In Situ Chemotaxis Assay att undersöka mikrobiellt beteende i akvatiska ekosystem

Summary

Presenteras här är protokollet för en in situ chemotaxis analys, en nyligen utvecklad mikrofluidic enhet som möjliggör studier av mikrobiellt beteende direkt i miljön.

Abstract

Mikrobiella beteenden, såsom motilitet och chemotaxis (förmågan hos en cell att ändra sin rörelse som svar på en kemisk gradient), är utbredd över bakterie-och arkaeala domäner. Chemotaxis kan resultera i betydande resursförvärvsfördelar i heterogena miljöer. Det spelar också en avgörande roll i symbiotiska interaktioner, sjukdomar och globala processer, såsom biogeokemisk cykling. Men nuvarande tekniker begränsar chemotaxis forskning till laboratoriet och är inte lätt tillämpliga inom området. Presenteras här är ett steg-för-steg-protokoll för utplacering av in situ chemotaxis assay (ISCA), en enhet som möjliggör robust förhör av mikrobiell chemotaxis direkt i den naturliga miljön. ISCA är en mikrofluidisk enhet som består av en 20 brunnsmatris, där kemikalier av intresse kan laddas. När de är utplacerade i vattenhaltiga miljöer sprider sig kemikalier ur brunnarna, vilket skapar koncentrationsgradienter som mikrober känner av och reagerar på genom att simma in i brunnarna via chemotaxis. Brunnsinnehållet kan sedan samplas och användas för att (1) kvantifiera styrkan hos de chemotactic svaren på specifika föreningar genom flödescytometri, (2) isolera och kultur lyhörda mikroorganismer, och (3) karakterisera identitet och genomisk potential av de svarande populationerna genom molekylära tekniker. ISCA är en flexibel plattform som kan användas i alla system med en vattenfas, inklusive marina miljöer, sötvatten och jord.

Introduction

Olika mikroorganismer använder motilitet och chemotaxis att utnyttja ojämna näringsmiljöer, hitta värdar, eller undvika skadliga förhållanden^1,2,3. Dessa mikrobiella beteenden kan i sin tur påverka andelen kemisk omvandling^{4 och} främja symbiotiska partnerskap över land-, sötvatten och marina ekosystem^2,5.

Chemotaxis har studerats ingående under laboratorieförhållanden under de senaste 60 åren⁶. Den första kvantitativa metoden för att studera chemotaxis, kapillär analysen, innebär en kapillär röret fylld med en putativ chemoattractant nedsänkt i en suspension av bakterier⁶. Diffusion av kemikalien ut ur röret skapar en kemisk gradient, och chemotactic bakterier svara på denna gradient genom att migrera in i röret⁷. Sedan utvecklingen av kapillär analysen, fortfarande används i stor utsträckning idag, många andra tekniker har utvecklats för att studera chemotaxis under alltmer kontrollerade fysiska / kemiska förhållanden, med den senaste innebär användning av mikrofluidik^8,9,10.

Mikrofluidik, tillsammans med höghastighetsvideomikroskopi, möjliggör spårning av enstaka cellers beteende som svar på noggrant kontrollerade lutningar. Även om dessa tekniker har avsevärt förbättrat vår förståelse av chemotaxis, har de begränsats till laboratorieanvändning och inte översätta lätt till fältutbyggnad i miljösystem. Som en konsekvens har kapaciteten hos naturliga samhällen av bakterier att använda chemotaxis inom naturliga ekosystem inte undersökts; således är nuvarande förståelse av den potentiella ekologiska betydelsen av chemotaxis partisk mot konstgjorda laboratorieförhållanden och ett begränsat antal laboratorie-odlade bakteriell isolat. Den nyligen utvecklade ISCA övervinner dessa begränsningar¹¹.

ISCA bygger vidare på den allmänna principen om kapilläranalysen; emellertid, Det använder sig av moderna mikrofabricering tekniker för att leverera en mycket replikerade, lätt deployable experimentell plattform för kvantifiering av chemotaxis mot föreningar av intresse för den naturliga miljön. Det möjliggör också identifiering och karakterisering av chemotactic mikroorganismer genom direkt isolering eller molekylära tekniker. Medan den första fungerande enheten var själv fabricerade och konstruerade av glas och PDMS¹¹, den senaste formsprutade versionen är sammansatt av polykarbonat, med hjälp av en mycket standardiserad tillverkning förfarande (för intresse för den senaste versionen av enheten, kan motsvarande författare kontaktas).

ISCA är kreditkortsstor och består av 20 brunnar fördelade i en 5 x 4 brunnsarray, var och en kopplad till den yttre vattenmiljön av en liten hamn (800 μm i diameter; Bild 1). Förmodade kemoattrater lastade i brunnarna diffusa i miljön via hamnen, och chemotactic mikrober svara genom att simma genom hamnen i brunnen. Eftersom många faktorer kan påverka resultatet av ett ISCA-experiment i den naturliga miljön, kommer detta steg-för-steg-protokoll att hjälpa nya användare att övervinna potentiella hinder och underlätta effektiva distributioner.

Protocol

Vi rekommenderar att du utför avsnitt 1 före fältexperiment för att optimera resultaten.

1. Optimering av laboratorium

OBS: De volymer som beskrivs i optimeringsförfarandet är tillräckliga för en enda ISCA (som består av 20 brunnar).

1. Förberedelse av kemikalien av intresse
   OBS: Den optimala koncentrationen för varje kemoattratant behöver ofta bestämmas under laboratorieförhållanden före fältutplaceringar. Det kemiska koncentrationsfältet kommer att minska i storlek med avstånd från källan (ISCA-brunnen), vilket innebär att den koncentration som mikroorganismerna upplever i miljön kommer att vara lägre än den som finns inuti enheten. Den optimala koncentrationen som ska användas i ISCA-brunnen beror på chemoattractantens diffusionshastighet. Om koncentrationen i brunnen är för låg (nära mikroberna upptäcktsgräns) kommer inga positiva kemotaxer att observeras. Omvänt, om koncentrationen i brunnen är för hög, kommer koncentrationen också att vara hög i närmiljön och mikrobiell ackumulering kommer att ske ovanför ISCA brunnarna snarare än inuti. Därför bör utspädningsserier utföras i laboratorieförhållanden för varje förening för att fastställa den optimala koncentrationen för fältutplaceringar. Helst bör ett koncentrationsintervall också testas på fältet för att bekräfta laboratorieresultat.
   1. Bered 2,5 L av ett lämpligt medium som innehåller lämplig saltkoncentration (t.ex. fosfatbuffrad saltlösning [PBS] eller konstgjort havsvatten). Filtrera mediet med ett 0,2 μm-filter med hjälp av en peristaltisk eller vakuumpump och autoklav.
   2. Bered en 10 mM lösning av kemoattratant i 1 mL av det sterila mediet. Filtrera chemoattractantlösningen med ett 0,2 μm sprutfilter för att avlägsna partiklar och potentiella föroreningar.
      OBS: Helst bör inga andra organiska föreningar än kemoattrat finnas i den slutliga lösningen.
2. Koncentrationsintervall efter utspädningsserie
   1. Späd den filtrerade kemoattrateranta stamlösningen i serie, med en sträcker sig (till exempel) från 10 mM till 100 μM.
      OBS: Minst en 0,7 mL slutlig volym behövs per testad koncentration.
3. Laddar ISCA-programmet
   1. Fyll en 1 mL spruta med den filtrerade kemoattractanten och anslut den till en 27 G spruta. Hålla ISCA med porten uppåt, injicera långsamt ämnet tills en liten droppe visas ovanpå hamnen.
      OBS: 1) Varje spädning eller ämne måste injiceras med en separat spruta och nål för att förhindra korskontaminering. 2) Denna lilla droppe är viktig eftersom den säkerställer att ingen luftbubbla är instängd i hamnen, vilket skulle kunna försämra mikrobers förmåga att migrera genom hamnen. 3) Det rekommenderas att fylla en hel rad per ämne eller koncentration (fem brunnar) för att ge en tillräcklig minimal volym för ytterligare analyser. 4) En rad per ISCA ska fungera som negativ kontroll och fyllas med det filtrerade medium som mikroberna kommer att suspenderas i. Denna behandling står för effekten av slumpmässig motilitet av mikrober i ISCA brunnarna och bör användas för att normalisera de behandlingar som innehåller en chemoattractant.
4. Utplacering i laboratoriet
   1. Över natten, inkubera en 5 mL-odling berikad med 1% marinbuljong (för marina bakterier) eller 1% lysogeny buljong (LB, för färskvattenbakterier).
      OBS: Motil bakterieisoter eller naturliga bakteriesamhällen kan användas för laboratorieutplaceringar.
   2. Inkubera kulturen i 12 h vid rumstemperatur (RT) och 180 rpm. Efter 12 h, se till att de mikrobiella samhällena är motila genom direkt observation under ett mikroskop.
   3. Snurra ner kulturen i 1 500 x g i 10 min och resuspend 1/100 i 150 mL lämpligt medium (t.ex. filtrerat havsvatten, filtrerat sötvatten).
   4. Placera två små bitar av dubbelhäftande tejp på den plana ytan av en 200 mL kapacitet facket (locken på 1 mL spets lådor har de idealiska måtten för detta ändamål och kan enkelt autoklaveras). Placera en ISCA ovanpå, se till att den fäster säkert på bandet. Fyll långsamt på distributionsbrickan med den bakteriella lösningen med hjälp av en serologisk pipett på 50 mL.
      OBS: Fyll på brickan tills ISCA är nedsänkt under ungefär 1–2 cm vätska. Om du använder flera magasin använder du samma volym över alla.
   5. Låt ISCA inkubera i 1 h för att tillåta bakteriell kemotax. Efter 1 h, ta bort mediet mycket försiktigt med en 50 mL serologisk pipett för att minimera turbulent flöde.
   6. Hämta ISCA från distributionsfacket utan att röra den övre ytan. Använd en pipett och engångstorkare för att avlägsna kvarvarande vätska på ISCA-ytan.
      OBS: Det är viktigt att undvika att vidröra portarna under denna process, eftersom de resulterande förändringarna i tryck kan ta bort eller lägga bakterier från den yttre miljön i brunnen och därigenom bias den bakteriell densitet och sammansättning inuti brunnen.
5. Hämtning av proverna
   1. Håll ISCA med porten nedåtvänd, hämta brunnens volym med hjälp av en steril 27 G spruta nål fäst på en 1 mL spruta.
      OBS: Varje rad (om den innehåller samma ämne) kan poolas för att ge ett arbetsprov på cirka 550 μL. Detta prov kan därefter alikvoterats till olika rör beroende på de nödvändiga applikationerna i efterföljande led.
   2. Bestäm antalet bakterier som attraheras av varje kemoattrateritiskt koncentration genom att analysera proverna med flödescytometri¹². Välj koncentrationen av chemoattractant som maximerar chemotaxis för efterföljande fältdistributioner.

2. Förberedelser inför utplacering av fält

OBS: Beredning av material och konstruktion av flödesdämpande kapslingen (avsnitt 2) måste ske före driftsättning.

1. Beredning av material
   1. Förbereda alla material som anges i tabell 1.
      OBS: Materialmängder tillhandahålls för en ISCA.
2. Konstruktion och beredning av flödesdämpande kapslingen
   OBS: Den flödesdämpande kapslingen minimerar oönskade turbulenser som annars förhindrar etablering av kemiska lutningar som utgår från ISCA.
   1. Klipp av bitarna för driftsättningshöljet med en laserskärare från ett 3 mm akrylark.
      OBS: Filen för bitarna finns med hjälp av följande länk: .
   2. Montera de laserskurna bitarna som visas i figur 2 med hjälp av akryllim.
      OBS: Montera ihop bitarna med omsorg. Hål eller feljustering kan skapa läckor vid distribution, vilket direkt påverkar datakvaliteten.
   3. Låt den monterade inneslutningen torka över natten.
   4. Tvätta inneslutningen med avjoniserat vatten.
   5. Identifiera potentiellt läckage genom att hälla avjoniserat vatten i inneslutningen. Fixa eventuella läckande skarvar genom att lägga till mer akryllim, upprepa sedan steg 2.2.3–2.2.5.
   6. Skär skruvgängorna i akrylbiten som kommer att användas för att säkra ISCA. Detta kan uppnås med hjälp av en kran med en diameter och stigning som matchar monteringsskruvarna.
      1. Först fäst kranen i en kran skiftnyckel, sedan säkra akryl bit som skall knackas i en bänkskiva vice. För bästa resultat, se till att akryl bit är så nivå som möjligt. Se till att kranen är vinkelrät mot akrylbiten och börja vrida på krannyckeln (medurs), applicera lätt tryck på kranen.
      2. Efter flera fulla varv i akrylstycket, vända rotationen av kranen (moturs) för en fjärdedel av en rotation för att rensa akryl från kranen. Upprepa processen tills hela djupet av akryl bit är knackade.
      3. Ta slutligen bort kranen (vrida moturs) och testa gängorna med hjälp av en skruv.

3. Förfarande på fältet

1. Vatten filtrering
   1. Samla vatten från fältet webbplats när redo att starta experimentet. Filtrera 5 mL vatten per ISCA genom ett 0,2 μm sprutfilter (med en 50 mL spruta) i ett koniskt centrifugrör på 50 mL.
      OBS: Ungefär 3 mL filtrerat vatten krävs för att fylla alla brunnarna i en ISCA; emellertid rekommenderas att 1) filtrera 5 mL per enhet för att redovisa förluster under fyrdubbla filtreringsprocessen, och 2) bevara alikvoter av filtratesna som negativa kontroller för både flödescytometri och molekylära procedurer.
   2. Filtrera filtratet två gånger genom en 0,2 μm hydrofil GP-filterpatron (med samma, båda gångerna) med en ny 50 mL spruta i ett nytt 50 mL koniskt centrifugrör. Filtrera filtratet genom ett 0,02 μm sprutfilter (med en ny 50 mL-spruta) i ett nytt koniskt rör på 50 mL.
      NOTERA: Denna fyrdubbla filtrering bör ta bort nästan alla mikroorganismer och partiklar från vattnet. Håll det slutliga filtratet borta från någon värmekälla tills användning. Detta vatten kommer att användas för att återanvända alla kemikalier som används i ISCA, och det bör bibehållas vid samma temperatur som vattnet vid utplaceringsplatsen. Konvektiva flöden som utlöses av skillnader i temperatur mellan ISCA-brunnarna och utanför miljön kan annars uppstå.
   3. Använd alikvoter av filtratet för att resuspend alla chemoattractants av intresse (typiskt torr) till de önskade koncentrationerna i 15 mL koniska centrifugrör.
   4. Filtrera de återanvända kemoattrastanterna genom ett 0,2 μmsprutedfilter med en 10 mL spruta i sterila 15 mL koniska centrifugrör för att avlägsna oönskade partiklar eller vattenolösliga föreningar (om de använder extrakt).
      OBS: Filtrera försiktigt för att förhindra att partiklar passerar genom filtret. Det är viktigt att återanvända chemoattractanterna i det ultrafiltrerat vattnet från fältplatsen och inte solubilisera dem till andra lösningar. Att använda vatten från fältplatsen är nödvändigt för att (1) erhålla samma saltkoncentration inuti brunnarna som den i bulk miljövattnet för att förhindra densitetsdrivet flöde, och (2) garantera att bakgrundsnäringsnivåerna är lika in- och utsida av brunnen.
2. ISCA fyllning
   1. Utför avsnitt 1.3 för att fylla ISCA.
      OBS: Det rekommenderas att fylla en rad (fem brunnar) per ämne (dvs. tre olika ämnen per ISCA och en ultrafiltrerad havsvattenkontroll).
3. Distribution i fält
   1. Skruva ISCA (Bild 3A) på styck 9 på kapslingen (Figur 2K och Figur 3B).
      OBS: Den flödesdämpande kapslingen som beskrivs ovan kan innehålla två ISCA:ar sida vid sida eller en ISCA som placeras i dess centrum.
   2. Stäng kapslingen (Bild 3C) och försegla den med klistertejp (Bild 3D).
      OBS: Rynkor måste undvikas för att säkerställa en perfekt tätning. Täta alla sidor först, sedan (i ett andra steg) försegla sidohålen, som kommer att användas för att dränera vatten från inneslutningen i slutet av provtagningen. Täta inte topp- och bottenhålen. Placera inte ISCA upp och ner, eftersom densitetsdrivet flöde kan uppstå i brunnar som innehåller kemoattrater, vilket kommer att snedvrida antalet celler i brunnarna.
   3. Eftersom inneslutningen måste förbli stadig under distributionen rekommenderas att fästa den på konstgjorda strukturer (t.ex. ponton, stege) med hjälp av bungee-sladdar.
      OBS: Kapslingen kan fästas på en utplaceringsarm (här, en modifierad klämma med en vinkelrät plattform) med hjälp av bungee-sladdar före nedsänkning i vattnet. Alternativt kan kapslingen fyllas och säkras med en liten vikt på grunda substrat. Om utplaceringar är avsedda i det pelagiska havet kan inneslutningen fästas på ett nät med en boj på ena sidan och dykvikt på den andra.
   4. Fyll i inneslutningen undersänts helt för att börja fyllas. Under fyllningen håller du fast inneslutningen ordentligt för att förhindra överdriven vattenrörelse inuti. När vattennivån når toppen av inneslutningen, se till att ingen luft är instängd.
      OBS: I fall vissa luftbubblor är fångade, luta inneslutningen försiktigt med avluftningshålet uppåt, vilket gör det möjligt för bubblorna att fly.
   5. När de är helt fulla, förseglar du botten- och topphålen med två pluggar, som kan göras av kisel eller gummi eller genom att täta extremiteterna på 20 μL pipettspetsar (Figur 4).
      OBS: Detta steg förhindrar flöde inuti inneslutningen under provtagningen.
   6. Lämna ISCA på plats för provtagning i 1–3 h.
      OBS: Den idealiska driftsättningstiden dikteras i första hand av vattnets temperatur och fördubblingstiden för bakteriesamhället. När vattentemperaturen är över 20 °C rekommenderas inte att placera ut ISCA i mer än 1 h, eftersom celldelning kan uppstå i de brunnar som innehåller kemoattrater efter 1,5–2,0 h. Optimal driftsättningstid kan dock testas före ISCA-experimentet genom att naturliga samhällen ändras med de laddade kemikalierna och kvantifiera antalet celler genom tiden.
   7. Ta bort inneslutningen från vattnet. Placera den över en behållare som gör det möjligt att tömma vattnet från inneslutningen.
   8. Ta bort den övre delen av den självhäftande tejpen från de främre hålen mycket försiktigt.
      OBS: Flödet av det vatten som lämnar inneslutningen måste vara vid en droppande hastighet. Fortsätt ett hål i taget, från toppen av inneslutningen till botten. Det bör ta ungefär 10–15 min att tömma kapslingen helt.
   9. När vattenlinjen passerar under toppen av ISCA, ta bort bottenpluggen, och dränera resten av vattnet.
   10. Medan ISCAs fortfarande är knutna till inneslutningen, försiktigt bort vattnet fångade ovanpå ISCA med en 1 mL pipett.
   11. Ta bort ISCA utan att röra den övre ytan och använd en engångstork för att avlägsna eventuell kvarvarande vätska på ytan.
       OBS: Det är viktigt att inte röra portarna under denna process, eftersom de resulterande förändringarna i tryck kan ta bort eller lägga bulk bakterier i brunnen och bias de bakteriella räknas.
   12. Hämta proverna från ISCA genom att upprepa steg 1.5.1.

4. Applikationer i senare led

OBS: Volymer ges baserat på ett 550 μL-prov (en rad i en ISCA).

1. Fix 100 μL brunnsinnehåll med glutaraldehyd (2% slutkoncentration) för flödescytometri för att kvantifiera chemotaxis till varje lockant.
   OBS: Förvaras på is (eller vid 4 °C) och analysera proverna samma dag. Alternativt kan prover blixtfryst i flytande kväve efter fixering om analys inte är genomförbart samma dag. Flödescytometri är den rekommenderade metoden för att kvantifiera antalet celler i ISCA-brunnarna, eftersom det är okomplicerat, snabbt och exakt¹².
2. Snap frys 300 μL brunnsinnehåll i flytande kväve för efterföljande DNA-extraktion och analys¹¹.
   OBS: Förvara proverna vid -80 °C tills analysen.
3. Tillsätt 90 μL brunnsinnehåll till 10 μL te-glycerolbuffert och snäpp-frys proverna för encellsgenomik¹³.
4. Sprid 10–20 μL på agarplattor som innehåller det önskade mediet för bakterieisolering.

Representative Results

Detta avsnitt presenterar laboratorieresultat med hjälp av ISCA för att testa den chemotactic svar marina mikrober till en koncentrationsintervall av glutamin, en aminosyra kända för att locka jordbakterier¹⁴. Koncentrationen av glutamin som framkallat den starkaste chemotactic svaret i laboratorietesterna användes för att utföra en chemotaxis analys i den marina miljön.

För att utföra laboratorietesterna berikades havsvattensamhällen som provsmakades från kustvatten i Sydney, Australien, för motila celler genom ett enkelt^{näringsämnesändring 4}, som beskrivs i steg 1.4. Glutamin var seriellt utspädd i ultrafiltrerat havsvatten för att få slutliga koncentrationer från 10 mM till 100 μM. Fem ISCA replikat utplacerades samtidigt för detta experiment, och var och en innehöll tre olika glutamin koncentrationer (en koncentration per rad) samt en filtrerad seawater kontroll rad. Efter en 1 h utplacering, var innehållet i varje ISCA rad (som innehåller samma glutamin koncentration) poolas för att ge fungerande prover på cirka 550 μL. Denna volym fastställdes i glutaraldehyd (2% slutlig koncentration), och antalet smöte bakterier kvantifieras via flödescytometri.

Kortfattat, var bakteriell överflöd kvantifieras genom 1) färgning cellerna med en grön fluorescerande DNA-färgämne och 2) analys med hjälp av ett flöde cytometer med ultrafiltrerat avjoniserat vatten som den härdvätska. För varje prov spelades framåtspäck (FSC), sidospridd (SSC) och grön fluorescens in. Proverna analyserades med en flödeshastighet på 25 μL/min, med bakterieceller som diskrimineras enligt SSC och grön fluorescens. Det chemotaktiska indexet (I_c) bestämdes genom att dividera de bakterietal som finns i varje prov med de genomsnittliga bakterietalen i de filtrerade sjövattenkontrollsvalarna (FSW).

Resultaten visade att 1 mM var den optimala koncentrationen av glutaminutbyggnad, eftersom den framkallade ett betydande chemotactic-svar som var 18-faldig högre än den filtrerade havsvattenkontrollen (t-test, p < 0,001) (Figur 5A). Högre eller lägre koncentrationer av glutamin inducerade signifikanta men svagare chemotaktiska svar (I_c = 5,43 för 100 μM, p < 0,001; I_c = 7,34 för 10 μM, p < 0,001). Om den kemoattraterkoncentration som tillsätts en ISCA-brunn är för hög, kan chemotaxis i brunnen minskas, eftersom (1) bakterier inte kommer att kunna upptäcka en gradient i portsektionen och kan aggregera över brunnen, eller (2) pH eller osmolariteten hos brunnen kan påverkas.

Den optimala glutaminkoncentrationen användes därefter för fältutplacering. Fem ISCA-replikat fyllda med 1 mM glutamin sattes in för 1 h vid en kustnära plats nära Sydney, Australien (33,91 °S, 151,26 °E). Glutamin lockade 2,98 gånger fler bakterier än kontroll brunnarna fyllda med filtrerat havsvatten från utplaceringsplatsen (Figur 5B). Det chemotactic svaret i detta fält experiment var väsentligt skiljer sig från de kontroller (t-test, p < 0,001) och utgjorde en stark respons för kustnära havsvatten¹¹.

Figur 1: Detaljerade vyer av ISCA (in situ chemotaxis assay). (A) Den senaste formsprutade ISCA. (B) Schematisk av en ISCA-brunn. Skala bar = 7,463 mm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Bild 2: Montering av flödesdämpande kapsling. (A) De bitar som krävs för montering av driftsättningshöljet. Under tillverkning, bör kanterna vara släta. (B) Placera bitar 2a, 2b, 3a, och 3b runt stycke 1 (nedre yta). (C) Sätt ihop den nedre delen av kapslingen genom att sätta ett tunt lager akryllim runt den första kanten av den nedre ytan (1). (D) Placera den första längre sidoväggsstycket (2a) vertikalt på limmet och håll den på plats. Limmet kräver ~ 1 min att stelna och tillåter bit 2a att stödja sig själv samtidigt placera nästa element. (E) Applicera ett tunt lager akryllim på den nedre ytan på en kortare sida av bit 1. Placera den korta sidoväggsbiten (3a) på akryllimet och lås fast den i den tidigare placerade sidoväggen. Håll de två bitarna i ungefär 1 min. (F) Placera det andra korta sidoväggsstycket (3b) på den motsatta sidan av den nedre ytan (1). Återigen, lås in den i anslutningsstycket (2a) och håll den i ungefär 1 min. (G) Om det behövs, applicera akryllim på den återstående långsidan av den nedre ytan (1). Placera den sista långa sidoväggsstycket (2b) och anslut den i de två intilliggande bitarna (3a och 3b). Se till att alla bitar är korrekt i linje med den nedre biten (1) och att inga tecken på feljustering eller mellanrum mellan sidoväggar eller den nedre ytan är närvarande. Upprepa dessa steg för att montera den kompletterande övre delen av kapslingen (4, 5a, 5b, 6a och 6b). (H) Se till att hålet i hörnet av stycke 4 inte hindras under monteringen, annars punsch öppningen med ett vasst föremål som en nål. Hålen i inneslutningen spelar en avgörande roll i utbyggnaden och tillåter vatten att rinna av på ett långsamt och kontrollerat sätt. Deras diameter har optimerats för att minska turbulent flöde inuti inneslutningen, vilket förhindrar störningar av vätskan kring ISCA-portar vid hämtning. (Ia,b) Limma ihop två stora rektanglar (7) och limma separat två mindre (8). Upprepa en gång för varje. (J) Limma de fyra hopmonterade rektanglarna i mitten av kapslingens undre yta (1). (K) Limma övre däck (9) ovanpå rektanglarna (7 och 8). Se till att bitens sidohål ligger på rektanglarnas yttre sida. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Bild 3: Placering av ISCAs i kapslingen och tätning genom tejpning. (A) Placera monteringsskruvarna i ISCA. (B) ISCA placering i distributionshöljet. Placera ISCA i mitten av distributionshöljet och fäst den med de angivna skruvarna. Kapslingens nedre dräneringshål måste tätas med en modifierad 20 μL-spets (Bild 4) när kapslingen är fylld med vatten. Detta bidrar till att undvika generering av turbulenta flöden som kan påverka stabiliteten i det kemiska fältet och effektiviteten av chemotaxis. (C) De övre och nedre delarna är ihopmonterade. (D) Försegling av kapslingen med hjälp av självhäftande tejp. Rynkor måste undvikas för att förhindra läckor. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Bild 4: Plugg för tätning av flödesdämpande kapslingen. Kontakten kan göras genom att täta en 20 μL pipettspets med värme. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 5: Chemotaxis-analyser som använder ISCA mot glutamin av ett berikat motilsamhälle i laboratoriet och den naturliga mikrobiella populationen på området. Chemotaxis index I_c (som representerar koncentrationen av celler inom ISCA brunnar) normaliseras genom medelvärdet koncentration av celler inom brunnarna som innehåller det filtrerade havsvattnet (FSW) efter 60 min av utbyggnaden. Varje koncentration testades i fem ISCA-replikat. Bakterieceller kvantifierades genom flödescytometri (A): FSW = 4,46 ± 0,25 x 10³; 100 μM = 2,43 ± 0,16 x 10⁴; 1 mM = 8,07 ± 0,45 x 10⁴; 10 mM = 3,28 ± 0,20 x 10⁴; (B): FSW = 1,26 ± 0,11 x 10⁴; 1 mM = 3,76 ± 0,28 x 10⁴ celler/mL). Alla koncentrationer av glutamin som testades i (A) laboratoriet och (B) fältet inducerade ett chemotaktiskt svar betydligt högre än de filtrerade havsvatten (FSW) kontroller. I alla parvis jämförelser: (A) Tukey HSD, n = 5, p < 0.005; (B) Tukey HSD, n = 5, p < 0.005. Felfält representerar SEM. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Fältmaterial	Kvantitet
Vatten filtrering
Rörställ - 50 mL	1
Hydrofil GP-filterpatron - 0,2 μm	1
Spruta filter - 0,2 μm	1
Spruta filter - 0,02 μm	1
Sprutor - 50 mL	4
Konisk centrifugrör - 50 mL	5
Kemisk återfingredning
Konisk centrifugrör - 15 mL	4
Chemoattractants
Sprutor - 10 mL	4
Spruta filter - 0,2 μm	4
Rörrack - 15 mL	1
ISCA fyllning
Spruta nål 27G	4
Spruta - 1 mL	4
Isca	1
Distribution
Distributionshölje	1
Nylon slitsade platt huvud skruvar	2
Utplacering arm	1
Bungee sladd	2
Tejp	1
Plugg för driftshölje för distribution	1
Prover hämtning
Spruta nål 27G	4
Sprutor - 1 mL	4
Centrifugeringsrör - 2 mL	12
Engångsrutttorkare	1 låda
Glutaraldehyd 25%	10 mL
Övrigt material
Pipetter set	1
Pipettspetsar 200 μL	1 låda
Pipettspetsar 20 μL	1 låda
Pipettspetsar 1 mL	1 låda

Tabell 1: Material som är nödvändiga för fältdistribution.

Discussion

På skalan av vattenlevande mikroorganismer, är miljön långt ifrån homogen och kännetecknas ofta av fysikaliska / kemiska gradienter som strukturerar mikrobiella samhällen^1,15. Kapaciteten hos motil mikroorganismer att använda beteende (dvs. chemotaxis) underlättar födosök inom dessa heterogena mikromiljöer¹. Att studera kemotaxis direkt i miljön har potential att identifiera viktiga interspecifika interaktioner och kemiska preferenser, och detta kan hjälpa till att reda ut bidragen från specifika mikrober till biogeokemiska processer. Det presenterade protokollet distribuerar ISCA i miljön^{11 för} att underlätta förvärv av reproducerbar forskning om chemotaxis in situ.

Med hjälp av ISCA, det visas att glutamin framkallar en positiv chemotactic svar både i laboratorieförhållanden och i fältet. ISCA-utplaceringen av glutamin på fältet ger ett lägre chemotactic svar än i laboratoriet (figur 5). Liknande patters mellan laboratoriet och fältexperiment har observerats tidigare¹¹. Dessa kan förklaras av den lägre andelen motilceller i miljön jämfört med de berikade samhällena eller ett enda motilisolet som används i laboratorieanalyser.

Betydelsen av preliminära laboratoriebaserade experiment bör inte underskattas, eftersom de tillåter fastställande av optimala kemoterapiritningskoncentrationer att använda i fältutplaceringar. Den optimala koncentrationen är specifik för varje kemoattrater och påverkas av dess molekylvikt, löslighet och diffusivitet från brunnarna. Vid utplacering av flera olika ämnen bör var och en testas individuellt över ett koncentrationsområde. Om ingen kemotaxis upptäcks i fältet efter 1 h, längre distributioner kan utföras. Längden på utplaceringen begränsas dock starkt av bakterietillväxt och bör alltid vara kortare än uppdelningen av bakterier i den riktade miljön. Detta bidrar till att undvika befolkningstillväxt inom ISCA.

ISCA är känslig för vattenturbulens och försiktighet bör tas vid påfyllning och tömning av flödesdämpande kapsling. Dessa steg måste utföras långsamt, eftersom flöden till följd av snabb fyllning kan spola eller späda ut innehållet i brunnarna. Som ett resultat, detta tar bort eller förhindrar chemoattractants från att sprida ordentligt eller införa bakterier från den omgivande miljön, i slutändan partisk cell räknas. Fullt fylla inneslutningen med vatten medan ventilera all luft, sedan stänga den helt, säkerställer att turbulens inte kommer att störa utbyggnaden. Att samla in metadata på utplaceringsplatsen (dvs. temperatur, salthalt, klorofyll/näringskoncentration) är också ett kritiskt steg för att tolka resultat, eftersom dessa faktorer kan påverka chemotaxis.

ISCA är en tillgänglig, användarvänlig enhet som ger nya insikter i chemotaxis roll och prevalens i miljön. Det möjliggör förhör av chemotaxis i alla system som innehåller en flytande fas (t.ex. marin, sötvatten, mark, avloppsvattensystem). Slutligen kan den användas för riktade studier av patogener och antibiotikaresistens i miljön, isolering av viktiga mikrober för bioprospecting, och bioremediering av specifika föroreningar och mikroplaster.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic glue	Evonik	1133	Acrifix 1S 0116
Acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K725	Or different company
Adhesive tape	Scotch	3M 810	Scotch Magic tape
Autoclave	Systec	D-200	Or different company
Benchtop centrifuge	Fisher Scientific	75002451	Or different company
Bungee cord	Paracord Planet	667569184000	Or different company
Centrifuge tube - 2 mL	Sigma Aldrich	BR780546-500EA	Eppendorf tube
Conical centrifuge tube - 15 mL	Fisher Scientific	11507411	Falcon tube
Conical centrifuge tube - 50 mL	Fisher Scientific	10788561	Falcon tube
Deployment arm	Irwin	1964719	Or different company
Deployment enclosure plug	Fisher Scientific	21-236-4	See alternatives in manuscript
Disposable wipers	Kimtech - Fisher Scientific	06-666	Kimwipes
Flow cytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%	Sigma Aldrich	G5882	Or different company
Green fluorescent dye	Sigma Aldrich	S9430	SYBR Green I - 1:10,000 final dilution
Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm	Merck	C3235	Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)	-	-	Contact corresponding authors
Laser cutter	Epilog Laser	Fusion pro 32	Or different company
Luria Bertani Broth	Sigma Aldrich	L3022	Or different company
Marine Broth 2216	VWR	90004-006	Difco
Nylon slotted flat head screws	McMaster-Carr	92929A243	M 2 × 4 × 8 mm
Pipette set	Fisher Scientific	05-403-151	Or different company
Pipette tips - 1 mL	Fisher Scientific	21-236-2A	Or different company
Pipette tips - 20 µL	Fisher Scientific	21-236-4	Or different company
Pipette tips - 200 µL	Fisher Scientific	21-236-1	Or different company
Sea salt	Sigma Aldrich	S9883	For artificial seawater
Serological pipette - 50 mL	Sigma Aldrich	SIAL1490-100EA	Or different company
Syringe filter - 0.02 µm	Whatman	WHA68091002	Anatop filter
Syringe filter - 0.2 µm	Fisher Scientific	10695211	Or different company
Syringe needle 27G	Henke Sass Wolf	4710004020	0.4 × 12 mm
Syringes - 1 mL	Codau	329650	Insulin Luer U-100
Syringes - 10 mL	BD	303134	Or different company
Syringes - 50 mL	BD	15899152	Or different company
Tube rack - 15 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Tube rack - 50 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap	McMaster-Carr	8305A77	Or different company
Vacuum filter - 0.2 µm	Merck	SCGPS05RE	Steritop filter