Summary
Здесь представлен протокол анализа химиотерапии на месте, недавно разработанного микрофлюидного устройства, позволяющего проводить исследования микробного поведения непосредственно в окружающей среде.
Abstract
Микробное поведение, такое как подвижность и хемотаксис (способность клетки изменять свое движение в ответ на химический градиент), широко распространены в бактериальных и археологических областях. Хемотаксис может привести к значительным преимуществам приобретения ресурсов в неоднородных средах. Он также играет решающую роль в симбиотических взаимодействиях, болезнях и глобальных процессах, таких как биогеохимическое велоспорт. Тем не менее, современные методы ограничивают исследования хемотаксиса в лаборатории и не легко применимы в этой области. Здесь представлен пошаговая протокола для развертывания на месте химиотаксиса (ISCA), устройства, которое позволяет проводить надежные допросы микробных хемотаксисов непосредственно в естественной среде. ISCA представляет собой микрофлюидное устройство, состоящее из массива из 20 колодец, в котором могут быть загружены химические вещества, представляющие интерес. После развертывания в aqueous средах, химические вещества рассеиваются из скважин, создавая концентрационные градиенты, что микробы смысле и реагировать на плавание в скважины через хемотаксис. Содержимое хорошо может быть отобрано и использовано для (1) количественной силы хемотаксических реакций на конкретные соединения через цитометрию потока, (2) изолят и культуру отзывчивых микроорганизмов, и (3) характеризуют идентичность и геномный потенциал ответивших популяций с помощью молекулярных методов. ISCA является гибкой платформой, которая может быть развернута в любой системе с водной фазой, включая морскую, пресноводную и почву.
Introduction
Разнообразные микроорганизмы используют подвижность и хемотаксис для использования неоднородных питательных сред, найти хозяев или избежать вредныхусловий 1,,2,,3. Такое микробное поведение, в свою очередь, может влиять натемпы химической трансформации 4 и способствовать симбиотическим партнерствам между наземными, пресноводнымии морскими экосистемами 2,,5.
Хемотаксис был широко изучен в лабораторных условиях в течение последних 60 лет6. Первый количественный метод для изучения хемотаксиса, капиллярный анализ, включает в себя капиллярную трубку, наполненную осязаемым хемоаттракантом, погруженным в суспензиюбактерий 6. Диффузия химического вещества из трубки создает химический градиент, и хемотаксических бактерий реагировать на этот градиент, мигрируя втрубку 7. С момента развития капиллярного анализа, по-прежнему широко используется сегодня, многие другие методы были разработаны для изучения хемотаксиса под все более контролируемых физических / химических условиях, с последними с использованиеммикрофлюиды 8,9,10.
Микрофлюиды, наряду с высокоскоростной видео микроскопией, позволяют отслеживать поведение одиночных клеток в ответ на тщательно контролируемые градиенты. Хотя эти методы значительно улучшили наше понимание хемотаксиса, они были ограничены лабораторным использованием и не легко переводятся на развертывание на местах в экологических системах. Вследствие этого не изучена способность естественных сообществ бактерий использовать хемотаксис в естественных экосистемах; таким образом, нынешнее понимание потенциальной экологической важности хемотаксиса пристрастно к искусственным лабораторным условиям и ограниченному числу лабораторно-культурных бактериальных изолятов. Недавно разработанный ISCA преодолевает эти ограничения11.
ISCA основывается на общем принципе анализа капилляров; однако, он использует современные методы микрофабрики для доставки высоко реплицируемой, легко развертываемой экспериментальной платформы для количественной оценки хемотаксиса по отношению к соединениям, представляющим интерес в природной среде. Он также позволяет идентифицировать и идентифицировать хемотаксических микроорганизмов путем прямой изоляции или молекулярных методов. В то время как первое рабочее устройство было самофабрикатом и построено из стекла и PDMS11,последняя инъекционная версия состоит из поликарбоната, используя высокостандартизированную процедуру изготовления (для интереса к последней версии устройства, с соответствующими авторами можно связаться).
ISCA размером с кредитную карту состоит из 20 скважин, распределенных в массиве скважин 5 х 4, каждая из которых связана с внешней водной средой небольшим портом (800 мкм в диаметре; Рисунок 1). Если химиотерапия загружается в скважины, диффузные в окружающую среду через порт, и хемотатические микробы реагируют, плавая через порт в колодец. Поскольку многие факторы могут повлиять на результаты эксперимента ISCA в естественной среде, этот пошаговой протокол поможет новым пользователям преодолеть потенциальные препятствия и облегчить эффективное развертывание.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мы рекомендуем выполнять раздел 1 до полевых экспериментов для оптимизации результатов.
1. Лабораторная оптимизация
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемов, описанных в процедуре оптимизации, достаточно для одной ISCA (состоящей из 20 скважин).
- Подготовка химического вещества, представляющих интерес
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация для каждого химиоаттраканта часто должна быть определена в лабораторных условиях до развертывания на местах. Химическое концентрационое поле будет уменьшаться в величине на расстоянии от источника (ISCA хорошо), что означает, что концентрация, переживаемая микроорганизмами в окружающей среде будет ниже, чем у присутствующих внутри устройства. Оптимальная концентрация для использования в ISCA хорошо зависит от скорости диффузии химиоаттраканта. Если концентрация в колодеце слишком низкая (близка к пределу обнаружения микробов), то положительного хемотаксиса не наблюдается. И наоборот, если концентрация в колодцах слишком высока, концентрация также будет высокой в непосредственной среде, и накопление микробов будет происходить над скважинами ISCA, а не внутри. Поэтому серия разбавления должна проводиться в лабораторных условиях для каждого соединения, с тем чтобы определить оптимальную концентрацию для развертывания на местах. В идеале, диапазон концентрации должен также быть протестирован в полевых условиях для подтверждения лабораторных результатов.- Приготовьте 2,5 л подходящей среды, содержащей соответствующую концентрацию соли (например, фосфатно-буферный солевой раствор (PBS) или искусственную морскую воду). Фильтруйте среду с помощью фильтра 0,2 мкм с помощью перистального или вакуумного насоса и автоклава.
- Приготовьте 10 мМ раствор химиоаттраканта в 1 мл стерильной среды. Фильтровать раствор химиоаттраканта с помощью фильтра шприца 0,2 мкм для удаления частиц и потенциальных загрязняющих веществ.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, никакие органические соединения, кроме химиоаттраканта, не должны присутствовать в окончательном растворе.
- Диапазон концентрации по сериям разбавления
- Разбавить фильтрованный раствор химиоаттраканта в серии, начиная (например) от 10 мМ до 100 МКМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере 0,7 мл конечного объема необходимо за концентрацию испытания.
- Разбавить фильтрованный раствор химиоаттраканта в серии, начиная (например) от 10 мМ до 100 МКМ.
- Загрузка ISCA
- Заполните шприц 1 мл с фильтрованным хемоаттрактаном и подключите его к шприцу 27 G. Удерживая ISCA с портом вверх, медленно впрыскивает вещество до тех пор, пока небольшая капля не появится на вершине порта.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Каждое разбавление или вещество должно быть введено с отдельным шприцем и иглой для предотвращения перекрестного загрязнения. 2) Эта небольшая капля имеет важное значение, поскольку она гарантирует, что ни один пузырь воздуха не оказался в ловушке в порту, что может ухудшить способность микробов мигрировать через порт. 3) Рекомендуется заполнить весь ряд на вещество или концентрацию (пять скважин), чтобы обеспечить достаточный минимальный объем для дальнейшего анализа. 4) Одна строка на ISCA должна выступать в качестве отрицательного контроля и должна быть заполнена фильтрованной средой, в которой микробы будут приостановлены. Эта обработка объясняет влияние случайной подвижности микробами в скважины ISCA и должна быть использована для нормализации лечения, содержащего хемоаттрактант.
- Заполните шприц 1 мл с фильтрованным хемоаттрактаном и подключите его к шприцу 27 G. Удерживая ISCA с портом вверх, медленно впрыскивает вещество до тех пор, пока небольшая капля не появится на вершине порта.
- Развертывание в лаборатории
- Ночью инкубировать культуру 5 мл, обогащенную 1% морского бульона (для морских бактерий) или 1% лисогенного бульона (LB, для бактерий пресной воды).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лабораторных развертываний могут использоваться более активные бактериальные изоляты или естественные бактериальные сообщества. - Инкубировать культуру на 12 ч при комнатной температуре (RT) и 180 об/мин. После 12 ч убедитесь, что микробные сообщества пестры прямым наблюдением под микроскопом.
- Спин вниз культуры на 1500 х г в течение 10 мин и повторно 1/100 в 150 мл соответствующей среды (например, фильтрованной морской воды, фильтрованной пресной воды).
- Поместите два небольших кусочка двусторонний клейкой лентой на плоскую поверхность лотка емкостью 200 мл (крышки 1 мл наконечник коробки имеют идеальные размеры для этой цели и могут быть легко autoclaved). Поместите один ISCA сверху, гарантируя, что он надежно прикрепляется к ленте. Медленно заполните лоток развертывания бактериальным раствором с помощью серологического пипетки 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Заполните лоток до тех пор, пока ISCA погружается под примерно 1-2 см жидкости. При использовании нескольких лотков используйте один и тот же объем во всех. - Оставьте ISCA инкубировать в течение 1 ч, чтобы бактериальный хемотаксис. После 1 ч, удалить средний очень осторожно с 50 мл серологической пипетки, чтобы свести к минимуму турбулентный поток.
- Извлеките ISCA из лотка развертывания, не касаясь верхней поверхности. Используйте пипетку и одноразовые стеклоочистители, чтобы удалить оставшуюся жидкость на поверхности ISCA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы избежать прикосновения к портам во время этого процесса, как в результате изменения давления может удалить или добавить бактерии из внешней среды в колодец и тем самым смещения бактериальной плотности и состава внутри хорошо.
- Ночью инкубировать культуру 5 мл, обогащенную 1% морского бульона (для морских бактерий) или 1% лисогенного бульона (LB, для бактерий пресной воды).
- Извлечение образцов
- Удерживая ISCA с портом лицом вниз, извлекать объем скважин с помощью стерильной шприц-иглы 27 G, прикрепленной к шприцу объемом 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый ряд (если он содержит одно и то же вещество) может быть объединяются, чтобы предоставить рабочую выборку из примерно 550 мл. Этот образец впоследствии может быть aliquoted в различные трубы в зависимости от необходимых приложений вниз по течению. - Определите количество бактерий, привлеченных к каждой концентрации хемоаттраканта, проанализировав образцы с цитометриейпотока 12. Выберите концентрацию химиоаттраканта, который максимизирует хемотаксис для последующего развертывания на местах.
- Удерживая ISCA с портом лицом вниз, извлекать объем скважин с помощью стерильной шприц-иглы 27 G, прикрепленной к шприцу объемом 1 мл.
2. Подготовка к развертыванию на местах
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка материала и строительство корпуса для демпфирования потока (раздел 2) должны быть проведены до развертывания.
- Подготовка материалов
- Подготовь все материалы, перечисленные в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Материальные объемы предоставляются для одного ISCA.
- Подготовь все материалы, перечисленные в таблице 1.
- Строительство и подготовка корпуса для демпфирования потока
ПРИМЕЧАНИЕ: Влажный корпус сводит к минимуму нежелательные турбулентности, которые в противном случае предотвращают создание химических градиентов, исходящих от ISCA.- Вырезать куски для развертывания корпуса с лазерным резаком из 3 мм акриловый лист.
ПРИМЕЧАНИЕ: Файл для частей можно найти по следующей ссылке: lt;https://figshare.com/articles/Flow_damping_enclosure_for_ISCA_deployments/10630220 - Соберите части лазерной резки, как попродемонстрировано на рисунке 2 с использованием акрилового клея.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите части с осторожностью. Отверстия или неправильное согласование могут создавать утечки при развертывании, что непосредственно влияет на качество данных. - Оставьте собранный корпус высохнуть на ночь.
- Вымойте вольер деионизированной водой.
- Определите потенциальную утечку путем заливки деионизированной воды в вольер. Исправить любые потенциальные утечки суставов, добавив больше акрилового клея, а затем повторить шаги 2.2.3-2.2.5.
- Вырежьте винт нити в акриловой части, которые будут использоваться для обеспечения ISCA. Это может быть достигнуто с помощью крана с диаметром и шаг соответствия монтажных винтов.
- Во-первых, прикрепить кран в кран гаечный ключ, а затем обеспечить акриловый кусок, который будет постучал в скамейке порока. Для получения наилучших результатов убедитесь, что акриловый кусок как можно более можно более ровень. Убедитесь, что кран перпендикулярно акриловой части и начать поворот гаечный ключ крана (по часовой стрелке), применяя световое давление на кран.
- После нескольких полных оборотов в акриловой части, обратить вспять вращение крана (против часовой стрелки) в течение одной четверти вращения, чтобы очистить акрил из крана. Повторите процесс до тех пор, пока вся глубина акриловой части постучал.
- Наконец, удалите кран (поворот против часовой стрелки) и проверьте нити с помощью винта.
- Вырезать куски для развертывания корпуса с лазерным резаком из 3 мм акриловый лист.
3. Процедура в полевых условиях
- Фильтрация воды
- Соберите воду с места поля, когда готовы начать эксперимент. Фильтр 5 мл воды на ISCA через фильтр шприца 0,2 мкм (со шприцем 50 мл) в 50 мл конической центрифуги трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для заполнения всех колодцев ISCA требуется около 3 мл фильтрованной воды; однако рекомендуется 1) фильтровать 5 мл на устройство для учета потерь в процессе четырехкратной фильтрации, а 2) сохранять алициты фильтратов в качестве отрицательного контроля как для цитометрии потока, так и для молекулярных процедур. - Фильтровать фильтр дважды через 0,2 мкм гидрофильных GP фильтр картриджа (с использованием одного и того же, оба раза) с новым 50 мл шприца в новый 50 мл конической центрифуги трубки. Фильтровать фильтр через фильтр шприца 0,02 мкм (с новым шприцем 50 мл) в новую коническую трубку 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта четырехкратная фильтрация должна удалить почти все микроорганизмы и частицы из воды. Держите окончательный фильтрат подальше от любого источника тепла до использования. Эта вода будет использоваться для повторного использования всех химических веществ, используемых в ISCA, и она должна поддерживаться при той же температуре, что и вода на месте развертывания. В противном случае могут возникать конвективные потоки, вызванные различиями в температуре между скважинами ISCA и внешней средой. - Используйте алициты фильтрата для повторного использования всех хемоаттракантов, представляющих интерес (обычно сухой) в желаемых концентрациях в 15 мл конической центрифуги труб.
- Фильтр повторного использования химиоатрактрактантов через фильтр шприца 0,2 мкм с шприцем 10 мл в стерильные 15 мл конической центрифуги труб для удаления нежелательных частиц или водорастворимых соединений (при использовании экстрактов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр осторожно, чтобы предотвратить частицы от прохождения через фильтр. Важно повторно использовать хемоаттрактаны в ультрафильтрованной воде с места месторождения и не растворять их в другие растворы. Использование воды с участка месторождения необходимо для того, чтобы (1) получить ту же концентрацию соли внутри скважин, что и в основных экологических водах для предотвращения потока, обусловленного плотностью, и (2) гарантировать, что уровни фоновых питательных веществ равны внутри и за пределами скважины.
- Соберите воду с места поля, когда готовы начать эксперимент. Фильтр 5 мл воды на ISCA через фильтр шприца 0,2 мкм (со шприцем 50 мл) в 50 мл конической центрифуги трубки.
- Заполнение ISCA
- Выполните раздел 1.3, чтобы заполнить ISCA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется заполнить один ряд (пять скважин) на одно вещество (т.е. три различных вещества на ISCA и один ультрафильтрованный контроль морской воды).
- Выполните раздел 1.3, чтобы заполнить ISCA.
- Развертывание на местах
- Винт ISCA (Рисунок 3A) кусок 9 корпуса (Рисунок 2K и рисунок 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Заслонка потока корпус, изложенный выше, может содержать два ISCA бок о бок или один ISCA размещены в его центре. - Закройте корпус(рисунок 3C) и запечатав его клейкой лентой(рисунок 3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Морщины следует избегать, чтобы обеспечить идеальное уплотнение. Печать со всех сторон, а затем (на втором шаге) печать боковых отверстий, которые будут использоваться для слива воды из корпуса в конце выборки. Не запечатывая верхние и нижние отверстия. Не развешив ISCA вверх дном, так как поток, управляемый плотностью, может возникать в скважинах, содержащих хемоаттрактаны, что приведет к смещениям количества клеток в скважинах. - Поскольку корпус должен оставаться устойчивым во время развертывания, рекомендуется прикрепить его к искусственным конструкциям (например, понтону, лестнице) с использованием банджи-кордов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Корпус может быть прикреплен к рукоятке развертывания (здесь модифицированный зажим с перпендикулярной платформой) с использованием банджи-шнуров перед погружением в воду. Кроме того, корпус может быть заполнен и закреплен с небольшим весом на мелких субстратах. Если развертывание предназначено в пелагической океан, корпус может быть прикреплен к сети с буем с одной стороны и нырять вес с другой. - Погрузить корпус полностью, чтобы начать заполнение. При заполнении, держите корпус твердо, чтобы предотвратить чрезмерное движение воды внутри. Как только уровень воды достигнет верхней части корпуса, убедитесь, что нет воздуха в ловушке внутри.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если некоторые пузырьки воздуха оказались в ловушке, наклоните корпус мягко с вентиляционным отверстием лицом вверх, что позволит пузырьки бежать. - После того, как полностью полный, печать нижней и верхней отверстия с двумя пробками, которые могут быть сделаны из кремния или резины или путем уплотнения конечностей 20 йл пипетки советы (Рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предотвращает поток внутри корпуса во время отбора проб. - Оставьте ISCA на месте для отбора проб на 1-3 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальное время развертывания в первую очередь продиктовано температурой воды и удвоением времени бактериального сообщества. При температуре воды выше 20 градусов по Цельсию не рекомендуется развертывать ISCA более 1 ч, так как деление клеток может происходить в скважинах, содержащих химиоаттраканты после 1,5-2,0 ч. Тем не менее, оптимальное время развертывания может быть проверено до эксперимента ISCA путем внесения изменений в естественные сообщества с загруженными химическими веществами и количественного количества клеток с течением времени. - Снимите вольер с воды. Поместите его на контейнер, позволяющий слить воду из вольера.
- Удалите верхнюю часть клейкой ленты с передних отверстий очень осторожно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поток воды, покидающей вольер, должен быть на капающей скорости. Пройти одно отверстие за один раз, от верхней части корпуса на дно. Это должно занять примерно 10-15 минут, чтобы полностью осушить корпус. - После того, как валиния проходит ниже верхней части ISCA, удалить нижнюю вилку, и слейте остальную часть воды.
- В то время как ISCAs по-прежнему прикреплены к корпусу, тщательно удалите воду, захваченную на вершине ISCA с 1 мл пипетки.
- Удалите ISCA, не касаясь верхней поверхности и используйте одноразовую салфетку, чтобы удалить оставшуюся жидкость на поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не прикасаться к портам во время этого процесса, так как в результате изменения давления может удалить или добавить объем бактерий в колодец и смещения бактериальных рассчитывает. - Извлеките образцы из ISCA, повторив шаг 1.5.1.
- Винт ISCA (Рисунок 3A) кусок 9 корпуса (Рисунок 2K и рисунок 3B).
4. Заявки вниз по течению
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы даются на основе образца 550 йл (один ряд ISCA).
- Исправить 100 МКЛ содержимого хорошо с глутаралдегидом (2% конечной концентрации) для цитометрии потока для количественной оценки хемотаксиса для каждого привкусанта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить на льду (или при 4 градусов по Цельсию) и анализировать образцы в тот же день. Кроме того, образцы могут быть заморожены в жидком азоте после фиксации, если анализ не представляется возможным в тот же день. Цитометрия потока является рекомендуемым методом количественной оценки количества клеток в скважинах ISCA, так как она проста, быстра и точна12. - Snap заморозить 300 МКЛ содержания хорошо в жидком азоте для последующей извлечения ДНК ианализа 11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы при -80 градусов по Цельсию до анализа. - Добавьте 90 мкл содержимого хорошо в 10 МКЛ буфера TE-глицерол и заморозить образцы для одноклеточной геномики13.
- Распространение 10-20 МКЛ на агарных пластин, содержащих желаемую среду для бактериальной изоляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом разделе представлены лабораторные результаты с использованием ISCA для проверки хемотаксической реакции морских микробов на диапазон концентрации глутамина, аминокислоты, известной для привлечения почвенныхбактерий 14. Концентрация глутамина, вызвавшая сильнейший химиотатический ответ в лабораторных испытаниях, была использована для проведения анализа хемотаксиса в морской среде.
Для проведения лабораторных испытаний сообщества морской воды, отобранные из прибрежных вод в Сиднее, Австралия, были обогащены для подвижных клеток с помощью простойпоправки к питательным веществам 4,как описано в шаге 1.4. Глутамин был последовательно разбавлен в ультрафильтрованной морской воде для получения окончательных концентраций в диапазоне от 10 мМ до 100 МКМ. Пять репликаций ISCA были развернуты одновременно для этого эксперимента, и каждый из них содержал три различных концентрации глутамина (одна концентрация на ряд), а также отфильтрованный ряд управления морской водой. После развертывания в 1 ч содержимое каждого ряда ISCA (содержащего ту же концентрацию глутамина) было объединяются для предоставления рабочих образцов примерно 550 МЛ. Этот объем был зафиксирован в глутаралдегиде (2% конечной концентрации), а количество реагирующихся бактерий количественно измеряется с помощью цитометрии потока.
Кратко, бактериальное изобилие было количественно 1) окрашивание клеток с зеленым флуоресцентным красителем ДНК и 2) анализ с использованием потока цитометра с ультрафильтрованной деионизированной воды, как оболочка жидкости. Для каждого образца были зарегистрированы рассеяние вперед (FSC), боковое рассеяние (SSC) и зеленая флуоресценция. Образцы были проанализированы со скоростью потока 25 МКЛ/мин, при этом бактериальные клетки дискриминировались в соответствии с SSC и зеленой флуоресценцией. Химиотатический индекс(I c)cбыл определен путем деления бактериальных подсчетов, присутствующих в каждом образце, на усреднечные количество бактерий в фильтрованных скважинах управления морской водой (FSW).
Результаты показали, что 1 мМ была оптимальной концентрацией глутамина, так как она индуцирована значительный хемотаксическая реакция, которая была в 18 раз выше, чем фильтрованная контроль морской воды(t-test, p lt; 0.001) (Рисунок 5A). Более высокие или более низкие концентрации глутамина, индуцированные значительными, но более слабыми хемотаксическими реакциями(Ic q 5.43 для 100 ЗМ, p lt; 0.001; Ic 7,34 евро за 10 МКМ, р-л; 0,001). Если концентрация химиоаттраканта, добавленная в колодец ISCA, слишком высока, химиотаксис в колодец может быть уменьшен, потому что (1) бактерии не смогут обнаружить градиент в разделе порта и могут агрегировать выше хорошо, или (2) рН или осмолярность хорошо могут быть затронуты.
Оптимальная концентрация глутамина впоследствии использовалась для развертывания на местах. Пять репликаций ISCA, наполненных 1 мМ глутамина были развернуты в течение 1 ч на прибрежном участке недалеко от Сиднея, Австралия (33,91 S, 151,26 ЕВРО). Глутамин привлек в 2,98 раза больше бактерий, чем контрольные скважины, заполненные фильтрованной морской водой с местаразвертывания (рисунок 5B). Химиотатический ответ в этом полевом эксперименте значительно отличался от элементов управления(t-test, p lt; 0.001) и представлял собой сильную реакцию на прибрежную морскуюводу 11.
Рисунок 1: Подробные представления анализа химиотерапии на месте (ISCA). (A)Последние инъекции формованных ISCA. (B)Схема хорошо ISCA. Масштабная планка 7,463 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 2: Сборка корпуса для демпфирования потока. (A)части, необходимые для сборки корпуса развертывания. Во время изготовления края должны быть гладкими. (B) Место штук 2a, 2b, 3a, и 3b вокруг части 1 (нижняя поверхность). (C) Соберите нижнюю часть корпуса, поставив тонкий слой акрилового клея вокруг первого края нижней поверхности (1). (D) Поместите первый более длинный кусок боковины (2a) вертикально на клей и удерживайте его на месте. Клей требует 1 мин, чтобы укрепить и позволяет кусок 2a, чтобы поддержать себя при размещении следующего элемента. (E) Нанесите тонкий слой акрилового клея на нижнюю поверхность на более короткой стороне куска 1. Поместите короткий кусок боковины (3a) на акриловый клей и заблокив его в ранее размещенную боковину. Держите две части в течение примерно 1 мин. (F) Поместите другой короткий кусок боковины (3b) на противоположную сторону нижней поверхности (1). Опять же, запереть его в соединительный кусок (2a) и держать его в течение примерно 1 мин. (G) При необходимости, повторно акриловый клей на оставшуюся длинную сторону нижней поверхности (1). Поместите последний длинный кусок боковины (2b) и соедините его в две смежные части (3a и 3b). Убедитесь, что все части должным образом выровнены с нижней части (1) и что никаких признаков несогласованности или зазоры между боковинами или нижней поверхности присутствуют. Повторите эти шаги, чтобы собрать дополнительную верхнюю часть корпуса (4, 5a, 5b, 6a и 6b). (H) Убедитесь, что отверстие в углу части 4 не препятствует во время сборки, в противном случае удар открытия с острым предметом, таким как игла. Отверстия корпуса играют решающую роль в процессе развертывания и позволяют медленно и контролируемо сливать воду. Их диаметр был оптимизирован для уменьшения турбулентного потока внутри корпуса, что предотвращает нарушение жидкости, окружающей порты ISCA при извлечении. (Иа, б) Склейте два больших прямоугольника (7) и отдельно склейте два меньших (8). Повторите один раз для каждого. (J) Клей четыре собранных прямоугольника в центре нижней поверхности корпуса (1). (K) Клей верхней палубе (9) в верхней части прямоугольников (7 и 8). Убедитесь, что боковые отверстия кусок находятся на внешней стороне прямоугольников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Размещение ISCAs в корпусе и уплотнения путем лентой. (A)Поместите монтажные винты в ISCA. (B)размещение ISCA в корпусе развертывания. Поместите ISCA в середину корпуса развертывания и прикрепите его с указанными винтами. Нижнее дренажное отверстие корпуса должно быть запечатано модифицированным наконечником 20 МКЛ(рисунок 4)после заполнения корпуса водой. Это помогает избежать генерации турбулентных потоков, которые могут повлиять на стабильность химического поля и эффективность хемотаксиса. (C)Верхняя и нижняя части собраны вместе. (D)Уплотнение корпуса с помощью клейкой ленты. Морщины следует избегать, чтобы предотвратить утечки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Подключите для уплотнения потока демпфирования корпуса. Вилка может быть сделана путем уплотнения 20 йл пипетки кончик с теплом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Chemotaxis анализы с использованием ISCA к глутамин обогащенного подвижного сообщества в лаборатории и природных микробных популяций в этой области. Индекс хемотаксиса Ic (представляющий концентрацию клеток в скважинах ISCA) нормализуется по среднему концентрации клеток в скважинах, содержащих фильтрованную морскую воду (FSW) после 60 минут развертывания. Каждая концентрация была протестирована в пяти репликациях ISCA. Бактериальные клетки были количественно по цитометрии потока (A): FSW 4,46 и 0,25 х 103; 100 МКМ 2,43 и 0,16 х 104; 1 мМ й 8,07 и 0,45 х 104; 10 мМм - 3,28 - 0,20 х 104; (B): FSW 1,26 и 0,11 x 104; 1 мМм - 3,76 - 0,28 х 104 ячейки/мл). Все концентрации глутамина, протестированные в лаборатории (A) и (B) поле индуцированных хемотаксических ответ значительно выше, чем фильтрованная морская вода (FSW) контроля. Во всех парных сравнениях: (A) Tukey HSD, n No 5, p lt; 0.005; (B) Туки HSD, n No 5, р йл; 0,005. Бары ошибок представляют SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Полевой материал | Количество |
| Фильтрация воды | |
| Стойка для труб - 50 мл | 1 |
| Гидрофильные картриджи фильтра GP - 0,2 мкм | 1 |
| Шприц-фильтр - 0,2 мкм | 1 |
| Шприц-фильтр - 0,02 мкм | 1 |
| Шприцы - 50 мл | 4 |
| Коническая центрифуга трубка - 50 мл | 5 |
| Химическое повторное успение | |
| Коническая центрифуга трубка - 15 мл | 4 |
| Химиоаттрацанты | |
| Шприцы - 10 мл | 4 |
| Шприц-фильтр - 0,2 мкм | 4 |
| Стойка для труб - 15 мл | 1 |
| Заполнение ISCA | |
| Шприц иглы 27G | 4 |
| Шприц - 1 мл | 4 |
| ИСКА | 1 |
| Развертывания | |
| Развертывание корпуса | 1 |
| Нейлон прорези плоские головные винты | 2 |
| Развертывание руки | 1 |
| Банджи шнур | 2 |
| Клеевая лента | 1 |
| Вилка корпуса развертывания | 1 |
| Поиск образцов | |
| Шприц иглы 27G | 4 |
| Шприцы - 1 мл | 4 |
| Центрифуга трубка - 2 мл | 12 |
| Одноразовые стеклоочистители | 1 коробка |
| Глутаралдехайд 25% | 10 мл |
| Прочие материалы | |
| Пипетки набор | 1 |
| Пипетт советы 200 йл | 1 коробка |
| Пипетт советы 20 йл | 1 коробка |
| Пипетт советы 1 мл | 1 коробка |
Таблица 1: Материалы, необходимые для развертывания на местах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В масштабе водных микроорганизмов окружающая среда далека от однородной и часто характеризуется физическими/химическими градиентами, которые структурироватьмикробные сообщества 1,15. Способность разношерстных микроорганизмов использовать поведение (т.е. хемотаксис) облегчает кормление в рамках этих неоднородных микроокнороний1. Изучение хемотаксиса непосредственно в окружающей среде имеет потенциал для выявления важных межвидовых взаимодействий и химических предпочтений, и это может помочь распутать вклад конкретных микробов в биогеохимические процессы. Представленный протокол развертывает ISCA в среде11 для облегчения приобретения воспроизводимых исследований по хемотаксису на месте.
Использование ISCA, показано, что глутамин вызывает положительный хемотатический ответ как в лабораторных условиях и в полевых условиях. Развертывание ISCA глутамина в полевых условиях дает более низкий химиотематтический ответ, чем в лаборатории(рисунок 5). Подобные скороговорки между лабораторными и полевыми экспериментами наблюдались ранее11. Это можно объяснить более низкой долей подвижных клеток в окружающей среде по сравнению с обогащенными сообществами или одной подвижной изоляцией, используемой в лабораторных анализах.
Важность предварительных лабораторных экспериментов не следует недооценивать, поскольку они позволяют определить оптимальные концентрации хемоаттраканта для использования в полевых развертываниях. Оптимальная концентрация специфична для каждого хемоаттраканта и зависит от его молекулярного веса, солуолюбия и диффузивности скважин. В случае развертывания нескольких различных веществ каждый из них должен проходить индивидуальную проверку в пределах диапазона концентрации. Если после 1 ч в поле не обнаруживается хемотаксис, можно проводить более длительные развертывания. Тем не менее, продолжительность развертывания сильно сдерживается ростом бактерий и всегда должна быть короче, чем скорость деления бактерий в целевой среде. Это помогает избежать роста населения в рамках ISCA.
ISCA чувствителен к турбулентности воды и следует позаботиться при заполнении и опорожнения потока демпфирования корпуса. Эти шаги должны выполняться медленно, так как потоки в результате быстрой заполнения могут промыть или разбавить содержимое скважин. В результате, это удаляет или предотвращает хемоаттраканты от диффузии должным образом или введения бактерий из окружающей среды, в конечном счете смещения клеток рассчитывает. Полное заполнение корпуса водой при вентиляции всего воздуха, а затем его полное закрытие гарантирует, что турбулентность не помешает развертыванию. Сбор метаданных на месте развертывания (т.е. температура, соленость, хлорофилл/концентрация питательных веществ) также является важным шагом для интерпретации результатов, поскольку эти факторы могут влиять на хемотаксис.
ISCA является доступным, удобным устройством, которое дает новое представление о роли и распространенности хемотаксиса в окружающей среде. Это позволяет проводить исследования хемотаксиса в любой системе, содержащей жидкую фазу (например, морские, пресноводные, почвенные, сточные воды). Наконец, он может быть использован для целевых исследований патогенов и устойчивости к антибиотикам в окружающей среде, изоляции ключевых микробов для биоразведки и биовосстановления конкретных загрязнителей и микропластика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было частично профинансировано Гордон и Бетти Мур Фонд морской микробиологии инициативы, через грант GBMF3801 ДЛЯ JRS и Р.С., и следователь премии (GBMF3783) для Р.С., а также стипендию Австралийского исследовательского совета (DE160100636) J.B.R., награду от Фонда Саймонс до B.S.L. (594111) и грант Фонда Симонс (542395) Р.С. в рамках Принципов микробных экосистем (PriME) Сотрудничество.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube - 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | - | - | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips - 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips - 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter - 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter - 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes - 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes - 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes - 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter - 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J.
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R.
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
