Summary
Præsenteret her er protokollen for en in situ chemotaxis assay, en nyligt udviklet mikrofluidic enhed, der muliggør undersøgelser af mikrobiel adfærd direkte i miljøet.
Abstract
Mikrobiel adfærd, såsom motilitet og chemotaxis (en celles evne til at ændre dens bevægelse som reaktion på en kemisk gradient), er udbredt på tværs af de bakterielle og arkaeale domæner. Chemotaxis kan resultere i betydelige fordele ved ressourceerhvervelse i heterogene miljøer. Det spiller også en afgørende rolle i symbiotiske interaktioner, sygdom og globale processer, såsom biogeokemisk cykling. De nuværende teknikker begrænser imidlertid chemotaxis-forskningen til laboratoriet og kan ikke let anvendes på området. Præsenteret her er en trin-for-trin protokol for indsættelsen af in situ chemotaxis assay (ISCA), en enhed, der muliggør robust forhør af mikrobielle chemotaxis direkte i det naturlige miljø. ISCA er en mikrofluidisk enhed bestående af et 20 brøndsystem, hvor kemikalier af interesse kan indlæses. Når indsat i vandige miljøer, kemikalier diffuse ud af brøndene, skabe koncentration gradienter, mikrober forstand og reagere på ved at svømme ind i brøndene via chemotaxis. Brøndindholdet kan derefter udtages prøver og bruges til (1) kvantificering af styrken af de chemotactic reaktioner på specifikke forbindelser gennem flow cytometri, (2) isolere og kultur lydhør mikroorganismer, og (3) karakterisere identitet og genomiske potentiale af de responderende populationer gennem molekylære teknikker. ISCA er en fleksibel platform, der kan implementeres i ethvert system med en vandig fase, herunder hav-, ferskvands- og jordmiljøer.
Introduction
Forskellige mikroorganismer bruger motilitet og chemotaxis til at udnytte spredte næringsstof miljøer, finde værter, eller undgå skadelige betingelser1,,2,3. Denne mikrobielle adfærd kan igen påvirke satserne for kemisk transformation4 og fremme symbiotiske partnerskaber på tværs af terrestriske, ferskvands- og marine økosystemer2,5.
Chemotaxis er blevet grundigt undersøgt under laboratorieforhold i de sidste 60 år6. Den første kvantitative metode til at studere chemotaxis, kapillær analyse, indebærer en kapillær rør fyldt med en formodede kemoattractant nedsænket i en suspension af bakterier6. Diffusion af kemikaliet ud af røret skaber en kemisk gradient, og chemotactic bakterier reagerer på denne gradient ved at migrere ind i røret7. Siden udviklingen af kapillær analyse, der stadig anvendes i vid udstrækning i dag, er der udviklet mange andre teknikker til at studere chemotaxis under stadig mere kontrollerede fysiske/kemiske forhold, hvor den seneste involverer anvendelse af mikrofluidics8,9,10.
Microfluidics, sammen med højhastighedsvideomikroskopi, gør det muligt at spore adfærden af enkelte celler som reaktion på omhyggeligt kontrollerede gradienter. Selv om disse teknikker har væsentligt forbedret vores forståelse af chemotaxis, har de været begrænset til laboratoriebrug og ikke oversætte let til felt implementering i miljøsystemer. Som følge heraf er bakteriernes evne til at anvende chemotaxis i naturlige økosystemer ikke blevet undersøgt. således er den nuværende forståelse af den potentielle økologiske betydning af chemotaxis forudindtaget mod kunstige laboratorieforhold og et begrænset antal laboratorie-dyrkede bakterielle isolater. Den nyligt udviklede ISCA overvinder disse begrænsninger11.
ISCA bygger på det generelle princip i kapillær analysen; men det gør brug af moderne mikrofabrikation teknikker til at levere en meget replikeret, let deployerbare eksperimentelle platform til kvantificering af chemotaxis mod forbindelser af interesse i det naturlige miljø. Det giver også mulighed for identifikation og karakterisering af chemotactic mikroorganismer ved direkte isolation eller molekylære teknikker. Mens den første arbejdsenhed var selvfabrikeret og konstrueret af glas og PDMS11, den nyeste sprøjtestøbt version er sammensat af polycarbonat, ved hjælp af en meget standardiseret fabrikation procedure (for interesse i den nyeste version af enheden, de tilsvarende forfattere kan kontaktes).
ISCA er kreditkortstørrelse og består af 20 brønde fordelt i et 5 x 4 brøndsystem, der hver især er forbundet med det eksterne vandmiljø ved en lille port (800 μm i diameter; Figur 1). Formodede chemoattractants læsset ind i brøndene diffuse i miljøet via havnen, og chemotactic mikrober reagere ved at svømme gennem havnen i brønden. Da mange faktorer kan påvirke resultatet af et ISCA-eksperiment i det naturlige miljø, vil denne trinvise protokol hjælpe nye brugere med at overvinde potentielle forhindringer og lette effektive implementeringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi anbefaler, at du udfører afsnit 1 før felteksperimenter for at optimere resultaterne.
1. Laboratorieoptimering
BEMÆRK: De mængder, der er beskrevet i optimeringsproceduren, er tilstrækkelige til en enkelt ISCA (bestående af 20 brønde).
- Fremstilling af kemikaliet af interesse
BEMÆRK: Den optimale koncentration for hvert kemoattractant skal ofte bestemmes under laboratorieforhold forud for feltindsættelser. Det kemiske koncentrationsfelt vil falde i størrelsesorden med afstand fra kilden (ISCA godt), hvilket betyder, at den koncentration, der opleves af mikroorganismer i miljøet, vil være lavere end den, der findes inde i enheden. Den optimale koncentration, der skal anvendes i ISCA-brønden, afhænger af kemoattractmidlets diffusionshastighed. Hvis koncentrationen i brønden er for lav (tæt på mikroberenes detektionsgrænse), vil der ikke blive observeret nogen positiv chemotaxis. Omvendt, hvis koncentrationen i brønden er for høj, vil koncentrationen også være høj i det umiddelbare miljø og mikrobiel akkumulering vil forekomme over ISCA brønde snarere end indeni. Derfor bør fortyndingsserier udføres under laboratorieforhold for hver forbindelse for at bestemme den optimale koncentration for feltint implementeringer. Ideelt set bør et koncentrationsområde også testes i marken for at bekræfte laboratorieresultater.- Der klargøres 2,5 L af et egnet medium, der indeholder den relevante saltkoncentration (f.eks. fosfatbufferet saltvand [PBS] eller kunstigt havvand). Mediet filtreres med et 0,2 μm filter ved hjælp af en peristaltisk pumpe eller vakuumpumpe og autoklave.
- Der klargøres en 10 mM opløsning af kemoattractant i 1 ml af det sterile medium. Chemoattractantopløsningen filtreres med et sprøjtefilter på 0,2 μm for at fjerne partikler og potentielle forurenende stoffer.
BEMÆRK: Ideelt set bør der ikke være andre organiske forbindelser end kemoattractanten i den endelige opløsning.
- Koncentrationsområde efter fortyndingsserie
- Den filtrerede kemoattractant stamopløsning fortyndes i serie, f.eks.
BEMÆRK: Der kræves mindst et slutvolumen på 0,7 ml pr. testet koncentration.
- Den filtrerede kemoattractant stamopløsning fortyndes i serie, f.eks.
- Indlæser ISCA
- Fyld en 1 ml sprøjte med det filtrerede kemoattractvæske, og tilslut den til en 27 G sprøjte. Hold ISCA med porten opad, injicer langsomt stoffet, indtil der vises en lille dråbe oven på havnen.
BEMÆRK: 1) Hver fortynding eller hvert stof skal injiceres med en separat sprøjte og nål for at forhindre krydskontaminering. 2) Denne lille dråbe er vigtig, fordi den sikrer, at der ikke fanges nogen luftboble i porten, hvilket kan forringe mikrobers evne til at migrere gennem porten. 3) Det anbefales at fylde en hel række pr stof eller koncentration (fem brønde) for at give en tilstrækkelig minimal volumen for yderligere analyser. 4) En række pr. ISCA bør fungere som negativ kontrol og skal fyldes med det filtrerede medium, hvori mikroberene vil blive suspenderet. Denne behandling tegner sig for effekten af tilfældig motilitet af mikrober i ISCA brønde og bør anvendes til at normalisere de behandlinger, der indeholder en kemoattractant.
- Fyld en 1 ml sprøjte med det filtrerede kemoattractvæske, og tilslut den til en 27 G sprøjte. Hold ISCA med porten opad, injicer langsomt stoffet, indtil der vises en lille dråbe oven på havnen.
- Indsættelse i laboratoriet
- Overnight, inkubere en 5 ml kultur beriget med 1% marine bouillon (for marine bakterier) eller 1% lysogen bouillon (LB, for ferskvand bakterier).
BEMÆRK: Motile bakterieisoler eller naturlige bakteriesamfund kan bruges til laboratorieinput. - Inkuber kulturen i 12 timer ved stuetemperatur (RT) og 180 omdrejninger i minuttet. Efter 12 timer skal du sikre dig, at de mikrobielle samfund er motile ved direkte observation under et mikroskop.
- Drej kulturen ned ved 1.500 x g i 10 min. og opsvar 1/100 i 150 ml passende medium (f.eks. filtreret havvand, filtreret ferskvand).
- Placer to små stykker dobbeltklæbende tape på den flade overflade af en 200 ml kapacitetsbakke (lågene på 1 ml spidskasser har de ideelle dimensioner til dette formål og kan nemt autoklaveres). Placer en ISCA på toppen, og sikre, at det lægger sikkert på båndet. Fyld langsomt udløsningsbakken med bakterieopløsningen ved hjælp af en 50 ml serologisk pipette.
BEMÆRK: Fyld bakken, indtil ISCA er nedsænket under ca. 1-2 cm væske. Hvis du bruger flere bakker, skal du bruge den samme lydstyrke på tværs af alle. - Lad ISCA inkubere i 1 time for at tillade bakteriel chemotaxis. Efter 1 time fjernes mediet meget forsigtigt med en 50 ml serologisk pipette for at minimere turbulent flow.
- Hent ISCA'en fra installationsbakken uden at røre ved den øverste overflade. Brug en pipette og engangsviskere til at fjerne resterende væske på ISCA's overflade.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå at røre havnene under denne proces, da de resulterende ændringer i trykket kan fjerne eller tilføje bakterier fra det ydre miljø i brønden og dermed bias bakterietætheden og sammensætningen inde i brønden.
- Overnight, inkubere en 5 ml kultur beriget med 1% marine bouillon (for marine bakterier) eller 1% lysogen bouillon (LB, for ferskvand bakterier).
- Hentning af prøverne
- Hold ISCA med porten nedad, hent lydstyrken på brøndene ved hjælp af en steril 27 G sprøjtenål fastgjort til en 1 ml sprøjte.
BEMÆRK: Hver række (hvis den indeholder det samme stof) kan grupperes for at give en arbejdsprøve på ca. 550 μL. Denne prøve kan efterfølgende udtages til forskellige rør afhængigt af de krævede downstream-anvendelser. - Antallet af bakterier, der tiltrækkes af hver kemoattractantkoncentration, bestemmes ved at analysere prøverne med flowcytometri12. Vælg den koncentration af kemoattractant, der maksimerer chemotaxis for efterfølgende felt implementeringer.
- Hold ISCA med porten nedad, hent lydstyrken på brøndene ved hjælp af en steril 27 G sprøjtenål fastgjort til en 1 ml sprøjte.
2. Forberedelse af indsættelse i marken
BEMÆRK: Klargøring af materiale og konstruktion af strømdæmpende kabinet (afsnit 2) skal udføres før indløsning.
- Fremstilling af materialer
- Klargør alle de materialer, der er anført i tabel 1.
BEMÆRK: Der er fastsat materialemængder for én ISCA.
- Klargør alle de materialer, der er anført i tabel 1.
- Konstruktion og klargøring af det strømdæmpende kabinet
BEMÆRK: Det flowdæmpningskabinet minimerer uønskede turbulenser, som ellers forhindrer etablering af kemiske stigninger fra ISCA.- Skær stykkerne til implementeringskabinettet med en laserskærer fra et 3 mm akrylark.
BEMÆRK: Filen til stykkerne kan findes ved hjælp af følgende link: - De laserskårne stykker samles som vist i figur 2 med akryllim.
BEMÆRK: Saml stykkerne med forsigtighed. Huller eller forskydninger kan skabe lækager ved implementering, hvilket direkte påvirker datakvaliteten. - Lad det samlede kabinet tørre natten over.
- Vask kabinettet med deioniseret vand.
- Identificer potentiel lækage ved at hælde deioniseret vand ind i kabinettet. Fix eventuelle utætte led ved at tilføje mere akryl lim, derefter gentage trin 2.2.3-2.2.5.
- Skær skruetrådene i akrylstykket, der skal bruges til at sikre ISCA. Dette kan opnås ved hjælp af en hane med en diameter og tonehøjde, der matcher monteringsskruerne.
- Først anbringes hanen i en hanenøgle, og fastgør derefter akrylstykket, der skal tappes i en benchtop skruestik. For de bedste resultater, sørg for akryl stykke er så niveau som muligt. Sørg for, at hanen er vinkelret på akrylstykket, og begynd at dreje hannøglen (med uret), og tryk på hanen.
- Efter flere fulde omdrejninger i akrylstykket skal du vende rotationen af hanen (mod uret) i en fjerdedel af en rotation for at fjerne akryl fra hanen. Gentag processen, indtil hele dybden af akrylstykket er tappet.
- Til sidst skal du fjerne hanen (dreje mod uret) og teste trådene ved hjælp af en skrue.
- Skær stykkerne til implementeringskabinettet med en laserskærer fra et 3 mm akrylark.
3. Procedure på området
- Vandfiltrering
- Opsaml vand fra marken, når du er klar til at starte eksperimentet. Der filtreres 5 ml vand pr. ISCA gennem et 0,2 μm sprøjtefilter (med en 50 ml sprøjte) i et 50 ml konisk centrifugerør.
BEMÆRK: Der kræves ca. 3 ml filtreret vand for at fylde alle brøndene i en ISCA; Det anbefales dog at 1) filter 5 ml pr. enhed for at tage højde for tab under den firedobbelte filtreringsproces, og 2) bevare filtrats aliquots som negative kontroller for både flowcytometri og molekylære procedurer. - Filtratet filtreres to gange gennem en 0,2 μm hydrofil GP-filterpatron (med samme, begge gange) med en ny 50 ml sprøjte i et nyt 50 ml konisk centrifugerør. Filtratet filtreres gennem et 0,02 μm sprøjtefilter (med en ny 50 ml sprøjte) i et nyt konisk rør på 50 ml.
BEMÆRK: Denne firedobbelte filtrering bør fjerne næsten alle mikroorganismer og partikler fra vandet. Hold den endelige filtrate væk fra enhver varmekilde, indtil den anvendes. Dette vand vil blive brugt til at opsbruge alle kemikalier, der anvendes i ISCA, og det bør holdes ved samme temperatur som vandet på udbygningen. Konvektive strømme udløst af temperaturforskelle mellem ISCA-brøndene og udemiljøet kan ellers forekomme. - Brug filtratets prøver til at opslæmle alle kemoatrakanter af interesse (typisk tør) til de ønskede koncentrationer i 15 ml koniske centrifugerør.
- De resuspenderede chemoattractanter filtreres gennem et sprøjtefilter på 0,2 μm med en 10 ml sprøjte i sterile 15 ml koniske centrifugerør for at fjerne uønskede partikler eller vandopløselige forbindelser (hvis der anvendes ekstrakter).
BEMÆRK: Filtrer forsigtigt for at forhindre partikler i at passere gennem filteret. Det er vigtigt at resuspendre chemoattractants i det ultrafiltrerede vand fra marken stedet og ikke opløse dem i andre løsninger. Brug af vand fra marken stedet er nødvendigt at (1) opnå den samme saltkoncentration inde i brøndene som i bulk miljøvand for at forhindre tæthed-drevet flow, og (2) garantere, at baggrunden næringsstof niveauer er lige inden for og uden for brønden.
- Opsaml vand fra marken, når du er klar til at starte eksperimentet. Der filtreres 5 ml vand pr. ISCA gennem et 0,2 μm sprøjtefilter (med en 50 ml sprøjte) i et 50 ml konisk centrifugerør.
- ISCA-påfyldning
- Udfør afsnit 1.3 for at udfylde ISCA.
BEMÆRK: Det anbefales at fylde en række (fem brønde) pr. stof (dvs. tre forskellige stoffer pr. ISCA og en ultrafiltreret havvandskontrol).
- Udfør afsnit 1.3 for at udfylde ISCA.
- Installation i marken
- Isca 'en (Figur 3A) skrues til indkapslingens stykke 9 (Figur 2K og Figur 3B).
BEMÆRK: Det strømdæmpende kabinet, der er beskrevet ovenfor, kan indeholde to ISCA'er side om side eller en ISCA placeret i midten. - Luk kabinettet (Figur 3C) og forsegle det med tape (Figur 3D).
BEMÆRK: Rynker skal undgås for at sikre en perfekt forsegling. Forsegle alle sider først, derefter (i et andet trin) forsegle sidehuller, som vil blive brugt til at dræne vand fra kabinettet i slutningen af prøveudtagningen. De øverste og nederste huller må ikke forsegles. Placer ikke ISCA på hovedet, da densitetsdrevet flow kan forekomme i brønde, der indeholder kemoattractanter, hvilket vil påvirke antallet af celler i brøndene. - Da kabinettet skal forblive stabilt under indløsning, anbefales det at fastgøre det til menneskeskabte strukturer (f.eks ponton, stige) ved hjælp af bungee ledninger.
BEMÆRK: Kabinettet kan fastgøres til en udløsningsarm (her en modificeret klemme med en vinkelretron) ved hjælp af bungee ledninger før nedsænkning i vandet. Alternativt kan kabinettet fyldes og fastgøres med en lille vægt på lavvandede underlag. Hvis der er beregnet deploye i det pelagiske hav, kan kabinettet fastgøres til et net med en bøje på den ene side og dykkevægt på den anden. - Nedsænk kabinettet helt for at begynde at fylde. Hold kabinettet fast under påfyldning for at forhindre overdreven vandbevægelse indeni. Når vandstanden når toppen af kabinettet, skal du sørge for, at ingen luft er fanget inde.
BEMÆRK: Hvis nogle luftbobler er fanget, skal du vippe kabinettet forsigtigt med udluftningshullet opad, hvilket vil gøre det muligt for boblerne at undslippe. - Når de er helt fulde, forsegles bund- og tophullerne med to stik, som kan være fremstillet af silicium eller gummi, eller ved at lukke ekstremiteterne på 20 μL pipettespidser (figur 4).
BEMÆRK: Dette trin forhindrer flow inde i prøvelokalet under prøveudtagning. - Lad ISCA være på plads til prøveudtagning i 1-3 timer.
BEMÆRK: Den ideelle anvendelsestid er primært dikteret af vandets temperatur og fordoblingstiden for bakteriemiljøet. Når vandtemperaturen er over 20 °C, anbefales det ikke at anvende ISCA i mere end 1 time, da celledeling kan forekomme i brøndene, der indeholder kemoattractanter efter 1,5-2,0 timer. Den optimale indløsningstid kan dog testes forud for ISCA-eksperimentet ved at ændre natursamfundene med de belastede kemikalier og kvantificere antallet af celler gennem tiden. - Fjern kabinettet fra vandet. Placer den over en beholder, så vandet kan tømmes fra kabinettet.
- Fjern den øverste del af tape fra de forreste huller meget forsigtigt.
BEMÆRK: Strømmen af det vand, der forlader kabinettet, skal være ved en dryppende hastighed. Fortsæt et hul ad gangen, fra toppen af kabinettet til bunden. Det bør tage ca 10-15 minutter at dræne kabinettet helt. - Når vandlinjen passerer under toppen af ISCA, skal du fjerne bundproppen og dræne resten af vandet.
- Mens ISCA'erne stadig er fastgjort til kabinettet, skal du forsigtigt fjerne det vand, der er fanget oven på ISCA, med en 1 ml pipette.
- Fjern ISCA uden at røre ved den øverste overflade og brug en engangsservietter til at fjerne eventuel resterende væske på overfladen.
BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at røre havnene under denne proces, da de deraf følgende ændringer i trykket kan fjerne eller tilføje bulkbakterier i brønden og bias bakterietællingerne. - Hent prøverne fra ISCA ved at gentage trin 1.5.1.
- Isca 'en (Figur 3A) skrues til indkapslingens stykke 9 (Figur 2K og Figur 3B).
4. Downstream-applikationer
BEMÆRK: Mængderne er angivet på basis af en 550 μL prøve (en række af en ISCA).
- Fastgør 100 μL brøndindhold med glutaraldehyd (2% endelig koncentration) for flowcytometri for at kvantificere chemotaxis til hvert tiltrækningsmiddel.
BEMÆRK: Opbevares på is (eller ved 4 °C) og analysere prøverne samme dag. Alternativt kan prøver flash fryses i flydende nitrogen efter fiksering, hvis analyse ikke er mulig på samme dag. Flowcytometri er den anbefalede metode til at kvantificere antallet af celler i ISCA-brøndene, da det er ligetil, hurtigt ogpræcist 12. - Fastgørelse fryses 300 μL brøndindhold i flydende nitrogen til efterfølgende DNA-ekstraktion og analyse11.
BEMÆRK: Prøverne opbevares ved -80 °C, indtil de analyseres. - Der tilsættes 90 μL brøndindhold til 10 μL TE-glycerolbuffer, og prøverne til encellegenomik13 .
- Spred 10-20 μL på agarplader, der indeholder det ønskede medium for bakteriel isolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit præsenterer laboratorieresultater ved hjælp af ISCA til at teste den chemotactic respons af marine mikrober til en koncentration vifte af glutamin, en aminosyre kendt for at tiltrække jordbakterier14. Koncentrationen af glutamin, der fremkaldte den stærkeste chemotactic respons i laboratorieundersøgelser blev brugt til at udføre en chemotaxis assay i havmiljøet.
Til at udføre laboratorietest, havvand samfund udtaget fra kystvand i Sydney, Australien, blev beriget for motile celler gennem en simpel næringsstofændring 4, som beskrevet i trin 1.4. Glutamin blev seriefortyndet i ultrafiltreret havvand for at opnå endelige koncentrationer fra 10 mM til 100 μM. Fem ISCA-replikater blev indsat samtidigt til dette eksperiment, og hver indeholdt tre forskellige glutaminkoncentrationer (en koncentration pr. række) samt en filtreret havvandskontrolrække. Efter en 1 timers indsættelse blev indholdet af hver ISCA-række (indeholdende samme glutaminkoncentration) samlet for at levere arbejdsprøver på ca. 550 μL. Dette volumen blev fastsat i glutaraldehyd (2% endelig koncentration), og antallet af reagerende bakterier kvantificeret via flow cytometri.
Kort, bakteriel overflod blev kvantificeret ved 1) farvning cellerne med en grøn fluorescerende DNA farvestof og 2) analyse ved hjælp af et flow cytometer med ultrafiltreret deioniseret vand som kappevæske. For hver prøve blev der registreret fremadspistelse (FSC), side scatter (SSC) og grøn fluorescens. Prøverne blev analyseret med en strømningshastighed på 25 μL/min. med bakterieceller diskrimineret i henhold til SSC og grøn fluorescens. Det chemotactic indeks ( Ic) blev bestemt ved at dividere de bakterietal, der er til stede i hver prøve, med de gennemsnitlige bakterietalide filtrerede havvandskontrolbedder (FSW).
Resultaterne viste, at 1 mM var den optimale koncentration af glutaminimplementering, da den inducerede et betydeligt chemotactic respons, der var 18 gange højere end den filtrerede havvandskontrol (t-test, p < 0,001) (Figur 5A). Højere eller lavere koncentrationer af glutamin induceret signifikant, men svagere chemotactic reaktioner (Ic = 5,43 for 100 μM, p < 0,001; Ic = 7,34 for 10 μM, p < 0,001). Hvis kemoattractantkoncentrationen, der tilsættes en ISCA-brønd, er for høj, kan chemotaxis i brønden reduceres, fordi (1) bakterier ikke vil være i stand til at detektere en gradient i havnesektionen og kan samle over brønden, eller (2) den pH eller osmolarity af brønden kan blive påvirket.
Den optimale glutaminkoncentration blev efterfølgende anvendt til indsættelse i marken. Fem ISCA replikater fyldt med 1 mM glutamin blev indsat i 1 time på et kystområde nær Sydney, Australien (33.91 °S, 151.26 °E). Glutamin tiltrak 2,98 gange flere bakterier end kontrolbbne fyldt med filtreret havvand fra etableringsstedet (Figur 5B). Det chemotactic respons i dette felteksperiment var væsentligt forskellig frakontrollerne( t -test, p < 0,001) og udgjorde en stærk respons for kystnære havvand11.
Figur 1: Detaljerede visninger af in situ chemotaxis-analysen (ISCA). (A)Den seneste sprøjtestøbte ISCA. (B) Skematisk af en ISCA brønd. Skalalinje = 7.463 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Samling af det strømdæmpende kabinet. a )Dedele, der er nødvendige for montering af indkapslingslokalet. Under fremstillingen skal kanterne være glatte. (B) Placer stykkerne 2a, 2b, 3a og 3b omkring stykke 1 (underlag). (C) Monter den nederste del af kabinettet ved at lægge et tyndt lag akryllim rundt om den første kant af den nederste overflade (1). (D) Placer det første længere sidevægsstykke (2a) lodret på limen og hold den på plads. Limen kræver ~ 1 min til at størkne og tillader stykke 2a til at støtte sig selv, mens du placerer det næste element. (E) Påfør et tyndt lag akryllim på den nederste overflade på en kortere side af stykke 1. Placer den korte sidevæg stykke (3a) på akryl lim og låse den ind i den tidligere placerede sidevæg. Hold de to stykker i ca. 1 min. (F) Placer det andet korte sidevægsstykke (3b) på den modsatte side af den nederste overflade (1). Igen, låse den ind i tilslutningsstykket (2a) og holde det i ca 1 min. (G) Hvis det er nødvendigt, genanvendes akryllim til den resterende lange side af den nederste overflade (1). Placer den sidste lange sidevæg stykke (2b) og forbinde den i de to tilstødende stykker (3a og 3b). Sørg for, at alle brikkerne er korrekt justeret med det nederste stykke (1), og at ingen tegn på forskydning eller mellemrum mellem sidevægge eller den nederste overflade er til stede. Gentag disse trin for at samle den supplerende øvre del af kabinettet (4, 5a, 5b, 6a og 6b). (H) Sørg for, at hullet i hjørnet af stykke 4 ikke er blokeret under montering, ellers punch åbningen med en skarp genstand såsom en nål. Hullerne i kabinettet spiller en afgørende rolle i implementeringsprocessen og tillader vand at løbe langsomt og kontrolleret. Deres diameter er blevet optimeret til at reducere turbulent flow inde i kabinettet, som forhindrer forstyrrelse af væsken omkring ISCA porte ved hentning. (Ia,b) Lim sammen to store rektangler (7) og lim hver for sig to mindre (8). Gentag én gang for hver. (J) Lim de fire samlede rektangler i midten af kabinettets nedre overflade (1). (K) Lim det øverste dæk (9) oven på rektanglene (7 og 8). Sørg for, at sidehullerne i stykket er på den udvendige side af rektanglet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Placering af ISC'er i kabinettet og forsegling ved tape. (A) Ansæt monteringsskruerne i ISCA. BB) ISCA-placering i installationskabinettet. Placer ISCA'en i midten af indløsningskabinettet, og fastgør den med de angivne skruer. Prøvelokalets nederste afløbshul skal forsegles med en modificeret 20 μL spids (Figur 4), når prøvelokalet er fyldt med vand. Dette hjælper med at undgå generering af turbulente strømme, der kan påvirke stabiliteten af det kemiske område og effektiviteten af chemotaxis. (C) De øverste og nederste dele samles sammen. d) Forsegling af kabinettet ved hjælp af tape.D Rynker skal undgås for at forhindre lækager. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Stik til forsegling af det strømdæmpende kabinet. Stikket kan gøres ved at forsegle en 20 μL pipette spids med varme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Chemotaxis analyserer ved hjælp af ISCA mod glutamin af et beriget motile samfund i laboratoriet og naturlige mikrobielle befolkning i marken. Chemotaxis indeks Ic (der repræsenterer koncentrationen af celler i ISCA brønde) normaliseret ved den gennemsnitlige koncentration af celler i brøndene, der indeholder det filtrerede havvand (FSW) efter 60 minutters indsættelse. Hver koncentration blev testet i fem ISCA replikater. Bakterieceller blev kvantificeret ved flowcytometri (A): FSW = 4,46 ± 0,25 x 103; 100 μM = 2,43 ± 0,16 x 104 1 mM = 8,07 ± 0,45 x 104; 10 mM = 3,28 ± 0,20 x 104; (B): FSW = 1,26 ± 0,11 x 104; 1 mM = 3,76 ± 0,28 x 104 celler/ml). Alle koncentrationer af glutamin, der blev testet i felten (A) og (B), inducerede et kemisk respons, der var betydeligt højere end de filtrerede havvandskontroller (FSW).. I alle sammenligninger med parvis: (A) Tukey HSD, n = 5, p < 0,005; (B) Tukey HSD, n = 5, p < 0,005. Fejllinjer repræsenterer SEM. Klik her for at få vist en større version af dette tal.
| Feltmateriale | Mængde |
| Vandfiltrering | |
| Tube rack - 50 ml | 1 |
| Hydrofile GP filterpatron - 0,2 μm | 1 |
| Sprøjtefilter - 0,2 μm | 1 |
| Sprøjtefilter - 0,02 μm | 1 |
| Sprøjter - 50 ml | 4 |
| Konisk centrifugerør - 50 ml | 5 |
| Kemisk resuspension | |
| Konisk centrifugerør - 15 ml | 4 |
| Chemoattractants | |
| Sprøjter - 10 ml | 4 |
| Sprøjtefilter - 0,2 μm | 4 |
| Tube rack - 15 ml | 1 |
| ISCA-påfyldning | |
| Sprøjtenål 27G | 4 |
| Sprøjte - 1 ml | 4 |
| ISCA | 1 |
| Installation | |
| Installationskabinet | 1 |
| Nylon slidset fladt hoved skruer | 2 |
| Indsættelsesarm | 1 |
| Bungee ledning | 2 |
| Tape | 1 |
| Stik til installationskabinet | 1 |
| Hentning af eksempler | |
| Sprøjtenål 27G | 4 |
| Sprøjter - 1 ml | 4 |
| Centrifuge rør - 2 ml | 12 |
| Engangsviskere | 1 kasse |
| Glutaraldehyd 25% | 10 mL |
| Andet materiale | |
| Pipetter indstillet | 1 |
| Pipettespidser 200 μL | 1 kasse |
| Pipettespidser 20 μL | 1 kasse |
| Pipettespidser 1 ml | 1 kasse |
Tabel 1: Materialer, der er nødvendige for indsættelse i marken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På omfanget af akvatiske mikroorganismer er miljøet langt fra homogent og er ofte karakteriseret ved fysiske/kemiske gradienter, der strukturerer mikrobiellesamfund 1,,15. Motile mikroorganismers evne til at bruge adfærd (dvs. chemotaxis) gør det lettere at fouragere inden for disse heterogene mikromiljøer1. Undersøgelse af chemotaxis direkte i miljøet har potentiale til at identificere vigtige interspecifik interaktioner og kemiske præferencer, og dette kan hjælpe med at rede bidragene fra specifikke mikrober til biogeokemiske processer. Den fremlagte protokol anvender ISCA i miljøet11 for at lette erhvervelsen af reproducerbar forskning i chemotaxis in situ.
Ved hjælp af ISCA, det er vist, at glutamin fremkalder en positiv chemotactic respons både i laboratorieforhold og i marken. ISCA's anvendelse af glutamin i marken giver et lavere chemotactic respons end i laboratoriet (figur 5). Lignende patters mellem laboratorie- og feltforsøg er tidligere blevet observeret11. Disse kan forklares ved den lavere andel af motile celler i miljøet sammenlignet med de berigede samfund eller enkelt motile isolat, der anvendes i laboratorieanalyser.
Betydningen af indledende laboratoriebaserede forsøg bør ikke undervurderes, da de gør det muligt at bestemme optimale kemoattractantkoncentrationer, der kan anvendes i feltanvendelser. Den optimale koncentration er specifik for hver kemoattractant og påvirket af sin molekylvægt, opløselighed, og diffusivitet fra brøndene. I tilfælde af anvendelse af flere forskellige stoffer bør hver især testes individuelt i et koncentrationsområde. Hvis der ikke registreres chemotaxis i marken efter 1 time, kan der udføres længere installationer. Men længden af indsættelsen er stærkt begrænset af bakterievækst og bør altid være kortere end opdelingen af bakterier i det målrettede miljø. Dette bidrager til at undgå befolkningstilvækst inden for ISCA.
ISCA er følsom over for vandturbulens, og der skal være forsigtighed ved påfyldning og tømning af strømningsdæmpningsrummet. Disse trin skal udføres langsomt, fordi strømme som følge af hurtig påfyldning kan skylle eller fortynde indholdet af brøndene. Som et resultat, dette fjerner eller forhindrer chemoattractants fra at sprede ordentligt eller indføre bakterier fra det omgivende miljø, i sidste ende biasing celletal. Fuldt fylde kabinettet med vand, mens udluftning al luft, derefter lukke den helt, sikrer, at turbulens ikke forstyrrer indsættelsen. Indsamling af metadata på etableringsstedet (dvs. temperatur, saltholdighed, klorofyl/næringsstofkoncentration) er også et afgørende skridt til at fortolke resultaterne, da disse faktorer kan påvirke chemotaxis.
ISCA er en tilgængelig, brugervenlig enhed, der giver ny indsigt i den rolle og udbredelse af chemotaxis i miljøet. Det muliggør forhør af chemotaxis i ethvert system, der indeholder en flydende fase (f.eks. hav, ferskvand, jord, spildevandssystemer). Endelig kan det anvendes til målrettede undersøgelser af patogener og antibiotikaresistens i miljøet, isolering af vigtige mikrober til bioforståelse og bioremediering af specifikke forurenende stoffer og mikroplast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret delvist af Gordon og Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, gennem tilskud GBMF3801 til JRS og RS, og en Investigator Award (GBMF3783) til RS, samt en australsk Research Council Fellowship (DE160100636) til J.B.R., en pris fra Simons Foundation til B.S.L. (594111), og et tilskud fra Simons Foundation (542395) til R.S. som en del af principperne for mikrobielle økosystemer (PriME) Collaborative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube - 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | - | - | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips - 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips - 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter - 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter - 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes - 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes - 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes - 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter - 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J.
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R.
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
