Summary
여기에 제시된 것은 환경에서 직접 미생물 행동의 연구를 가능하게 하는 최근 개발된 미세 유체 장치인 시투 화학분석분석의 프로토콜이다.
Abstract
운동성 및 화학 요법과 같은 미생물 행동 (화학 적 그라데이션에 대한 응답으로 움직임을 변경하는 세포의 능력)은 세균 및 고고학 도메인에 걸쳐 널리 퍼져 있습니다. 화학 요법은 이기종 환경에서 상당한 자원 획득 이점을 초래할 수 있습니다. 또한 생지구화학적 사이클링과 같은 공생 상호 작용, 질병 및 글로벌 프로세스에서 중요한 역할을 합니다. 그러나, 현재 기술은 실험실에 화학 요법 연구를 제한하고 필드에 쉽게 적용되지 않습니다. 여기에 제시된 현장 화학 요법 분석(ISCA)의 배치를 위한 단계별 프로토콜이며, 이는 자연 환경에서 직접 미생물 화학요법의 강력한 심문을 가능하게 하는 장치이다. ISCA는 관심 있는 화학물질을 적재할 수 있는 20개의 웰 어레이로 구성된 미세 유체 장치입니다. 일단 수성 환경에 배치되면, 화학 물질은 우물밖으로 확산되어 미생물이 화학 요법을 통해 우물로 수영하여 감지하고 반응하는 농도 그라데이션을 만듭니다. 상기 웰 함량은 유동 세포측정을 통해 특정 화합물에 대한 화학 반응의 강도를 정량화하고, (2) 분리 및 배양 반응성 미생물을 정량화하고, (3) 분자 기술을 통해 반응하는 집단의 정체성과 게놈 잠재력을 특성화하는 데 사용될 수 있다. ISCA는 해양, 담수 및 토양 환경을 포함하여 수성 단계를 갖춘 모든 시스템에 배포할 수 있는 유연한 플랫폼입니다.
Introduction
다양한 미생물은 연골과 화학요법을 사용하여 영양 환경을 이용하거나, 호스트를 찾거나, 해로운 조건1,,2,,3을피한다. 이러한 미생물 행동은 차례로 화학 적변형의 비율에 영향을 미칠 수 있습니다 4 지상파, 담수, 해양 생태계에 걸쳐 공생 파트너십을 촉진2,,5.
화학 요법은 지난 60 년 동안 실험실 조건에서 광범위하게 연구되었습니다6. 화학을 연구하는 첫번째 정량적인 방법, 모세관 분석, 박테리아 6의 현탁액에 침지된 putative 화학요법제로 채워진 모세관관을 관련시킵니다6. 튜브 에서 화학 물질의 확산은 화학 적 그라데이션을 생성하고, 화학 박테리아는 튜브로 이동하여이 그라데이션에 반응7. 모세관 분석의 개발 이후, 오늘날에도 널리 사용되고 있는 다른 많은 기술은 점점 더 통제되는 물리적/화학적 조건 하에서 화학요법을 연구하기 위해 개발되었으며, 가장 최근에는 미세유체제 의 사용과 관련된8,,9,,10.
미세 유체는 고속 비디오 현미경 검사법과 함께 신중하게 제어된 그라데이션에 대응하여 단일 세포의 동작을 추적할 수 있습니다. 이러한 기술은 화학 요법에 대한 우리의 이해를 크게 향상했지만 실험실 사용으로 제한되었으며 환경 시스템의 현장 배치로 쉽게 변환되지 않습니다. 결과적으로, 자연 생태계 내에서 화학 요법을 사용 하 여 박테리아의 자연 커뮤니티의 용량 검사 되지 않았습니다.; 따라서, 화학 요법의 잠재적 인 생태학적 중요성의 현재 이해는 인공 실험실 조건과 실험실 배양 세균 분리의 제한된 수에 편향된다. 최근 개발 된 ISCA는 이러한 한계를 극복11.
ISCA는 모세관 분석의 일반적인 원리를 기반으로 합니다. 그러나 현대 의 미세 제조 기술을 사용하여 자연 환경에 대한 관심 화합물에 대한 화학 요법의 정량화를 위해 매우 복제되고 쉽게 배포 할 수있는 실험 플랫폼을 제공합니다. 또한 직접적인 격리 또는 분자 기술에 의한 화학적 미생물의 식별 및 특성화를 허용합니다. 첫 번째 작업 장치는 유리 및PDMS(11)로자체 제작 및 제작되었지만, 최신 사출 성형 버전은 고도로 표준화된 제조 절차를 사용하여 폴리카보네이트로 구성됩니다(최신 버전의 장치에 대한 관심으로 해당 작성자는 연락할 수 있음).
ISCA는 신용 카드 크기이며 5 x 4 웰 어레이에 분포된 20개의 우물로 구성되어 있으며, 각 우물은 작은 포트(직경 800 μm)에 의해 외부 수생 환경에 연결됩니다. 그림 1). 우물에 적재된 처제 화학물질은 항구를 통해 환경으로 확산되고, 항만을 통해 우물로 수영하여 화학물질 미생물이 반응한다. 자연 환경에서 ISCA 실험의 결과에 영향을 줄 수 있는 많은 요인이 발생할 수 있는 이 단계별 프로토콜은 새로운 사용자가 잠재적인 장애물을 극복하고 효과적인 배포를 용이하게 하는 데 도움이 됩니다.
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Protocol
결과를 최적화하기 위해 현장 실험 전에 섹션 1을 실행하는 것이 좋습니다.
1. 실험실 최적화
참고: 최적화 절차에 설명된 볼륨은 단일 ISCA(20개의 우물로 구성된)에 충분합니다.
- 관심있는 화학 물질의 준비
참고: 각 화학 요법에 대한 최적의 농도는 종종 현장 배치 전에 실험실 조건에서 결정되어야 합니다. 화학 농도 필드는 소스 (ISCA 잘)와의 거리와 함께 크기가 감소할 것이며, 이는 환경에서 미생물에 의해 경험되는 농도가 장치 내부에 존재하는 것보다 낮을 것임을 의미합니다. ISCA에서 사용하기에 가장 적합한 농도는 화학 요법의 확산 속도에 따라 달라집니다. 우물의 농도가 너무 낮으면 (미생물의 검출 한계에 가깝면) 양성 화학 요법이 관찰되지 않습니다. 반대로, 우물의 농도가 너무 높으면, 농도도 즉각적인 환경에서 높을 것이고 미생물 축적은 내부가 아닌 ISCA 우물 위에 일어날 것이다. 따라서, 희석 계열은 필드 배치를 위한 최적 농도를 결정하기 위하여 각 화합물에 대한 실험실 조건에서 수행되어야 한다. 이상적으로, 농도 범위는 또한 실험실 결과를 확인하기 위하여 현장에서 시험되어야 합니다.- 적절한 염농도를 함유하는 적합한 배지의 2.5L(예를 들어, 인산염 완충식염식염수[PBS] 또는 인공 해수)를 준비한다. 연동 또는 진공 펌프 및 오토클레이브를 사용하여 0.2 μm 필터로 매체를 필터링합니다.
- 멸균 배지의 1mL에 10mM의 화학요법제 용액을 준비한다. 0.2 μm 주사기 필터로 화학 요법용액을 필터링하여 입자와 잠재적인 오염 물질을 제거합니다.
참고: 이상적으로, 화학 요법 이외의 유기 화합물은 최종 용액에 존재해서는 안됩니다.
- 희석 계열별 농도 범위
- 여과된 화학섬유 스톡 용액을 10mM에서 100 μM까지(예:) 연재하여 희석시켰다.
참고: 농도 테스트당 최소 0.7mL 최종 부피가 필요합니다.
- 여과된 화학섬유 스톡 용액을 10mM에서 100 μM까지(예:) 연재하여 희석시켰다.
- ISCA 로드
- 여과된 화학 요법으로 1mL 주사기를 채우고 27 G 주사기에 연결합니다. 포트가 위쪽으로 향하는 ISCA를 잡고, 포트 위에 작은 물방울이 나타날 때까지 천천히 물질을 주입합니다.
참고: 1) 각 희석 또는 물질은 교차 오염을 방지하기 위해 별도의 주사기와 바늘로 주입되어야 합니다. 2) 이 작은 물방울은 항구 내에 기포가 갇히지 않도록 하여 미생물이 항구를 통해 이동하는 능력을 손상시킬 수 있기 때문에 중요합니다. 3) 추가 분석을 위해 적절한 최소 부피를 제공하기 위해 물질 또는 농도(5개의 우물)당 전체 행을 채우는 것이 좋습니다. 4) ISCA 당 한 행은 부정적인 제어 역할을해야하며 미생물이 일시 중단되는 필터링 된 매체로 채워야합니다. 이 치료는 ISCA 우물로 미생물에 의한 임의의 운동성의 효과를 차지하며 화학 요법을 포함하는 치료를 정상화하는 데 사용되어야합니다.
- 여과된 화학 요법으로 1mL 주사기를 채우고 27 G 주사기에 연결합니다. 포트가 위쪽으로 향하는 ISCA를 잡고, 포트 위에 작은 물방울이 나타날 때까지 천천히 물질을 주입합니다.
- 실험실에 배치
- 하룻밤 사이에, 1 % 해양 국물 (해양 박테리아) 또는 1 % 리소제니 국물 (LB, 담수 박테리아)로 농축 된 5 mL 배양을 배양하십시오.
참고: Motile 세균 분리 또는 자연 세균 지역 사회는 실험실 배포에 사용할 수 있습니다. - 실온(RT) 및 180rpm에서 12시간 동안 배양합니다. 12 h 후, 미생물 공동체가 현미경하에서 직접 관찰함으로써 motile있는지 확인하십시오.
- 1,500 x g에서 10분 동안 배양물을 회전시키고 적절한 매체(예: 여과된 바닷물, 여과된 담수)의 150mL에서 1/100을 재중단합니다.
- 200mL 용량 트레이의 평평한 표면에 양면 접착제 테이프 두 개를 놓습니다 (1 mL 팁 박스의 뚜껑은이 목적을 위해 이상적인 치수를 가지며 쉽게 자동화 될 수 있습니다). 하나의 ISCA를 위에 놓고 테이프에 안전하게 부착되도록 합니다. 50mL 세로지컬 파이펫을 사용하여 배치 트레이를 세균용 용액으로 천천히 채웁니다.
참고: ISCA가 약 1-2cm의 액체 아래에 잠길 때까지 트레이를 채웁니다. 여러 트레이를 사용하는 경우 모두 동일한 볼륨을 사용합니다. - ISCA를 1h로 배양하여 세균 화학 요법을 허용하십시오. 1 시간 후, 난류 흐름을 최소화하기 위해 50 mL 세로지피펫으로 매체를 매우 부드럽게 제거하십시오.
- 위쪽 면을 건드리지 않고 배포 트레이에서 ISCA를 검색합니다. 파이펫과 일회용 와이퍼를 사용하여 ISCA 표면에 남아 있는 액체를 제거합니다.
참고: 압력의 결과로 변경이 외부 환경으로부터 박테리아를 제거하거나 첨가할 수 있으므로 이 과정에서 포트를 만지지 않는 것이 중요하며, 이로 인해 세균밀도와 조성물을 잘 편향시킬 수 있다.
- 하룻밤 사이에, 1 % 해양 국물 (해양 박테리아) 또는 1 % 리소제니 국물 (LB, 담수 박테리아)로 농축 된 5 mL 배양을 배양하십시오.
- 샘플 검색
- ISCA를 아래쪽으로 향하고 있는 ISCA를 잡고, 1mL 주사기에 부착된 멸균 27 G 주사기 바늘을 사용하여 우물의 부피를 회수한다.
참고: 각 행(동일한 물질을 포함하는 경우)을 풀링하여 약 550μL의 작업 샘플을 제공할 수 있습니다. 이 샘플은 이후에 필요한 다운스트림 응용 프로그램에 따라 다른 튜브로 알리인용될 수 있습니다. - 유동세포측정(12)을가진 시료를 분석하여 각 화학요법 농도에 끌리는 박테리아의 수를 결정한다. 후속 필드 배포를 위해 화학 요법을 극대화하는 화학 요법의 농도를 선택하십시오.
- ISCA를 아래쪽으로 향하고 있는 ISCA를 잡고, 1mL 주사기에 부착된 멸균 27 G 주사기 바늘을 사용하여 우물의 부피를 회수한다.
2. 현장 배치 준비
참고: 유동 감쇠 인클로저(섹션 2)의 재료 준비 및 시공은 배포 전에 수행해야 합니다.
- 재료의 준비
- 표 1에나열된 모든 자료를 준비합니다.
참고: 하나의 ISCA에 대해 재료 수량이 제공됩니다.
- 표 1에나열된 모든 자료를 준비합니다.
- 유동 감쇠 인클로저의 구성 및 준비
참고: 유동 감쇠 인클로저는 ISCA에서 방출되는 화학 그라데이션의 확립을 방지하는 원치 않는 난류를 최소화합니다.- 3mm 아크릴 시트에서 레이저 커터로 배치 인클로저의 조각을 잘라냅니다.
참고: 조각에 대한 파일은 다음 링크를 사용하여 찾을 수 있습니다: - 아크릴 접착제를 사용하여 도 2에서 설명한 대로 레이저 컷 조각을 조립합니다.
참고 : 주의조각을 조립합니다. 구멍이나 정렬 불량은 배포 시 누출을 생성하여 데이터 품질에 직접적인 영향을 줄 수 있습니다. - 조립된 인클로저를 하룻밤 동안 건조시다.
- 바닷물로 인클로저를 씻으시다.
- 인클로저에 탈온된 물을 부어 잠재적 누출을 식별합니다. 아크릴 접착제를 더 추가하여 잠재적 누출 관절을 수정한 다음 2.2.3-2.2.5 단계를 반복합니다.
- 나사 실을 ISCA를 확보하는 데 사용되는 아크릴 조각으로 잘라냅니다. 이는 마운팅 나사와 일치하는 직경과 피치가 있는 탭을 사용하여 달성할 수 있습니다.
- 먼저 탭을 탭 렌치에 부착한 다음 아크릴 조각을 고정하여 벤치탑 바이스로 탭합니다. 최상의 결과를 얻으려면 아크릴 조각이 가능한 한 레벨인지 확인하십시오. 탭이 아크릴 조각에 수직인지 확인하고 탭 렌치(시계 방향으로)를 돌리기 시작하여 탭에 가벼운 압력을 가합니다.
- 아크릴 조각에서 몇 가지 전체 회전 후, 탭의 회전을 반전 (시계 반대 방향으로) 탭에서 아크릴을 취소 회전의 1 분기. 아크릴 조각의 전체 깊이를 탭할 때까지 프로세스를 반복합니다.
- 마지막으로 탭을 제거하고(시계 반대 방향으로 돌리기) 나사를 사용하여 스레드를 테스트합니다.
- 3mm 아크릴 시트에서 레이저 커터로 배치 인클로저의 조각을 잘라냅니다.
3. 현장의 절차
- 물 여과
- 실험을 시작할 준비가 되면 현장 사이트에서 물을 수집합니다. ISCA당 5mL의 물을 0.2 μm 주사기 필터(50mL 주사기)를 50mL 원심분리기 튜브로 필터링합니다.
참고: ISCA의 모든 우물을 채우기 위해서는 약 3mL의 여과된 물이 필요합니다. 그러나, 4중 여과 과정에서 손실을 설명하기 위해 장치당 5mL를 1) 필터링하고, 2) 유동 세포및 분자 절차 모두에 대한 음의 대조군으로서 여과류의 알리쿼트보존을 권장한다. - 새로운 50mL 원심분리기 튜브에 새로운 50mL 주사기를 사용하여 0.2 μm 친수성 GP 필터 카트리지(동일한 것을 사용하여 두 번 모두 사용)를 통해 여과물을 두 번 필터링합니다. 0.02 μm 주사기 필터(새로운 50mL 주사기)를 통해 새로운 50mL 원문 튜브로 여과물을 필터링합니다.
참고: 이 네 배 여과는 물에서 거의 모든 미생물과 입자를 제거해야합니다. 마지막 여과물을 사용 까지 열의 모든 소스에서 멀리 유지 합니다. 이 물은 ISCA에 사용되는 모든 화학 물질을 재중단하는 데 사용되며 배포 현장의 물과 동일한 온도로 유지관리해야 합니다. ISCA 우물과 외부 환경 간의 온도 차이로 인해 발생하는 대류 흐름이 발생할 수 있습니다. - 15mL 원심분리기 튜브에서 원하는 농도로 관심있는 모든 화학 물질 (일반적으로 건조)을 재보중단하기 위해 여과의 알리쿼트를 사용합니다.
- 10mL 주사기가 있는 0.2 μm 주사기 필터를 통해 15mL 원심분리기 튜브를 사용하여 원치 않는 입자 또는 수성 불용성 화합물(추출물을 사용하는 경우)을 제거합니다.
참고: 입자가 필터를 통과하지 못하도록 부드럽게 필터링합니다. 필드 사이트에서 초여과 된 물에 있는 화학 물질을 다시 중단하고 다른 해결책으로 용해하지 않는 것이 중요합니다. 현장으로부터의 물을 이용하여 (1) 밀도 구동 흐름을 방지하기 위해 벌크 환경수에서와 동일한 염분 농도를 얻고, (2) 배경 영양소 수준이 우물 안팎에서 동일하다는 것을 보장한다.
- 실험을 시작할 준비가 되면 현장 사이트에서 물을 수집합니다. ISCA당 5mL의 물을 0.2 μm 주사기 필터(50mL 주사기)를 50mL 원심분리기 튜브로 필터링합니다.
- ISCA 충전
- ISCA를 채우기 위해 섹션 1.3을 수행합니다.
참고: 물질당 1열(5개의 우물)을 채우는 것이 좋습니다(즉, ISCA당 3개의 다른 물질과 1개의 초여과해 관제).
- ISCA를 채우기 위해 섹션 1.3을 수행합니다.
- 현장에서의 배포
- ISCA(그림3A)를나사로 파비의 9개조각(도 2K 및 도 3B).
참고: 위에 설명된 흐름 감쇠 인클로저에는 두 개의 ISCA가 나란히 또는 중앙에 배치된 ISCA 하나가 포함될 수 있습니다. - 인클로저(도3C)를닫고 접착제테이프(도 3D)로밀봉합니다.
참고: 완벽한 씰을 보장하기 위해 주름을 피해야 합니다. 먼저 모든 면을 밀봉한 다음(두 번째 단계에서) 샘플링 끝에 인클로저에서 물을 배출하는 데 사용되는 측면 구멍을 밀봉합니다. 상단 및 하단 구멍을 밀봉하지 마십시오. 밀도 중심의 흐름이 우물의 세포 수를 편향시키는 화학 요법을 포함하는 우물에서 발생할 수 있기 때문에 ISCA를 거꾸로 놓지 마십시오. - 인클로저는 배포 중에 안정적으로 유지되어야 하므로 번지 코드를 사용하여 인공 구조물(예: 폰톤, 사다리)에 부착하는 것이 좋습니다.
참고: 인클로저는 물에 담기 전에 번지 코드를 사용하여 배포 팔(여기, 수직 플랫폼이 있는 수정된 클램프)에 부착할 수 있습니다. 또는 인클로저를 얕은 기판에 작은 무게로 채우고 고정할 수 있습니다. 배치가 펠라곤 해에 의도된 경우 인클로저를 한쪽에 부표가 있는 그물에 부착하고 다른 쪽에는 다이빙 무게를 낼 수 있습니다. - 인클로저를 완전히 잠그고 채우기를 시작합니다. 채우는 동안 인클로저를 단단히 잡고 내부의 과도한 물 이동을 방지합니다. 물의 수위가 인클로저의 꼭대기에 도달하면 내부에 공기가 갇혀 있지 않은지 확인하십시오.
참고: 일부 기포가 갇힌 경우 통풍구구멍이 위쪽으로 향하여 인클로저를 부드럽게 기울여 거품이 빠져나갈 수 있습니다. - 완전히 가득 차면 실리콘이나 고무로 만들거나 20 μL 파이펫 팁(그림 4)의사지를 밀봉하여 두 개의 플러그로 바닥과 상단 구멍을 밀봉하십시오.
참고: 이 단계는 샘플링 하는 동안 인클로저 내부의 흐름을 방지 합니다. - 1-3 시간 동안 샘플링을 위해 ISCA를 제자리에 둡니다.
참고: 이상적인 배포 시간은 주로 물의 온도와 세균 계 지역 사회의 두 배의 시간에 의해 결정됩니다. 수온이 20°C 이상이면, 세포 분열이 1.5-2.0h 이후 화학물질을 함유하는 우물에서 발생할 수 있기 때문에 ISCA를 1시간 이상 에 대해 배포하는 것이 권장되지 않는다. 그러나, 최적의 배치 시간은 로드된 화학물질로 자연 공동체를 수정하고 시간을 통해 세포의 수를 정량화함으로써 ISCA 실험 전에 테스트될 수 있다. - 물에서 인클로저를 제거합니다. 인클로저에서 물을 배출할 수 있도록 컨테이너 위에 놓습니다.
- 앞 구멍에서 접착 테이프의 상부를 매우 부드럽게 제거합니다.
참고: 인클로저를 떠나는 물의 흐름은 떨어지는 속도에 있어야 합니다. 인클로저 의 상단에서 아래쪽으로 한 번에 하나의 구멍을 진행합니다. 인클로저를 완전히 배수하는 데 약 10-15 분이 소요됩니다. - 수중선이 ISCA 상단 아래로 지나면 하단 플러그를 제거하고 나머지 물을 배출합니다.
- ISCA는 여전히 인클로저에 부착되어 있지만 ISCA 위에 갇힌 물을 1mL 파이펫으로 조심스럽게 제거하십시오.
- 상부 표면에 닿지 않고 ISCA를 제거하고 일회용 와이프를 사용하여 표면에 남아있는 액체를 제거하십시오.
참고: 압력의 결과로 변경이 제거하거나 우물에 벌크 박테리아를 추가하고 세균 수를 편향할 수 있기 때문에 이 과정 도중 포트를 만지지 않는 것이 중요합니다. - 1.5.1 단계를 반복하여 ISCA에서 샘플을 검색합니다.
- ISCA(그림3A)를나사로 파비의 9개조각(도 2K 및 도 3B).
4. 다운스트림 애플리케이션
참고: 볼륨은 550 μL 샘플(ISCA의 한 행)을 기준으로 제공됩니다.
- 각 유인자에 화학요법을 정량화하기 위해 혈류 세포측정을 위해 글루타랄데히드(2% 최종 농도)로 100 μL의 음함량을 수정합니다.
참고: 얼음 에 저장 (또는 4 °C) 같은 날에 샘플을 분석. 또는 같은 날 분석이 가능하지 않으면 시료가 액상 질소로 동결될 수 있습니다. 유동 세포측정은 ISCA 우물의 세포 수를 정량화하는 것이 좋습니다.12 - 스냅 동결 300 μL 액체 질소에 있는 음함량의 후속 DNA 추출 및 분석(11).
참고: 분석할 때까지 샘플을 -80°C에 저장합니다. - TE-글리세롤 버퍼 10μL에 90 μL의 음함량을 추가하고 단세포유전체학(13)의시료를 스냅 동결한다.
- 세균 분리를 위해 원하는 배지를 함유한 천접시에 10-20 μL을 퍼뜨리세요.
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Representative Results
이 섹션에서는 ISCA를 이용하여 토양박테리아(14)를유치하는 것으로 알려진 아미노산인 글루타민의 농도 범위에 대한 해양 미생물의 화학 반응을 시험하는 실험실 결과를 제시한다. 실험실 테스트에서 가장 강력한 화학 반응을 유도한 글루타민의 농도는 해양 환경에서 화학 분석법을 수행하는 데 사용되었습니다.
실험실 테스트를 수행하기 위해 호주 시드니의 해안 물에서 샘플링 된 해수 지역 사회는 1.4 단계에서 설명 된 간단한 영양소 수정4를통해 motile 세포에 농축되었습니다. 글루타민은 10mM에서 100 μM에 이르는 최종 농도를 얻기 위해 초여과 된 해수로 연속적으로 희석되었다. 1h 전개 후, 각 ISCA 행의 내용(동일한 글루타민 농도 포함)은 약 550μL의 작업 샘플을 제공하기 위해 풀링되었다. 이 부피는 글루타랄데히드(2% 최종 농도)로 고정되었으며, 유동 세포측정을 통해 정량화된 반응균의 수.
간단히, 세균성 풍부는 1) 녹색 형광 DNA 염료로 세포를 염색하고 2) 초여식 탈온화 수를 칼집 유체로 사용하여 유동 세포계를 이용하여 분석하였다. 각 샘플에 대해, 전방 분산(FSC), 측면 분산(SSC), 및 녹색 형광이 기록되었다. 견본은 SSC및 녹색 형광에 따라 구별된 세균성 세포와 함께 25 μL/min의 유량으로 분석되었습니다. 화학지수(Ic)는 여과된 해수제어웰(FSW)에서 각 시료에 존재하는 세균수를 평균세균수로 나누어 결정하였다.Ic
그 결과 1mM은 최적의 글루타민 배치 농도였으며, 여과된 해수제어(t-test, p&001)보다 18배 높은 상당한 화학 반응을 유도한 것으로 나타났다(도5A). 글루타민의 농도가 높거나 낮을수록 유의하지만 약한 화학반응(Ic = 5.43 for 100 μM, p< 0.001; ic = 7.34 용 10 μM, p & 0.001). ISCA에 첨가된 화학농축제가 너무 높으면, (1) 박테리아가 항만 섹션에서 그라데이션을 검출할 수 없기 때문에, 우물내의 화학요법농도가 감소될 수 있고, 또는 (2) 우물의 pH 또는 삼투성이 영향을 받을 수 있다.
최적의 글루타민 농도는 이후에 현장 배치에 사용되었습니다. 호주 시드니 근처 해안 부지(33.91°S, 151.26°E)에서 1mM 글루타민으로 채워진 5개의 ISCA 복제본이 1시간 동안 배치되었다. 글루타민은 배치부위(도 5B)에서여과된 해수로 채워진 대조군 우물보다 2.98배 더 많은 박테리아를 유치했다. 이 분야 실험에서 의 화학 반응은 대조군(t-test, p&001)과 크게 다르며 연안 해수(11)에 대한 강력한 반응을 구성하였다.t11
그림 1: 시투 화학 분석(ISCA)의 자세한 보기. (A)최신 사출 성형 ISCA. (B)ISCA의 회로도가 잘. 스케일 바 = 7.463mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유동 감쇠 인클로저의 어셈블리. (A)배포 인클로저의 조립에 필요한 조각입니다. 제작 하는 동안 가장자리는 부드러운 해야 합니다. (B)1장(하부 표면)을 중심으로 2a, 2b, 3a, 3b를 놓습니다. (C)하부 표면(1)의 제1 모서리 주위에 아크릴 접착제의 얇은 층을 배치하여 인클로저의 하부를 조립한다. (D) 첫 번째 긴 사이드월 조각(2a)을 접착제에 수직으로 놓고 제자리에 고정합니다. 접착제는 고형화하려면 ~1분이 필요하며 다음 요소를 배치하면서 2a 조각이 자신을 지원할 수 있습니다. (E) 조각 1의 짧은 면에 아래표면에 아크릴 접착제의 얇은 층을 적용합니다. 짧은 측벽 조각(3a)을 아크릴 접착제에 놓고 이전에 배치된 측벽에 잠급니다. 두 조각을 약 1분 동안 잡으라(F) 다른 짧은 사이드월 조각(3b)을 하부 표면(1)의 반대편에 놓습니다. 다시, 연결 조각 (2a)에 잠그고 약 1 분 동안 보관하십시오. (G) 필요한 경우, 하부 표면 (1)의 나머지 긴 면에 아크릴 접착제를 다시 적용합니다. 마지막 긴 측벽 조각 (2b)을 놓고 인접한 두 조각 (3a 및 3b)에 연결합니다. 모든 조각이 하부 조각(1)과 적절하게 정렬되어 있고 측벽이나 낮은 표면 사이의 정렬 불량 이나 간격의 흔적이 없는지 확인하십시오. 인클로저의 보완적인 상부(4, 5a, 5b, 6a 및 6b)를 조립하려면 이러한 단계를 반복합니다. (H) 조각 4의 모서리에 구멍이 조립 중에 방해되지 않았는지 확인하고, 그렇지 않으면 바늘과 같은 날카로운 물체로 개구부를 펀치한다. 인클로저의 구멍은 배포 프로세스에서 중요한 역할을 하며 물이 느리고 제어되는 방식으로 배출되도록 합니다. 직경은 인클로저 내부의 난류 흐름을 줄이기 위해 최적화되어 있으며, 이는 검색 시 ISCA 포트 주변의 유체의 방해를 방지합니다. (이아, b) 두 개의 큰 사각형 (7)을 함께 접착제와 별도로 두 개의 작은 사각형 (8)을 접착제. 각각 에 대해 한 번 반복합니다. (J) 인클로저의 하부 표면(1)의 중앙에 있는 4개의 조립된 사각형을 접착제로 붙입니다. (K) 직사각형(7과 8)의 상단에 상부 데크(9)를 붙입니다. 조각의 측면 구멍이 사각형의 외부 측면에 있는지 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 테이핑으로 ISCA를 인클로저에 배치하고 밀봉합니다. (A)ISCA에 장착 나사를 놓습니다. (B)배포 인클로저에 ISCA 배치. ISCA를 배포 인클로저 중간에 배치하고 지정된 나사와 연결합니다. 인클로저의 하부 드레인 구멍은 인클로저가 물로 채워지면 수정된 20 μL팁(그림 4)으로밀봉되어야 합니다. 이것은 화학 분야의 안정성과 화학 요법의 효과에 영향을 미칠 수있는 난류 흐름의 생성을 피하는 데 도움이됩니다. (C)상부및 하부부분이 함께 조립됩니다. (D)접착제 테이프를 사용하여 인클로저의 밀봉. 누출을 방지하기 위해 주름을 피해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 플로우 감쇠 인클로저를 밀봉하기 위해 플러그를 꽂습니다. 플러그는 20 μL 파이펫 팁을 열로 밀봉하여 만들 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 실험실에서 농축 된 motile 지역 사회의 글루타민과 현장에서 자연 미생물 집단으로 ISCA를 사용하여 화학 요법 을 사용 하 여. 화학대탁증지수 IIc(ISCA 우물 내 세포의 농도를 나타내는)는 60분 후 여과된 해수(FSW)를 함유하는 우물 내의 세포의 평균 농도에 의해 정상화된다. 각 농도는 5개의 ISCA 복제에서 시험되었다. 세균 세포는 유동 세포측정(A): FSW = 4.46 ± 0.25 x103에의해 정량화되었다; 100 μM = 2.43 ± 0.16 x 104; 1 mM = 8.07 ± 0.45 x 104; 10 mM = 3.28 ± 0.20 x 104; (B): FSW = 1.26 ± 0.11 x 104; 1 mM = 3.76 ± 0.28 x 104 셀 /mL). (A) 실험실및 (B) 분야에서 시험된 글루타민의 모든 농도는 여과된 해수(FSW) 대조군보다 현저히 높은 화학 반응을유도하였다. 모든 쌍별 비교: (A) 투키 HSD, n = 5, p & 0.005; (B) 투키 HSD, n = 5, p & 0.005. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다.
| 현장 재료 | 수량 |
| 물 여과 | |
| 튜브 랙 - 50mL | 1 |
| 수성 GP 필터 카트리지 - 0.2 μm | 1 |
| 주사기 필터 - 0.2 μm | 1 |
| 주사기 필터 - 0.02 μm | 1 |
| 주사기 - 50mL | 4 |
| 원심분리기 튜브 - 50mL | 5 |
| 화학 적 재발 | |
| 원심분리기 튜브 - 15mL | 4 |
| 화학 요법 | |
| 주사기 - 10mL | 4 |
| 주사기 필터 - 0.2 μm | 4 |
| 튜브 랙 - 15mL | 1 |
| ISCA 충전 | |
| 주사기 바늘 27G | 4 |
| 주사기 - 1 mL | 4 |
| 이스카 | 1 |
| 배포 | |
| 배포 인클로저 | 1 |
| 나일론 슬롯 플랫 헤드 나사 | 2 |
| 배포 암 | 1 |
| 번지 코드 | 2 |
| 접착제 테이프 | 1 |
| 배포 인클로저 플러그 | 1 |
| 샘플 검색 | |
| 주사기 바늘 27G | 4 |
| 주사기 - 1 mL | 4 |
| 원심분리기 튜브 - 2mL | 12 |
| 일회용 와이퍼 | 상자 1개 |
| 글루타랄데히드 25% | 10mL |
| 기타 재료 | |
| 파이펫 세트 | 1 |
| 파이펫 팁 200 μL | 상자 1개 |
| 파이펫 팁 20 μL | 상자 1개 |
| 파이펫 팁 1 mL | 상자 1개 |
표 1: 필드 배포에 필요한 자료입니다.
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Discussion
수생 미생물의 규모에서, 환경은 균질과는 거리가 멀며 종종 미생물 공동체1,15를구성하는1물리적/ 화학적 그라데이션을 특징으로 한다. 모틸성 미생물의 용량은 거동(즉, 화학요법)을 사용하여 이러한 이질적인 미생물 환경1내에서 포징을 용이하게 한다. 환경에서 직접 화학 요법을 연구하는 것은 중요한 상호 작용 및 화학 적 선호도를 식별 할 수있는 잠재력을 가지고 있으며, 이것은 생지구 화학 적 공정에 특정 미생물의 기여를 풀어 내는 데 도움이 될 수 있습니다. 제시된 프로토콜은환경(11)에 ISCA를 배포하여 시상에서 화학요법에 대한 재현 가능한 연구의 수집을 용이하게 합니다.
ISCA를 사용 하 여, 글루타민 실험실 조건 및 현장에서 모두 긍정적인 화학 반응을 유도 표시 됩니다. 현장에서 글루타민의 ISCA 배치는실험실(그림 5)보다낮은 화학 반응을 산출한다. 실험실과 필드 실험 사이의 유사한 patters는 이전에 관찰되었다11. 이들은 실험실 분석에서 사용되는 농축 된 지역 사회 또는 단일 운동 분리에 비해 환경에서 운동 세포의 낮은 비율에 의해 설명 될 수있다.
예비 실험실 기반 실험의 중요성은 현장 배치에서 사용하기에 최적의 화학 요법 농도의 결정을 허용하기 때문에 과소 평가해서는 안됩니다. 최적의 농도는 각 화학 요법에 특이적이며 분자량, 용해도 및 우물의 확산성에 의해 영향을 받습니다. 여러 개의 별개의 물질을 배포하는 경우, 각각은 농도 범위에서 개별적으로 테스트되어야 합니다. 1시간 이후에 현장에서 화학 요법이 발견되지 않으면 더 긴 배포를 수행할 수 있습니다. 그러나, 배치의 길이는 세균성 성장에 의해 강하게 제한되고 항상 표적으로 한 환경에서 박테리아의 분할 비율 보다는 짧아야 합니다. 이것은 ISCA 내의 인구 증가를 방지하는 데 도움이됩니다.
ISCA는 물 난기류에 민감하며 유동 댐핑 인클로저를 채우고 비우면 주의해야 합니다. 신속한 충전으로 인한 흐름이 우물의 내용을 플러시하거나 희석시킬 수 있으므로 이러한 단계는 천천히 수행해야 합니다. 결과적으로, 이것은 제거 하거나 제대로 확산 또는 주변 환경에서 박테리아를 도입에서 화학 요법을 방지, 궁극적으로 세포 수를 편향. 모든 공기를 배출하는 동안 인클로저를 물로 완전히 채운 다음 완전히 닫으면 난기류가 배포를 방해하지 않도록 합니다. 배포 현장에서 메타데이터 수집(예: 온도, 염분, 엽록소/영양소 농도)은 이러한 요인이 화학요법에 영향을 줄 수 있기 때문에 결과를 해석하는 중요한 단계이기도 하다.
ISCA는 환경에서 화학 요법의 역할과 보급에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 접근 가능하고 사용자 친화적인 장치입니다. 그것은 액체 단계 (예를 들어, 해양, 담수, 토양, 폐수 시스템)를 포함하는 모든 시스템에서 화학 요법의 심문을 할 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 환경에 있는 병원체 및 항생 저항에 표적으로 한 연구 결과, 생물 탐사를 위한 중요한 세균의 격리, 특정 오염 물질 및 미세 플라스틱의 생물 치료에 이용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 고든과 베티 무어 재단 해양 미생물학 이니셔티브에 의해 부분적으로 투자되었다, J.R.S.와 R.S.에 GBMF3801을 부여를 통해, 그리고 조사자 상 (GBMF3783) R.S.에, 뿐만 아니라 J.B.R.에 호주 연구 위원회 펠로우십 (DE160100636), B.S.L. (594111)에 시몬스 재단에서 상, 사이먼스 재단 (542395)에서 R.S.에 대한 보조금 (프리메) 협력의 일환으로.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube - 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | - | - | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips - 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips - 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter - 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter - 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes - 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes - 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes - 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter - 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
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