Summary
Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) ist ein neuartiger Ansatz für den quantitativen Nachweis endogener und exogen angewendeter MeCP2-Proteinvarianten, der hochquantitative, genaue und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler über einen weiten Arbeitsbereich erzeugt. Hier wird das Protokoll für die MeCP2-ECLIA im 96-Well-Format beschrieben.
Abstract
Die ECLIA ist eine vielseitige Methode, die in der Lage ist, endogene und rekombinante Proteinmengen in einem 96-Well-Format zu quantifizieren. Um die ECLIA-Effizienz zu demonstrieren, wurde dieser Test verwendet, um intrinsische Konzentrationen von MeCP2 im Gehirngewebe der Maus und die Aufnahme von TAT-MeCP2 in humanen dermalen Fibroblasten zu analysieren. Der MeCP2-ECLIA erzeugt hochpräzise und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler. Zusammenfassend haben wir eine quantitative Methode zur Bewertung von MeCP2-Proteinvarianten entwickelt, die in Hochdurchsatz-Bildschirmen eingesetzt werden können.
Introduction
Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) basiert auf einem Verfahren, bei dem Etiketten verwendet werden, die bei elektrochemisch stimulierter Lumineszenz emittiert werden. Es ist eine allgemein anwendbare Technik für den quantitativen Nachweis biologischer Analyten in der Grundlagenindustrie und der akademischen Forschung, der Lebensmittelindustrie sowie in der klinischen Diagnostik1. Üblicherweise wird eine Einwegplatte mit Carbon-Tintenelektroden verwendet. Diese Elektroden fungieren als Festphasenträger für den Immunoassay. Ein sekundärer Antikörper wird mit einem elektrochemilumineszierenden Etikett konjugiert und wenn Strom auf das System aufgebracht wird, wird die Lichtemission des chemischen Etiketts ausgelöst. Ein ultra-low noise charge coupled device (CCD) zeichnet die Lichtintensität auf, die direkt proportional zum Antigen ist, das an den Aufnahmeantikörper gebunden ist, was zur Quantifizierung des Zielanalyten der Probe2führt. Im Vergleich zum enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA) gilt ECLIA als vorteilhaft, da es eine höhere Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit sowie eine bessere Automatisierung und Konsistenzbietet 3.
Hier analysierten wir die Methyl-CpG-Bindungsprotein-2 (MeCP2)-Spiegel in Proben menschlichen und murinen Ursprungs sowie verschiedene Varianten des rekombinanten Proteins mit dem neu entwickelten ECLIA-System. MecP2 ist ein X-verknüpftes Nukleinsäure-bindendes Protein, das bekanntermaßen mit methylierten DNA-Sequenzen interagiert. Dieses Protein ist in die Regulation der Genexpression4,5verwickelt. Funktionsverlustmutationen im Gen, die dieses Protein kodiert, sind die Hauptschuldigen, die das Rett-Syndrom (RTT), eine schwere neuroentwicklungsbedingten Störungverursachen 6. Eine weitere MeCP2-bedingte Erkrankung, das MECP2-Duplikationssyndrom, führt auch zu neurologischen Symptomen, die sich mit denen von RTT7überschneiden können. MECP2 Insbesondere sind Frauen meist von RTT betroffen, während Männer meist vom MECP2-Duplikationssyndrom 6,7betroffen sind.
Diese Störungen sind mit unzureichenden oder überschüssigen MeCP2-Spiegeln bzw. im Zentralnervensystem (ZNS) verbunden. Daher müssten Behandlungsoptionen für RTT, die eine Erhöhung des MeCP2-Spiegels im CNS beinhalten, die nachteiligen Auswirkungen im Zusammenhang mit einem Überschuss an MeCP27vermieden werden. Aufgrund dieser Tatsache ist eine hochsensible und genaue Quantifizierung des MeCP2-Proteinspiegels, wie sie vom ECLIA-System bereitgestellt wird, entscheidend für die Weiterentwicklung der RTT sowie der Forschung zum MECP2-Duplizierungssyndrom. MECP2 Die präzisen Messungen von endogenen und exogenen MeCP2-Spiegeln aus menschlichen Zelllinien und Mausgewebeproben sowie eines rekombinanten Proteins bestehend aus humanem MeCP2-Isoform B (auch bekannt als Isoform e1) und einer minimalen N-terminalen HIV-TAT-Transduktionsdomäne (TAT-MeCP2), die das Potenzial hat, die Blut-Hirn-Schranke8,,9 zu überqueren, werden in dieser Arbeit vorgestellt.
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Protocol
Die Zulassung für die Beschaffung von Hautbiopsien zu Forschungszwecken wurde von der Human Research Ethics Committee of the Children es Hospital in Westmead, Australien, eingeholt. Die Zustimmung zu Tierversuchen erhielt das Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft, die nach den örtlichen Tierschutzbestimmungen durchgeführt wurden (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
ANMERKUNG: Das Prinzip des ECLIA-Systems ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Antikörperauswahl
- Bewerten Sie das Signal-Rausch-Verhältnis für eine Reihe von verschiedenen MeCP2-Antikörpern und identifizieren Sie die beste Signalstärke und höchste Spezifität in der Kombination eines primären monoklonalen MeCP2-Antikörpers (Klon Mec-168) und eines polyklonalen MeCP2-Detektionsantikörpers (kundenspezifisch). Verwenden Sie für den sekundären Antikörper einen systemspezifischen Antikörper (Materialtabelle), der ebenfalls experimentell verifiziert wurde.
HINWEIS: Tabelle 1 gibt einen Überblick über alle nachgewiesenen Antikörper während der MeCP2-ECLIA-Entwicklung und deren getestete Verdünnungsbereiche.
| Funktion | Namen | Klon | Verdünnung |
| Primäre | Maus, anti-MeCP2 | Mec-168 | 1:500 bis 1:10.000 |
| Primäre | Maus, anti-MeCP2 | 4B6 | 1:250 bis 1:4.000 |
| Primäre | Maus, anti-MeCP2 | Herren-8 | 1:500 bis 1:4.000 |
| Primäre | Maus, anti-MeCP2 | 1B11 | 1:500 bis 1:4.000 |
| Primäre | Kaninchen, anti-MeCP2 | D4F3 | 1:500 bis 1:4.000 |
| Sekundären | Kaninchen, anti-MeCP2 | Polyclonal | 1:2,000 bis 1:20,000 |
| Sekundären | Kaninchen, anti-MeCP2 | Polyclonal | 1:2,000 bis 1:20,000 |
| Erkennung | SULFO-TAG gekennzeichnet Anti-Kaninchen | Polyclonal | 1:500 bis 1:1.000 |
Tabelle 1: Liste der Antikörper und der verwendeten Arbeitsverdünnungen.
- Alternativ können Sie jedes Paar MeCP2-Antikörper verwenden, das gut mit herkömmlichem ELISA funktioniert.
2. Behandlung von HDFs mit TAT-MeCP2-Fusionsprotein
ANMERKUNG: TAT-MeCP2 wurde rekombinant in Escherichia coli exprimiert und mit Standardchromatographietechniken wie zuvorbeschrieben 8 gereinigt und bei -80 °C gelagert.
- Platte 1 x 106 menschliche dermale Fibroblasten (HDF) Zellen in 100 mm Schalen und wachsen die Zellen über Nacht bei 37 °C mit 5%CO2, bis sie etwa 90% Konfluenz erreichen.
- Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit TAT-MeCP2-Fusionsprotein heraus. Auf Eis auftauen und sanft mischen.
- TAT-MeCP2 auf eine Endkonzentration von 500 nM in 50 ml HDF-Kulturmedien verdünnen.
- Entfernen Sie die Medien von 100 mm Geschirr und inkubieren Sie die Zellen mit 500 nM TAT-MeCP2 bei 37 °C für verschiedene Inkubationsperioden bis zu 24 h.
- Entfernen Sie die TAT-MeCP2-Lösung aus den Zellen. Waschen Sie die Zellen 2x mit vorgewärmter Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS).
- Behandeln Sie die Zellen mit 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung für 5 min bei 37 °C10.
- Fügen Sie 6 ml HDF-Kulturmedien hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren und die Zellen in 15 ml-Röhren zu sammeln.
- Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen 2x mit eiskaltem DPBS. Das Pellet auf Eis aufbewahren und mit der Probenvorbereitung fortfahren.
3. Probenvorbereitung
- HDF-Lysate
- Bestimmen Sie die höchsten Proteingehalte von MeCP2 mit der REAP-Methode zur subzellulären Fraktionierung in die zytoplasmatischen und nuklearen subzellulären Kompartimente nach Suzuki et al.11. Beschränken Sie die Fraktionierung auf nicht mehr als sechs Proben pro Experiment.
- Mausgehirn lysiert
- Bereiten Sie 100 ml jedes hypotonischen Lysereagenz und Extraktionspuffer s.
- Für das hypotonische Lysereagenz 10 mM HEPES, 1,5 mM Magnesiumchlorid und 10 mM Kaliumchlorid gut mischen.
- Für den Extraktionspuffer gut 20 mM HEPES, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,42 M Natriumchlorid, 0,2 mM EDTA und 25% (v/v) Glycerin mischen.
- Stellen Sie den pH-Wert beider Puffer auf 7,9 ein.
- 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 1x Protease-Hemmer-Cocktail zu beiden Puffern frisch hinzufügen. Vor Gebrauch auf Eis abkühlen lassen.
- Suspend 100 mg des gesamten Maushirns (Stamm: C57BL/6J, Wildtyp männlich und weiblich und B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygotes männchen und heterozygotes Weibchen; Alter: 4 bis 8 Wochen alt) in 1 ml eiskaltem hypotonischem Lysereage.
- Homogenisieren Sie das Gehirn mit einem vorgekühlten Dounce Ganzglas-Gewebehomogenisator durch 15 Striche Homogenisator A (locker, für große Freiraum) bzw. B (eng, für kleine Freiräume).
- Die homogenisierten Zellen bei 10.000 x g bei 10.000 x g bei 20 min bei 4 °C in ein sauberes Rohr und eine Zentrifuge übertragen. Entsorgen Sie den Überstand (oder halten Sie ihn als zytoplasmatische Fraktion für die weitere Verwendung).
- Setzen Sie das Pellet in 140 l Extraktionspuffer pro 100 mg Ausgangsmaterial wieder auf. Das Rohr in einen vorgekühlten Thermoblock geben und bei 4 °C 30 min sanft mischen.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 16.000 g für 10 min bei 4 °C. Den Überstand (d.h. die Kernfraktion) in ein neues vorgekühltes Rohr geben und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.
HINWEIS: Die Proteinkonzentration von Lysaten aus Maushirn und HDFs kann durch den BCA-Proteintest beurteilt werden.
- Bereiten Sie 100 ml jedes hypotonischen Lysereagenz und Extraktionspuffer s.
4. MeCP2-ECLIA-Protokoll
- Vorbereitung von Waschlösung, Sperrpuffer und Assay-Verdünnungslösung (Tag 1)
- Fügen Sie 500 l Tween 20 bis 1 L PBS hinzu, um eine 0,05% Tween 20 in PBS-Lösung vorzubereiten, kräftig mischen und als "Waschlösung" kennzeichnen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass nur frisch zubereiteter Waschpuffer verwendet wird. - Bereiten Sie eine Blockierlösung von 3% Blocker A (Materialtabelle) in phosphatgepufferter Saline (PBS) vor. Durch sanftes Rühren mischen, sterilisieren und im Kühlschrank aufbewahren, bis sie maximal zwei Wochen lang verwendet werden.
- Fügen Sie 5 ml Blockierlösung zu 10 ml PBS hinzu, um eine Assay-Verdünnungslösung vorzubereiten (1% Blocker A in PBS).
- Fügen Sie 500 l Tween 20 bis 1 L PBS hinzu, um eine 0,05% Tween 20 in PBS-Lösung vorzubereiten, kräftig mischen und als "Waschlösung" kennzeichnen.
- Beschichtung von hochbindbaren Platten
- Nehmen Sie eine 96-Well Multi-Array-Single-Spot-High-Bind-Platte heraus.
HINWEIS: Hohe Bindeplatten haben eine größere Bindungskapazität und damit einen größeren Dynamikbereich als Standardplatten mit hydrophoben Oberflächen. - Den monoklonalen Maus-Anti-MeCP2-Antikörper auf Eis auftauen und 0,67 l des Antikörpers mit 4 ml PBS (1:6.000 Antikörperverdünnung in PBS) mischen. Wirbel die Antikörperlösung gut zu mischen und die Röhre als "Beschichtungslösung" zu kennzeichnen.
- Mit einem Mehrkanal-Pipettor dosieren Sie vorsichtig 25 L Beschichtungslösung in der unteren Ecke jedes Brunnens; dies wird als Lösungsbeschichtungsverfahren bezeichnet. Tippen Sie auf jeder Seite vorsichtig auf die 96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass die Beschichtungslösung den Boden jedes Brunnens abdeckt.
- Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebefolie und bebrüten Sie die Platte im Kühlschrank bei 4 °C über Nacht (12-16 h).
- Nehmen Sie eine 96-Well Multi-Array-Single-Spot-High-Bind-Platte heraus.
- Blockierung (Tag 2)
- Nehmen Sie die Platte aus dem Kühlschrank und entfernen Sie die Folie.
- Entfernen Sie die Antikörper-Beschichtungslösung, indem Sie sie in den Abfallkorb werfen und tippen Sie auf die Platte auf ein Papiertuch, um die gesamte Beschichtungslösung aus den Brunnen zu entfernen.
- Fügen Sie 125 L Blockierlösung pro Bohrgut hinzu. Versiegeln Sie die Platte erneut und legen Sie sie auf einen Orbital-Mikroplatten-Shaker.
- Inkubieren Sie die Platte für 90 min bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln bei 800 Rpm.
- Vorbereitung von Normen und Proben
- Bereiten Sie während der Inkubationszeit die MeCP2- und/oder TAT-MeCP2-Proteinstandards und verschiedene Proben vor.
HINWEIS: Der Für die Standardverdünnung verwendete Lysispuffer muss mit dem in den analysierten Proben verwendeten identisch sein. - Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit MePC2- und/oder TAT-MeCP2-Protein-Stammlösung (250 g/ml), Maus-Gehirnlysate und HDF-Lysate aus -80 °C heraus. Tauen Sie sie auf Eis.
- Verdünnen Sie die Standard-Lagerlösung (MeCP2 und/oder TAT-MeCP2) in sauberen Rohren nach Tabelle 2.
- Verdünnen Sie die Proben im Lysepuffer wie folgt: 1,20 g Maushirnlysat pro 25 L Lysepuffer und 0,25 ,1 g HDF-Lysat pro 25 L Lysepuffer. Bereiten Sie genügend Volumen jeder Probe vor, um eine Analyse in dreifacher Ausfertigung durchzuführen.
- Bereiten Sie während der Inkubationszeit die MeCP2- und/oder TAT-MeCP2-Proteinstandards und verschiedene Proben vor.
| Standard | Konzentration | Verdünnung |
| Standard 1 | 1.800 ng/mL | 1,08 l Standard-Lagerlösung + 148,92 l Lysispuffer |
| Standard 2 | 600 ng/mL | 50 l Standard 1 + 100 l Lysispuffer |
| Standard 3 | 200 ng/mL | 50 l Standard 2 + 100 l Lysispuffer |
| Standard 4 | 66,67 ng/ml | 50 l Standard 3 + 100 l Lysispuffer |
| Standard 5 | 22,22 ng/ml | 50 l Standard 4 + 100 l Lysispuffer |
| Standard 6 | 7,41 ng/ml | 50 l Standard 5 + 100 l Lysispuffer |
| Standard 7 | 2,47 ng/ml | 50 l Standard 6 + 100 l Lysispuffer |
| Standard 8 | 0,82 ng/ml | 50 l Standard 7 + 100 l Lysispuffer |
| Standard 9 | 0,27 ng/ml | 50 l Standard 8 + 100 l Lysispuffer |
| Standard 10 | 0 ng/mL | 150 L Lysis-Puffer |
Tabelle 2: Standardserien von 0 bis 1.800 ng/ml.
- Hinzufügen der Muster und Standardlösungen
- Entfernen Sie die Sperrlösung, indem Sie sie in den Abfallkorb werfen und tippen Sie auf die Platte auf ein Papiertuch, um die gesamte Blocklösung aus den Brunnen zu entfernen.
- Waschen Sie die Platte 3x mit 150 l Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.
- Fügen Sie 25 Ul von Standards und Proben in die untere Ecke des Brunnens mit einer einkanaligen Pipette.
- Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie die Platte für 4 h bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen von 15.00 Uhr.
- Unbeschrifteter Detektionsantikörper
- Den polyklonalen Kaninchen-Anti-MeCP2-Antikörper auf Eis auftauen. Verdünnen Sie den Antikörper 1:6.000 in Assay-Verdünnungslösung.
- Entfernen Sie die Standards und Proben, indem Sie sie in den Abfallkorb werfen und tippen Sie auf die Platte auf ein Papiertuch.
- Waschen Sie die Platte 3x mit 150 l Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.
- Fügen Sie mit dem Mehrkanal-Pipettor 25 L unbeschrifteten Detektionsantikörper zu jedem Brunnen hinzu. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie sie für 1 h mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen bei Raumtemperatur.
- Spezifischer konjugierter Antikörper
- Nehmen Sie den spezifischen sekundären Antikörper (Tabelle der Materialien) aus dem Kühlschrank und legen Sie ihn auf Eis. Den Antikörper 1:666.67 in assay verdünnungsmitteler Lösung verdünnen und sanft mischen.
- Entfernen Sie den kostenlosen unbeschrifteten Sekundärantikörper, indem Sie ihn in den Abfallkorb werfen und auf ein Papiertuch tippen.
- Waschen Sie die Platte 3x mit 150 l Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.
- Fügen Sie mit dem Mehrkanalpipettor 25 L spezifischen konjugierten Antikörper (Materialtabelle) zu jedem Brunnen hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten für 1 h mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen bei Raumtemperatur.
- Lesen der Platte
- Entfernen Sie den freien konjugierten Antikörper (Tabelle der Materialien), indem Sie ihn in den Abfallkorb werfen und tippen Sie auf die Platte auf ein Papiertuch.
- Waschen Sie die Platte 3x mit 150 l Waschlösung.
- Fügen Sie 150 L 1x Tris-basierten Gold-Lesepuffer (Tabelle der Materialien) mit Tensid enthaltenTripropylamin als Co-Reaktant für die Lichterzeugung auf die Platte. Vermeiden Sie Luftblasen, indem Sie Reverse Pipettiertechniken verwenden.
- Legen Sie die Platte auf die Mikroplatten-Erkennungsplattform (Materialtabelle) und starten Sie die Messung sofort. Verwenden Sie die Einstellungen für die 96-Well-Plattenerfassung.
- Erfassen Sie die Elektrochemilumineszenzsignale mit einer eingebauten CCD-Kamera in einem Elektrochemilumineszenz-Erkennungssystem (Materialtabelle) und erfassen Sie die Signalzahlen, die relativen Lichteinheiten (RLU) entsprechen und direkt proportional zur Lichtintensität sind.
HINWEIS: Bei elektrochemischer Stimulation emittiert das an die Kohlenstoffelektrode gebundene Ruthenium-Etikett Leuchtlicht bei 620 nm. Analysieren Sie Daten mit der instrumentenbegleiteten Software (Tabelle der Materialien).
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Representative Results
Das Prinzip des ECLIA-Systems ist in Abbildung 1beschrieben. Standardkurven für zwei MeCP2-Varianten sind in Abbildung 2dargestellt. Eine genaue Quantifizierung war über einen breiten Konzentrationsbereich (1.800 ng/ml) möglich. In Abbildung 3wurden MeCP2-Spiegel von Lysaten aus Dem mausgehirn und HDFs analysiert. Die MeCP2-Expression in Kernlysaten im Gehirn von heterozygoten, Wildtyp- und Knockout-Mäusen wurde in Abbildung 3Averglichen, während in Abbildung 3B kein MeCP2-Protein in den MECP2-defizienten menschlichen Fibroblasten (c.806delG) mit dem ECLIA nachgewiesen wurde. Die Aufnahme von TAT-MeCP2 durch die MECP2-defizide Zelllinie (ca.806delG) wurde ebenfalls im Laufe der Zeit untersucht (Abbildung 4). Schließlich wurde die Präzision zwischen und in der In-Assay-Verbindung nachgewiesen, wie aus Tabelle 3hervorgeht.
Abbildung 1: Diagramm des MeCP2-Elektrochemilumineszenz-Assays. Diese Zahl wurde von www.meso-scale.com adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: MeCP2-Standardkurve, die aus dem menschlichen MeCP2 in mehreren Messungen generiert wurde. Die untere Erkennungsgrenze (LLOD), definiert als 2,5 Standardabweichungen (SDs) über dem Rohling, beträgt 1,00 ng/ml. Rekombinantes humanes MeCP2 (Abnova) konnte über einen Bereich von 1,00 ng/ml (LLOD) bis 1.800 ng/ml (obere Nachweisgrenze [ULOD]) mit R2 = 0,996 genau quantifiziert werden. Fehlerbalken stellen den Standardfehler von n = 3 dar. Die Figur wurde von Steinkellner et al.8modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: MeCP2-Spiegel in Mausgehirn und HDFs. (A) Der MeCP2-Proteinspiegel wurde in Kernlysaten des Gehirns von heterozygoten (grau, HET) und weiblichen Wildtypmäusen (schwarz, wildtyp) (n = 4) und einer Mecp2-Knockout-Maus(RTT) gemessen; (B) Zelllysate aus MeCP2-defizitiver Fibroblasten-Zelllinie (ca.806delG), die von einem männlichen Patienten mit neonataler Enzephalopathie als Modell für das RTT-Syndrom abgeleitet wurden, wurden durchgeführt, um den MeCP2-Proteinspiegel beim Menschen und eine gesunde Kontrolle (schwarz) zu bewerten. Die dargestellten Daten sind mittelwert - SD von dreifachen Brunnen (n = 3). Kein MeCP2-Protein wurde in den mutierten Zelllinien durch Immunfluoreszenz oder mit der ECLIA nachgewiesen,was weiter zeigt, dass es sich um ein hochempfindliches System für weitere Aufnahmestudien mit TAT-Fusionsproteinen handelt. Diese Zahl wurde von Steinkellner et al.8geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Zeitabhängige Aufnahme von TAT-MeCP2. MeCP2-Spiegel von Kernfraktionen in c.806delG HDFs wurden mit 500 nM rekombinantem TAT-MeCP2-Fusionsprotein behandelt. Die Analyse wurde mit dem MeCP2-ECLIA durchgeführt. Zu festgelegten Zeitpunkten wurden die Zellen mit DPBS gewaschen und mit 0,05% Trypsin-EDTA für 5 min inkubiert, um extrazellulär gebundenes TAT-MeCP2 zu eliminieren. Die Trypsinisierung wurde durch Hinzufügen von Medien mit Serum gestoppt. Die Zellsuspension wurde bei 500 x g für 5 min zentrifugiert. Nach dem Waschen des Zellpellets 2x mit eiskaltem DPBS wurde die Probe für die Extraktion der Kernfraktion vorbereitet, wie im Protokollabschnitt beschrieben. Diese Zahl wurde von Steinkellner et al.8geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| INTRA ASSAY | INTER ASSAY | ||||||||||
| ng MeCP2 pro ml Protein | ng MeCP2 pro ml Protein | ||||||||||
| Gut 1 | Gut 2 | Gut 3 | Bedeuten | SDa | SEMb | %CVc | Bedeuten | SDa | SEMb | %CVc | |
| Menschliche Fibroblasten | 6.42 | 6.30 | 6.45 | 6.39 | 0.08 | 0.05 | 1.24 | 6.61 | 0.64 | 0.37 | 9.71 |
| Maus-Gehirn lysieren | 9.92 | 10.16 | 10.36 | 10.14 | 0.22 | 0.13 | 2.17 | 11.22 | 0.94 | 0.54 | 8.33 |
| a Standardabweichung, bStandardfehlermittel, cVariationskoeffizient | |||||||||||
Tabelle 3: Bestimmung der Inter-Assay-Präzision an drei aufeinanderfolgenden Tagen von HDF- und Wildtyp-Maus-Gehirnlysaten. Pro gut 1bis 10 g Wurde ein Protein von Zelllysat aufgetragen. a SD, Standardabweichung; b SEM, Standardfehlermittel; c CV, Variationskoeffizient. Diese Tabelle wurde von Steinkellner et al.8geändert.
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Discussion
Zur Messung der endogenen MeCP2-, rekombinanten MeCP2- und TAT-MeCP2-Spiegel wurde eine 96-Well-Platte ECLIA entwickelt. Es hat sich gezeigt, dass der Verlust der MeCP2-Proteinfunktion zum RTT-Syndrom6führt, für das die Behandlung derzeit auf Symptommanagement und Physiotherapie beschränkt ist. Eine vielversprechende Behandlungsmöglichkeit ist die sogenannte Proteinersatztherapie, bei der MeCP2-Spiegel bis zu ihrer benötigten Konzentration12,,13,14,15titriert werden können. Das Potenzial von TAT-Fusionsproteinen, die Blut-Hirn-Schranke zu überschreiten, hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten bewährt12,13,14,15. Daher kann diese Methode für die MeCP2-Bereitstellung im Zusammenhang mit der Verabreichung von Proteinersatztherapien nützlich sein. Um das Potenzial von TAT-Fusionsproteinen und anderen Behandlungen zur Wiederherstellung des MeCP2-Proteinspiegels zu bewerten, ist die Entwicklung eines effizienten und erschwinglichen Assays, der sie quantifizieren kann, von größter Bedeutung. Der in dieser Arbeit beschriebene Assay, die ECLIA, ist in der Lage, meCP2-Niveaus sowohl präzise als auch konsistent mit günstigen Intra- und Inter-Assay-Werten zu bestimmen (Tabelle 3).
Für das folgende MeCP2-ECLIA-Protokoll wurden Maushirnlysate und HDFs als Interessenszellen eingesetzt. Jedoch, Dieses Protokoll kann mit allen anderen Zelltypen von mindestens menschlichen und murinen Ursprung verwendet werden. Darüber hinaus wurden HDFs mit TAT-MePC2-Fusionsprotein behandelt, um die Fähigkeit dieses Tests zur Messung verschiedener MeCP2-Proteinvarianten zu zeigen. Bei der Probenvorbereitung ist die Vermeidung oder Minimierung von Reduktionsmitteln im Lysepuffer wie DTT oder Mercaptoethanol von entscheidender Bedeutung, um die Effizienz der Technik zu erhalten. Weitere kritische Schritte bei diesem Verfahren umfassen die Plattenbeschichtung mit einem Maus-Anti-MeCP2-Antikörper, Plattenblockierung und Probenzugabe, gefolgt von einer 4 h Inkubation mit einem Kaninchen-Anti-MeCP2-Antikörper. Die nachfolgende Inkubation mit einem spezifischen Sekundärantikörper(Materialtabelle) und die Zugabe von Reagenzien, die für die Lumineszenzreaktion erforderlich sind, bilden die letzten wichtigen Schritte dieses Verfahrens.
Um die ECLIA-Leistung zu optimieren, können die folgenden Schritte unternommen werden. Der maximale Ausgang für das Signal für diesen Test sollte nicht mehr als eine Million Zählungen betragen. Um zu verhindern, dass sich die Flüssigkeit über die Elektrode hinaus ausbreitet, kann eine Technik namens Spotbeschichtung verwendet werden, um die Beschichtungslösung in den Brunnen einzuführen. Diese Technik erfordert eine hochpräzise Pipettierung oder den Einsatz eines Pipettenroboters. Darüber hinaus könnten tests verschiedene Antikörperkonzentrationen nützlich sein, um sowohl die Spezifität des Tests zu erhöhen als auch das Hintergrundsignal zu reduzieren. Um Letzteres zu beheben, können verschiedene Blocker (wie MSD, Blocker D-M) auch zu einer Endkonzentration von 0,1% verwendet werden. Um die Signalqualität zu optimieren, wird empfohlen, verschiedene Inkubationszeiten (Schütteln bei oder über 300 Umdrehungen pro Minute) zu testen. Um die Rückgewinnung und Verdünnungslinearität in bestimmten Medien wie Serum, Plasma, Urin oder Zerebrospinalflüssigkeit zu erhöhen, können mehrere Verdünnungsmittel getestet werden.
Semiquantitative western blot und kommerziell erhältliche MeCP2-ELISA werden normalerweise verwendet, um MeCP2-Proteinspiegel zu untersuchen. Das Arbeitsprinzip hinter dem ELISA ähnelt dem unserer ECLIA, wobei der deutliche Unterschied der Erkennungsmodus ist. Im Vergleich zu diesen Methoden ist der MeCP2-ECLIA schneller und bequemer. Die ECLIA wurde verwendet, um nach Wildtyp-, Heterozygot- und Mecp2-Knockout-Maus-Gehirnproben zu suchen (Abbildung 3A), mit Befunden im Vergleich zu MeCP2-Mengen aus den gleichen Proben, die durch Western Blotting gewonnen wurden (Daten nicht gezeigt). Ein deutlicher Unterschied wurde bei MeCP2-Spiegeln weiblicher Wildtyp- und heterozygoter Maushirnproben beobachtet, die von der ECLIA gemessen wurden und die vom westlichen Fleck nicht als statistisch signifikant nachgewiesen wurden. Diese höhere ECLIA-Assay-Genauigkeit kann bei der Suche nach neuartigen Verbindungen, die den MeCP2-Proteinspiegel erhöhen können, von Bedeutung sein.
Darüber hinaus ist der MeCP2-ECLIA kostengünstiger als sein MeCP2-ELISA-Pendant und kann aufgrund seines hohen Dynamikbereichs von 1 ng/mL bis 1.800 ng/ml (R2 = 0,996) mit Proben mit niedrigen MeCP2-Mengen verwendet werden. Im Vergleich zu allen handelsüblichen ELISA-Kits übertrifft die ECLIA sie deutlich. Die ECLIA verfügt über einen günstigeren Dynamikbereich von 1 bis 1.800 ng/ml im Vergleich zu ihren ELISA-Pendants, die sich bei 0,312 x 20 ng/mL (Maus, Cloud-Clone Corp.) und 0,156 x 10 ng/ml (Human, Cloud-Clone Corp.) befanden. Da es keine explizite Definition einer unteren Nachweisgrenze gibt, ist ein direkter Vergleich zwischen diesen beiden Assays für die Zwecke dieser Arbeit nicht möglich.
Zusammenfassend wurde gezeigt, dass die MeCP2-ECLIA meCP2-Mengen in vivo und in vitro genau bestimmen kann. Während die Auffüllung des MeCP2-Proteinspiegels in den Neuronen von RTT-betroffenen Patienten in der Tat eine vielversprechende Behandlungsmöglichkeit ist, kann das Vorhandensein von übermäßigem MeCP2 auch zu schweren neurologischen Symptomen führen, die mit dem MECP2-Duplikationssyndrom16,17,18verbunden sind. Daher kann diese Methode von integraler Bedeutung bei der Optimierung der Menge an exogen eingeführten MeCP2 während der Proteinersatztherapie sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Brigitte Sturm für ihre Unterstützung beim ECLIA-Instrument.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
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