Summary
Hier wird das Protokoll für einen In-situ-Chemotaxis-Assay vorgestellt, ein kürzlich entwickeltes mikrofluidisches Gerät, das Studien des mikrobiellen Verhaltens direkt in der Umwelt ermöglicht.
Abstract
Mikrobielle Verhaltensweisen wie Motilität und Chemotaxis (die Fähigkeit einer Zelle, ihre Bewegung als Reaktion auf einen chemischen Gradienten zu verändern), sind in den bakteriellen und archaealen Bereichen weit verbreitet. Chemotaxis können in heterogenen Umgebungen erhebliche Vorteile beim Erwerb von Ressourcen mit sich bringen. Es spielt auch eine entscheidende Rolle bei symbiotischen Wechselwirkungen, Krankheiten und globalen Prozessen, wie biogeochemische Radfahren. Aktuelle Techniken beschränken jedoch die Chemotaxis-Forschung auf das Labor und sind im Feld nicht leicht anwendbar. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Einsatz des In-situ-Chemotaxis-Assays (ISCA) vorgestellt, einem Gerät, das eine robuste Abfrage von mikrobiellen Chemotaxis direkt in der natürlichen Umgebung ermöglicht. Die ISCA ist ein mikrofluidisches Gerät, das aus einem 20-Well-Array besteht, in das Chemikalien von Interesse geladen werden können. Einmal in wässrigen Umgebungen eingesetzt, diffundieren Chemikalien aus den Brunnen und erzeugen Konzentrationsgradienten, die Mikroben spüren und darauf reagieren, indem sie über Chemotaxis in die Brunnen schwimmen. Der Brunneninhalt kann dann beprobt und verwendet werden, um (1) die Stärke der chemotaktischen Reaktionen auf bestimmte Verbindungen durch Durchflusszytometrie zu quantifizieren, (2) isolierbare und kulturresponsive Mikroorganismen zu isolieren und (3) die Identität und das genomische Potenzial der antwortenden Populationen durch molekulare Techniken zu charakterisieren. Die ISCA ist eine flexible Plattform, die in jedem System mit wässriger Phase eingesetzt werden kann, einschließlich Meeres-, Süßwasser- und Bodenumgebungen.
Introduction
Verschiedene Mikroorganismen verwenden Beweglichkeit und Chemotaxis, um lückenhafte Nährstoffumgebungen auszubeuten, Wirte zu finden oder schädliche Bedingungen zu vermeiden1,2,3. Diese mikrobiellen Verhaltensweisen können wiederum die Raten der chemischen Transformation beeinflussen4 und symbiotische Partnerschaften in terrestrischen, Süßwasser- und marinen Ökosystemen fördern2,5.
Chemotaxis wurde in den letzten 60 Jahren unter Laborbedingungen ausgiebig untersucht6. Die erste quantitative Methode zur Untersuchung von Chemotaxis, der Kapillar-Assay, beinhaltet ein Kapillarrohr, das mit einem vermeintlichen Chemolockant gefüllt ist, das in eine Suspension von Bakterien eingetaucht ist6. Die Diffusion der Chemikalie aus dem Rohr erzeugt einen chemischen Gradienten, und chemotaktische Bakterien reagieren auf diesen Gradienten, indem sie in die Röhre7wandern. Seit der Entwicklung des Kapillar-Assays, der heute noch weit verbreitet ist, wurden viele andere Techniken entwickelt, um Chemotaxis unter zunehmend kontrollierten physikalisch-chemischen Bedingungen zu untersuchen, wobei die jüngste mit der Verwendung von Mikrofluidik8,9,10.
Mikrofluidik, zusammen mit Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie, ermöglicht die Verfolgung des Verhaltens einzelner Zellen als Reaktion auf sorgfältig kontrollierte Gradienten. Obwohl diese Techniken unser Verständnis von Chemotaxis erheblich verbessert haben, wurden sie auf den Einsatz im Labor beschränkt und übersetzen sich nicht leicht in den Einsatz in Umweltsystemen. Infolgedessen wurde die Fähigkeit natürlicher Bakteriengemeinschaften, Chemotaxis in natürlichen Ökosystemen zu verwenden, nicht untersucht; Daher ist das derzeitige Verständnis der potenziellen ökologischen Bedeutung von Chemotaxis auf künstliche Laborbedingungen und eine begrenzte Anzahl von laborkultivierten bakteriellen Isolaten ausgerichtet. Die kürzlich entwickelte ISCA überwindet diese Einschränkungen11.
Die ISCA baut auf dem allgemeinen Prinzip des Kapillar-Assays auf; Es nutzt jedoch moderne Mikrofabrikationstechniken, um eine hochgradig replizierte, leicht einsetzbare experimentelle Plattform für die Quantifizierung von Chemotaxis zu Verbindungen zu liefern, die für die natürliche Umwelt von Interesse sind. Es ermöglicht auch die Identifizierung und Charakterisierung von chemotaktischen Mikroorganismen durch direkte Isolierung oder molekulare Techniken. Während das erste Arbeitsgerät selbstgefertigt und aus Glas und PDMS11gebaut wurde, besteht die neueste spritzgegossene Version aus Polycarbonat, wobei ein hochstandardisiertes Herstellungsverfahren verwendet wird (für Interesse an der neuesten Version des Geräts können die entsprechenden Autoren kontaktiert werden).
Der ISCA ist Kreditkartengröße und besteht aus 20 Brunnen, die in einem 5 x 4-Well-Array verteilt sind, die jeweils durch einen kleinen Port (800 m Durchmesser) mit der äußeren aquatischen Umgebung verbunden sind. Abbildung 1). Vermeintliche Chemoattractants, die über den Hafen in die Brunnen geladen werden, diffundieren in die Umgebung, und chemotaktische Mikroben reagieren, indem sie durch den Hafen in den Brunnen schwimmen. Da viele Faktoren das Ergebnis eines ISCA-Experiments in der natürlichen Umgebung beeinflussen können, wird dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll neuen Benutzern helfen, potenzielle Hürden zu überwinden und effektive Bereitstellungen zu erleichtern.
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Protocol
Wir empfehlen, Abschnitt 1 vor Feldversuchen auszuführen, um die Ergebnisse zu optimieren.
1. Laboroptimierung
HINWEIS: Die im Optimierungsverfahren beschriebenen Volumina reichen für eine einzelne ISCA (bestehend aus 20 Brunnen) aus.
- Herstellung der Chemikalie von Interesse
HINWEIS: Die optimale Konzentration für jeden Chemo-Plünderer muss oft unter Laborbedingungen vor Feldeinsätzen bestimmt werden. Das Feld der chemischen Konzentration wird mit der Entfernung von der Quelle (ISCA-Brunnen) in der Größe abnehmen, was bedeutet, dass die Konzentration von Mikroorganismen in der Umgebung niedriger sein wird als die konzentration, die im Inneren des Geräts vorhanden ist. Die optimale Konzentration im ISCA-Gut hängt von der Diffusionsrate des Chemoattraktions ab. Wenn die Konzentration im Brunnen zu niedrig ist (nahe der Nachweisgrenze der Mikroben), werden keine positiven Chemotaxis beobachtet. Umgekehrt, wenn die Konzentration im Brunnen zu hoch ist, wird die Konzentration auch in der unmittelbaren Umgebung hoch sein und mikrobielle Akkumulation wird über den ISCA-Brunnen statt im Inneren auftreten. Daher sollten Verdünnungsreihen unter Laborbedingungen für jede Verbindung durchgeführt werden, um die optimale Konzentration für Feldeinsätze zu bestimmen. Idealerweise sollte auch ein Konzentrationsbereich vor Ort getestet werden, um Laborergebnisse zu bestätigen.- 2,5 L eines geeigneten Mediums mit der entsprechenden Salzkonzentration (z. B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS] oder künstliches Meerwasser) vorbereiten. Filtern Sie das Medium mit einem 0,2-mm-Filter mit einer Peristaltik- oder Vakuumpumpe und einem Autoklaven.
- Bereiten Sie eine 10 mM Lösung von Chemoattractant in 1 ml des sterilen Mediums vor. Filtern Sie die Chemoattractantlösung mit einem 0,2 m Spritzenfilter, um Partikel und mögliche Verunreinigungen zu entfernen.
HINWEIS: Idealerweise sollten in der keine anderen organischen Verbindungen als das Chemoattractant vorhanden sein.
- Konzentrationsbereich nach Verdünnungsreihen
- Verdünnen Sie die gefilterte Chemolockant-Stammlösung in Reihe, die z.B. von 10 mM bis 100 m reicht.
HINWEIS: Pro getesteter Konzentration wird mindestens ein Endvolumen von 0,7 ml benötigt.
- Verdünnen Sie die gefilterte Chemolockant-Stammlösung in Reihe, die z.B. von 10 mM bis 100 m reicht.
- IsCA geladen
- Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit dem gefilterten Chemoattractant und schließen Sie sie an eine 27 G Spritze an. Halten Sie die ISCA mit dem Port nach oben, langsam injizieren Sie die Substanz, bis ein kleines Tröpfchen auf dem Hafen erscheint.
ANMERKUNG: 1) Jede Verdünnung oder Substanz muss mit einer separaten Spritze und Einer Nadel injiziert werden, um eine Kreuzkontamination zu verhindern. 2) Dieses kleine Tröpfchen ist wichtig, weil es sicherstellt, dass keine Luftblase im Hafen gefangen ist, was die Fähigkeit von Mikroben beeinträchtigen könnte, durch den Hafen zu migrieren. 3) Es wird empfohlen, eine ganze Reihe pro Stoff oder Konzentration (fünf Brunnen) zu füllen, um ein ausreichendes Mindestvolumen für weitere Analysen bereitzustellen. 4) Eine Zeile pro ISCA sollte als Negativkontrolle fungieren und mit dem gefilterten Medium gefüllt werden, in dem die Mikroben ausgesetzt werden. Diese Behandlung erklärt die Wirkung der zufälligen Beweglichkeit durch Mikroben in die ISCA-Brunnen und sollte verwendet werden, um die Behandlungen zu normalisieren, die ein Chemoattraktionsmittel enthalten.
- Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit dem gefilterten Chemoattractant und schließen Sie sie an eine 27 G Spritze an. Halten Sie die ISCA mit dem Port nach oben, langsam injizieren Sie die Substanz, bis ein kleines Tröpfchen auf dem Hafen erscheint.
- Einsatz im Labor
- Über Nacht eine 5 ml Kultur mit 1% Meeresbrühe (für Meeresbakterien) oder 1% Lysogenybrühe (LB, für Süßwasserbakterien) angereichert.
HINWEIS: Motile bakterielle Isolate oder natürliche Bakteriengemeinschaften können für Laboreinsätze verwendet werden. - Inkubieren Sie die Kultur für 12 h bei Raumtemperatur (RT) und 180 Rpm. Nach 12 h, stellen Sie sicher, dass die mikrobiellen Gemeinschaften durch direkte Beobachtung unter dem Mikroskop motil sind.
- Die Kultur bei 1.500 x g für 10 min abdrehen und 1/100 in 150 ml geeignetem Medium (z.B. gefiltertes Meerwasser, gefiltertes Süßwasser) wieder aufsetzen.
- Legen Sie zwei kleine Stücke doppelseitigen Klebebandes auf die flache Oberfläche eines 200 ml Fassungsfachs (die Deckel von 1 ml Spitzenboxen haben dafür die idealen Abmessungen und können leicht autoklaviert werden). Platzieren Sie einen ISCA oben, um sicherzustellen, dass es sicher am Band befestigt wird. Füllen Sie das Einsatztablett mit einer 50 ml serologischen Pipette langsam mit der bakteriellen Lösung.
HINWEIS: Füllen Sie das Fach, bis der ISCA unter ca. 1–2 cm Flüssigkeit getaucht ist. Wenn Sie mehrere Trays verwenden, verwenden Sie das gleiche Volume für alle. - Lassen Sie die ISCA für 1 h brüten, um bakterielle Chemotaxis zu ermöglichen. Nach 1 h, entfernen Sie das Medium sehr sanft mit einer 50 ml serologischen Pipette, um turbulenten Fluss zu minimieren.
- Rufen Sie die ISCA aus dem Bereitstellungstask ab, ohne die obere Oberfläche zu berühren. Verwenden Sie eine Pipette und Einweg-Wischer, um die verbleibende Flüssigkeit auf der ISCA-Oberfläche zu entfernen.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Ports während dieses Prozesses nicht zu berühren, da die daraus resultierenden Druckänderungen Bakterien aus der äußeren Umgebung entfernen oder in den Brunnen einbringen können und dadurch die bakterielle Dichte und Zusammensetzung im Brunnen verzerrt werden.
- Über Nacht eine 5 ml Kultur mit 1% Meeresbrühe (für Meeresbakterien) oder 1% Lysogenybrühe (LB, für Süßwasserbakterien) angereichert.
- Abruf der Proben
- Halten Sie die ISCA mit dem Nachdruck nach unten, holen Sie das Volumen der Brunnen mit einer sterilen 27 G Spritzennadel, die an einer 1 ml Spritze befestigt ist.
HINWEIS: Jede Zeile (wenn sie denselben Stoff enthält) kann gepoolt werden, um eine Arbeitsprobe von ca. 550 l bereitzustellen. Diese Probe kann anschließend je nach den erforderlichen nachgeschalteten Anwendungen in verschiedene Rohre eingegliedert werden. - Bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien, die zu jeder Chemoattraktionskonzentration angezogen werden, indem Sie die Proben mit Durchflusszytometrie12analysieren. Wählen Sie die Konzentration von Chemoattractant, die Chemotaxis für nachfolgende Feldeinsätze maximiert.
- Halten Sie die ISCA mit dem Nachdruck nach unten, holen Sie das Volumen der Brunnen mit einer sterilen 27 G Spritzennadel, die an einer 1 ml Spritze befestigt ist.
2. Vorbereitung auf den Einsatz vor Ort
HINWEIS: Die Vorbereitung des Materials und die Konstruktion des Strömungsdämpfungsgehäuses (Abschnitt 2) müssen vor dem Einsatz durchgeführt werden.
- Herstellung von Materialien
- Bereiten Sie alle in Tabelle 1aufgeführten Materialien vor.
HINWEIS: Materialmengen werden für einen ISCA bereitgestellt.
- Bereiten Sie alle in Tabelle 1aufgeführten Materialien vor.
- Konstruktion und Vorbereitung des Strömungsdämpfungsgehäuses
HINWEIS: Das Strömungsdämpfungsgehäuse minimiert unerwünschte Turbulenzen, die sonst das Auftreten chemischer Gradienten verhindern, die von der ISCA ausgeht.- Schneiden Sie die Teile für das Einsatzgehäuse mit einem Laserschneider aus einer 3 mm Acrylfolie.
HINWEIS: Die Datei für die Stücke kann unter dem folgenden Link gefunden werden: - Montieren Sie die lasergeschnittenen Stücke, wie in Abbildung 2 mit Acrylkleber gezeigt.
HINWEIS: Montieren Sie die Teile mit Sorgfalt. Bohrungen oder Fehlausrichtungen können bei der Bereitstellung zu Lecks führen, was sich direkt auf die Datenqualität auswirkt. - Lassen Sie das montierte Gehäuse über Nacht trocknen.
- Waschen Sie das Gehäuse mit entionisiertem Wasser.
- Identifizieren Sie mögliche Leckagen, indem Sie entionisiertes Wasser in das Gehäuse gießen. Beheben Sie mögliche undichte Verbindungen, indem Sie mehr Acrylkleber hinzufügen, und wiederholen Sie dann die Schritte 2.2.3–2.2.5.
- Schneiden Sie die Schraubgewinde in das Acrylstück, das zur Sicherung des ISCA verwendet wird. Dies kann mit einem Wasserhahn mit einem Durchmesser und einer Steigung erreicht werden, die zu den Befestigungsschrauben passt.
- Zuerst den Wasserhahn in einen Hahnenschlüssel anbringen und dann das Acrylstück sichern, das in einem Tischschrauber angezapft wird. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie sicher, dass das Acrylstück so eben wie möglich ist. Stellen Sie sicher, dass der Hahn senkrecht zum Acrylstück ist, und drehen Sie den Hahnenschlüssel (im Uhrzeigersinn), indem Sie leichten Druck auf den Wasserhahn ausüben.
- Nach mehreren vollen Umdrehungen im Acrylstück die Drehung des Wasserhahns (gegen den Uhrzeigersinn) für ein Viertel einer Drehung umkehren, um Acryl aus dem Wasserhahn zu löschen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamte Tiefe des Acrylstücks angezapft ist.
- Entfernen Sie schließlich den Wasserhahn (gegen den Uhrzeigersinn drehen) und testen Sie die Gewinde mit einer Schraube.
- Schneiden Sie die Teile für das Einsatzgehäuse mit einem Laserschneider aus einer 3 mm Acrylfolie.
3. Verfahren vor Ort
- Wasserfiltration
- Sammeln Sie Wasser vom Feldgelände, wenn Sie bereit sind, das Experiment zu starten. Filtern Sie 5 ml Wasser pro ISCA durch einen 0,2 m Spritzenfilter (mit einer 50 ml Spritze) in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr.
HINWEIS: Ungefähr 3 ml gefiltertes Wasser sind erforderlich, um alle Brunnen eines ISCA zu füllen; Es wird jedoch empfohlen, 1) 5 ml pro Gerät zu filtern, um Verluste während des Vierfachfiltrationsprozesses zu berücksichtigen, und 2) Aliquots der Filtrate als Negativkontrollen sowohl für die Durchflusszytometrie als auch für molekulare Verfahren beizubehalten. - Filtern Sie das Filtrat zweimal durch eine hydrophile GP-Filterpatrone von 0,2 m (beide Male mit derselben) mit einer neuen 50 ml Spritze in ein neues 50 ml konisches Zentrifugenrohr. Filtern Sie das Filtrat durch einen 0,02 m Spritzenfilter (mit einer neuen 50 ml Spritze) in ein neues 50 ml konisches Rohr.
HINWEIS: Diese Vierfachfiltration sollte fast alle Mikroorganismen und Partikel aus dem Wasser entfernen. Halten Sie das endgültige Filtrat von jeder Wärmequelle fern, bis sie verwendet werden. Dieses Wasser wird verwendet, um alle in der ISCA verwendeten Chemikalien wieder auszusetzen, und es sollte bei der gleichen Temperatur wie das Wasser am Einsatzort gehalten werden. Konvektive Ströme, die durch Temperaturunterschiede zwischen den ISCA-Brunnen und der Außenumgebung ausgelöst werden, können andernfalls auftreten. - Verwenden Sie Aliquots des Filtrats, um alle (typischerweise trocken) Chemopaugen auf die gewünschten Konzentrationen in 15 ml konischen Zentrifugenrohren auszusetzen.
- Filtern Sie die resuspendierten Chemoattractants durch einen 0,2 m Spritzenfilter mit einer 10 ml Spritze in sterile 15 ml konische Zentrifugenröhrchen, um unerwünschte Partikel oder wasserunlösliche Verbindungen (bei Verwendung von Extrakten) zu entfernen.
HINWEIS: Filtern Sie vorsichtig, um zu verhindern, dass Partikel durch den Filter gelangen. Es ist wichtig, die Chemolockanten im ultragefilterten Wasser vom Feldplatz aus auszusetzen und nicht in andere Lösungen zu überweisen. Die Verwendung von Wasser aus dem Feldgelände ist notwendig, um (1) die gleiche Salzkonzentration in den Brunnen zu erhalten wie im Massenumweltwasser, um einen dichtegetriebenen Fluss zu verhindern und (2) sicherzustellen, dass der Nährstoffgehalt im Hintergrund innerhalb und außerhalb des Brunnens gleich ist.
- Sammeln Sie Wasser vom Feldgelände, wenn Sie bereit sind, das Experiment zu starten. Filtern Sie 5 ml Wasser pro ISCA durch einen 0,2 m Spritzenfilter (mit einer 50 ml Spritze) in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr.
- ISCA-Füllung
- Führen Sie Abschnitt 1.3 aus, um die ISCA auszufüllen.
HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Reihe (fünf Brunnen) pro Substanz zu füllen (d. h. drei verschiedene Substanzen pro ISCA und eine ultrafiltrierte Meerwasserkontrolle).
- Führen Sie Abschnitt 1.3 aus, um die ISCA auszufüllen.
- Einsatz vor Ort
- Schrauben Sie den ISCA (Abbildung 3A) auf Stück 9 des Gehäuses (Abbildung 2K und Abbildung 3B).
HINWEIS: Das oben beschriebene Strömungsdämpfegehäuse kann zwei ISCAs nebeneinander oder einen ISCA in der Mitte enthalten. - Schließen Sie das Gehäuse (Abbildung 3C) und versiegeln Sie es mit Klebeband (Abbildung 3D).
HINWEIS: Falten müssen vermieden werden, um eine perfekte Versiegelung zu gewährleisten. Versiegeln Sie zuerst alle Seiten, dann (in einem zweiten Schritt) die Seitenlöcher, die verwendet werden, um Wasser aus dem Gehäuse am Ende der Probenahme abzuleiten. Versiegeln Sie die oberen und unteren Löcher nicht. Stellen Sie die ISCA nicht auf den Kopf, da dichtegetriebene Strömung in Brunnen auftreten kann, die Chemolockanten enthalten, was die Anzahl der Zellen in den Brunnen verzerrt. - Da das Gehäuse während des Einsatzes stabil bleiben muss, wird empfohlen, es mit Bungee-Schnüren an von Menschenhand (z. B. Pontoon, Leiter) zu befestigen.
HINWEIS: Das Gehäuse kann mit Bungee-Kabeln vor dem Eintauchen in das Wasser an einem Einsatzarm (hier eine modifizierte Klemme mit senkrechter Plattform) befestigt werden. Alternativ kann das Gehäuse mit geringem Gewicht auf flachen Substraten befüllt und gesichert werden. Wenn Einsätze im pelagischen Ozean vorgesehen sind, kann das Gehäuse an einem Netz mit einer Boje auf der einen Seite und Tauchgewicht auf der anderen Seite befestigt werden. - Tauchen Sie das Gehäuse vollständig ein, um mit dem Füllen zu beginnen. Halten Sie das Gehäuse während der Füllung fest, um übermäßige Wasserbewegungen im Inneren zu verhindern. Sobald der Wasserstand die Oberseite des Gehäuses erreicht hat, stellen Sie sicher, dass keine Luft im Inneren eingeschlossen ist.
HINWEIS: Falls einige Luftblasen eingeschlossen sind, neigen Sie das Gehäuse sanft mit dem nach oben gerichteten Entlüftungsloch, wodurch die Blasen entweichen können. - Nach vollständiger Vollung die unteren und oberen Löcher mit zwei Steckern versiegeln, die aus Silizium oder Gummi hergestellt werden können, oder durch Abdichten der Extremitäten von 20 L Pipettenspitzen (Abbildung 4).
HINWEIS: Dieser Schritt verhindert den Fluss innerhalb des Gehäuses während der Probenahme. - Lassen Sie die ISCA für 1-3 h an Ort und Stelle für die Probenahme.
HINWEIS: Die ideale Einsatzzeit wird in erster Linie durch die Temperatur des Wassers und die Verdoppelung der Zeit der Bakteriengemeinschaft bestimmt. Wenn die Wassertemperatur über 20 °C liegt, wird es nicht empfohlen, die ISCA für mehr als 1 h einzusetzen, da die Zellteilung in den Brunnen auftreten kann, die Chemolockanten enthalten, nach 1,5–2,0 h. Die optimale Einsatzzeit kann jedoch vor dem ISCA-Experiment getestet werden, indem natürliche Gemeinschaften mit den geladenen Chemikalien geändert und die Anzahl der Zellen im Laufe der Zeit quantifiziert werden. - Entfernen Sie das Gehäuse aus dem Wasser. Legen Sie es über einen Behälter, so dass das Wasser aus dem Gehäuse abgelassen werden kann.
- Entfernen Sie den oberen Teil des Klebebandes sehr sanft von den vorderen Löchern.
HINWEIS: Der Wasserfluss, der das Gehäuse verlässt, muss mit einer Tropfengeschwindigkeit sein. Fahren Sie ein Loch nach dem anderen fort, von der Oberseite des Gehäuses bis zum Boden. Es sollte etwa 10–15 min dauern, um das Gehäuse vollständig zu entleeren. - Sobald die Wasserlinie unter der Oberseite des ISCA verläuft, entfernen Sie den unteren Stecker und entleeren Sie den Rest des Wassers.
- Während die ISCAs noch am Gehäuse befestigt sind, entfernen Sie vorsichtig das Wasser, das auf der OBERSEITE der ISCA gefangen ist, mit einer 1 ml Pipette.
- Entfernen Sie den ISCA, ohne die obere Oberfläche zu berühren, und entfernen Sie mit einem Einwegtuch die verbleibende Flüssigkeit auf der Oberfläche.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Ports während dieses Prozesses nicht zu berühren, da die daraus resultierenden Druckänderungen Massenbakterien in den Brunnen entfernen oder hinzufügen können und die Bakterienzahlen verzerrt. - Rufen Sie die Beispiele aus der ISCA ab, indem Sie Schritt 1.5.1 wiederholen.
- Schrauben Sie den ISCA (Abbildung 3A) auf Stück 9 des Gehäuses (Abbildung 2K und Abbildung 3B).
4. Nachgelagerte Anwendungen
HINWEIS: Volumes werden basierend auf einer 550-L-Probe (eine Zeile eines ISCA) angegeben.
- Fix ieren Sie 100 l Brunnengehalt mit Glutaraldehyd (2% Endkonzentration) für die Durchflusszytometrie, um Chemotaxis zu jedem Lockmittel zu quantifizieren.
HINWEIS: Auf Eis (oder bei 4 °C) aufbewahren und die Proben am selben Tag analysieren. Alternativ können Proben nach der Fixierung in flüssigem Stickstoff eingefroren werden, wenn eine Analyse am selben Tag nicht möglich ist. Durchflusszytometrie ist die empfohlene Methode, um die Anzahl der Zellen in den ISCA-Brunnen zu quantifizieren, da sie einfach, schnell und genau ist12. - Snap Freeze 300 l Brunnengehalt in flüssigem Stickstoff für die nachfolgende DNA-Extraktion und -Analyse11.
HINWEIS: Bewahren Sie die Proben bis zur Analyse bei -80 °C auf. - Fügen Sie 90 L Well-Inhalt zu 10 l TE-Glyzerinpuffer hinzu und fangen Sie die Proben für die einzellige Genomik13ein.
- Auf Agarplatten, die das gewünschte Medium für die bakterielle Isolierung enthalten, 10–20 l verteilen.
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Representative Results
Dieser Abschnitt stellt Laborergebnisse mit der ISCA vor, um die chemotaktische Reaktion von Marinemikroben auf einen Konzentrationsbereich von Glutamin zu testen, einer Aminosäure, die bekanntermaßen Bodenbakterien anzieht14. Die Konzentration von Glutamin, die die stärkste chemotaktische Reaktion in den Labortests auslöste, wurde verwendet, um einen Chemotaxis-Assay in der Meeresumwelt durchzuführen.
Zur Durchführung der Labortests wurden Meerwassergemeinschaften, die aus dem Küstenwasser in Sydney, Australien, entnommen wurden, durch eine einfache Nährstoffänderung4für motile Zellen angereichert, wie in Schritt 1.4 beschrieben. Glutamin wurde in ultrafiltriertem Meerwasser seriell verdünnt, um Endkonzentrationen von 10 mM bis 100 m zu erhalten. Fünf ISCA-Replikate wurden gleichzeitig für dieses Experiment eingesetzt, und jede enthielt drei verschiedene Glutaminkonzentrationen (eine Konzentration pro Reihe) sowie eine gefilterte Meerwasserkontrollreihe. Nach einem 1-H-Einsatz wurde der Inhalt jeder ISCA-Zeile (die die gleiche Glutaminkonzentration enthält) gepoolt, um Arbeitsproben von ca. 550 l bereitzustellen. Dieses Volumen wurde in Glutaraldehyd (2% Endkonzentration) fixiert und die Anzahl der reagierenden Bakterien über die Durchflusszytometrie quantifiziert.
Kurz gesagt, wurde die bakterielle Fülle quantifiziert, indem 1) die Zellen mit einem grünen fluoreszierenden DNA-Farbstoff und 2) Analyse mit einem Durchflusszytometer mit ultrafiltriertem entionisiertem Wasser als Mantelflüssigkeit gefärbt wurde. Für jede Probe wurden Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) und grüne Fluoreszenz aufgezeichnet. Die Proben wurden mit einer Durchflussrate von 25 l/min analysiert, wobei Bakterienzellen nach SSC und grüner Fluoreszenz diskriminiert wurden. Der chemotaktische Index (Ic) wurde ermittelt, indem die in jeder Probe vorhandenen Bakterienzahl durch die gemittelten Bakterienzahlen in den gefilterten Meerwasserkontrollbrunnen (FSW) dividiert wurde.
Die Ergebnisse zeigten, dass 1 mM die optimale Glutamin-Einsatzkonzentration war, da sie eine signifikante chemotaktische Reaktion induzierte, die 18-mal höher war als die gefilterte Meerwasserkontrolle (t-test, p < 0.001) (Abbildung 5A). Höhere oder niedrigere Konzentrationen von Glutamin induzierten signifikante, aber schwächere chemotaktische Reaktionen (Ic = 5,43 für 100 M, p < 0,001; Ic = 7,34 für 10 m, p < 0,001). Wenn die Chemoattraktionskonzentration, die einem ISCA-Brunnen zugesetzt wird, zu hoch ist, können Chemotaxis in den Brunnen reduziert werden, da (1) Bakterien nicht in der Lage sind, einen Gradienten im Hafenabschnitt zu erkennen und sich über dem Brunnen aggregieren können, oder (2) der pH- oder Osmolarität des Brunnens betroffen sein kann.
Die optimale Glutaminkonzentration wurde anschließend für den Feldeinsatz verwendet. Fünf ISCA-Replicates, gefüllt mit 1 mM Glutamin, wurden für 1 h an einem Küstenort in der Nähe von Sydney, Australien (33,91 °S, 151,26 °E) eingesetzt. Glutamin zog 2,98 Mal mehr Bakterien an als die mit gefiltertem Meerwasser gefüllten Kontrollbrunnen vom Einsatzort (Abbildung 5B). Die chemotaktische Reaktion in diesem Feldexperiment unterscheidet sich signifikant von den Kontrollen (t-test, p < 0.001) und stellte eine starke Reaktion für Küstenmeerwasser11dar.
Abbildung 1: Detaillierte Ansichten des In-situ-Chemotaxis-Assays (ISCA). (A) Die neueste spritzgegossene ISCA. (B) Schematische sedereiner ISCA-Gut. Maßstabsleiste = 7.463 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Montage des Strömungsdämpfungsgehäuses. (A) Die für die Montage des Bereitstellungsgehäuses erforderlichen Teile. Während der Fertigung sollten die Kanten glatt sein. (B) Stücke 2a, 2b, 3a und 3b um Stück 1 legen (untere Oberfläche). (C) Montieren Sie den unteren Teil des Gehäuses, indem Sie eine dünne Schicht Acrylkleber um den ersten Rand der unteren Oberfläche legen (1). (D) Legen Sie das erste längere Seitenwandstück (2a) vertikal auf den Kleber und halten Sie es an Ort und Stelle. Der Kleber benötigt 1 min zu erstarren und ermöglicht Stück 2a, sich zu stützen, während das nächste Element platziert wird. (E) Tragen Sie eine dünne Schicht Acrylkleber auf die untere Oberfläche auf einer kürzeren Seite des Stückes 1 auf. Legen Sie das kurze Seitenwandstück (3a) auf den Acrylkleber und verriegeln Sie es in die zuvor platzierte Seitenwand. Halten Sie die beiden Stücke ca. 1 min. (F) Legen Sie das andere kurze Seitenwandstück (3b) auf die gegenüberliegende Seite der unteren Fläche (1). Verriegeln Sie es erneut in das Verbindungsstück (2a) und halten Sie es ca. 1 min. (G) Bei Bedarf Acrylkleber auf die verbleibende lange Seite der unteren Oberfläche (1) auftragen. Legen Sie das letzte lange Seitenwandstück (2b) und verbinden Sie es mit den beiden angrenzenden Stücken (3a und 3b). Stellen Sie sicher, dass alle Teile richtig am unteren Stück (1) ausgerichtet sind und dass keine Anzeichen von Fehlausrichtung oder Lücken zwischen Seitenwänden oder der unteren Oberfläche vorhanden sind. Wiederholen Sie diese Schritte, um den komplementären oberen Teil des Gehäuses (4, 5a, 5b, 6a und 6b) zusammenzubauen. (H) Stellen Sie sicher, dass das Loch in der Ecke von Stück 4 während der Montage nicht behindert wird, sonst schlagen Sie die Öffnung mit einem scharfen Gegenstand wie einer Nadel. Die Löcher des Gehäuses spielen eine entscheidende Rolle im Bereitstellungsprozess und ermöglichen das langsame und kontrollierte Ablassen von Wasser. Ihr Durchmesser wurde optimiert, um den turbulenten Fluss im Gehäuse zu reduzieren, wodurch Störungen der Flüssigkeit, die ISCA-Ports umgibt, beim Abrufen verhindert werden. (Ia,b) Zwei große Rechtecke (7) zusammenkleben und zwei kleinere (8) einzeln kleben. Wiederholen Sie dies einmal für jeden Einzelnen. (J) Kleben Sie die vier zusammengebauten Rechtecke in der Mitte der unteren Fläche des Gehäuses (1). (K) Kleben Sie das Oberdeck (9) auf die Rechtecke (7 und 8). Stellen Sie sicher, dass sich die Seitenlöcher des Stückes auf der Außenseite der Rechtecke befinden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Platzierung von ISCAs im Gehäuse und Versiegelung durch Kleben. (A) Legen Sie die Befestigungsschrauben in die ISCA. (B) ISCA-Platzierung im Bereitstellungsgehäuse. Platzieren Sie den ISCA in der Mitte des Bereitstellungsgehäuses und befestigen Sie ihn mit den angegebenen Schrauben. Das untere Abflussloch des Gehäuses muss mit einer modifizierten 20-L-Spitze (Abbildung 4) abgedichtet werden, sobald das Gehäuse mit Wasser gefüllt ist. Dies hilft, die Erzeugung von turbulenten Strömungen zu vermeiden, die die Stabilität des chemischen Feldes und die Wirksamkeit von Chemotaxis beeinflussen können. (C) Die oberen und unteren Teile werden zusammengefügt. (D) Versiegelung des Gehäuses mit Klebeband. Falten müssen vermieden werden, um Leckagen zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Stecker zum Abdichten des Durchflussdämpfungsgehäuses. Der Stecker kann durch Abdichten einer 20-L-Pipettenspitze mit Wärme hergestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Chemotaxis-Assays mit dem ISCA in Richtung Glutamin einer angereicherten Motil-Gemeinschaft im Labor und natürliche mikrobielle Population auf dem Feld. Chemotaxis-Index Ic (das die Konzentration von Zellen in ISCA-Brunnen darstellt) normalisiert sich durch die mittlere Konzentration der Zellen in den Brunnen, die das gefilterte Meerwasser (FSW) enthalten, nach 60 min Einsatz. Jede Konzentration wurde in fünf ISCA-Replikationen getestet. Die Bakterienzellen wurden durch Durchflusszytometrie (A) quantifiziert: FSW = 4,46 x 0,25 x 103; 100 m = 2,43 x 0,16 x 104; 1 mM = 8,07 x 0,45 x 104; 10 mM = 3,28 x 0,20 x 104; (B): FSW = 1,26 x 0,11 x 104; 1 mM = 3,76 x 0,28 x 104 Zellen/ml). Alle im (A) Labor und (B) Untersuchten Vonglutaminkonzentrationen induzierten eine chemotaktische Reaktion, die deutlich höher war als die Kontrollen des gefilterten Meerwassers (FSW).. In allen paarweise Vergleichen: (A) Tukey HSD, n = 5, p < 0.005; (B) Tukey HSD, n = 5, p < 0,005. Fehlerbalken stellen SEM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Feldmaterial | Menge |
| Wasserfiltration | |
| Rohrträger - 50 ml | 1 |
| Hydrophile GP-Filterpatrone - 0,2 m | 1 |
| Spritzenfilter - 0,2 m | 1 |
| Spritzenfilter - 0,02 m | 1 |
| Spritzen - 50 ml | 4 |
| Konisches Zentrifugenrohr - 50 ml | 5 |
| Chemische Resuspension | |
| Konisches Zentrifugenrohr - 15 ml | 4 |
| Chemoattractants | |
| Spritzen - 10 ml | 4 |
| Spritzenfilter - 0,2 m | 4 |
| Rohrträger - 15 ml | 1 |
| ISCA-Füllung | |
| Spritzennadel 27G | 4 |
| Spritze - 1 ml | 4 |
| Isca | 1 |
| Einsatz | |
| Bereitstellungsgehäuse | 1 |
| Nylon schlitzgeschlitzte Flachkopfschrauben | 2 |
| Bereitstellungsarm | 1 |
| Bungee-Schnur | 2 |
| Klebeband | 1 |
| Bereitstellungsgehäuse-Stecker | 1 |
| Probenabruf | |
| Spritzennadel 27G | 4 |
| Spritzen - 1 ml | 4 |
| Zentrifugenrohr - 2 ml | 12 |
| Einweg-Wischer | 1 Box |
| Glutaraldehyd 25% | 10 ml |
| Sonstiges Material | |
| Pipetten-Set | 1 |
| Pipettenspitzen 200 l | 1 Box |
| Pipettenspitzen 20 l | 1 Box |
| Pipettenspitzen 1 mL | 1 Box |
Tabelle 1: Materialien, die für die Feldbereitstellung erforderlich sind.
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Discussion
Auf der Skala der aquatischen Mikroorganismen ist die Umwelt bei weitem nicht homogen und ist oft durch physikalische/chemische Gradienten gekennzeichnet, die mikrobielle Gemeinschaften1,15strukturieren. Die Fähigkeit von motilen Mikroorganismen, Verhalten (d.h. Chemotaxis) zu verwenden, erleichtert die Nahrungsaufnahme innerhalb dieser heterogenen Mikroumgebungen1. Das Studium von Chemotaxis direkt in der Umwelt hat das Potenzial, wichtige interspezifische Wechselwirkungen und chemische Präferenzen zu identifizieren, und dies kann dazu beitragen, die Beiträge bestimmter Mikroben zu biogeochemischen Prozessen zu entwirren. Das vorgestellte Protokoll setzt die ISCA in der Umgebung11 ein, um den Erwerb reproduzierbarer Forschung an Chemotaxis vor Ort zu erleichtern.
Mit dem ISCA wird gezeigt, dass Glutamin sowohl bei Laborbedingungen als auch im Feld eine positive chemotaktische Reaktion hervorruft. Der ISCA-Einsatz von Glutamin im Feld liefert eine geringere chemotaktische Reaktion als im Labor (Abbildung 5). Ähnliche Patzer zwischen Labor- und Feldexperimenten wurden zuvor beobachtet11. Diese können durch den geringeren Anteil von motilen Zellen in der Umwelt im Vergleich zu den angereicherten Gemeinschaften oder einzelnen motile Isolat in Labor-Assays verwendet erklärt werden.
Die Bedeutung von vorläufigen Laborexperimenten sollte nicht unterschätzt werden, da sie die Bestimmung optimaler Chemoattractantenkonzentrationen für Feldeinsätze ermöglichen. Die optimale Konzentration ist spezifisch für jeden Chemoattraktion und beeinflusst durch sein Molekulargewicht, Löslichkeit und Diffusivität aus den Brunnen. Bei der Verwendung mehrerer unterschiedlicher Substanzen sollte jeder einzeln über einen Konzentrationsbereich hinweg getestet werden. Wenn nach 1 h keine Chemotaxis im Feld entdeckt werden, können längere Einsätze durchgeführt werden. Die Dauer des Einsatzes ist jedoch stark durch das Bakterienwachstum eingeschränkt und sollte immer kürzer sein als die Divisionsrate von Bakterien in der Zielumgebung. Dies trägt dazu bei, das Bevölkerungswachstum innerhalb der ISCA zu vermeiden.
Der ISCA ist empfindlich gegenüber Wasserturbulenzen und sollte beim Befüllen und Entleeren des Strömungsdämpfungsgehäuses beachtet werden. Diese Schritte müssen langsam durchgeführt werden, da Ströme, die durch eine schnelle Füllung entstehen, den Inhalt der Brunnen spülen oder verdünnen können. Dadurch werden Chemolock-Mittel entfernt oder verhindert, dass sie sich richtig diffusen oder Bakterien aus der Umgebung einschleusen, was letztlich die Zellzahl verzerrt. Das vollständige Befüllen des Gehäuses mit Wasser, während die gesamte Luft entlüftet wird, dann vollständig zu schließen, stellt sicher, dass Turbulenzen den Einsatz nicht stören. Das Sammeln von Metadaten am Einsatzort (d. h. Temperatur, Salzgehalt, Chlorophyll/Nährstoffkonzentration) ist ebenfalls ein entscheidender Schritt, um Ergebnisse zu interpretieren, da diese Faktoren Chemotaxis beeinflussen können.
Das ISCA ist ein zugängliches, benutzerfreundliches Gerät, das neue Einblicke in die Rolle und Prävalenz von Chemotaxis in der Umwelt bietet. Es ermöglicht die Abfrage von Chemotaxis in jedem System, das eine flüssige Phase enthält (z. B. Meeres-, Süßwasser-, Boden-, Abwassersysteme). Schließlich kann es für gezielte Studien über Krankheitserreger und Antibiotikaresistenzen in der Umwelt, Isolierung wichtiger Mikroben für die Bioprospektion und Biosanierung bestimmter Schadstoffe und Mikroplastik verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde zum Teil von der Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative finanziert, indem sie GBMF3801 an J.R.S. und R.S., und einen Investigator Award (GBMF3783) an R.S. sowie ein Australian Research Council Fellowship (DE160100636) an J.B.R., eine Auszeichnung der Simons Foundation an B.S.L. (594111) und ein Stipendium der Simons Foundation (542395) an R.S. im Rahmen der Principles of Microbial Ecosystems (PriME) Collaborative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube - 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | - | - | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips - 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips - 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter - 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter - 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes - 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes - 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes - 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter - 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J.
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R.
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
