エレクトロケミ発光免疫測定法(ECLIA)は、内因性および外因的に適用されたMeCP2タンパク質変異体の定量的検出のための新しいアプローチであり、幅広い作業範囲での低いイントラおよびインターアッセイ誤差で定量的、正確、再現性の高い測定を行います。ここでは、96 ウェル形式での MeCP2-ECLIA のプロトコルについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
ECLIAは、96ウェル形式で内因性および組換えタンパク質量を定量化することができる汎用性の高い方法です。ECLIAの効率を実証するために、このアッセイは、マウス脳組織におけるMeCP2の本質的なレベルとヒト真皮線維芽細胞におけるTAT-MeCP2の取り込みの分析に使用された。MeCP2-ECLIAは、低いイントラおよびインターアッセイ誤差で、高精度で再現性の高い測定を行います。要約すると、高スループットスクリーンで利用できるMeCP2タンパク質変異体の定量的手法を開発しました。
概要
エレクトロケミフルミネッセンスイムノアッセイ(ECLIA)は、電気化学的に刺激された際に発光を放出するように設計されたラベルを利用するプロセスに基づいています。これは、基礎産業および学術研究、食品産業、ならびに臨床診断における生物学的分析物の定量的検出のための広く適用可能な技術である1.一般的に、カーボンインク電極を備えた使い捨て可能な96ウェルプレートが使用されます。これらの電極は、免疫測定のための固相担体として機能する。二次抗体は電気化学発光ラベルに結合され、電気がシステムに適用されると、化学ラベルの発光がトリガされます。超低雑音電荷結合装置(CCD)は、捕捉抗体に結合した抗原に直接比例する光強度を記録し、その結果、試料2の標的検体の定量化を行う。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)と比較して、ECLIAは高感度、再現性、ならびにより優れた自動化および一貫性を提供するので有利であると考えられる3。
ここでは、新開発のECLIAシステムを用いて、ヒトおよびマウス由来のサンプルおよび組換えタンパク質の異なる変異体におけるメチルCpG結合タンパク質2(MeCP2)レベルを分析した。MecP2は、メチル化DNA配列と相互作用することが知られているX結合型核酸結合タンパク質である。このタンパク質は、遺伝子発現
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プロトコル
研究目的での皮膚生検調達の承認は、オーストラリアのウェストミードにある小児病院の人間研究倫理委員会から得られました。動物実験の同意は、オーストリア連邦科学研究経済省から取得され、地元の動物福祉規制に従って実施されました(GZ:66.009/0218-II/3b/2015)。
注: ECLIA システムの原理は図1に示されています。
1. 抗体の選択
- 様々なMeCP2抗体の範囲のシグナル対雑音比を評価し、一次マウスモノクローナルMeCP2抗体(クローンMec-168)とウサギポリクローナルMeCP2検出抗体(カスタムメイド)の組み合わせ内で最良のシグナル強度と最高特異性を同定します。二次抗体については、実験的に検証されたシステム特異的抗体(材料表)を用いた。
注:表 1は、MeCP2-ECLIA の開発中に検証されたすべての抗体とその試験希釈範囲の概要を示しています。
| 関数 |
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結果
ECLIA システムの原理は図 1に説明されています。図2に、2 つの MeCP2 バリアントの標準曲線を示します。幅広い濃度(1-1,800 ng/mL)で正確な定量が可能でした。図3では、マウス脳およびHDFに由来するライセートのMeCP2レベルを分析した。図3Aでは、ヘテロ接合、野生型およびノックアウトマウス由来の脳核ライゼートにおけるMeCP2発現を比較したが、図3BではECLIAを用いたMECP2欠損ヒト線維芽細胞(c.806delG)ではMeCP2タンパク質が検出されなかった。MECP2欠損セルライン(c.806delG)によるTAT-MeCP2の取り込みも経時に調査された(図4)。最後に、表3に示すように、相互アッセイとイントラアッセイ.......
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ディスカッション
内因性MeCP2、組換えMeCP2およびTAT-MeCP2レベルを測定するために、96ウェルプレートECLIAが開発されました。MeCP2タンパク質機能の喪失は、現在、治療が症状管理および理学療法に限定されているRTT症候群6につながることが示されている。1つの有望な治療手段は、MeCP2レベルが必要な,濃度12、13、14、15,13まで滴定することができる、いわゆるタンパク質補充療法,14です。TAT融合タンパク質が血液脳関門を越える可能性は、過去20年間で成功することが証明されています12,,13,,14,,
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
ブリジット・シュトゥルム博士がECLIAの楽器を支えてくれたことにとても感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1,4-ジチオスレイトール (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | 低張溶解試薬、抽出バッファー |
| Bio-Rad Protein Assay Dye 試薬濃縮 | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | サンプル調製 |
| 検出 AB SULFO-TAG標識抗ウサギ | メソスケール診断 | R32AB-1 | 抗体 |
| 検出ワークベンチ 4.0 | メソスケール検出 | ソフトウェア | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | サンプル調製 |
| ダルベッコs PBS (滅菌) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | サンプル調製、洗浄液、コーティング液 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 抽出バッファー |
| ウシ胎児血清 | Sigma-Aldrich | F9665 | サンプル調製 |
| グリセロール | Sigma-Aldrich | G2025 | 抽出バッファー |
| ゴールドリードバッファー T (1x) 界面活性剤配合 | メソスケール診断 | R92TG | MeCP2 ECLIA プロトコル |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | 低張溶解試薬、抽出バッファー |
| KIMBLE Dounce ティッシュグラインダーセット | Sigma-Aldrich | D8938 | サンプル調製 |
| ラボラトリーシェーカー、ロッキングモーション (低速) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA プロトコル |
| 塩化マグネシウム六水和物 (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | 低張溶解試薬、抽出バッファー |
| MeCP2 (ヒト) 組換えタンパク質 (P01) | アブノバコーポレーション | H00004204-P01 | 細胞治療 |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | プレートシーリング用 | |
| MSB1001モノクローナル抗MeCP2、マウス、クローンMec-168、精製免疫グロブリン | Sigma-Aldrich | M6818-100ULで産生。RRID:AB_262075 | 、コーティング溶液 |
| MSDブロッカーA | メソスケール診断 | R93BA-4 | ロッカー |
| MSD SECTOR イメージャー 2400 | メソスケール診断 | I30AA-0 | MeCP2 ECLIAプロトコル |
| マルチアレイ96ウェルプレート | メソスケール診断 | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIAプロトコル |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | ライフサイエンス社 | 15140122 | サンプル調製 |
| ポリクローナル抗MeCP2、ウサギ | Eurogentec S.A. | カスタムデザイン | 抗体 |
| 塩化カリウム(KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063;RRID:AB_10737296 | 抗体 |
| 初代ABマウス、抗MeCP2(4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1;RRID:AB_1842411 | 抗体 |
| 一次ABマウス、抗MeCP2(Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818;RRID:AB_262075 | 抗体 |
| 初代ABマウス、抗MeCP2(Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443;RRID:AB_477235 | 抗体 |
| 一次ABウサギ、抗MeCP2(D4F3) | 細胞シグナル伝達技術 | 3456S;RRID:AB_2143849 | |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル(100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction |
| Buffer Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | カスタム | 抗体 |
| 二次 AB, ウサギ, 抗 MeCP2 | メルク | 07-013 | 抗体 |
| 塩化ナトリウム (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | 抽出バッファー |
| SULFO-TAG 標識抗ウサギ抗体 (ヤギ) | メソスケール | 診断 W0015528S | 抗体 |
| TAT-MeCP2 融合タンパク質 | 社内生産 | 細胞治療 | |
| トリプシン EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | 細胞治療 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 洗浄液 |
参考文献
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electr....
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再版と許可
