCP2 à une concentration finale de 500 nM dans 50 mL de médias culturels HDF.
- Retirez le support des plats de 100 mm et incuber les cellules avec 500 nM TAT-MeCP2 à 37 oC pour diverses périodes d’incubation jusqu’à 24 h.
- Retirez la solution TAT-MeCP2 des cellules. Laver les cellules 2x avec pré-réchauffé Dulbecco phosphate tamponné saline (DPBS).
- Traiter les cellules avec 2 ml de solution trypsin-EDTA à 0,05 % pendant 5 min à 37 oC10.
- Ajouter 6 ml de support de culture HDF pour inactiver la trypsine et recueillir les cellules dans des tubes de 15 ml.
- Pelleter les cellules par centrifugation à 500 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
- Retirer le supernatant et laver les cellules 2x avec DPBS glacé. Rangez le granulé sur la glace et procédez à la préparation de l’échantillon.
3. Préparation de l’échantillon
- HDF lysates
- Déterminez les niveaux de protéines les plus élevés de MeCP2 en utilisant la méthode REAP pour la fractionnement subcellulaire dans les compartiments subcellulaires cytoplasmiques et nucléaires selon Suzuki et coll.11. Limiter la fractionnement à pas plus de six échantillons par expérience.
- lysates de cerveau de souris
- Préparer 100 ml de chaque réactif hypotonique et tampon d’extraction.
- Pour le réactif hypotonique de lyse, mélanger bien 10 mM HEPES, 1,5 mM de chlorure de magnésium et 10 mm de chlorure de potassium.
- Pour le tampon d’extraction, mélanger bien 20 mM HEPES, 1,5 mM de chlorure de magnésium, 0,42 M de chlorure de sodium, 0,2 mM EDTA et 25% (v/v) glycérol.
- Ajuster le pH des deux tampons à 7,9.
- Ajouter 1 mM dithiothreitol (TNT) et 1x cocktail inhibiteur de protéase aux deux tampons fraîchement. Refroidir sur la glace avant l’utilisation.
- Suspendre 100 mg du cerveau total de la souris (souche : C57BL/6J, mâle et femelle de type sauvage et B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J,mâle hemizygous et femelle hétérozygote; âge : 4-8 semaines) dans 1 mL de froid hypotonique froid lysis reagent.
- Homogénéisez le cerveau avec un homogénéisateur de tissu tout en verre Dounce pré-réfrigéré par 15 coups d’homogénéiseur A (lâche, pour le dégagement important) et B (serré, pour le petit dégagement), respectivement.
- Transférer les cellules homogénéisées dans un tube propre et une centrifugeuse à 10 000 x g pendant 20 min à 4 oC. Jetez le supernatant (ou gardez-le comme fraction cytoplasmatique pour une utilisation ultérieure).
- Réutilisez la granule dans 140 l de tampon d’extraction par 100 mg de matériau de départ. Placer le tube dans un thermobloc pré refroidi et mélanger délicatement pendant 30 minutes à 4 oC.
- Centrifuge le tube à 16.000 g pendant 10 min à 4 oC. Transférer le supernatant (c.-à-d. la fraction nucléaire) dans un nouveau tube pré-réfrigéré et conserver à -80 oC jusqu’à l’utilisation.
REMARQUE : La concentration de protéines de lysates dérivées du cerveau de souris et des HDF peut être évaluée par l’essai de protéine de BCA.
- Préparer 100 ml de chaque réactif hypotonique et tampon d’extraction.
4. Protocole MeCP2-ECLIA
- Préparation de la solution de lavage, tampon de blocage et solution diluente d’essai (jour 1)
- Ajoutez 500 L de Tween 20 à 1 L de PBS pour préparer une Tween 20 de 0,05 % dans la solution PBS, mélanger vigoureusement et étiqueter comme « solution de lavage ».
REMARQUE : Assurez-vous que seul le tampon de lavage fraîchement préparé est utilisé. - Préparer une solution de blocage de 3% de bloqueur A(Tableau des matériaux) en saline tamponnée par phosphate (PBS). Mélanger en remuant doucement, filtrer la stérilisation et les conserver au réfrigérateur jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pendant un maximum de deux semaines.
- Ajoutez 5 ml de solution de blocage à 10 ml de PBS pour préparer la solution de diluent d’essai (1 % de bloqueur A dans PBS).
- Ajoutez 500 L de Tween 20 à 1 L de PBS pour préparer une Tween 20 de 0,05 % dans la solution PBS, mélanger vigoureusement et étiqueter comme « solution de lavage ».
- Revêtement des plaques de linge haute
- Sortez une plaque de lier haute à un seul endroit multi-array 96-well.
REMARQUE : Les plaques de lier élevées ont une plus grande capacité de liaison et donc une plus grande plage dynamique que les plaques standard avec des surfaces hydrophobes. - Décongeler l’anticorps anti-MeCP2 de souris monoclonale sur la glace et mélanger 0,67 l d’anticorps avec 4 ml de PBS (1:6,000 dilution d’anticorps dans PBS). Vortex la solution d’anticorps pour bien mélanger et étiqueter le tube comme "solution de revêtement".
- Distribuez soigneusement 25 L de solution de revêtement dans le coin inférieur de chaque puits à l’aide d’un tuyauteur multicanal; c’est ce qu’on appelle la méthode de revêtement de solution. Appuyez doucement sur la plaque de 96 puits de chaque côté pour vous assurer que la solution de revêtement couvre le fond de chaque puits.
- Sceller l’assiette avec un papier d’aluminium adhésif et incuber l’assiette au réfrigérateur à 4 oC pendant la nuit (12-16 h).
- Sortez une plaque de lier haute à un seul endroit multi-array 96-well.
- Blocage (jour 2)
- Sortir l’assiette du réfrigérateur et retirer le papier d’aluminium.
- Retirez la solution de revêtement d’anticorps en la faisant glisser dans le panier à déchets et appuyez sur la plaque sur un essuie-tout pour enlever toute la solution de revêtement des puits.
- Ajouter 125 L de solution de blocage par puits. Scellez à nouveau la plaque et placez-la sur un shaker orbital de microplaque.
- Incuber la plaque pendant 90 min à température ambiante avec secousse constante à 800 tr/min.
- Préparation des normes et des échantillons
- Pendant le temps d’incubation, préparez les normes de protéines MeCP2 et/ou TAT-MeCP2 et divers échantillons.
REMARQUE : Le tampon de Lyse utilisé pour la dilution standard doit être le même que celui utilisé dans les échantillons analysés. - Sortez une fiole de mePC2 et/ou de la solution de stock de protéines TAT-MeCP2 (250 g/mL), des lysates du cerveau de souris et des lysates HDF à partir de -80 oC. Décongeler sur la glace.
- Diluer la solution de stock standard (MeCP2 et/ou TAT-MeCP2) dans des tubes propres selon le tableau 2.
- Diluer les échantillons dans le tampon de lyse comme suit : 1 à 20 g de lysate du cerveau de souris par tampon de lyse de 25 l et 0,25 à 1 g de HDF lysate par tampon de lyse de 25 ll. Préparer suffisamment de volume de chaque échantillon pour effectuer l’analyse en triplicate.
- Pendant le temps d’incubation, préparez les normes de protéines MeCP2 et/ou TAT-MeCP2 et divers échantillons.
| Standard | Concentration | Dilution |
| Norme 1 | 1 800 ng/mL | Solution d’actions standard de 1,08 l ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' |
| Norme 2 | 600 ng/mL | 50 L Standard 1 '100 'L 'L Lysis tampon |
| Norme 3 | 200 ng/mL | 50 L Standard 2 '100 'L 'L Lysis tampon |
| Norme 4 | 66,67 ng/mL | 50 L Standard 3 et 100 L tampon de Lysis |
| Norme 5 | 22,22 ng/mL | 50 L Standard 4 '100 'L 'L Lysis tampon |
| Norme 6 | 7,41 ng/mL | 50 L Standard 5 '100 'L 'L Lysis tampon |
| Norme 7 | 2,47 ng/mL | 50 L Standard 6 '100 'L 'L Lysis tampon |
| Norme 8 | 0,82 ng/mL | 50 L Standard 7 '100 'L 'L Lysis tampon |
| Norme 9 | 0,27 ng/mL | 50 L Standard 8 '100 'L 'L Lysis tampon |
| Norme 10 | 0 ng/mL | Tampon de 150 l de Lysis |
Tableau 2 : Série standard de 0 à 1 800 ng/mL.
- Ajout d’échantillons et de solutions standard
- Retirez la solution de blocage en la faisant glisser dans le panier à déchets et appuyez sur la plaque sur un essuie-tout pour supprimer toute la solution de blocage des puits.
- Laver la plaque 3x avec 150 l de solution de lavage en ajoutant la solution de lavage et en l’enlevant immédiatement.
- Ajoutez 25 ul de normes et d’échantillons au coin inférieur du puits à l’aide d’une pipette à canal unique.
- Scellez la plaque et incuber la plaque pendant 4 h à température ambiante avec une secousse constante à 800 tr/min.
- Anticorps de détection non étiquetés
- Décongeler l’anticorps anti-MeCP2 de lapin polyclonal sur la glace. Diluer l’anticorps 1:6,000 dans la solution diluent d’essai.
- Retirez les normes et les échantillons en le faisant glisser dans le panier à déchets et appuyez sur la plaque sur un essuie-tout.
- Laver la plaque 3x avec 150 l de solution de lavage en ajoutant la solution de lavage et en l’enlevant immédiatement.
- Ajouter 25 L d’anticorps de détection non étiquetés à chaque puits avec le tuyauteur multicanal. Scellez la plaque et incuber pendant 1 h avec une secousse constante à 800 tr/min à température ambiante.
- Anticorps conjugués spécifiques
- Sortez l’anticorps secondaire spécifique(tableau des matériaux) du réfrigérateur et placez-le sur la glace. Diluer l’anticorps 1:666.67 dans la solution de diluent d’essai et mélanger doucement.
- Retirez l’anticorps secondaire non étiqueté en le faisant glisser dans le panier à déchets et appuyez sur la plaque sur un essuie-tout.
- Laver la plaque 3x avec 150 l de solution de lavage en ajoutant la solution de lavage et en l’enlevant immédiatement.
- Ajoutez 25 L d’anticorps conjugués spécifiques(tableau des matériaux)à chaque puits avec le tuyauteur multicanal. Scellez la plaque et incuber pendant 1 h avec une secousse constante à 800 tr/min à température ambiante.
- Lecture de l’assiette
- Retirez l’anticorps conjugué gratuit (tableau des matériaux) en le faisant glisser dans le panier à déchets et appuyez sur la plaque sur un essuie-tout.
- Laver la plaque 3x avec 150 l ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
- Ajoutez 150 L de tampon de lecture d’or à base de 1x Tris(Tableau des matériaux) avec un surfactant contenant de la tripropylamine comme co-réactif pour la production légère à l’assiette. Évitez les bulles d’air en utilisant des techniques de tuyauterie inversée.
- Placez la plaque sur la plate-forme de détection des microplates(tableau des matériaux) et commencez la mesure immédiatement. Utilisez les paramètres pour l’acquisition de plaques de 96 puits.
- Capturez les signaux d’électrochimie par une caméra CCD intégrée dans un système de détection d’électrochimie(Tableau des matériaux) et enregistrez les nombres de signaux, qui correspondent aux unités de lumière relatives (RLU) et sont directement proportionnels à l’intensité de la lumière.
REMARQUE : Lors de la stimulation électrochimique, l’étiquette de ruthénium liée à l’électrode de carbone émet une lumière de luminescence à 620 nm. Analyser les données avec le logiciel accompagné d’instruments(Tableau des matériaux).
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Representative Results
Le principe du système ECLIA est décrit à la figure 1. Les courbes standard pour deux variantes MeCP2 sont indiquées dans la figure 2. La quantification précise était possible sur un large éventail de concentrations (1 à 1 800 ng/mL). Dans la figure 3, les niveaux de lysates meCP2 dérivés du cerveau de souris et des HDF ont été analysés. L’expression meCP2 dans les lysates nucléaires du cerveau des hétérozygotes, du wildtype et des souris knock-out a été comparée dans la figure 3A, tandis que dans la protéine de meCP2 de la figure 3B no MeCP2 a été détectée dans les fibroblastes humains MECP2-déficients (c.806delG) utilisant l’ECLIA. L’adoption du TAT-MeCP2 par la lignée cellulaire MECP2 (c.806delG) a également fait l’objet d’une enquête au fil du temps(figure 4). Enfin, la précision inter-et intra-analyse a été démontrée comme le montre le tableau 3.
Figure 1 : Diagramme de l’essai d’électrochimie meCP2. Ce chiffre a été adapté de www.meso-scale.com. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Courbe standard MeCP2 générée par MeCP2 humain dans plusieurs mesures. La limite inférieure de détection (LLOD), définie comme 2,5 écarts standard (SD) au-dessus du blanc, est de 1,00 ng/mL. Recombinant humain MeCP2 (Abnova) pourrait être quantifié avec précision sur une gamme de 1,00 ng/mL (LLOD) à 1800 ng/mL (limite supérieure de détection [ULOD]) avec R2 - 0,996. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de n 3. Le chiffre a été modifié à partir de Steinkellner et al.8. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Niveaux MeCP2 dans le cerveau de souris et les HDF. (A) Les niveaux de meCP2-protéines ont été mesurés dans les lysates nucléaires du cerveau des hétérozygotes (gris, HET) et des souris femelles de type sauvage (noir, wildtype) (n ' 4) et une souris Mecp2-knockout (RTT); (B) Des lysates de cellules de la lignée de cellules fibroblastes meCP2-déficientes (c.806delG) dérivés d’un patient masculin présentant l’encéphalopathie néonatale comme modèle pour le syndrome de RTT ont été menés pour évaluer les niveaux de protéine de MeCP2 chez l’homme et un contrôle sain (noir). Les données présentées sont moyennes et SD des puits triplicate (n - 3). Aucune protéine MeCP2 n’a été détectée (sous la plage de détection) dans les lignées cellulaires mutantes par immunofluorescence ou en utilisant l’ECLIA, démontrant en outre qu’il s’agit d’un système très sensible pour d’autres études d’absorption avec des protéines TAT-fusion. Ce chiffre a été modifié à partir de Steinkellner et al.8. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : L’adoption dépendante du temps de TAT-MeCP2. Les niveaux de MeCP2 des fractions nucléaires dans les HDFs c.806delG ont été traités avec 500 nM recombinants TAT-MeCP2 protéine de fusion. L’analyse a été effectuée avec le MeCP2-ECLIA. Aux points de temps stipulés, les cellules ont été lavées avec DPBS et incubées avec 0,05% trypsin-EDTA pendant 5 min pour éliminer tat-MeCP2 extracellulaire.. La trypsinisation a été arrêtée en ajoutant des médias avec le sérum. La suspension de cellule a été centrifugée à 500 x g pendant 5 min. Après avoir lavé la granule 2x de cellules avec DPBS glacé, l’échantillon a été préparé pour l’extraction de fraction nucléaire telle que décrite dans la section du protocole. Ce chiffre a été modifié à partir de Steinkellner et al.8. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| IN ASSAY | INTER ASSAY | ||||||||||
| ng MeCP2 par protéine mL | ng MeCP2 par protéine mL | ||||||||||
| Eh bien 1 | Eh bien 2 | Eh bien 3 | Veux dire | SDa | SEMb | %CVc | Veux dire | SDa | SEMb | %CVc | |
| Fibroblastes humains | 6.42 | 6.30 | 6.45 | 6.39 | 0.08 | 0.05 | 1.24 | 6.61 | 0.64 | 0.37 | 9.71 |
| lysate de cerveau de souris | 9.92 | 10.16 | 10.36 | 10.14 | 0.22 | 0.13 | 2.17 | 11.22 | 0.94 | 0.54 | 8.33 |
| a Déviation standard, bMoyenne d’erreur standard, cCoefficient de Variation | |||||||||||
Tableau 3 : Détermination de la précision inter-assay sur trois jours consécutifs de HDF et de lysates de cerveau de souris de type sauvage. Par puits, une protéine de lysate cellulaire a été appliquée. a SD, déviation standard; b SEM, moyenne d’erreur standard; c CV, coefficient de variation. Ce tableau a été modifié à partir de Steinkellner et al.8.
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Discussion
Pour mesurer les niveaux endogènes MeCP2, recombinants MeCP2 et TAT-MeCP2, une plaque de 96 puits ECLIA a été développée. Il a été démontré que la perte de la fonction de protéine MeCP2 conduit au syndrome de RTT6, pour lequel le traitement est actuellement limité à la gestion des symptômes et la physiothérapie. Une avenue de traitement prometteuse est la thérapie de remplacement de protéine, où les niveaux de MeCP2 peuvent être titrés jusqu’à leur concentration nécessaire12,13,14,15. Le potentiel des protéines TAT-fusion pour traverser la barrière hémato-encéphalique s’est avéré être un succès au cours des deux dernières décennies12,13,14,15. En tant que tel, cette méthode pour la livraison de MeCP2 peut être utile dans le contexte de l’administration de thérapie de remplacement de protéine. Afin d’évaluer le potentiel des protéines TAT-fusion et d’autres traitements pour restaurer les niveaux de protéines MeCP2, le développement d’un essai efficace et abordable qui peut les quantifier est de la plus haute importance. L’analyse décrite dans ce travail, l’ECLIA, est en mesure de déterminer les niveaux de MeCP2 avec précision et de façon cohérente, avec des valeurs intra- et inter-assay favorables (tableau 3).
Pour le protocole MeCP2-ECLIA suivant, les lysates de cerveau de souris et les HDF ont été employés comme cellules d’intérêt. Cependant, ce protocole peut être utilisé avec tous les autres types de cellules d’origine au moins humaine et murine. En outre, les HDF ont été traités avec la protéine de fusion TAT-MePC2 pour montrer la capacité de cet essai à mesurer diverses variantes de protéine MeCP2. Pendant la préparation de l’échantillon, il est essentiel d’éviter ou de minimiser les agents de réduction dans le tampon de lyse comme la TNT ou le mercaptoethanol, pour préserver l’efficacité de la technique. D’autres étapes critiques de cette méthode impliquent le revêtement de plaque avec un anticorps anti-MeCP2 de souris, le blocage de plaque, et l’addition d’échantillon, suivie d’une incubation de 4 h avec un anticorps anti-MeCP2 de lapin. L’incubation subséquente avec un anticorps secondaire spécifique(tableau des matériaux) et l’ajout de réactifs nécessaires à la réaction de luminescence ont lieu, comprennent les dernières étapes importantes de cette procédure.
Afin d’optimiser les performances d’ECLIA, les étapes suivantes peuvent être entreprises. La sortie maximale pour le signal de cet essai ne doit pas dépasser un million de comptes. Afin d’empêcher le liquide de se propager au-delà de l’électrode, une technique appelée revêtement spot peut être utilisée pour introduire la solution de revêtement dans le puits. Cette technique nécessite un tuyautage de haute précision ou l’utilisation d’un robot pipette. En outre, l’essai de diverses concentrations d’anticorps pourrait être utile à la fois pour augmenter la spécificité d’analyse et réduire le signal de fond. Pour répondre à ce dernier, divers bloqueurs (tels que MSD, Blocker D-M) peuvent également être utilisés à une concentration finale de 0,1%. Afin d’optimiser la qualité du signal, il est recommandé de tester divers temps d’incubation (secouant à ou au-dessus de 300 tr/min). Enfin, pour augmenter la linéarité de récupération et de dilution dans des médias spécifiques tels que le sérum, le plasma, l’urine ou le liquide phérique, plusieurs diluants peuvent être testés.
La tache occidentale semi-quantitative et la meCP2-ELISA disponibles dans le commerce sont normalement utilisées pour étudier les niveaux de protéines MeCP2. Le principe de travail derrière l’ELISA est similaire à celui de notre ECLIA avec la différence notable étant le mode de détection. Par rapport à ces méthodes, le MeCP2-ECLIA est plus rapide et plus pratique. L’ECLIA a été utilisé pour faire des échantillons de cerveau de souris sauvages, hétérozygotes et Mecp2-knockout(figure 3A), avec des résultats comparés aux quantités meCP2 des mêmes échantillons obtenus par le ballonnement occidental (données non montrées). Une différence marquée a été observée dans les niveaux de MeCP2 des échantillons femelles de cerveau de souris de wildtype et d’hétérozygote mesurés par l’ECLIA qui n’a pas été détecté comme statistiquement significatif par la tache occidentale. Cette précision d’essai ECLIA plus élevée peut être importante dans la recherche de nouveaux composés qui peuvent élever des niveaux de protéines MeCP2.
En outre, le MeCP2-ECLIA est moins coûteux que son homologue MeCP2-ELISA et en raison de sa gamme dynamique élevée de 1 ng/mL à 1800 ng/mL (R2 - 0,996), peut être utilisé avec des échantillons contenant de faibles quantités MeCP2. Par rapport à tous les kits ELISA disponibles dans le commerce, l’ECLIA les surpasse considérablement. L’ECLIA possède une plage dynamique plus favorable de 1 à 1 800 ng/mL par rapport à ses homologues ELISA, qui se sont avérées être de 0,312 à 20 ng/mL (souris, Cloud-Clone Corp.) et de 0,156 à 10 ng/mL (humain, Cloud-Clone Corp.). En raison de l’absence d’une définition explicite d’une limite inférieure de détection, sa comparaison directe entre ces deux essais n’est pas possible aux fins de ce travail.
En résumé, il a été démontré que le MeCP2-ECLIA peut déterminer avec précision les montants MeCP2 in vivo et in vitro. Tandis que reconstituer des niveaux de protéine de MeCP2 dans les neurones des patients RTT-affectés est en effet une avenue prometteuse de traitement, la présence de MeCP2 excessif peut également avoir comme conséquence des symptômes neurologiques graves, associés au syndrome de duplication de MECP216,17,18. En tant que telle, cette méthode peut être d’une importance intégrale dans l’optimisation de la quantité de MeCP2 exogènement introduit pendant la thérapie de remplacement de protéine.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes très reconnaissants à la Dre Brigitte Sturm pour son soutien à l’instrument ECLIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
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