Summary
O imunoensaio eletroqueiluminescence (ECLIA) é uma nova abordagem para detecção quantitativa de variantes de proteína MeCP2 endógenas e exógenamente aplicadas, que produz medições altamente quantitativas, precisas e reprodutíveis com baixo erro intra e interensaio sobre uma ampla gama de trabalho. Aqui, o protocolo para o MeCP2-ECLIA em um formato de 96 poços é descrito.
Abstract
O ECLIA é um método versátil que é capaz de quantificar quantidades de proteínas endógenas e recombinantes em um formato de 96 poços. Para demonstrar a eficiência do ECLIA, este ensaio foi utilizado para analisar os níveis intrínsecos de MeCP2 no tecido cerebral do camundongo e a captação de TAT-MeCP2 em fibroblastos dérmicos humanos. O MeCP2-ECLIA produz medidas altamente precisas e reprodutíveis com baixo erro intra e interensaio. Em resumo, desenvolvemos um método quantitativo para a avaliação de variantes proteicas MeCP2 que podem ser utilizadas em telas de alto throughput.
Introduction
O imunoensaio eletroqueiluminescência (ECLIA) baseia-se em um processo que utiliza rótulos projetados para emitir luminescência quando estimulados eletroquimicamente. É uma técnica amplamente aplicável para a detecção quantitativa de analitos biológicos na indústria básica e na pesquisa acadêmica, na indústria alimentícia, bem como nos diagnósticos clínicos1. Comumente, uma placa descartável de 96 poços com eletrodos de tinta de carbono é usada. Estes eletrodos agem como um portador de fase sólida para o imunoensaio. Um anticorpo secundário é conjugado a um rótulo eletroquímico e quando a eletricidade é aplicada ao sistema, a emissão de luz da etiqueta química é acionada. Um dispositivo de carga de ruído ultra-baixo (CCD) registra a intensidade da luz que é diretamente proporcional ao antígeno ligado ao anticorpo de captura, resultando na quantificação do analito alvo da amostra2. Em comparação com o ensaio imunosorbent ligado à enzima (ELISA), o ECLIA é considerado vantajoso, pois oferece maior sensibilidade e reprodutibilidade, bem como melhor automação e consistência3.
Aqui analisamos os níveis de proteína de ligação metil-CpG 2 (MeCP2) em amostras de origem humana e murina, bem como diferentes variantes da proteína recombinante usando o recém-desenvolvido sistema ECLIA. MECP2 é uma proteína de ligação de ácido nucleico ligada a X conhecida por interagir com seqüências de DNA metilados. Esta proteína foi implicada na regulação da expressão genética4,5. Mutações de perda de função no gene que codifica essa proteína são os principais culpados pela síndrome de Rett (TRT), uma grave desordem neurodesenvolvimentista6. Outro distúrbio relacionado ao MECP2, a síndrome da duplicação do MECP2, também leva a sintomas neurológicos que podem se sobrepor aos da TRT7. Notavelmente, as fêmeas são mais afetadas pela TT, enquanto os machos são mais acometidos pela síndrome de duplicação MECP2 6,7.
Esses transtornos estão associados a níveis insuficientes ou excessivos de MeCP2, respectivamente, no sistema nervoso central (SNC). Assim, as opções de tratamento para tRT que envolvem o aumento dos níveis de MeCP2 no CNS precisariam evitar os efeitos prejudiciais associados ao excesso de MECP27. Devido a esse fato, uma quantificação altamente sensível e precisa dos níveis de proteína MeCP2, conforme fornecido pelo sistema ECLIA, é crucial para o avanço da TRT, bem como a pesquisa da síndrome da duplicação mecp2. As medidas precisas dos níveis endógenos e exógenos de MeCP2 de linhas de células humanas e amostras de tecido de camundongos, bem como uma proteína recombinante composta pelo isoform ebeuco B humano MeCP2 (também conhecido como isoform e1), e um domínio mínimo de transdução n-terminal HIV-TAT (TAT-MeCP2) que tem o potencial de atravessar abarreirahemato-cérebro-8,9 são apresentadas neste trabalho.
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Protocol
A aprovação para aquisição de biópsias de pele para fins de pesquisa foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Hospital Infantil de Westmead, Austrália. O consentimento para experimentos em animais foi obtido do Ministério da Ciência, Pesquisa e Economia da Áustria, realizado de acordo com as normas locais de bem-estar animal (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
NOTA: O princípio do sistema ECLIA é retratado na Figura 1.
1. Seleção de anticorpos
- Avalie a relação sinal-ruído para uma gama de vários anticorpos MeCP2 e identifique a melhor resistência ao sinal e a maior especificidade dentro da combinação de um anticorpo MeCP2 monoclonal do mouse primário (clone Mec-168) e anticorpo de detecção de coelclonal MeCP2 (feito sob medida). Para o anticorpo secundário, use um anticorpo específico do sistema(Table of Materials),que também foi verificado experimentalmente.
NOTA: A Tabela 1 fornece uma visão geral de todos os anticorpos verificados durante o desenvolvimento do MeCP2-ECLIA e suas faixas de diluição testadas.
| Função | Nome | Clone | Diluição |
| Primária | Mouse, anti-MeCP2 | MEC-168 | 1:500-1:10.000 |
| Primária | Mouse, anti-MeCP2 | 4B6 | 1:250-1:4.000 |
| Primária | Mouse, anti-MeCP2 | Homens-8 | 1:500-1:4.000 |
| Primária | Mouse, anti-MeCP2 | 1B11 | 1:500-1:4.000 |
| Primária | Coelho, anti-MeCP2 | D4F3 | 1:500-1:4.000 |
| Secundário | Coelho, anti-MeCP2 | Polyclonal | 1:2.000-1:20.000 |
| Secundário | Coelho, anti-MeCP2 | Polyclonal | 1:2.000-1:20.000 |
| Detecção | SULFO-TAG rotulado anti-coelho | Polyclonal | 1:500-1:1.000 |
Tabela 1: Lista de anticorpos e diluições de trabalho utilizadas.
- Alternativamente, use cada par de anticorpos MeCP2 que funcionem bem com o ELISA convencional.
2. Tratamento de HDFs com proteína de fusão TAT-MeCP2
NOTA: TAT-MeCP2 foi recombinantemente expresso em Escherichia coli e purificado usando técnicas cromatográficas padrão como descrito anteriormente8 e armazenado a -80 °C.
- Placa 1 x 106 células humanas de fibroblasto dérmico (HDF) em pratos de 100 mm e crescer as células durante a noite a 37 °C com 5% de CO2 até atingirem cerca de 90% de confluência.
- Tire um frasco de proteína de fusão TAT-MeCP2. Descongele no gelo e misture delicadamente.
- Diluir TAT-MeCP2 para uma concentração final de 500 nM em 50 mL de mídia de cultura HDF.
- Retire a mídia de pratos de 100 mm e incuba as células com 500 nM TAT-MeCP2 a 37 °C para vários períodos de incubação até 24 h.
- Remova a solução TAT-MeCP2 das células. Lave as células 2x com o salino pré-aquecido de Dulbecco com fosfato tampão (DPBS).
- Tratar as células com 2 mL de 0,05% de solução trypsin-EDTA por 5 min a 37 °C10.
- Adicione 6 mL de mídia de cultura HDF para inativar a tripsina e coletar as células em tubos de 15 mL.
- Pelota as células por centrifugação a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente.
- Remova o sobrenadante e lave as células 2x com DPBS frio. Armazene a pelota no gelo e prossiga com a preparação da amostra.
3. Preparação da amostra
- Lysates HDF
- Determinar os mais altos níveis de proteína de MeCP2 utilizando o método REAP para fracionamento subcelular nos compartimentos subcelulares citoplasmáticos e nucleares de acordo com Suzuki et al.11. Limitar o fracionamento a não mais de seis amostras por experimento.
- Lysates cerebrais de camundongos
- Prepare 100 mL de cada reagente de lyse hipotônica e tampão de extração.
- Para o reagente de lise hipotônica, misture bem 10 mM HEPES, 1,5 mM cloreto de magnésio e cloreto de potássio de 10 mM.
- Para o tampão de extração, misture bem 20 mM HEPES, 1,5 mM cloreto de magnésio, 0,42 M cloreto de sódio, 0,2 mM EDTA e 25% (v/v) glicerol.
- Ajuste o pH de ambos os buffers para 7,9.
- Adicione 1 mM dithiothreitol (DTT) e 1x coquetel inibidor de protease a ambos os buffers recentemente. Esfrie no gelo antes de usar.
- Suspender 100 mg de cérebro total do rato (cepa: C57BL/6J, macho e fêmea selvagem e B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous masculino e heterozigoso feminino; idade: 4-8 semanas de idade) em 1 mL de reagente de llysis hipotônica gelada.
- Homogeneize o cérebro com um homogeneizador de tecido dounce pré-refrigerado por 15 golpes de homogeneizador A (solto, para grande folga) e B (apertado, para pequena folga), respectivamente.
- Transfira as células homogeneizadas para um tubo limpo e centrífuga a 10.000 x g por 20 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante (ou mantenha-o como fração citoplasmática para uso posterior).
- Ressuspensão da pelota em 140 μL de tampão de extração por 100 mg de material inicial. Coloque o tubo em um termobloco pré-resfriado e misture suavemente por 30 min a 4 °C.
- Centrifugar o tubo a 16.000 g por 10 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante (ou seja, a fração nuclear) para um novo tubo pré-refrigerado e armazene a -80 °C até o uso.
NOTA: A concentração proteica de lysates derivados do cérebro do camundongo e hdfs pode ser avaliada pelo ensaio de proteína BCA.
- Prepare 100 mL de cada reagente de lyse hipotônica e tampão de extração.
4. Protocolo MeCP2-ECLIA
- Preparação da solução de lavagem, bloqueio do tampão e solução diluente de ensaio (dia 1)
- Adicione 500 μL de Tween 20 a 1 L de PBS para preparar uma solução De 0,05% Tween 20 na solução PBS, misture vigorosamente e rotule como "solução de lavagem".
NOTA: Certifique-se de que apenas o tampão de lavagem recém-preparado é usado. - Prepare uma solução de bloqueio de 3% do bloqueador A (Tabela de Materiais)em solução salina tampoprotetora da fosfato (PBS). Misture com agitação suave, filtre esterilize e mantenha-os na geladeira até usar por no máximo duas semanas.
- Adicionar 5 mL de solução de bloqueio a 10 mL de PBS para preparar a solução diluente de ensaio (1% de bloqueador A na PBS).
- Adicione 500 μL de Tween 20 a 1 L de PBS para preparar uma solução De 0,05% Tween 20 na solução PBS, misture vigorosamente e rotule como "solução de lavagem".
- Revestimento de placas de alta ligação
- Pegue uma placa de ligação de 96 polegadas de 96 polegadas.
NOTA: As placas de ligação elevada têm maior capacidade de ligação e, portanto, um alcance dinâmico maior do que as placas padrão com superfícies hidrofóbicas. - Descongele o anticorpo anti-MeCP2 do rato monoclonal no gelo e misture 0,67 μL do anticorpo com 4 mL de PBS (diluição de anticorpos 1:6.000 no PBS). Vórtice a solução de anticorpos para misturar bem e rotular o tubo como "solução de revestimento".
- Dispense cuidadosamente 25 μL de solução de revestimento no canto inferior de cada poço usando um pipettor multicanal; isso é chamado de método de revestimento de solução. Toque suavemente na placa de 96 poços de cada lado para garantir que a solução de revestimento cubra a parte inferior de cada poço.
- Sele a placa com uma folha de adesivo e incubar a placa na geladeira a 4 °C durante a noite (12-16 h).
- Pegue uma placa de ligação de 96 polegadas de 96 polegadas.
- Bloqueio (dia 2)
- Retire o prato da geladeira e retire a folha.
- Remova a solução de revestimento de anticorpos, apertando-a no cesto de resíduos e bata a placa em uma toalha de papel para remover toda a solução de revestimento dos poços.
- Adicione 125 μL de solução de bloqueio por poço. Sele a placa novamente e coloque-a em um agitador de microplacas orbitais.
- Incubar a placa por 90 min em temperatura ambiente com agitação constante a 800 rpm.
- Preparações de normas e amostras
- Durante o tempo de incubação, prepare os padrões de proteína MeCP2 e/ou TAT-MeCP2 e várias amostras.
NOTA: O tampão de lyse utilizado para diluição padrão deve ser o mesmo utilizado nas amostras analisadas. - Retire um frasco de solução de estoque de proteína MePC2 e/ou TAT-MeCP2 (250 μg/mL), lysates cerebrais de camundongos e lysates HDF de -80 °C. Descongelá-los no gelo.
- Diluir a solução padrão de estoque (MeCP2 e/ou TAT-MeCP2) em tubos limpos de acordo com a Tabela 2.
- Diluir as amostras no tampão de lysis da seguinte forma: 1−20 μg de lysate cerebral de camundongos por 25 μL de tampão de lysis, e 0,25-1 μg de hdf lysate por 25 μL de tampão de lysis. Prepare volume suficiente de cada amostra para realizar a análise em triplicado.
- Durante o tempo de incubação, prepare os padrões de proteína MeCP2 e/ou TAT-MeCP2 e várias amostras.
| Padrão | Concentração | Diluição |
| Padrão 1 | 1.800 ng/mL | 1,08 μL Solução de estoque padrão + tampão de lysis de 148,92 μL |
| Padrão 2 | 600 ng/mL | Tampão de lysis padrão de 50 μL + 100 μL |
| Padrão 3 | 200 ng/mL | Tampão de lysis padrão de 50 μL + 100 μL |
| Padrão 4 | 66,67 ng/mL | Tampão de lysis padrão de 50 μL 3 + 100 μL |
| Padrão 5 | 22.22 ng/mL | Tampão de lysis padrão de 50 μL 4 + 100 μL |
| Padrão 6 | 7.41 ng/mL | Tampão de lysis padrão de 50 μL 5 + 100 μL |
| Padrão 7 | 2,47 ng/mL | Tampão de lysis padrão de 50 μL 6 + 100 μL |
| Padrão 8 | 0,82 ng/mL | Tampão de lysis padrão de 50 μL 7 + 100 μL |
| Padrão 9 | 0,27 ng/mL | Tampão de lysis padrão de 50 μL 8 + 100 μL |
| Padrão 10 | 0 ng/mL | Tampão de lysis de 150 μL |
Tabela 2: Série padrão de 0 a 1.800 ng/mL.
- Adicionando as amostras e soluções padrão
- Remova a solução de bloqueio, apertando-a no cesto de resíduos e bata na placa em uma toalha de papel para remover toda a solução de bloqueio dos poços.
- Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.
- Adicione 25 ul de padrões e amostras ao canto inferior do poço usando uma pipeta de canal único.
- Sele a placa e incuba a placa por 4 h em temperatura ambiente com agitação constante a 800 rpm.
- Anticorpo de detecção não rotulado
- Descongele o anticorpo policlonal anti-MeCP2 no gelo. Diluir o anticorpo 1:6.000 em solução diluída de ensaio.
- Remova as normas e amostras, apertando-as no cesto de resíduos e bata a placa em uma toalha de papel.
- Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.
- Adicione 25 μL de anticorpo de detecção não rotulado a cada poço com o pipettor multicanal. Sele a placa e incuba-a por 1h com agitação constante a 800 rpm à temperatura ambiente.
- Anticorpo conjugado específico
- Retire o anticorpo secundário específico(Tabela de Materiais)da geladeira e coloque-o no gelo. Diluir o anticorpo 1:666.67 na solução diluída do ensaio e misturar suavemente.
- Remova o anticorpo secundário livre sem rótulo, apertando-o no cesto de lixo e bata o prato em uma toalha de papel.
- Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.
- Adicione 25 μL de anticorpos conjugados específicos(Tabela de Materiais)a cada poço com o pipettor multicanal. Sele a placa e incuba por 1 h com agitação constante a 800 rpm à temperatura ambiente.
- Lendo a placa
- Remova o anticorpo conjugado livre(Table of Materials)apertando-o no cesto de resíduos e bata a placa em uma toalha de papel.
- Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem.
- Adicione 150 μL de 1x tampão de leitura de ouro baseado em Tris(Tabela de Materiais)com surfactante contendo tripropylamina como co-reandré para a geração de luz para a placa. Evite bolhas de ar utilizando técnicas de pipetting reversa.
- Coloque a placa na plataforma de detecçãode microplacas (Tabela de Materiais)e inicie a medição imediatamente. Use as configurações para aquisição de placas de 96 poços.
- Capture os sinais de eletroquímicailuminescência por uma câmera CCD embutida em um sistema de detecção de eletroquímicailuminescência (Tabela de Materiais) e registre as contagens de sinais, que correspondem a unidades de luz relativa (RLU) e são diretamente proporcionais à intensidade da luz.
NOTA: Após a estimulação eletroquímica, o rótulo de rutênio ligado ao eletrodo de carbono emite luz de luminescência a 620 nm. Analisar dados com o software acompanhado por instrumentos (Tabela de Materiais).
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Representative Results
O princípio do sistema ECLIA é descrito na Figura 1. As curvas padrão para duas variantes MeCP2 são mostradas na Figura 2. A quantificação precisa foi possível em uma ampla gama de concentrações (1-1.800 ng/mL). Na Figura 3,foram analisados os níveis de Lnadameado derivados do cérebro do rato e dos HDFs. A expressão mecp2 em lisatos nucleares cerebrais de camundongos heterozigos, selvagens e camundongos nocauteados foi comparada na Figura 3A,enquanto na Figura 3B a proteína MeCP2 foi detectada nos fibroblastos humanos deficientes mecp2 (c.806delG) usando o ECLIA. A captação de TAT-MeCP2 pela linha celular deficiente mecp2 (c.806delG) também foi investigada ao longo do tempo (Figura 4). Por fim, a precisão inter e intra-ensaio foi demonstrada conforme mostrado na Tabela 3.
Figura 1: Diagrama do ensaio de eletroquímicailuminescência MeCP2. Esta figura foi adaptada a partir de www.meso-scale.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curva padrão MeCP2 gerada a partir de MeCP2 humano em múltiplas medições. O limite inferior de detecção (LLOD), definido como 2,5 desvios padrão (SDs) acima do branco, é de 1,00 ng/mL. O MeCP2 humano recombinante (Abnova) pode ser quantificado com precisão em uma faixa de 1,00 ng/mL (LLOD) a 1.800 ng/mL (limite superior de detecção [ULOD]) com R2 = 0,996. As barras de erro representam o erro padrão de n = 3. A figura foi modificada de Steinkellner et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Níveis de MeCP2 no cérebro do rato e HDFs. (A) Os níveis de proteína mecp2 foram medidos em lysates nucleares cerebrais de camundongos heterozigos (cinza, HET) e fêmeas do tipo selvagem (preto, selvagem) (n = 4) e um rato Mecp2-knockout (RTT); (B) Foram realizadas licatos celulares da linha celular fibroblasto deficiente de MeCP2 (c.806delG) derivados de um paciente do sexo masculino com encefalopatia neonatal como modelo para síndrome de TRT para avaliar os níveis de proteína MeCP2 em humanos e um controle saudável (preto). Os dados apresentados são de média ± D SD de poços triplicados (n = 3). Nenhuma proteína MeCP2 foi detectada (abaixo do alcance de detecção) nas linhas celulares mutantes por imunofluorescência ou uso do ECLIA, demonstrando ainda que é um sistema altamente sensível para estudos de captação posterior com proteínas de fusão TAT. Esta figura foi modificada a partir de Steinkellner et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Captação dependente do tempo de TAT-MeCP2. Os níveis de mecp2 de frações nucleares em HDFs c.806delG foram tratados com proteína de fusão TAT-MeCP2 recombinante de 500 nM. A análise foi realizada com o MeCP2-ECLIA. Em pontos de tempo estipulados, as células foram lavadas com DPBS e incubadas com 0,05% de trypsin-EDTA por 5 minutos para eliminar o TAT-MeCP2 com limite extracelular. A tripspsinização foi interrompida adicionando mídia com soro. A suspensão celular foi centrifugada a 500 x g por 5 min. Após a lavagem da pelota celular 2x com DPBS frio, a amostra foi preparada para extração de fração nuclear conforme descrito na seção de protocolo. Esta figura foi modificada a partir de Steinkellner et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| ENSAIO INTRA | ENSAIO INTER | ||||||||||
| ng MeCP2 por proteína mL | ng MeCP2 por proteína mL | ||||||||||
| Bem 1 | Bem 2 | Bem 3 | Média | SDa | SEMb | %CVc | Média | SDa | SEMb | %CVc | |
| Fibroblastos humanos | 6.42 | 6.30 | 6.45 | 6.39 | 0.08 | 0.05 | 1.24 | 6.61 | 0.64 | 0.37 | 9.71 |
| Lysate cerebral de camundongos | 9.92 | 10.16 | 10.36 | 10.14 | 0.22 | 0.13 | 2.17 | 11.22 | 0.94 | 0.54 | 8.33 |
| um Desvio Padrão, bMédia de Erro Padrão, cCoeficiente de Variação | |||||||||||
Tabela 3: Determinação da precisão do ensaio inter-ensaio em três dias consecutivos de hdf e linsatos cerebrais de camundongos selvagens. Por poço, 1-10 μg de proteína de lysato celular foi aplicado. um DS, desvio padrão; b SEM, média de erro padrão; c CV, coeficiente de variação. Esta tabela foi modificada de Steinkellner et al.8.
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Discussion
Para medir os níveis endógenos de MeCP2, MeCP2 recombinante e TAT-MeCP2, foi desenvolvida uma placa eclia de 96 poços. Foi demonstrado que a perda da função proteica MeCP2 leva à síndrome de TRT6, para a qual o tratamento está atualmente limitado ao gerenciamento de sintomas e fisioterapia. Um caminho promissor para o tratamento é a chamada terapia de reposição de proteínas, onde os níveis de MeCP2 podem ser titulados até a concentração necessária12,13,14,15. O potencial das proteínas de fusão TAT para atravessar a barreira hematoencefálica provou ser bem sucedido nas últimas duas décadas12,13,14,15. Como tal, este método para a entrega do MeCP2 pode ser útil no contexto da administração da terapia de reposição de proteínas. A fim de avaliar o potencial de proteínas de fusão TAT e outros tratamentos para restaurar os níveis de proteína MeCP2, desenvolver um ensaio eficiente e acessível que possa quantificá-las é de extrema importância. O ensaio descrito neste trabalho, o ECLIA, é capaz de determinar os níveis de MeCP2 com precisão e consistência, com valores intra e interensaios favoráveis(Tabela 3).
Para o seguinte protocolo MeCP2-ECLIA, foram empregados os cérebros dos camundongos e os HDFs como células de interesse. No entanto, este protocolo pode ser usado com todos os outros tipos de células de origem pelo menos humana e murina. Além disso, os HDFs foram tratados com proteína de fusão TAT-MePC2 para mostrar a capacidade deste ensaio para medir várias variantes proteicas MeCP2. Durante a preparação da amostra, evitar ou minimizar agentes redutores no tampão de lise, como DTT ou β-mercaptoetanol, é crucial para preservar a eficiência da técnica. Passos críticos adicionais neste método envolvem revestimento de placas com um anticorpo anti-MeCP2 do mouse, bloqueio de placas e adição de amostra, seguido por uma incubação de 4 h com um anticorpo anti-MeCP2 de coelho. A incubação subsequente com um anticorpo secundário específico (Tabela de Materiais) e a dição de reagentes necessários para que a reação de luminescência ocorra, compõem os passos finais importantes deste procedimento.
Para otimizar o desempenho da ECLIA, as seguintes etapas podem ser realizadas. A saída máxima para o sinal para este ensaio não deve exceder um milhão de contagens. Para evitar que o fluido se espalhe para além do eletrodo, uma técnica chamada revestimento local pode ser usada para introduzir a solução de revestimento no poço. Esta técnica requer pipetting de alta precisão ou o uso de um robô pipeette. Além disso, testar várias concentrações de anticorpos pode ser útil tanto para aumentar a especificidade do ensaio quanto reduzir o sinal de fundo. Para lidar com este último, vários bloqueadores (como MSD, Bloqueador D-M) também podem ser usados para uma concentração final de 0,1%. Para otimizar a qualidade do sinal, recomenda-se testar vários tempos de incubação (tremer a 300 rpm) ou acima de 300 rpm. Finalmente, para aumentar a recuperação e a linearidade de diluição em meios específicos, como soro, plasma, urina ou fluido cefalorraquidiano, vários diluentes podem ser testados.
A mancha ocidental semi-quantitativa e o MeCP2-ELISA comercialmente disponível são normalmente usados para estudar os níveis de proteína MeCP2. O princípio de trabalho por trás do ELISA é semelhante ao da nossa ECLIA, com a diferença notável sendo o modo de detecção. Em comparação com esses métodos, o MeCP2-ECLIA é mais rápido e conveniente. O ECLIA foi usado para ensaio para amostras cerebrais de camundongos selvagens, heterozigos e mecp2-knockout(Figura 3A),com achados comparados com quantidades de MeCP2 das mesmas amostras obtidas pela mancha ocidental (dados não mostrados). Observou-se diferença acentuada nos níveis de MeCP2 de amostras cerebrais de camundongos fêmeas e heterozigosas medidas pelo ECLIA, que não foi detectada como estatisticamente significante pela mancha ocidental. Essa maior precisão de ensaio eclia pode ser importante na busca de novos compostos que possam elevar os níveis de proteína MeCP2.
Além disso, o MeCP2-ECLIA é menos caro que sua contraparte MeCP2-ELISA e devido à sua alta faixa dinâmica de 1 ng/mL a 1.800 ng/mL (R2 = 0,996), pode ser usado com amostras contendo baixas quantidades de MeCP2. Quando comparado com todos os kits ELISA disponíveis comercialmente, a ECLIA supera-os muito. O ECLIA possui uma faixa dinâmica mais favorável de 1-1.800 ng/mL em comparação com suas contrapartes ELISA, que foram encontradas como 0,312-20 ng/mL (mouse, Cloud-Clone Corp.) e 0,156-10 ng/mL (humana, Cloud-Clone Corp.). Devido à ausência de definição explícita de um limite inferior de detecção, sua comparação direta entre esses dois ensaios não é possível para os fins deste trabalho.
Em resumo, foi demonstrado que o MeCP2-ECLIA pode determinar com precisão os montantes de MeCP2 in vivo e in vitro. Embora a reposição dos níveis de proteína MeCP2 nos neurônios dos pacientes afetados pelo TRT seja de fato uma via de tratamento promissora, a presença de mecp2 excessivo também pode resultar em sintomas neurológicos graves, associados à síndrome de duplicação MECP216,17,18. Como tal, este método pode ser de importância integral na otimização da quantidade de MeCP2 exogenamente introduzida durante a terapia de reposição de proteínas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Somos muito gratos à Dra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
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