Summary
يُعرض هنا البروتوكول الخاص بـ اختبار كميكوتاكس في الموقع، وهو جهاز microfluidic تم تطويره مؤخرًا ويمكّن من إجراء دراسات للسلوك الميكروبي مباشرة في البيئة.
Abstract
السلوكيات الميكروبية، مثل حركية وchemotaxis (قدرة الخلية على تغيير حركتها استجابة للتدرج الكيميائي)، تنتشر على نطاق واسع عبر المجالات البكتيرية والعتقية. يمكن أن ينتج عن Chemotaxis مزايا كبيرة في الحصول على الموارد في بيئات غير متجانسة. كما تلعب دوراً حاسماً في التفاعلات التكافلية، والمرض، والعمليات العالمية، مثل الدراجات الكيميائية الحيوية. ومع ذلك، فإن التقنيات الحالية تقيد بحوث الchemotaxis بالمختبر ولا يمكن تطبيقها بسهولة في هذا المجال. يُعرض هنا بروتوكول خطوة بخطوة لنشر مقايسة الأوموتاكسيس في الموقع (ISCA)، وهو جهاز يمكّن من الاستجواب القوي لخموتاكسيس الميكروبات مباشرة في البيئة الطبيعية. وICCA هو جهاز microfluidic تتكون من مجموعة 20 بئر، والتي يمكن تحميل المواد الكيميائية ذات الأهمية. وبمجرد نشرها في بيئات مائيّة، تنتشر المواد الكيميائية خارج الآبار، مما يخلق تدرجات تركيز تستشعرها الميكروبات وتستجيب لها بالسباحة في الآبار عبر الآبار. ويمكن بعد ذلك أخذ عينات من محتويات البئر واستخدامها في (1) قياس قوة الاستجابات الكيميائية لمركبات محددة من خلال قياس الخلايا المتدفقة، (2) عزل الكائنات الدقيقة المتجاوبة وثقافتها، (3) توصيف هوية السكان المستجيبين وإمكاناتهم الجينية من خلال التقنيات الجزيئية. و ISCA هو منصة مرنة يمكن نشرها في أي نظام مع مرحلة مائي، بما في ذلك البيئة البحرية والمياه العذبة والتربة.
Introduction
الكائنات الحية الدقيقة المتنوعة استخدام الحركة وchemotaxis لاستغلال البيئات غير مكتمل المغذيات، والعثور على المضيفين، أو تجنب الظروف الضارة1،2،3. ويمكن أن تؤثر هذه السلوكيات الميكروبية بدورها على معدلات التحول الكيميائي4 وأن تعزز الشراكات التكافلية عبر النظم الإيكولوجية الأرضية والمياه العذبة والنظم الإيكولوجية البحرية2،5.
وقد درست على نطاق واسع Chemotaxis تحت ظروف المختبرات على مدى السنوات ال 60 الماضية6. الطريقة الكمية الأولى لدراسة chemotaxis ، المقايسة الشعرية ، ينطوي على أنبوب شعري مملوءة بكيموااتtractant المفترضة مغمورة في تعليق البكتيريا6. نشر المادة الكيميائية من الأنبوب يخلق تدرج كيميائي، والبكتيريا الكيميائية تستجيب لهذا التدرج عن طريق الهجرة إلى الأنبوب7. منذ تطور المقايسة الشعرية ، لا تزال تستخدم على نطاق واسع اليوم ، وقد تم تطوير العديد من التقنيات الأخرى لدراسة chemotaxis تحت ظروف فيزيائية / كيميائية تسيطر عليها بشكل متزايد ، مع أحدثها التي تنطوي على استخدام microfluidics8،9،10.
Microfluidics، جنبا إلى جنب مع المجهر الفيديو عالية السرعة، تمكن من تتبع سلوك الخلايا الفردية استجابة لتدرجات تسيطر عليها بعناية. وعلى الرغم من أن هذه التقنيات قد حسنت إلى حد كبير فهمنا لخموتاكسيس، إلا أنها اقتصرت على الاستخدام المختبري ولا تترجم بسهولة إلى النشر الميداني في النظم البيئية. ونتيجة لذلك، لم يتم فحص قدرة المجتمعات الطبيعية من البكتيريا على استخدام البكيميوتاكسيس داخل النظم الإيكولوجية الطبيعية؛ وهكذا، فإن الفهم الحالي للأهمية البيئية المحتملة لخميموتاكسيس منحاز لظروف المختبر الاصطناعي وعدد محدود من عزل البكتيريا المستزرعة في المختبرات. وSCA وضعت مؤخرا يتغلب على هذه القيود11.
وSCA يبني على المبدأ العام من المقايسة الشعرية; ومع ذلك، فإنه يجعل من استخدام تقنيات microfabrication الحديثة لتقديم منصة تجريبية منسوخة للغاية، يمكن الانتشار بسهولة لتحديد كمي من chemotaxis نحو مركبات ذات فائدة في البيئة الطبيعية. كما يسمح بتحديد وتوصيف الكائنات الحية الدقيقة الكيميائية عن طريق العزل المباشر أو التقنيات الجزيئية. في حين أن أول جهاز عمل كان ذاتي التصنيع وشيد من الزجاج و PDMS11، فإن أحدث نسخة مصبوب حقن يتكون من البولي ، وذلك باستخدام إجراء تصنيع موحدة للغاية (لمصلحة في أحدث إصدار من الجهاز ، يمكن الاتصال المؤلفين المقابلة).
وتتميز هذه الآبار بحجم بطاقة الائتمان، وتتألف من 20 بئراً موزعة في صفيف آبار 5 × 4، يرتبط كل منها بالبيئة المائية الخارجية بواسطة ميناء صغير (قطره 800 ميكرومتر؛ و20 بئراً من الآبار، و 400 ميكرومتر، و100 ميكرومتر، و100 100 متر، و100 ميكرو متر، و100 100 متر، و150 ميكرو، و1000 ميكرو، و1999، و1999،100 متر مربع، و 2000 متر مربع، و 100 ميكرومتر، و 100 الشكل 1). المواد الكيميائية المفترضة المحملة في الآبار تنتشر في البيئة عبر الميناء ، والميكروبات الكيميائية تستجيب عن طريق السباحة من خلال الميناء في البئر. وبما أن العديد من العوامل يمكن أن تؤثر على نتائج تجربة ISCA في البيئة الطبيعية، فإن هذا البروتوكول خطوة بخطوة سوف يساعد المستخدمين الجدد على التغلب على العقبات المحتملة وتسهيل عمليات النشر الفعالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
نوصي بتنفيذ القسم 1 قبل التجارب الميدانية لتحسين النتائج.
1. مختبر التحسين
ملاحظة: وحدات التخزين الموضحة في الإجراء الأمثل كافية لـ ISCA واحد (يتكون من 20 بئر).
- إعداد المادة الكيميائية ذات الأهمية
ملاحظة: غالباً ما يحتاج التركيز الأمثل لكل مُتراكٍ كيميائي إلى تحديد في ظروف مختبرية قبل عمليات النشر الميدانية. سينخفض مجال التركيز الكيميائي في حجمه مع المسافة من المصدر (ISCA جيدًا) ، مما يعني أن التركيز الذي تعاني منه الكائنات الحية الدقيقة في البيئة سيكون أقل من الموجود داخل الجهاز. التركيز الأمثل لاستخدامها في ISCA بشكل جيد يعتمد على معدل انتشار الكيميائي. إذا كان التركيز في البئر منخفضًا جدًا (قريبًا من حد الكشف عن الميكروبات) ، فلن يتم ملاحظة أي chemotaxis إيجابي. وعلى العكس من ذلك، إذا كان التركيز في البئر مرتفعاً جداً، فإن التركيز سيكون أيضاً عالياً في البيئة المباشرة، وسوف يحدث تراكم الميكروبات فوق آبار اسكا بدلاً من داخلها. ولذلك، ينبغي أن تنفذ سلسلة التخفيف في ظروف مختبرية لكل مركب من أجل تحديد التركيز الأمثل للانتشار الميداني. ومن الناحية المثالية، ينبغي أيضا اختبار نطاق تركيز في الميدان لتأكيد النتائج المختبرية.- إعداد 2.5 لتر من وسيط مناسب يحتوي على تركيز الملح المناسب (مثل الملح (PBS) أو مياه البحر الاصطناعية المخزنة بالفوسفات. تصفية المتوسطة مع مرشح 0.2 μm باستخدام مضخة ال peristaltic أو فراغ والأتوماتيكلاف.
- إعداد حل 10 mM من chemoattractant في 1 مل من المتوسطة العقيمة. تصفية محلول كيميائي مع مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر لإزالة الجسيمات والملوثات المحتملة.
ملاحظة: من الناحية المثالية، لا ينبغي أن تكون أي مركبات عضوية غير كيموبات تراسيتانتانت موجودة في الحل النهائي.
- نطاق التركيز حسب سلسلة التخفيف
- تخفيف محلول الأسهم الكيميائية المصفاة في سلسلة، تتراوح (على سبيل المثال) من 10 إلى 100 ميكرومتر.
ملاحظة: هناك حاجة على الأقل 0.7 مل الحجم النهائي لكل تركيز اختبارها.
- تخفيف محلول الأسهم الكيميائية المصفاة في سلسلة، تتراوح (على سبيل المثال) من 10 إلى 100 ميكرومتر.
- تحميل ISCA
- املأ حقنة 1 مل مع المُصفى الكيميائي وربطها بحقنة 27 G. عقد ISCA مع الميناء التي تواجه التصاعدي، وحقن المادة ببطء حتى تظهر قطرات صغيرة على رأس الميناء.
ملاحظة: 1) يجب حقن كل تخفيف أو مادة مع حقنة وإبرة منفصلة لمنع التلوث المتبادل. 2) هذه القطيرة الصغيرة مهمة لأنها تضمن عدم وجود فقاعة هوائية محصورة داخل الميناء ، مما قد يضعف قدرة الميكروبات على الهجرة عبر الميناء. 3) من المستحسن ملء صف كامل لكل مادة أو تركيز (خمسة آبار) لتوفير الحد الأدنى من الحجم الكافي لإجراء المزيد من التحليلات. 4) صف واحد لكل ISCA يجب أن تعمل كتحكم سلبي وينبغي أن تكون مليئة المتوسطة التي سيتم ترشيحها تعليق الميكروبات. هذا العلاج يفسر تأثير الحركة العشوائية من قبل الميكروبات في آبار ISCA وينبغي أن تستخدم لتطبيع العلاجات التي تحتوي على chemoattractant.
- املأ حقنة 1 مل مع المُصفى الكيميائي وربطها بحقنة 27 G. عقد ISCA مع الميناء التي تواجه التصاعدي، وحقن المادة ببطء حتى تظهر قطرات صغيرة على رأس الميناء.
- النشر في المختبر
- بين عشية وضحاها، احتضان ثقافة 5 مل المخصب مع 1٪ مرق البحرية (للبكتيريا البحرية) أو 1٪ مرق lysogeny (LB، لبكتيريا المياه العذبة).
ملاحظة: يمكن استخدام عزلات البكتيريا الـ Motile أو المجتمعات البكتيرية الطبيعية في عمليات النشر المختبرية. - احتضان الثقافة لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) و 180 دورة في الدقيقة. بعد 12 ساعة، تأكد من أن المجتمعات الميكروبية هي منسّغة عن طريق المراقبة المباشرة تحت المجهر.
- تدور أسفل الثقافة في 1500 × ز لمدة 10 دقيقة و resuspend 1/100 في 150 مل من المتوسطة المناسبة (على سبيل المثال، مياه البحر المصفاة، والمياه العذبة المصفاة).
- ضع قطعتين صغيرتين من الشريط اللاصق على الوجهين على السطح المسطح لولب سعة 200 مل (أغطية صناديق تلميح 1 مل لها الأبعاد المثالية لهذا الغرض ويمكن بسهولة أن تكون autoclaved). ضع واحدة ISCA على القمة، وضمان أن تعلق بشكل آمن على الشريط. املأ درج النشر ببطء بالمحلول البكتيري باستخدام ماصات مصلي 50 مل.
ملاحظة: املأ الصينية حتى يتم غمر ISCA تحت حوالي 1-2 سم من السائل. إذا كنت تستخدم عدة علب، استخدم نفس وحدة التخزين في جميع. - ترك ISCA لاحتضان لمدة 1 ساعة للسماح chemotaxis البكتيرية. بعد 1 ساعة، وإزالة المتوسطة بلطف جدا مع ماصة المصلية 50 مل للحد من تدفق المضطربة.
- استرداد ISCA من علبة التوزيع دون لمس السطح العلوي. استخدمي ماصة وماسحات يمكن التخلص منها لإزالة السائل المتبقي على سطح ISCA.
ملاحظة: من المهم تجنب لمس المنافذ أثناء هذه العملية، حيث أن التغيرات الناتجة في الضغط يمكن أن تزيل أو تضيف البكتيريا من البيئة الخارجية إلى البئر وبالتالي تحيز الكثافة البكتيرية والتركيب داخل البئر.
- بين عشية وضحاها، احتضان ثقافة 5 مل المخصب مع 1٪ مرق البحرية (للبكتيريا البحرية) أو 1٪ مرق lysogeny (LB، لبكتيريا المياه العذبة).
- استرجاع العينات
- عقد ISCA مع ميناء تواجه إلى أسفل، واسترداد حجم الآبار باستخدام إبرة حقنة 27 G معقمة تعلق على حقنة 1 مل.
ملاحظة: يمكن تجميع كل صف (إذا كان يحتوي على نفس المادة) لتوفير عينة عمل تبلغ حوالي 550 ميكرولتر. ويمكن فيما بعد أن يتم نقل هذه العينة إلى أنابيب مختلفة تبعاً للتطبيقات المصب المطلوبة. - تحديد عدد البكتيريا التي جذبت إلى كل تركيز كيميائي من خلال تحليل العينات مع تدفق cytometry12. اختيار تركيز كيمواتراكاتنتانت أن يزيد من chemotaxis للنشر الميدانية اللاحقة.
- عقد ISCA مع ميناء تواجه إلى أسفل، واسترداد حجم الآبار باستخدام إبرة حقنة 27 G معقمة تعلق على حقنة 1 مل.
2 - الإعداد للنشر الميداني
ملاحظة: يجب أن يتم إعداد المواد وبناء حاوية تخميد التدفق (القسم 2) قبل النشر.
- إعداد المواد
- إعداد جميع المواد المدرجة في الجدول 1.
ملاحظة: يتم توفير كميات المواد لإحدى هذه الكميات.
- إعداد جميع المواد المدرجة في الجدول 1.
- بناء وإعداد حاوية تخميد التدفق
ملاحظة: تقلل حاوية تخميد التدفق من الاضطرابات غير المرغوب فيها التي تمنع بخلاف ذلك إنشاء تدرجات كيميائية منبثقة من ISCA.- قطع القطع للغلبة نشر مع قطع الليزر من ورقة الاكريليك 3 ملم.
ملاحظة: يمكن العثور على ملف القطع باستخدام الارتباط التالي: - تجميع قطع الليزر قطع كما هو موضح في الشكل 2 باستخدام الغراء الاكريليك.
ملاحظة: تجميع القطع بعناية. يمكن أن تؤدي الثغرات أو المحاذاة غير المُهمة إلى حدوث تسربات عند النشر، مما يؤثر بشكل مباشر على جودة البيانات. - ترك الضميمة المجمعة لتجف بين عشية وضحاها.
- اغسل العلبة بالماء الأيوني.
- تحديد التسرب المحتمل عن طريق صب المياه الأيونية في الضميمة. إصلاح أي تسرب محتمل المفاصل عن طريق إضافة المزيد من الاكريليك الغراء، ثم كرر الخطوات 2.2.3-2.2.5.
- قطع خيوط المسمار في قطعة الاكريليك التي سيتم استخدامها لتأمين ISCA. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الصنبور مع القطر والملعب مطابقة مسامير تصاعد.
- أولاً، قم بلصق الصنبور في وجع الصنبور، ثم قم بتأمين قطعة الأكريليك التي سيتم استغلالها في نائب benchtop. للحصول على أفضل النتائج، تأكد من قطعة الاكريليك هو مستوى ممكن. تأكد من أن الصنبور عمودي على قطعة الاكريليك والبدء في تحويل وجع الصنبور (في اتجاه عقارب الساعة)، وتطبيق الضغط الخفيف على الصنبور.
- بعد عدة الثورات الكاملة في قطعة الاكريليك، عكس دوران الحنفية (عكس عقارب الساعة) لمدة ربع التناوب لمسح الاكريليك من الصنبور. كرر العملية حتى يتم استغلال عمق كامل قطعة الاكريليك.
- وأخيرا ، وإزالة الصنبور (تحول عكس عقارب الساعة) واختبار المواضيع باستخدام المسمار.
- قطع القطع للغلبة نشر مع قطع الليزر من ورقة الاكريليك 3 ملم.
3- الإجراءات في الميدان
- تنقية المياه
- جمع المياه من موقع الحقل عندما تكون جاهزة لبدء التجربة. تصفية 5 مل من المياه لكل ISCA من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر (مع حقنة 50 مل) في أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 50 مل.
ملاحظة: يلزم 3 مل من المياه المصفاة لملء جميع آبار أيسكا؛ ومع ذلك، فمن المستحسن أن 1) تصفية 5 مل لكل جهاز لحساب الخسائر خلال عملية الترشيح الرباعية، و 2) الحفاظ على aliquots من filtrates والضوابط السلبية لكل من تدفق العمليات الجذرية والإجراءات الجزيئية. - تصفية الترشيح مرتين من خلال 0.2 ميكرومتر هيدروفيليك اخصاطة تصفية سباق الجائزة الكبرى (باستخدام نفس واحد، في كلتا المرتين) مع حقنة جديدة 50 مل في أنبوب جديد 50 مل مخروطية الطرد المركزي. تصفية الترشيح من خلال مرشح حقنة 0.02 ميكرومتر (مع حقنة جديدة 50 مل) في أنبوب جديد مخروطي 50 مل.
ملاحظة: يجب أن يزيل هذا الترشيح الرباعي جميع الكائنات الدقيقة والجسيمات تقريبًا من الماء. الحفاظ على الترشيح النهائي بعيدا عن أي مصدر للحرارة حتى الاستخدام. وسوف تستخدم هذه المياه لإعادة توزيع جميع المواد الكيميائية المستخدمة في هذه المنطقة، وينبغي الحفاظ عليها في نفس درجة حرارة المياه في موقع النشر. أما التدفقات الحُمَكية الناجمة عن الاختلافات في درجة الحرارة بين آبار إيسكا والبيئة الخارجية فقد تحدث خلاف ذلك. - استخدام aliquots من filtrate لإعادة تعليق جميع chemoattractants من الفائدة (عادة الجافة) إلى التركيزات المطلوبة في 15 مل أنابيب أجهزة الطرد المركزي المخروطية.
- تصفية المتعاطات الكيماوية المُعاد اعتمادها من خلال فلتر حقنة 0.2 ميكرومتر مع حقنة 10 مل في أنابيب أجهزة طرد مركزي مخروطية 15 مل معقم لإزالة الجسيمات غير المرغوب فيها أو المركبات غير القابلة للذوبان في الماء (إذا كان استخدام المستخلصات).
ملاحظة: قم بالتصفية بلطف لمنع الجسيمات من المرور عبر المرشح. من المهم إعادة تعليق المواد الكيميائية في المياه فائقة التصفية من موقع الحقل وعدم solubilize لهم في حلول أخرى. استخدام المياه من موقع الحقل ضروري (1) الحصول على نفس تركيز الملح داخل الآبار كما هو الحال في المياه البيئية السائبة لمنع التدفق الذي يحركه الكثافة، و(2) ضمان أن مستويات المغذيات الخلفية متساوية داخل البئر وخارجه.
- جمع المياه من موقع الحقل عندما تكون جاهزة لبدء التجربة. تصفية 5 مل من المياه لكل ISCA من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر (مع حقنة 50 مل) في أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 50 مل.
- ISCA ملء
- تنفيذ المقطع 1.3 لتعبئة ISCA.
ملاحظة: يوصى بملء صف واحد (خمسة آبار) لكل مادة (أي ثلاث مواد مختلفة لكل ISCA وأخرى لمراقبة مياه البحر المرشحة للغاية).
- تنفيذ المقطع 1.3 لتعبئة ISCA.
- النشر في الميدان
- المسمار ISCA (الشكل 3A) إلى قطعة 9 من الضميمة (الشكل 2K والشكل 3B).
ملاحظة: يمكن أن تحتوي حاوية تخميد التدفق الموضحة أعلاه على اثنين من الـ ISCAs جنباً إلى جنب أو واحدة من ISCA موضوعة في مركزها. - إغلاق الضميمة (الشكل 3C) وختم مع شريط لاصق (الشكل 3D).
ملاحظة: يجب تجنب التجاعيد لضمان ختم الكمال. ختم جميع الجوانب أولا، ثم (في خطوة ثانية) ختم الثقوب الجانبية، والتي سيتم استخدامها لاستنزاف المياه من الضميمة في نهاية أخذ العينات. لا تغلق الثقوب العلوية والسفلى. لا تضع ISCA رأسا على عقب، حيث يمكن أن يحدث تدفق يحركها الكثافة في الآبار التي تحتوي على chemoattractants، والتي سوف تحيز عدد الخلايا في الآبار. - لأن العلبة يجب أن تبقى ثابتة أثناء النشر، فمن المستحسن إرفاقه بهياكل من صنع الإنسان (مثل، عائم، سلم) باستخدام حبال بانجي.
ملاحظة: يمكن ربط العلبة بذراع نشر (هنا، مشبك معدل مع منصة عمودية) باستخدام أسلاك بانجي قبل الغمر في الماء. بدلا من ذلك، يمكن ملء الضميمة وتأمينها مع وزن صغير على ركائز ضحلة. إذا كان الغرض من عمليات النشر في المحيط البحري، يمكن ربط العلبة بشباك مع عوامة على جانب واحد وثقل الغوص من جهة أخرى. - غمر العلبة تمامًا لبدء التعبئة. أثناء الملء، أمسك العلبة بقوة لمنع حركة المياه المفرطة في الداخل. بمجرد أن يصل مستوى الماء إلى أعلى العلبة، تأكد من عدم وجود هواء في الداخل.
ملاحظة: في حالة وجود بعض فقاعات الهواء المحاصرين، إمالة الضميمة بلطف مع فتحة تنفيس التي تواجه صعودا، والتي سوف تمكن فقاعات للهروب. - مرة واحدة كاملة تماما، وختم الثقوب أسفل وأعلى مع اثنين من المقابس، والتي يمكن أن تكون مصنوعة من السيليكون أو المطاط أو عن طريق ختم الأطراف من 20 نصائح ماصة μL(الشكل 4).
ملاحظة: هذه الخطوة يمنع تدفق داخل الضميمة أثناء أخذ العينات. - ترك ISCA في مكان لأخذ العينات لمدة 1-3 ساعة.
ملاحظة: يتم إملاء وقت النشر المثالي في المقام الأول من خلال درجة حرارة الماء ومضاعفة الوقت للمجتمع البكتيري. عندما تكون درجة حرارة الماء فوق 20 درجة مئوية، لا ينصح بنشر ISCA لأكثر من 1 ساعة، لأن انقسام الخلايا يمكن أن يحدث في الآبار التي تحتوي على كيموات تراكسيتاترات بعد 1.5-2.0 ساعة. ومع ذلك، يمكن اختبار وقت النشر الأمثل قبل تجربة ISCA عن طريق تعديل المجتمعات الطبيعية بالمواد الكيميائية المحملة وتحديد عدد الخلايا عبر الزمن. - إزالة العلبة من الماء. وضعه فوق حاوية مما يتيح المياه التي يمكن تصريفها من الضميمة.
- إزالة الجزء العلوي من شريط لاصق من الثقوب الأمامية بلطف شديد.
ملاحظة: يجب أن يكون تدفق المياه التي تغادر العلبة بسرعة يقطر. المضي قدما حفرة واحدة في وقت واحد، من أعلى الضميمة إلى أسفل. وينبغي أن يستغرق ما يقرب من 10-15 دقيقة لاستنزاف الضميمة تماما. - مرة واحدة في خط المياه يمر تحت الجزء العلوي من ISCA، وإزالة المكونات السفلي، واستنزاف بقية الماء.
- في حين لا تزال الـ ISCAs متصلة بالضمية، قم بإزالة المياه العالقة بعناية فوق ISCA مع ماصة 1 مل.
- إزالة ISCA دون لمس السطح العلوي واستخدام مسح المتاح لإزالة أي السائل المتبقية على السطح.
ملاحظة: من المهم عدم لمس المنافذ أثناء هذه العملية، حيث أن التغييرات الناتجة في الضغط يمكن أن تزيل أو تضيف البكتيريا السائبة إلى البئر وتنحي تعداد البكتيريا. - استرداد العينات من ISCA بتكرار الخطوة 1.5.1.
- المسمار ISCA (الشكل 3A) إلى قطعة 9 من الضميمة (الشكل 2K والشكل 3B).
4- تطبيقات المصب
ملاحظة: يتم إعطاء وحدات التخزين استناداً إلى عينة 550 ميكرولتر (صف واحد من ISCA).
- إصلاح 100 ميكرولتر من محتويات جيدا مع الجلوتارالدهيد (2٪ التركيز النهائي) لالتدفق cytometry لتحديد chemotaxis لكل جذب.
ملاحظة: يخزن على الجليد (أو عند 4 درجات مئوية) ويحلل العينات في نفس اليوم. وبدلاً من ذلك، يمكن تجميد العينات في النيتروجين السائل بعد التثبيت إذا لم يكن التحليل ممكناً في نفس اليوم. إن عملية استئصال الخلايا هي الطريقة الموصى بها لتحديد عدد الخلايا في آبار ISCA، حيث أنها واضحة وسريعة ودقيقة12. - المفاجئ تجميد 300 μL من محتوى جيد في النيتروجين السائل لاستخراج الحمض النووي اللاحقة وتحليل11.
ملاحظة: تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى التحليل. - إضافة 90 ميكرولتر من محتويات جيدا إلى 10 ميكرولتر من TE-الجليسرول العازلة والانطباق تجميد العينات للجينوم وحيد الخلية13.
- انتشار 10-20 ميكرولتر على لوحات أجار التي تحتوي على المتوسطة المطلوبة لعزل البكتيريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعرض هذا القسم نتائج المختبر باستخدام ISCA لاختبار الاستجابة الكيميائية للميكروبات البحرية إلى نطاق تركيز الجلوتامين ، وهو حمض أميني معروف لجذب بكتيريا التربة14. وقد استخدم تركيز الجلوتامين الذي أثار أقوى استجابة كيميائية في الاختبارات المخبرية لإجراء فحص كميموتكس في البيئة البحرية.
لإجراء الاختبارات المعملية، تم إثراء مجتمعات مياه البحر التي تم أخذ عينات منها من المياه الساحلية في سيدني، أستراليا، للخلايا الزجرية من خلال تعديل بسيط للمغذيات4، كما هو موضح في الخطوة 1.4. تم تخفيف الجلوتامين بشكل متسلسل في مياه البحر المرشحة للغاية للحصول على تركيزات نهائية تتراوح بين 10 mM إلى 100 ميكرومتر. بعد نشر 1 ساعة، تم تجميع محتويات كل صف ISCA (الذي يحتوي على نفس تركيز الجلوتامين) لتوفير عينات عمل تبلغ حوالي 550 ميكرولتر. تم إصلاح هذا الحجم في الجلوتارالديهيد (2٪ التركيز النهائي)، وعدد البكتيريا المستجيبة كميا عن طريق تدفق استئصال الاليات.
لفترة وجيزة، تم تحديد كمية الوفرة البكتيرية من قبل 1) تلطيخ الخلايا مع صبغة الحمض النووي الفلورية الخضراء و 2) التحليل باستخدام مقياس تدفق الخلايا مع المياه ذات الاستيداد فائقة التصفية مثل السائل العاصم. لكل عينة، تم تسجيل التشتت الأمامي (FSC) وتشتت الجانب (SSC) وفلورسنس أخضر. تم تحليل العينات بمعدل تدفق 25 ميكرولتر/دقيقة، مع تمييز الخلايا البكتيرية وفقًا لـ SSC والفلورسيه الخضراء. تم تحديد مؤشر العلاج الكيميائي (Ic) عن طريق قسمة عدد البكتيريا الموجودة في كل عينة من قبل متوسط عدد البكتيريا في آبار مراقبة مياه البحر المصفاة (FSW).
وأظهرت النتائج أن 1 mM هو التركيز الأمثل لنشر الجلوتامين، كما أنه تسبب في استجابة كيمائية كبيرة التي كانت 18 أضعاف أعلى من مراقبة مياه البحر المصفاة(t-test, p < 0.001)(الشكل 5A). ارتفاع أو انخفاض تركيزات الجلوتامين الناجمة عن الردود الكيميائية الكبيرة ولكن أضعف(Ic = 5.43 ل 100 ميكرومتر، p < 0.001; Ic = 7.34 ل 10 μM، p < 0.001). إذا كان تركيز كيميائي المضافة إلى بئر ISCA عالية جدا، يمكن تقليل chemotaxis في البئر، لأن (1) البكتيريا لن تكون قادرة على الكشف عن تدرج في قسم الميناء، وربما تجميع فوق البئر، أو (2) قد تتأثر درجة الHH أو osmolarity من البئر.
وقد استخدم تركيز الجلوتامين الأمثل في وقت لاحق في النشر الميداني. تم نشر خمسة من الـ ISCA مملوءة بـ 1 mM glutamine لمدة 1 ساعة في موقع ساحلي بالقرب من سيدني، أستراليا (33.91 درجة مئوية، 151.26 درجة شرقاً). جذبت الجلوتامين 2.98 مرة أكثر من البكتيريا من الآبار التحكم مليئة مياه البحر المصفاة من موقع النشر (الشكل 5B). وكانت الاستجابة الكيميائية في هذه التجربة الميدانية مختلفة بشكل كبير عن الضوابط(t-test, p< 0.001) وشكلت استجابة قوية لمياه البحر الساحلية11.
الشكل 1: آراء مفصلة عن اختبار الأوموتاكسي في الموقع (ISCA). (أ) أحدث حقن مصبوب ISCA. (ب) التخطيطي من بئر ISCA. شريط مقياس = 7.463 ملم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تجميع حاوية تخميد التدفق. (أ) القطع المطلوبة لتجميع حاوية النشر. أثناء التصنيع، يجب أن تكون الحواف ناعمة. (B) ضع القطع 2a، 2b، 3a، و 3b حول القطعة 1 (السطح السفلي). (C) تجميع الجزء السفلي من الضميمة عن طريق وضع طبقة رقيقة من الغراء الاكريليك حول الحافة الأولى من السطح السفلي (1). (د) ضع أول قطعة جانبية أطول (2a) عموديًا على الغراء وتمسكها في مكانها. الغراء يتطلب ~ 1 دقيقة لترسيخ ويسمح قطعة 2a لدعم نفسها في حين وضع العنصر التالي. (E) تطبيق طبقة رقيقة من الاكريليك الغراء على السطح السفلي على الجانب أقصر من قطعة 1. ضع قطعة الحائط الجانبي القصير (3a) على الغراء الاكريليك وقفل في الجدار الجانبي وضعت سابقا. ضع القطعتين لمدة دقيقة واحدة تقريبًا (F) ضع قطعة الحائط الجانبي القصير الآخر (3b) على الجانب المقابل من السطح السفلي (1). مرة أخرى، قفله في قطعة ربط (2a) وعقد عليه لمدة 1 دقيقة تقريبا (ز) إذا لزم الأمر، إعادة تطبيق الغراء الاكريليك على الجانب الطويل المتبقي من السطح السفلي (1). ضع آخر قطعة جانبية طويلة (2b) واربطها بالقطعتين المجاورتين (3a و 3b). تأكد من أن جميع القطع تتماشى بشكل صحيح مع القطعة السفلية (1) وأنه لا توجد علامات على عدم المحاذاة أو الفجوات بين الجدران الجانبية أو السطح السفلي. كرر هذه الخطوات لتجميع الجزء العلوي التكميلي من العلبة (4 و5a و5b و6a و6b). (ح) تأكد من أن لا يتم عرقلة ثقب في زاوية قطعة 4 أثناء التجمع، وإلا لكمة الفتحة مع كائن حاد مثل إبرة. تلعب فتحات الضمّة دورًا حاسمًا في عملية النشر وتسمح بتصريف المياه بطريقة بطيئة وخاضعة للرقابة. وقد تم تحسين قطرها للحد من التدفق المضطرب داخل الضميمة، مما يمنع اضطراب السوائل المحيطة بموانئ ISCA عند الاسترجاع. (Ia, b) الغراء معا اثنين من المستطيلات الكبيرة (7) واللصق بشكل منفصل اثنين أصغر منها (8). كرر مرة واحدة لكل. (ي) الغراء المستطيلات الأربعة المجمعة في وسط السطح السفلي للحاويات (1). (K) الغراء الطابق العلوي (9) على أعلى المستطيلات (7 و 8). تأكد من أن الثقوب الجانبية للقطعة موجودة على الجانب الخارجي من المستطيلات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: وضع الـ ISCAs في الضميمة والختم بواسطة التسجيل. (A) ضع مسامير التركيب في ISCA. (B) وضع ISCA في حاوية النشر. ضع ISCA في منتصف حاوية النشر وارفقه بالمسامير المحددة. يجب أن تكون مختومة فتحة التصريف السفلية للضميمة مع 20 μL تلميح معدلة (الشكل 4) بمجرد أن يتم تعبئة العلبة بالماء. وهذا يساعد على تجنب توليد التدفقات المضطربة التي يمكن أن تؤثر على استقرار المجال الكيميائي وفعالية chemotaxis. (C) يتم تجميع الأجزاء العلوية والسفلى معا. (D) ختم العلبة باستخدام شريط لاصق. يجب تجنب التجاعيد لمنع التسرب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: سد لختم التخميد تدفق الضميمة. ويمكن إجراء المكونات عن طريق ختم 20 ميكرولتر ماصة مع الحرارة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: Chemotaxis المقايسة باستخدام ISCA نحو الجلوتامين من المجتمع motile المخصب في المختبرات والسكان الميكروبية الطبيعية في هذا المجال. مؤشر Chemotaxis Ic (الذي يمثل تركيز الخلايا داخل آبار ISCA) الذي تم تطبيعه حسب متوسط تركيز الخلايا داخل الآبار التي تحتوي على مياه البحر المصفاة (FSW) بعد 60 دقيقة من النشر. وقد تم اختبار كل تركيز في خمس تكرارات ISCA. تم تحديد كمية الخلايا البكتيرية بواسطة تدفق cytometry (A): FSW = 4.46 ± 0.25 × 103; 100 ميكرومتر = 2.43 ± 0.16 × 104؛ 1 mM = 8.07 ± 0.45 × 104؛ 10 mM = 3.28 ± 0.20 × 104؛ (ب): FSW = 1.26 ± 0.11 × 104؛ 1 mM = 3.76 ± 0.28 × 104 خلايا / مل). جميع تركيزات الجلوتامين التي تم اختبارها في المختبر (A) و (B) تسبب في استجابة كيميائي أعلى بكثير من الضوابط مياه البحر (FSW)المصفاة. في جميع المقارنات الزوجية: (أ) Tukey HSD، n = 5، p < 0.005؛ (أ) هـ. (ب) توكي HSD، ن = 5، p < 0.005. تمثل أشرطة الأخطاء SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المواد الميدانية | كميه |
| تنقية المياه | |
| رف أنبوب - 50 مل | 1 |
| خرطوشة فلتر سباق الجائزة الكبرى المائية - 0.2 ميكرومتر | 1 |
| مرشاح الحقن - 0.2 ميكرومتر | 1 |
| مرشاح الحقن - 0.02 ميكرومتر | 1 |
| المحاقن - 50 مل | 4 |
| أنبوب مركزي مخروطي - 50 مل | 5 |
| إعادة المعالجة الكيميائية | |
| أنبوب مركزي مخروطي - 15 مل | 4 |
| كيموات تراسيتانتس | |
| المحاقن - 10 مل | 4 |
| مرشاح الحقن - 0.2 ميكرومتر | 4 |
| رف أنبوب - 15 مل | 1 |
| ISCA ملء | |
| حقنة إبرة 27G | 4 |
| حقنة - 1 مل | 4 |
| الرابطه | 1 |
| نشر | |
| حاوية النشر | 1 |
| نايلون مشقوق مسامير الرأس المسطحة | 2 |
| ذراع النشر | 1 |
| سلك بانجي | 2 |
| شريط لاصق | 1 |
| مقبس حاوية النشر | 1 |
| استرداد العينات | |
| حقنة إبرة 27G | 4 |
| المحاقن - 1 مل | 4 |
| أنبوب الطرد المركزي - 2 مل | 12 |
| ماسحات يمكن التخلص منها | 1 مربع |
| الجلوتارالديهيد 25% | 10 مل |
| مواد أخرى | |
| مجموعة الماصات | 1 |
| نصائح الماصات 200 ميكرولتر | 1 مربع |
| نصائح الماصات 20 ميكرولتر | 1 مربع |
| نصائح Pipette 1 مل | 1 مربع |
الجدول 1: المواد اللازمة للنشر الميداني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على نطاق الكائنات الحية الدقيقة المائية، والبيئة بعيدة كل البعد عن التجانس وغالبا ما تتميز بالتدرجات الفيزيائية/الكيميائية التي تُهيّن المجتمعات الميكروبية1،,15. قدرة الكائنات الحية الدقيقة motile على استخدام السلوك (أي chemotaxis) يسهل الأعلاف داخل هذه البيئة الدقيقة غير المتجانسة1. دراسة chemotaxis مباشرة في البيئة لديه القدرة على تحديد التفاعلات الهامة بين خصوصيات وتفضيلات المواد الكيميائية، وهذا يمكن أن يساعد على فك مساهمات الميكروبات محددة للعمليات الكيميائية الحيوية. ويُنشر البروتوكول المعروض في البيئة11 من هذا البروتوكول لتيسير الحصول على البحوث القابلة للاستنساخ في الموقع.
باستخدام ISCA، يظهر أن الجلوتامين يثير استجابة إيجابية كيميائي في كل من الظروف المختبرية وفي الميدان. إن نشر الغلوتامين في المجال يعطي استجابة أقل من المعالجة الكيميائية في المختبر (الشكل 5). وقد لوحظت في السابق11من ال patters مماثلة بين التجارب المختبرية والميدانية. ويمكن تفسير ذلك بانخفاض نسبة الخلايا المتحركة في البيئة مقارنة بالمجتمعات الغنية أو عزل الروتيل الواحد المستخدم في المقايسات المختبرية.
وينبغي عدم التقليل من أهمية التجارب المختبرية الأولية، لأنها تسمح بتحديد التركيزات المثلى من المواد الكيميائية لاستخدامها في عمليات النشر الميدانية. التركيز الأمثل هو خاص بكل كيميائي وتأثر بوزنه الجزيئي، والذوبان، والناشرة من الآبار. وفي حالة نشر مواد متعددة متميزة، ينبغي اختبار كل منها على حدة عبر نطاق تركيز. إذا لم يتم الكشف عن chemotaxis في الميدان بعد 1 ساعة، يمكن تنفيذ عمليات نشر أطول. ومع ذلك، فإن طول النشر مقيد بشدة بسبب النمو البكتيري ويجب أن يكون دائمًا أقصر من معدل تقسيم البكتيريا في البيئة المستهدفة. وهذا يساعد على تجنب النمو السكاني داخل ا.إي.إي.إيكا.
وSCA حساسة لاضطرابات المياه وينبغي توخي الحذر عند ملء وتفريغ الانسياب التخميد الضميمة. ويجب أن تتم هذه الخطوات ببطء، لأن التدفقات الناتجة عن الملء السريع يمكن أن تطرد أو تخفف محتويات الآبار. ونتيجة لذلك، هذا يزيل أو يمنع chemoattractants من نشرها بشكل صحيح أو إدخال البكتيريا من البيئة المحيطة، في نهاية المطاف التحيز عدد الخلايا. ملء العلبة بالماء بالكامل أثناء تنفيس الهواء بالكامل، ثم إغلاقه بالكامل، يضمن عدم تداخل الاضطراب مع عملية النشر. كما أن جمع البيانات الوصفية في موقع النشر (أي درجة الحرارة والملوحة والكلوروفيتيل/تركيز المغذيات) هو أيضاً خطوة حاسمة لتفسير النتائج، لأن هذه العوامل يمكن أن تؤثر على chemotaxis.
وSCA هو وسيلة سهلة الاستخدام يمكن الوصول إليها ، ويوفر رؤى جديدة في دور وانتشار chemotaxis في البيئة. وهو يتيح استجواب الكيموتاكسيس في أي نظام يحتوي على مرحلة سائلة (مثل نظم المياه البحرية والمياه العذبة والتربة ومياه الصرف الصحي). وأخيراً، يمكن استخدامه لإجراء دراسات محددة الهدف بشأن مسببات الأمراض ومقاومة المضادات الحيوية في البيئة، وعزل الميكروبات الرئيسية للتنقيب البيولوجي، والمعالجة الحيوية لملوثات محددة وجسيمات مجهرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل مبادرة الأحياء الدقيقة البحرية مؤسسة غوردون وبيتي مور، من خلال منحة GBMF3801 إلى J.R.S. وR.S.، وجائزة المحقق (GBMF3783) إلى R.S.، فضلا عن زمالة مجلس البحوث الأسترالي (DE160100636) إلى J.B.R. ، وهي جائزة من مؤسسة سيمونز إلى B.S.L. (594111) ، ومنحة من مؤسسة سيمونز (542395) إلى R.S. كجزء من مبادئ النظم الإيكولوجية الميكروبية (PriME) التعاونية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube - 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | - | - | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips - 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips - 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter - 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter - 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes - 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes - 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes - 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter - 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J.
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R.
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
