Summary
Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), geniş bir çalışma aralığında düşük intra ve inter-assay hatası ile yüksek nicel, doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üreten endojen ve eksojen olarak uygulanan MeCP2 protein varyantlarının kantitatif tespiti için yeni bir yaklaşımdır. Burada, 96-iyi formatta MeCP2-ECLIA için protokol açıklanmıştır.
Abstract
ECLIA, endojen ve rekombinant protein miktarlarını 96-iyi formatta ölçebilen çok yönlü bir yöntemdir. ECLIA verimliliğini göstermek için bu analiz, fare beyin dokusundaki MeCP2'nin içsel düzeylerini ve insan dermal fibroblastlarında TAT-MeCP2 alımını analiz etmek için kullanılmıştır. MeCP2-ECLIA, düşük intra ve inter-assay hatası ile son derece doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üretir. Özetle, yüksek iş itme ekranlarında kullanılabilen MeCP2 protein varyantlarının değerlendirilmesi için nicel bir yöntem geliştirdik.
Introduction
Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), elektrokimyasal olarak uyarıldığında lüminesans yayan etiketleri kullanan bir işleme dayanmaktadır. Bu temel sanayi ve akademik araştırma, gıda endüstrisi nin yanı sıra klinik tanı1biyolojik analitlerin kantitatif tespiti için geniş bir uygulama tekniğidir. Genellikle karbon mürekkep elektrotlu tek kullanımlık 96 kuyuluk bir plaka kullanılır. Bu elektrotlar immünoassay için katı faz taşıyıcı olarak hareket. İkincil bir antikor elektromilüminesans etikete konjuge edilir ve sisteme elektrik uygulandığında kimyasal etiketin ışık salınımı tetiklenir. Ultra düşük gürültü şarj lı bir cihaz (CCD) ışık yoğunluğunu kaydeder ve bu durum, yakalama antikoruna bağlı antijenle doğru orantılıdır ve bu da numunenin hedeflenen analitinin sayısallaştırılmasıile sonuçlanır2. Enzime bağlı immünosorbent çıktısı (ELISA) ile karşılaştırıldığında, ECLIA daha yüksek duyarlılık ve tekrarlanabilirlik yanı sıra daha iyi otomasyon vetutarlılık3 sunduğu için avantajlı olarak kabul edilir.
Burada insan ve mürin kökenli örneklerde metil-CpG bağlayıcı protein 2 (MeCP2) düzeyleri nin yanı sıra yeni geliştirilen ECLIA sistemini kullanarak rekombinant proteinin farklı varyantlarını analiz ettik. MecP2, metillenmiş DNA dizileri ile etkileşime girdiği bilinen X'e bağlı bir nükleik asit bağlayıcı proteindir. Bu protein gen ekspresyonunun düzenlenmesinde yer almıştır4,5. Bu proteini kodlayan gendeki fonksiyon kaybı mutasyonları, ciddi bir nörogelişimsel bozukluk olan Rett sendromuna (RTT) neden olan başlıca suçlulardır6. Başka bir MeCP2 ile ilgili bozukluk, MECP2 çoğaltma sendromu, aynı zamanda RTT ile örtüşebilir nörolojik belirtilere yol açar7. Özellikle, erkekler çoğunlukla MECP2 çoğaltma sendromu6,,7etkilenir ken özellikle, kadınlar çoğunlukla RTT etkilenir.
Bu bozukluklar merkezi sinir sisteminde (CNS) sırasıyla yetersiz veya fazla MeCP2 düzeyleri ile ilişkilidir. Bu nedenle, CNS artan MeCP2 düzeylerini içeren RTT için tedavi seçenekleri MeCP27aşırı ile ilişkili zararlı etkileri önlemek gerekir. Bu nedenle, ECLIA sistemi tarafından sağlanan MeCP2 protein düzeylerinin son derece hassas ve doğru bir niceliği, RTT'nin ilerlemesi ve MECP2 tekrar sendromu araştırması için çok önemlidir. İnsan hücre hatları ve fare doku örneklerinden endojen ve eksojen MeCP2 düzeylerinin kesin ölçümleri ve insan MeCP2 izoform B 'den (izoform e1 olarak da bilinir) oluşan rekombinant protein ve kan-beyin bariyerini aşma potansiyeline sahip minimal N-terminal HIV-TAT transdüksiyon etki alanı (TAT-MeCP2) bu çalışmada8,sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Araştırma amaçlı cilt biyopsisi alımı için onay Westmead, Avustralya Çocuk Hastanesi İnsan Araştırma Etik Komitesi'nden alındı. Hayvan deneyleri için onay, yerel hayvan refahı yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilen Avusturya Federal Bilim, Araştırma ve Ekonomi Bakanlığı'ndan alındı (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
NOT: ECLIA sisteminin prensibi Şekil 1'degösterilmiştir.
1. Antikor seçimi
- Çeşitli MeCP2 antikorları bir dizi için sinyal-gürültü oranı değerlendirmek ve birincil fare monoklonal MeCP2 antikor kombinasyonu içinde en iyi sinyal gücü ve en yüksek özgüllük belirlemek (klon Mec-168) ve tavşan poliklonal MeCP2 algılama antikor (özel yapılmış). İkincil antikor için, aynı zamanda deneysel olarak doğrulanmış bir sisteme özgü antikor(Malzeme Tablosu)kullanın.
NOT: Tablo 1, MeCP2-ECLIA gelişimi sırasında doğrulanmış tüm antikorların ve test edilmiş seyreltme aralıklarına genel bir bakış sunar.
| Işlev | Adı | Klon | Seyreltme |
| Birincil | Fare, MeCP2 karşıtı | Mec-168 | 1:500−1:10.000 |
| Birincil | Fare, MeCP2 karşıtı | 4B6 | 1:250−1:4,000 |
| Birincil | Fare, MeCP2 karşıtı | Erkekler-8 | 1:500−1:4,000 |
| Birincil | Fare, MeCP2 karşıtı | 1B11 | 1:500−1:4,000 |
| Birincil | Tavşan, anti-MeCP2 | D4F3 | 1:500−1:4,000 |
| Ikincil | Tavşan, anti-MeCP2 | Poliklonal | 1:2.000−1:20.000 |
| Ikincil | Tavşan, anti-MeCP2 | Poliklonal | 1:2.000−1:20.000 |
| Algılama | SULFO-TAG anti-tavşan etiketli | Poliklonal | 1:500−1:1.000 |
Tablo 1: Antikorlar ve kullanılan çalışma seyreltmeleri listesi.
- Alternatif olarak, geleneksel ELISA ile iyi çalışan mecp2 antikorlarının her bir çiftini kullanın.
2. TAT-MeCP2 füzyon proteini ile HDF tedavisi
NOT: TAT-MeCP2, Escherichia coli ile rekombinant olarak ifade edilmiş ve daha önce8'de açıklandığı gibi standart kromatografik teknikler kullanılarak saflaştırılmış ve -80 °C'de depolanmıştır.
- Plaka 1 x 106 insan dermal fibroblast (HDF) hücreleri 100 mm tabaklarda ve hücreleri bir gecede 37 °C'de %5 CO2 ile %90 biraraya gelene kadar büyütür.
- Bir şişe TAT-MeCP2 füzyon proteinini çıkar. Buz üzerinde çözülün ve yavaşça karıştırın.
- TAT-MeCP2'yi 50 mL HDF kültür medyasında 500 nM'lik son konsantrasyona seyreltin.
- Ortamı 100 mm'lik tabaklardan çıkarın ve hücreleri 37 °C'de 500 nM TAT-MeCP2 ile 24 saate kadar çeşitli kuluçka süreleri için kuluçkaya yatırın.
- TAT-MeCP2 çözeltisini hücrelerden çıkarın. Hücreleri önceden ısıtılmış Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile 2 kat yıkayın.
- Hücreleri 2 mL %0,05 tripsin-EDTA çözeltisi ile 37 °C10'da5 dk tedavi edin.
- Tripsini inaktive etmek ve hücreleri 15 mL tüplerde toplamak için 6 mL HDF kültür ortamı ekleyin.
- Hücreyi 500 x g'da oda sıcaklığında 5 dk santrifüj ile peletleyin.
- Supernatant çıkarın ve buz gibi DPBS ile hücreleri 2x yıkayın. Peleti buz üzerinde saklayın ve numune hazırlamaya devam edin.
3. Örnek hazırlama
- HDF lysates
- Suzuki ve ark.11'egöre sitoplazmik ve nükleer hücre altı bölmelerine subsellüler fraksiyonu için REAP yöntemini kullanarak MeCP2'nin en yüksek protein düzeylerini belirleyin. Kesirlendirmeyi deney başına en fazla altı örnekle sınırlandırın.
- Fare beyin lysates
- Her hipotonik lisis reaktifi ve ekstraksiyon tamponunun 100 mL'sini hazırlayın.
- Hipotonik lisis reaktifi için 10 mM HEPES, 1,5 mM magnezyum klorür ve 10 mM potasyum klorür karıştırın.
- Ekstraksiyon tamponu için, iyi karıştırın 20 mM HEPES, 1.5 mM magnezyum klorür, 0.42 M sodyum klorür, 0.2 mM EDTA, ve 25% (v / v) gliserol.
- Her iki arabellekteki pH'ı 7,9 olarak ayarlayın.
- Her iki tampona da 1 mM dithiothreitol (DTT) ve 1x proteaz inhibitör kokteyli ekleyin. Kullanmadan önce buz üzerinde soğutun.
- Toplam fare beyninin 100 mg'ını askıya alın (zorlanma: C57BL/6J, yabani tip erkek ve dişi ve B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous erkek ve heterozigot kadın; yaş: 4−8 haftalık) 1 mL buz gibi hipotonik lisis reaktifinde.
- Homogenizer A (gevşek, büyük açıklık için) ve B (sıkı, küçük açıklık için), sırasıyla 15 vuruş ile önceden soğutulmuş dounce tüm cam doku homogenizer ile beyni homojenize.
- Homojenize edilmiş hücreleri temiz bir tüpe ve 4 °C'de 20 dk için 10.000 x g'de santrifüje aktarın. Supernatant atın (veya daha fazla kullanım için sitoplazmatik fraksiyonu olarak tutun).
- 100 mg başlangıç malzemesi başına 140 μL çıkarma tamponu içinde peleti yeniden askıya alın. Tüpü önceden soğutulmuş bir termoblok içine yerleştirin ve 4 °C'de 30 dk hafifçe karıştırın.
- Tüpü 16.000 g'da 10 dakika 4 °C'de santrifüj edin. Supernatant'ı (yani nükleer fraksiyonu) yeni bir önceden soğutulmuş tüpe aktarın ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
NOT: Fare beyni ve HDF'lerden elde edilen lysatların protein konsantrasyonu BCA protein teşbiile değerlendirilebilir.
- Her hipotonik lisis reaktifi ve ekstraksiyon tamponunun 100 mL'sini hazırlayın.
4. MeCP2-ECLIA protokolü
- Yıkama çözeltisinin hazırlanması, tampon ve artüytümün engellenmesi (gün 1)
- PBS çözeltisinde %0,05 Ara 20 hazırlamak için 500 ila 1 L PBS arasında 500 l'lik PBS ekleyin, şiddetle karıştırın ve "yıkama solüsyonu" olarak etiketlendirin.
NOT: Sadece taze hazırlanmış yıkama tamponu kullanıldığından emin olun. - Fosfat tamponlu salinde (PBS) %3 bloker A(Malzeme Tablosu)blokaj çözeltisi hazırlayın. Hafifçe karıştırarak karıştırın, sterilize filtre ve en fazla iki hafta boyunca kullanıma kadar buzdolabında saklayın.
- 10 mL PBS'ye 5 mL engelleme çözeltisi ekleyerek, atojen dilüent çözeltisi (PBS'de %1 bloker A) hazırlayın.
- PBS çözeltisinde %0,05 Ara 20 hazırlamak için 500 ila 1 L PBS arasında 500 l'lik PBS ekleyin, şiddetle karıştırın ve "yıkama solüsyonu" olarak etiketlendirin.
- Yüksek bağlama plakalarının kaplaması
- 96-iyi çok dizili tek nokta yüksek bağlama plaka sı.
NOT: Yüksek bağlama plakaları daha büyük bir bağlama kapasitesine ve dolayısıyla hidrofobik yüzeylere sahip standart plakalardan daha büyük bir dinamik aralıktadır. - Monoklonal fare anti-MeCP2 antikorunu buz üzerinde eritin ve antikordan 0.67 μL'lik pbs (PBS'de 1:6.000 antikor seyreltme) ile karıştırın. Girdap iyi karıştırmak ve "kaplama çözeltisi" olarak tüp etiket antikor çözeltisi.
- Çok kanallı bir pipettor kullanarak her kuyunun alt köşesinde 25 μL kaplama çözeltisi dikkatlice dağıtın; buna çözelti kaplama yöntemi denir. Kaplama çözeltisinin her kuyunun altını kapladığından emin olmak için her iki taraftaki 96 kuyulu tablaya hafifçe dokunun.
- Plakayı yapışkan folyo ile kapatın ve tabağı buzdolabında gece leme (12−16 saat) 4 °C'de inküleyin.
- 96-iyi çok dizili tek nokta yüksek bağlama plaka sı.
- Engelleme (gün 2)
- Buzdolabından tabağı çıkarın ve folyo çıkarın.
- Antikor kaplama çözeltisini atık sepetine basarak çıkarın ve kuyulardan tüm kaplama çözümlerini çıkarmak için plakayı kağıt havluya dokunun.
- Kuyu başına 125 μL engelleme çözeltisi ekleyin. Plakayı tekrar kapatın ve yörüngesel bir mikroplaka çalkalayıcısının üzerine yerleştirin.
- 800 rpm sürekli sallayarak oda sıcaklığında 90 dakika boyunca plaka kuluçka.
- Standartların ve numunelerin hazırlıkları
- Kuluçka süresi boyunca MeCP2 ve/veya TAT-MeCP2 protein standartlarını ve çeşitli numuneleri hazırlayın.
NOT: Standart seyreltme için kullanılan lysis tamponu, analiz edilen numunelerde kullanılanla aynı olmalıdır. - Bir şişe MePC2 ve/veya TAT-MeCP2 protein stok çözeltisi (250 μg/mL), fare beyin lisatları ve -80 °C'den HDF lysates alın. Onları buzda erit.
- Standart stok çözeltisini (MeCP2 ve/veya TAT-MeCP2) temiz tüplerde Tablo 2'yegöre seyreltin.
- Örnekleri lysis tamponunda şu şekilde seyreltin: 25 μL lysis tamponu başına 1−20 μg fare beyni lysate ve 25 μL lysis tamponbaşına 0,25−1 g HDF lysate. Her numunenin yeterli hacimli hazırlayın triplicate analizi yürütmek için.
- Kuluçka süresi boyunca MeCP2 ve/veya TAT-MeCP2 protein standartlarını ve çeşitli numuneleri hazırlayın.
| Standart | Konsantrasyon | Seyreltme |
| Standart 1 | 1.800 ng/mL | 1.08 μL Standart stok çözeltisi + 148,92 μL Lysis tampon |
| Standart 2 | 600 ng/mL | 50 μL Standart 1 + 100 μL Lysis tampon |
| Standart 3 | 200 ng/mL | 50 μL Standart 2 + 100 μL Lysis tampon |
| Standart 4 | 66,67 ng/mL | 50 μL Standart 3 + 100 μL Lysis tampon |
| Standart 5 | 22.22 ng/mL | 50 μL Standart 4 + 100 μL Lysis tampon |
| Standart 6 | 7.41 ng/mL | 50 μL Standart 5 + 100 μL Lysis tampon |
| Standart 7 | 2.47 ng/mL | 50 μL Standart 6 + 100 μL Lysis tampon |
| Standart 8 | 0.82 ng/mL | 50 μL Standart 7 + 100 μL Lysis tampon |
| Standart 9 | 0.27 ng/mL | 50 μL Standart 8 + 100 μL Lysis tampon |
| Standart 10 | 0 ng/mL | 150 μL Lysis tamponu |
Tablo 2: Standart seri 0 ile 1.800 ng/mL arasındadır.
- Numunelerin ve standart çözümlerin eklenmesi
- Atık sepetine basarak engelleme çözeltisini çıkarın ve kuyulardan tüm engelleme çözümlerini çıkarmak için plakayı kağıt havluya dokunun.
- Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak plakayı 3x 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkayın.
- Tek bir kanallı pipet kullanarak kuyunun alt köşesine 25 ul standart ve numune ekleyin.
- Plakayı kapatın ve 800 rpm'de sürekli sallayarak oda sıcaklığında 4 saat boyunca plakayı kuluçkaya yatırın.
- Etiketsiz algılama antikor
- Çok klonal tavşan anti-MeCP2 antikorbuz üzerinde eritin. Antikor 1:6,000'i tazyikli seyreltme çözeltisi.
- Atık sepetine basarak standartları ve numuneleri çıkarın ve plakayı kağıt havluya dokunun.
- Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak plakayı 3x 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkayın.
- Çok kanallı pipettor ile her kuyuya 25 μL etiketsiz algılama antikorekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında 800 rpm'de sürekli sallayarak 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Spesifik konjuge antikor
- Buzdolabından belirli ikincil antikor(Malzeme Tablosu)alın ve buz üzerine yerleştirin. Antikor 1:666.67'yi tazyik seyreltme çözeltisinde seyreltin ve hafifçe karıştırın.
- Atık sepetine basarak ücretsiz etiketsiz ikincil antikor çıkarın ve bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun.
- Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak plakayı 3x 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkayın.
- Çok kanallı pipettor ile her kuyuya 25°L spesifik konjuge antikor(Malzeme Tablosu)ekleyin. Oda sıcaklığında 800 rpm sürekli sallayarak 1 saat için plaka ve kuluçka mühür.
- Plakayı okuma
- Ücretsiz konjuge antikor(Tablo Malzemeler)atık sepeti içine flicking ve bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun çıkarın.
- Plakayı 150 μL yıkama çözeltisi ile 3x yıkayın.
- 150 μL 1x Tris tabanlı Altın okuma tamponu ekleyin(Tablo Malzemeler)plaka ışık üretimi için bir co-reatoant olarak tripropylamin içeren sürfaktan ile. Ters pipetleme teknikleri kullanarak herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.
- Plakayı mikro plaka algılama platformuna(Malzeme Tablosu)yerleştirin ve hemen ölçüme başlayın. 96-iyi plaka edinimi için ayarları kullanın.
- Elektromilüminesans sinyallerini, yerleşik bir CCD kamera ile elektrokemilüminesans algılama sisteminde(Malzeme Tablosu)yakalayın ve göreceli ışık birimlerine (RLU) karşılık gelen ve ışığın yoğunluğuyla doğru orantılı olan sinyal sayılarını kaydedin.
NOT: Elektrokimyasal stimülasyon üzerine karbon elektrota bağlanan rutenyum etiketi 620 nm'de parlak ışık yayır. Alet eşliğinde yazılım(Malzeme Tablosu)ile verileri analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ECLIA sisteminin prensibi Şekil 1'deaçıklanmıştır. İki MeCP2 varyantı için standart eğriler Şekil 2'degösterilmiştir. Çok çeşitli konsantrasyonlarda (1−1.800 ng/mL) doğru niceleme mümkün oldu. Şekil 3'tefare beyni ve HDF'lerden elde edilen LYSAt'ların MeCP2 düzeyleri analiz edildi. Beyinde mecp2 ekspresyonu heterozigot, yabani tip ve nakavt farelerden karşılaştırıldı, Şekil 3B'de ECLIA kullanılarak MECP2 eksikliği olan insan fibroblastlarında (c.806delG) MeCP2 proteini saptanmadı. MECP2-eksik hücre hattı (c.806delG) ile TAT-MeCP2 alımı da zaman içinde araştırıldı(Şekil 4). Son olarak, tablo 3'tegösterildiği gibi inter-ve intra-assay hassasiyeti gösterilmiştir.
Şekil 1: MeCP2 elektrokemilüminesans şeması. Bu rakam www.meso-scale.com uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Birden fazla ölçümde insan MeCP2'den oluşturulan MeCP2 standart eğrisi. Boş un üzerinde 2,5 standart sapma (SD) olarak tanımlanan alt algılama sınırı (LLOD) 1.00 ng/mL'dir. Rekombinant insan MeCP2 (Abnova) doğru r2 = 0,996 ile 1.00 ng /mL (LLOD) 1.800 ng/ mL (algılama üst sınırı [ULOD]) arasında bir aralık ta ölçülebilir. Hata çubukları n = 3 standart hatatemsil. Şekil Steinkellner ve ark.8değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fare beyni ve HDF'lerde MeCP2 düzeyleri. (A) MeCP2-protein düzeyleri beyinde heterozigot (gri, HET) ve dişi yabani fareler (siyah, yabani tip) (n = 4) ve bir Mecp2-nakavtfare (RTT) ile ölçüldü; (B) RtT sendromuiçin model olarak neonatal ensefalopatisi olan bir erkek hastadan elde edilen MeCP2 eksikliği eksikliği fibroblast hücre hattından (c.806delG) hücre lisatları insanlarda MeCP2 protein düzeylerini ve sağlıklı bir kontrol (siyah) değerlendirmek için yapılmıştır. Sunulan veriler triplicate kuyuların ± SD ortalamasıdır (n = 3). Mutant hücre hatlarında immünfloresans veya ECLIA kullanılarak mecp2 proteini saptanmadı (tespit aralığının altında), TAT-füzyon proteinleriyle daha fazla alım çalışmaları için son derece hassas bir sistem olduğunu gösterdi. Bu rakam Steinkellner ve ark.8'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: TAT-MeCP2'nin zamana bağlı alımı. C.806delG HDF'lerdeki meCP2 nükleer fraksiyonları 500 nM rekombinant TAT-MeCP2 füzyon proteini ile tedavi edildi. Analiz MeCP2-ECLIA ile yapıldı. Öngörülen zaman noktalarında hücreler DPBS ile yıkandı ve hücre dışı tat-MeCP2'yi ortadan kaldırmak için 5 dk için %0.05 tripsin-EDTA ile inkübe edildi. Trypsinizasyon serum ile ortam eklenerek durduruldu. Hücre süspansiyonu 5 dk için 500 x g olarak santrifüj edildi. Hücre peletinin 2x buz gibi DPBS ile yıkanmasından sonra, örnek protokol bölümünde açıklandığı gibi nükleer fraksiyonun çıkarılması için hazırlanmıştır. Bu rakam Steinkellner ve ark.8'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| İç ASSAY | INTER ASSAY | ||||||||||
| ng MeCP2 başına mL protein | ng MeCP2 başına mL protein | ||||||||||
| Peki 1 | Peki 2 | Peki 3 | Demek | SDa | SEMb | %CVc | Demek | SDa | SEMb | %CVc | |
| İnsan fibroblastları | 6.42 | 6.30 | 6.45 | 6.39 | 0.08 | 0.05 | 1.24 | 6.61 | 0.64 | 0.37 | 9.71 |
| Fare beyin lysate | 9.92 | 10.16 | 10.36 | 10.14 | 0.22 | 0.13 | 2.17 | 11.22 | 0.94 | 0.54 | 8.33 |
| bir Standart Sapma, bStandart Hata Ortalaması, cDeğişim Katsayısı | |||||||||||
Tablo 3: Üst üste üç gün boyunca HDF ve wildtype fare beyin lysates inter-teşbibialıntayini. Hücre lisatının 1−10 μg proteini başına uygulandı. bir SD, standart sapma; b SEM, standart hata ortalaması; c CV, değişim katsayısı. Bu tablo Steinkellner ve ark.8'dendeğiştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endojen MeCP2, rekombinant MeCP2 ve TAT-MeCP2 düzeylerini ölçmek için 96 kuyulu bir eclia plaka geliştirilmiştir. Bu MeCP2 protein fonksiyonukaybı RTT sendromu yol açtığı gösterilmiştir6, hangi tedavi şu anda semptom yönetimi ve fizik tedavi ile sınırlıdır. Bir umut verici tedavi cadde sözde protein replasman tedavisi, MeCP2 düzeyleri kendi ihtiyaç duydukları konsantrasyon12kadar titrated olabilir12 ,13,14,15. TAT-füzyon proteinlerinin kan-beyin bariyerini geçme potansiyeli son yirmi yılda başarılı olduğu kanıtlanmıştır12,13,14,15. Bu nedenle, MeCP2 teslimatı için bu yöntem protein replasman tedavisi uygulaması bağlamında yararlı olabilir. TAT-füzyon proteinlerinin ve diğer tedavilerin MeCP2 protein düzeylerini geri getirme potansiyelini değerlendirmek için, bunları ölçebilecek verimli ve uygun fiyatlı bir analiz geliştirmek son derece önemlidir. Bu çalışmada açıklanan analiz, ECLIA, doğru yanı sıra tutarlı, olumlu intra-ve inter-assay değerleri ile MeCP2 düzeylerini belirlemek mümkün(Tablo 3).
Aşağıdaki MeCP2-ECLIA protokolü nde fare beyin lisatları ve HDF'ler ilgi hücreleri olarak kullanılmıştır. Ancak, bu protokol en az insan ve murine kökenli diğer tüm hücre tipleri ile kullanılabilir. Ayrıca, HDF'ler çeşitli MeCP2 protein çeşitlerini ölçmek için bu talın yeteneğini göstermek için TAT-MePC2 füzyon proteini ile tedavi edildi. Numune hazırlama sırasında, DTT veya β-mercaptoetanol gibi lysis tamponundaki azaltıcı ajanların önlenmesi veya en aza indirilmesi tekniğin verimliliğini korumak için çok önemlidir. Bu yöntemde ek kritik adımlar bir fare anti-MeCP2 antikor ile plaka kaplama içerir, plaka engelleme, ve örnek toplama, bir tavşan anti-MeCP2 antikor ile 4 saat kuluçka izledi. Belirli bir ikincil antikor(Malzeme Tablosu)ile sonraki kuluçka ve lüminesans reaksiyonu gerçekleşmesi için gerekli reaktiflerin eklenmesi, bu işlemin son önemli adımlarını oluşturmaktadır.
ECLIA performansını optimize etmek için aşağıdaki adımlar atılabilir. Bu türetme için sinyal için maksimum çıkış bir milyon sayısı geçmemelidir. Sıvının elektrotun ötesine yayılmasını önlemek için, kaplama çözeltisini kuyuya sokmak için nokta kaplama adı verilen bir teknik kullanılabilir. Bu teknik yüksek hassasiyetli pipetleme veya pipet robotu kullanımını gerektirir. Buna ek olarak, çeşitli antikor konsantrasyonları test hem test özgüllüğünü artırmak ve arka plan sinyalini azaltmak için yararlı olabilir. İkinci sini ele almak için, çeşitli engelleyiciler (MSD, Blocker D-M gibi) %0,1'lik son konsantrasyoniçin de kullanılabilir. Sinyal kalitesini optimize etmek için, çeşitli kuluçka sürelerini (300 rpm veya üzerinde sallayarak) test önerilir. Son olarak, serum, plazma, idrar veya beyin-omurilik sıvısı gibi belirli ortamlarda iyileşme ve seyreltme doğrusallığı artırmak için, birkaç seyreltici test edilebilir.
Yarı-kantitatif batı blot ve ticari olarak kullanılabilir MeCP2-ELISA normalde MeCP2 protein düzeylerini incelemek için kullanılır. ELISA'nın arkasındaki çalışma prensibi, eklia'mızınkine benzer ve önemli fark algılama modudur. Bu yöntemlerle karşılaştırıldığında, MeCP2-ECLIA daha hızlı ve daha kullanışlıdır. ECLIA wildtype, heterozigot ve Mecp2-nakavt fare beyin örnekleri(Şekil 3A)için analiz etmek için kullanıldı ve bulgular batı lekeleme ile elde edilen aynı örneklerden MeCP2 miktarları ile karşılaştırıldığında (veriler gösterilmedi). Eclia tarafından ölçülen kadın wildtype ve heterozigot fare beyin örneklerinin MeCP2 düzeylerinde belirgin bir fark gözlendi ve bu örnekler batı lekeleri ile istatistiksel olarak anlamlı olarak saptanmadı. Bu yüksek ECLIA titreşme doğruluğu, MeCP2 protein düzeylerini yükseltebilecek yeni bileşiklerin aranmasında önemli olabilir.
Buna ek olarak, MeCP2-ECLIA MeCP2-ELISA muadili daha az maliyetlidir ve 1 ng/mL ile 1.800 ng/mL (R2 = 0.996) arası yüksek dinamik aralığı nedeniyle düşük MeCP2 miktarları içeren numunelerle kullanılabilir. Ticari olarak kullanılabilen tüm ELISA kitleri ile karşılaştırıldığında, ECLIA bunları büyük ölçüde geride bırakarak daha iyi performans gösterir. ECLIA, 0.312−20 ng/mL (fare, Cloud-Clone Corp.) ve 0.156−10 ng/mL (insan, Bulut-Klon Corp.) olduğu tespit edilen ELISA muadillerine göre 1−1.800 ng/mL arasında daha elverişli bir dinamik aralıkta dır. Daha düşük bir algılama sınırının açık bir tanımının bulunmaması nedeniyle, bu iki tahlil arasında doğrudan karşılaştırma bu çalışmanın amaçları için mümkün değildir.
Özetle, MeCP2-ECLIA'nın MeCP2 tutarlarını in vivo ve in vitro olarak doğru bir şekilde belirleyebileceği gösterilmiştir. RTT etkilenen hastaların nöronların MeCP2 protein düzeyleri doldurmak gerçekten umut verici bir tedavi cadde iken, aşırı MeCP2 varlığı da ciddi nörolojik belirtilere neden olabilir, MECP2 çoğaltma sendromu ile ilişkili16,17,18. Bu nedenle, bu yöntem protein replasman tedavisi sırasında ekseksen olarak tanıtılan MeCP2 miktarını optimize etmek ayrılmaz bir öneme sahip olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Eclia aletine verdiği destekten dolayı Dr. Brigitte Sturm'a çok müteşekkiriz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H.
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
