Summary
Erken fare embriyolarında mikroRNA'ların profilini çıkarmak için bir teknik tanımladık. Bu protokol, düşük hücre girişi ve küçük RNA zenginleştirme zorluğunun üstesinden gelebiliyor. Bu tsay erken fare embriyofarklı hücre soylarında zaman içinde miRNA ifade değişiklikleri analiz etmek için kullanılabilir.
Abstract
MikroRNA'lar (miRNA'lar) hücre kaderi kararlarının ve gelişimsel zamanlamanın karmaşık düzenlenmesi için önemlidir. Erken gelişim sırasında miRNA'ların katkısının in vivo çalışmaları, sınırlayıcı hücre sayısı nedeniyle teknik olarak zordur. Ayrıca, birçok yaklaşım kuzey blotting, mikrodizi ve qPCR gibi tahlillerde tanımlanması ilgi bir miRNA gerektirir. Bu nedenle, birçok miRNA'nın ve onların isoformlarının ekspresyonu erken gelişim sırasında incelenmemiştir. Burada, nöral krest hücrelerinin erken popülasyonlarında miRNA'ların nispeten tarafsız profilini çıkarmak için erken fare embriyolarından sıralanmış hücrelerin küçük RNA dizilimi için bir protokol gösteriyoruz. Kütüphane hazırlığı sırasında amplifikasyon ve jel bazlı arınma kullanarak düşük hücre girişi ve boyut seçiminin zorluklarının üstesinden çıkıyoruz. Embriyonik yaşı, kopyalar arasındaki varyasyonun değişken bir muhasebesi olarak tanımlarız ve biyolojik kopyalarda miRNA'ları doğru bir şekilde profillemek için sahne eşlenen fare embriyoları kullanılmalıdır. Sonuçlarımız, bu yöntemin diğer hücre soylarından miRNA'ların ekspresyonunun profiline geniş ölçüde uygulanabileceğini göstermektedir. Özetle, bu protokol miRNA'ların erken fare embriyosu farklı hücre soylarındaki gelişim programlarını nasıl düzenlediğini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Gelişim biyolojisinin temel sorusu, tek bir farklılaşmamış hücrenin çok sayıda karmaşık hücre tipine sahip bütün bir organizmaya nasıl yol abildiğidir. Embriyogenez sırasında, organizmalar geliştikçe hücrelerin gelişim potansiyeli giderek kısıtlanır. Bir örnek nöral krest soy, giderek periferik nöronlar gibi çeşitli terminal türevleri içine multipotent hücre popülasyonundan ayırt, glia, kranial kemik, ve kıkırdak. Nöral krest hücreleri gastrulation sırasında ektoderm belirtilir ve daha sonra mezenkimal geçiş için bir epitel geçmesi ve ölümcül ayırt edecek vücut boyunca ayrık yerlere embriyo ile göç1. Onlarca yıllık çalışmalar transkripsiyonel gen düzenleyici ağ ortaya çıkardı, ancak nöral krest gelişiminin zamanlamasını kontrol post-transkripsiyonel düzenleme mekanizmaları hakkında çok daha az bilinmektedir.
Önceki çalışma mikroRNA 'lar (miRNA'lar) uygun gelişimsel zamanlama ve hücre kaderikararları2,3,4,5,6için gen ekspresyonunu bastırmak olduğunu göstermektedir . Nöral krest gelişiminde miRNA çalışmaları büyük ölçüde kraniyofasiyal gelişimin sonraki aşamalarına odaklanmıştır. Örneğin, miR-17 ~92 ve miR-140 fare ve zebra balığıkrayon gelişimi sırasında palatogenez için kritik, sırasıyla7,8. MiRNA'ların embriyonun ilk nöral krest kader kararlarına katkısı tam olarak araştırılmamıştır. Erken kader kararlarında miRNA'lar üzerinde yapılan çalışmalar, erken embriyolarda bulunan düşük hücre sayısı gibi teknik zorluklarla sınırlandırılmıştır.
MiRNA'lar erken fare gelişimimodelinefarklı aşamalarında embriyoid cisimler kullanılarak hücre hatlarından in vitro profilli olmuştur 9 . Erken memeli gelişimi sırasında vivo küçük RNA'ların araştırılması nispeten sınırlı olmuştur. QPCR, microarrays ve kuzey lekeleri10gibi yöntemlerde belirli bir miRNA ekspresyonu analiz etmek için kullanılan bilinen bir dizi olarak profil miRNA'lar için önceki yöntemler önyargı yol açmıştır. Yeni nesil sıralama ve hiç moleküler araçlar iyileştirilmesi şimdi erken memeli gelişimi ve hücre kaderi kararlarına katkılarını incelemek için miRNA ifade nispeten tarafsız analizi için izin verir.
Burada, gastrulation (E7.5) organogenezin in başına kadar erken fare embriyolarından (E7.5) nöral krest hücrelerinde ifade edilen küçük RNA'ların hasat ve dizilimi için bir teknik (E9.5) rapor ediyoruz. Bu teknik basittir ve yeni nesil sıralama için en az sayıda hücreden küçük RNA sıralama kitaplıkları hazırlamak için soy izleme, hücre sıralama ve jel tabanlı boyut seçimi birleştirir. Erken gelişimin hızlı değişimleri sırasında miRNA'ların kapsamlı bir görünümünü elde etmek için 6 saatlik zaman aralıklarını çözmek için embriyoların katı somit evre sinin eşleştirilmesinin önemini vurguluyoruz. Bu yöntem genetik ve gelişimsel çalışmalara yaygın olarak uygulanabilir ve embriyoların biraraya gelebisini önler. Jel bazlı arınma, kütüphane nicelemesi ve PCR'den getirilen önyargıyı en aza indirme kullanarak miRNA zenginleştirme gibi mevcut yöntemlerin zorluklarının üstesinden gelmenin bir yolunu tanımlıyoruz. Bu yöntem, miRNA'ların fare embriyolarının nöral krest soyundan gelişimsel zamanlamayı nasıl kontrol ettiğine çalışmak için zaman içinde miRNA ifade modellerini tanımlamak için kullanılmıştır.
Protocol
Tüm araştırma ve hayvan bakım prosedürleri Baylor College of Medicine Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Değerlendirme ve Laboratuvar Hayvan Bakımı onaylı hayvan tesisi Baylor College of Medicine akreditasyon için Derneği ev sahipliği yapmaktadır. Tüm suşlar C57BL6 arka plan üzerinde muhafaza edildi.
1. Embriyo diseksiyonu (E7.5-E9.5)
- Hamile bir kadın fare den rahim boynuzları çıkarın, kesi yapılacak nerede% 70 etanol ile karın sterilize.
- Fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayarak rahim temizleyin. Steril bir plastik 10 cm çanak içine rahim yerleştirin.
- Mikrodiseksiyon makası kullanarak, bölgeyi içeren her bir yaprak birbirlerinden ayırın. Rahim kasını soyup tüm yaprak balığını ortaya çıkar. Birer birer, her embriyodan yaprak olanı çıkarın.
- Her embriyo dan sarısı kese çıkarın ve genotipleme için kaydedin.
- Görüntüleme için taze PBS yeni bir çanak içine tüm embriyolar taşıyın.
- Tüm çöp bir görüntü alın. Her embriyoyu ayrı ayrı görüntüleyin ve her embriyonun somit sayısını sayın. Büyütme ve pozlama (floresan sayılsın) deneyler arasında aynı tutun.
NOT: 50-200 ms maruziyetinin floresan için yeterli olduğunu ve 20 ms'in parlak alan ayarı için yeterli olduğunu görüyoruz.
2. Embriyo bölünmesi ve hücre sıralama
- Her embriyoiçin sıralanacak, aşağıdakileri yapın.
- E8.0'dan daha yaşlı embriyolar için otik plakodun hemen üzerinde decapitate (sadece kafatası bölgesietiketli hücreler isteniyorsa). E7.5 embriyoları için ekstra embriyonik yapıları çıkarın (sadece embriyo uygun isteniyorsa).
- Başı en az miktarda PBS'den 48 kuyulu temiz bir kuyuya taşıyın. 250 μL papain (27 U/mL) ekleyin. Pipet p200 kullanarak yavaşça yukarı ve aşağı.
- Mikroskop altında kontrol edin ve kümeler ve tek hücreler arayın.
- Tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar yukarı ve aşağı hafif pipetleme tekrarlayın (genellikle e7.5-E9.5 için 30 s ile 1 dk arasında eşit olmalıdır yukarı ve aşağı pipetleme genellikle üç tur).
- 250 μL fetal sığır serumu (FBS) ile söndürme.
- Her embriyonun sıralanması için 2.1.1-2.1.5 adımlarını tekrarlayın.
- Kümeleri temizlemek için 35 μm naylon örgü filtre tüpünden 500 μL hücre süspansiyonu filtreleyin.
- Filtrat alın ve yeni 1.5 mL tüp ve 5 dakika için 200 x g spin taşıyın. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve yeni tüpe aktarın (canlı hücrelerin pelette olduğu bilinene kadar kaydedin).
- % 0.5-1 büyükbaş serum albumin içeren PBS 300 μL hücre pelet resuspend ve sıralama kadar buz üzerinde tutmak (şimdi ve sıralama sonu arasındaki süreyi en aza indirmek).
- İstenirse, 10 μL hücre süspansiyonu alın ve 10 μL Trypan mavisi (%0,4) ile birleştirin ve Trypan mavisi sadece ölü hücreleri lekeler olarak yaklaşık hücre niceliği ve canlılığı belirlemek için bir hemositometre kullanarak saymak.
- Sıralamadan hemen önce, her örneği bir filtre kapağı tüpüne tekrar süzün ve canlı hücreler için DAPI lekesi ekleyin.
- Her numuneyi 70 μm nozüllü hücre ayırıcısı üzerinde 500 μL RNA ekstraksiyon lisis çözeltisine (Bkz. Malzeme Tablosuna)sıralayın.
- Tüm numuneler hasat edilene kadar -80 °C'de karıştırın ve saklayın. Bu noktadan itibaren yalnızca bir deneme için gereken tüm numuneler, kitaplık hazırlama turları arasındaki teknik değişimi azaltmak için hasat edildiğinde devam edin.
3. RNA çıkarma
NOT: Protokol RNA izolasyon kitinden uyarlanmıştır; bkz. Malzemeler Tablosu.
- Toplam hacmi 1000 μL yapmak için her numuneye 500 μL RNA ekstraksiyon lysis çözeltisi (bkz. Malzeme Tablosu)ekleyin.
- Her numuneyi oda sıcaklığında eritin.
- Girdap her numune için 1,5 dakika, homojenizasyon başlamadan önce kapağın her tüp üzerinde güvenli olduğundan emin olun. Homojeni oda sıcaklığında (15-25 °C) 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- 140 μL kloroform, kapak tüpünü güvenli bir şekilde ekleyin ve 15 s boyunca şiddetle sallayın. 3 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- 4 °C'de 12.000 x g'de 15 dk santrifüj. Üst sulu fazı buz üzerinde yeni bir toplama tüpüne aktarın. Herhangi bir interfaz veya herhangi bir organik faz transfer etmeyin. Pembe organik faza yaklaşırken, tüpü yan lara doğru çevirin ve net sulu faz toplanana kadar küçük aliquotları çıkarın.
- Bir sonraki adımda doğru hesaplama için her örnekten toplanan sulu faz içeren RNA hacmini ölçün.
- %100 etanol 1,5 hacim (genellikle 525°L ama biraz daha fazla veya daha az olabilir) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın.
- Herhangi bir çökelti dahil 700 μL'ye kadar pipet, 2 mL toplama tüpündeki kolona dönüşür. Oda sıcaklığında 15 s için 8.000 x g ≥ kapağı nı ve santrifüjkapatın. Akışı atın.
- Numunenin geri kalanını kullanarak adım 3.8'i tekrarlayın.
- Kolon, üretici talimatlarına göre yıkayın. 1 dakika boyunca tam hızda iplik tarafından sütun kuru. Sütunu yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne aktarın.
- Pipet 11 μL çekirdeksiz su membranın merkezine. 1 dakika oda sıcaklığında oturalım. Sütunu kapatmak için 1 dakika boyunca maksimum hızı döndürün.
- RNA konsantrasyonu bir spektrofotometre ve paralel kapiller elektroforez cihazı(Tablo Malzemeler)kullanarak ölçün.
4. Kütüphane hazırlama
NOT: Protokol küçük RNA kütüphane hazırlama kiti el kitabından uyarlanmıştır; bkz. Malzemeler Tablosu.
- 3' Adaptörün seyreltilmesini kullanarak küçük RNA kütüphane hazırlama kiti el kitabında belirtildiği gibi denatürasyon ve 3' adaptör ligasyonunu tamamlayın.
- 3' bağdaştırıcı kaldırma işlemine devam edin.
- Küçük RNA kitaplık hazırlama kiti el kitabında belirtildiği gibi bağdaştırıcı tükenmesini tamamlayın. Boncuk temizliği için taze hazırlanmış %80 etanol kullandığınızdan ve boncukları aşırı kurutmadan çekirdeksiz suda yeniden süspansiyondan hemen önce tüm fazla etanolün tamamen çıkarıldığından emin olun (boncuk peletinin çatlaması aşırı kuruma üzerine gözlenir).
- Doğrudan aşırı bağdaştırıcı inaktivasyonuna devam edin.
- Tüm reaktifleri buz üzerinde biraraya getiren küçük RNA kitaplık hazırlama kiti el kitabında belirtildiği gibi fazla bağdaştırıcı inaktivasyonunu tamamlayın.
- 5' 4N adaptör ligasyonuna devam edin.
- Küçük RNA kütüphane hazırlama kiti el kitabında belirtildiği gibi 5' adaptör ligasyonunu tamamlayın ve 5' adaptörün seyreltilmesini ve tüm reaktiflerin buz üzerinde biraraya getirildiğinden emin olun.
- Transkripsiyon tersine çevirmek için devam edin.
- Küçük RNA kütüphane hazırlama kiti el kitabında belirtildiği gibi tam ters transkripsiyon-ilk iplikçik sentezi ve buz üzerinde tüm reaktifler monte etmek için özen ve uzun süre dondurucu enzim tutmak değil.
NOT: Bu noktada protokol durdurulabilir ve numuneler bir gecede 4 °C'de depolanabilir. Alternatif olarak PCR amplifikasyon devam edin. - Küçük RNA kitaplık hazırlama kiti el kitabında belirtildiği gibi reaktifleri birleştirerek ve PCR döngülerinin sayısını en aza indirerek TAM PCR amplifikasyonu. PCR döngülerinin sayısı deneysel olarak her uygulama için belirlenmeli ve minimum döngü sayısı kullanılmalıdır. Burada küçük RNA kütüphanelerimizi başarıyla yükseltmek için 16 döngü kullandık.
- Doğrudan boyut seçimine devam edin.
5. Boyut seçimi
- Her numuneiçin, karıştırmak için 5 μL 6x jel yükleme boya ve pipet ekleyin.
- Jelin ilk kuyusu için merdiven 10 μL yükleyin, hemen sağ boş kuyu bırakarak. Adım 5.1'den tüm ürünü %6 Tris/borate/ethylenediaminetetraasetik asit – poliakrilamid jel (TBE-PAGE) üzerine yükleyin ve her numunenin arasına 1 şerit bırakın.
NOT: Jel sonraki adımlar için geldi konteyner tutun. - Jeli 150 V'de yaklaşık 30-40 dk 0,5x TBE çalışan tamponda çalıştırın (alt boya bandı jelin dibine yakın olana kadar, 0,5-1 cm).
- Jel çalışırken 1 L boyama çözeltisi yapın: SYBR Gold 0,5x TBE'de 1:10.000 seyreltilmiş.
- Jel çalışma bittiğinde (yani, alt boya bandı jelin alt kısmında), dikkatle jel yönünü belirterek, cam plakalar jel kaldırın.
- Jeli orijinal ambalajının tepsisine yerleştirin. 0.5x TBE'yi çıkarın ve 5.5 adımdaki boyama çözeltisi ile değiştirin. 15 dk için leke jeli. Boyama süresinin arttırılması gerekebilir.
- Jeli uv transilluminator'a yerleştirin, jeli yırtmamaya özen görünün ve yukarıda belirtilen oryantasyonu koruyun (merdiven bantları açıkça görülemiyorsa ek süre için yeniden leke).
- Bir kamera ile UV transilluminator üzerinde boyama tamamlandıktan sonra jel görüntü.
- Daha iyi bir görüntü gerekiyorsa, uv transilluminator üzerinde doğrudan görüntüleme şekil 3A-B'degösterildiği gibi arka plan değişken boyama neden olarak bir UV transilluminator üzerinde bantları kesmeden önce jel bir görüntü yakalamak için uv transilluminator dışında bir görüntüleme cihazı kullanın . Hassas ve yırtılma olabilir gibi jel çok fazla kez hareket etmeyin.
- ~150 bp bandı temiz bir jilet kullanarak tanımlayın ve çıkarın ve temiz 1,5 mL tüpiçine yerleştirin. ~130 bp bandı (adaptör dimer ürün) kesip etmeyin.
- Belgeleme amacıyla kitaplık ürünlerini içeren dilimleri kaldırdıktan sonra jeli yeniden görüntüleyin.
- Her tüpün altındaki dilimleri toplamak için 30 s için maksimum hızda jel dilimi içeren mikrosantrifüj tüplerspin.
- Mümkün olan en küçük bit içine jel dilim ezmek için her örnek için bir p200 ucu kullanın. Her ucu her tüpe at.
- Her tüp için, 300 μL elüsyon tamponekleyin, tüpün yan tarafında jel bityıkamak ve p200 ucu yeniden ve her örnek için ucu yıkamadikkat.
- Eluting örneklerini 25 °C'ye ayarlanmış bir titreyen kuvöze yerleştirin. 1000 rpm sallayarak bir gecede kuluçka. Tüplerini kuvözden çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika maksimum hızda döndürün.
- Kütüphane ürünlerini içeren süpernatantı 2 mL RNase ücretsiz 96 kuyu plakasına aktarın. Herhangi bir jel transfer değil dikkat edin.
- Her numuneye 50 μL temizleme boncukları ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Hemen, 350 μL isopropanol ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Sallayarak 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- Darbe spin plaka pelet boncuk ve daha sonra 2 dakika için manyetize. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve atın.
- %80 etanol 950 μL ekleyin. 30 s için kuluçka. Tüm supernatant çıkarın. Toplam iki etanol yıkAma için tekrarlayın.
- Numuneyi 3 dk kurulayın. Bu adımda her kuyunun altında toplanan herhangi bir artık etanol kaldırmak için dikkat edin (en fazla bir kez) ve boncuk aşırı kurudeğil (aşırı kurutma boncuk pelet çatlama neden olacaktır).
- Kuyunun altındaki tüm artık sıvıyı çıkarın. Plakayı manyetik standdan çıkarın.
- Peleti 13 μL resuspension tamponunda yeniden askıya alın. Homojen olana kadar pipetle karıştırın. 2 dk kuluçka ve sonra 3 dakika için manyetize.
- 12 μL supernatant'ı temiz bir tüpe veya sonraki depolama için temiz bir tabağa aktarın. Tüm numuneleri gece boyunca 4 °C veya -20 °C uzun süreli olarak saklayın.
- Kapiller elektroforez yüksek duyarlılık DNA testi kullanarak her kütüphanede bulunan parçaların boyutunu ve konsantrasyonu kontrol edin. Konsantrasyonu birden fazla yöntemle doğrulayın.
NOT: Kapiller elektroforezin aşırı yüklenmesini önlemek için zaman zaman standart hassasiyet kitini kullandık.
Representative Results
Burada gösterilen prosedürü kullanarak, E7.5, E8.5 ve E9.5'te embriyo ları hasat ettik. Ekstraembriyonik yapılar tüm embriyolardan çıkarıldı ve daha sonra embriyolar 6 saatlik zaman aralıklarını çözmek için somite sahnelendi(Şekil 1A-1B). Örnekleri benzerliğe göre gruplandırmak için prensip bileşen analizini kullanarak, örneklerin yaşa göre kümelenmelerini, embriyonik yaşın bir sonucu olarak değişimi ve biyolojik kopyalar için dikkatli somit eşleşmesi ihtiyacını vurgulayarak buluruz(Şekil 1C). E7.5'te pluripotent epiblastı profilledik, soy e8.5'te Wnt1-Cre ve E9.5'te Sox10-Cre kullanarak göç eden nöral krest hücreleri kullanılarak premigratory ve migratory nöral krest hücrelerini takip ettik (Şekil 1D). Burada özellikle otik placode hemen üzerinde embriyo kafasını keserek kranial nöral ibik hasat. Nöral krest hücrelerini etiketlemek için sıklıkla kullanılan iki Cre-sürücülerin (Wnt1 ve Sox10) karşılaştırılması, erken fare embriyolarında farklı popülasyonları işaretlediklerini doğrular(Şekil 1E). Gating stratejileri doğrudan RNA ekstraksiyon lisis çözeltisine göre sıralanmış ve -80 °C 'de saklanan canlı tek RFP pozitif hücreleri elde etmek için kullanılmıştır(Şekil 1F). Table of Materials Her örnekten kaç hücre toplandığını takip etmek önemlidir.
RNA yalıtımı, RNA kiti protokolünün değiştirilmiş bir sürümü kullanılarak gerçekleştirildi. Özellikle 4 °C'de depolanacak mini RNA kolonları kullanıyoruz. Bu sütunlar, hücre girişinin sınırlandığı örneklerden mümkün olan en yüksek RNA konsantrasyonuna elde etmek için küçük hacimli (11°L) eluting için yararlıdır. Aynı nedenle fenol kloroform ekstraksiyonundan sonra sulu fazın tamamının elde edilmesi önemlidir. Toplama sırasında tüpün yavaş borulanması ve bir tarafa yatırılanması verimi en üst düzeye çıkarmak için önemlidir. Bu prosedürde, tuz/protein kontaminasyonu hakkında bilgi edinmek için rna'yı hem spektrofotometre hem de konsantrasyonu ölçmek için kılcal elektroforez kullanarak ölçeriz (Şekil 2). Spektrofotometre izi RNA'nın kirletici proteinlerle izole edildiğini ancak yüksek tuz içeriğine sahip olduğunu ortaya koymaktadır(Şekil 2A-2B). İdeal olarak 260/280 oranı ~1.8, 260/230 oranı ise >2.0 olmalıdır. Spektrofotometre ile ölçülen toplam RNA verimi yaşla birlikte E8.5-E9.5 arasında artmadı. Bunun nedeni spektrofotometrenin hasat ettiğimiz hücre sayısındaki RNA konsantrasyonundaki değişiklikleri tespit edecek kadar hassas olmamasıdır ve kılcal elektroforezden elde edilen konsantrasyon bilgilerini kullanmanızı öneririz(Şekil 2C). Kapiller elektroforez izi, RNA parçalarının konsantrasyonu ve boyutunu tahmin etmek için kullanılabilir. Zirveler <1000 nükleotid bozulmanın göstergesidir. Temsili izleme, bozulmayan RNA ile tutarlıdır. 2000 nükleotit ve 5100 nükleotitteki zirveler sırasıyla 18 ve 28s rRNA'dır. Küçük RNA bölgesi ~150 nükleotitte bulunur(Şekil 2D).
Küçük RNA sıralama kitaplıkları, Malzeme Tablosu'ndaaçıklanan küçük RNA kitaplık hazırlık kiti kullanılarak hazırlanmıştır. Burada her örnekten elde edilen RNA'nın yarısından sadece daha azını (11°L elution'ın 4'ü, ~80-120 ng) kullanarak RNA sıralama kitaplıklarının her örnekten kalan RNA'dan sentezlemesini sağlıyoruz. Burada mevcut adaptör dimer miktarını düşürmek için 3' ve 5' küçük RNA adaptörleri 1/4 seyreltmek ve adaptör ligasyon, temizleme ve ters transkripsiyon adımları sürekli bir şekilde mümkün olduğunca tamamlanır öneririz. Kütüphaneleri yükseltmek ve herhangi bir deney için minimum PCR döngüsü sayısının ampirik olarak belirlenmesini önermek için 16 PCR döngüsü kullandık. Fazla PCR döngülerini tamamlayarak, düşük ifade edilmiş bir miRNA'nın okuma sayısını yapay olarak şişirebilirsiniz.
Boyut seçimi miRNA'lar ve genellikle mevcut adaptör dimers değil kütüphaneleri için zenginleştirmek için zorunludur. Kütüphane ürün boyutu (150 bp) ve adaptör dimers (130 bp) boyutu çok benzer. Jel çıkarma, küçük RNA sıralama kitaplıklarını bağdaştırıcı dimerlerinden ayırmak için kullanılır (Şekil 3). Eksizyondan önce bir PAGE jelinin görüntüsü, her örnekte çok sayıda ürün boyutu bulunduğunu gösterir(Şekil 3A). Herhangi bir iki örnek veya jel üzerine yüklenen bir merdiven arasında bir şerit açık bırakmak önemlidir. Jelin altındaki geçiş cephesi, 150 bp bandının tüm numuneler için ayırt edilmesi zorsa daha yavaş bir hızda koşmanın gerekli olabileceğini gösteren hafif eğimlidir. Bu temsili görüntü de pozitif kontrol RNA yüksek konsantrasyondan 150 bp ürün bir bolluk gösterir (bir sıçan beyninden toplam RNA) her embriyonik örnek gitti göre kütüphane hazırlık gitti. Negatif kontrol, reaktiflerin nükleik asit türlerini kirletmekten arındığını ortaya koymaktadır(Şekil 3A). 150 bp bandının eksizyonu temiz bir jiletle yapılmalı ve toplanan alan Şekil 3B'degösterilmiştir. Boyut seçiminden önce ve sonra kapiller elektroforez izleri jel saflaştırma ile 150 bp kütüphane ürününün saflığında dramatik bir iyileşme göstermektedir(Şekil 3C-3D). Şekil 3C-3D'deki izlerin işaretçilerden daha yüksek örnek zirvelere sahip olduğunu ve aşırı yüklemenin göstergesi olduğunu belirtmek önemlidir. Bu gibi durumlarda, parçaların boyutu doğru olabilir, ancak konsantrasyon olmayabilir. Nicelleştirme, kitaplıkların işaretleyicilerin aralığına seyreltilmesi veya alternatif yöntemler kullanılarak elde edilebilir. Kütüphane nicelemesinin alternatif yöntemleri arasında bazı farklılıklar buluyoruz ve birden fazla nicelik yönteminin ampirik olarak test edilmesini öneriyoruz. Bir defada sıralanacak numune sayısını en üst düzeye çıkarırken konsantrasyonun doğru ölçülmesi esastır. Kütüphaneler sıralama için 1,3 pM'ye kadar seyreltilir ve genellikle 15-25 örnekten herhangi bir yerde ~ 140 milyon okuma sağlayan 150 döngü sıralama kiti üzerinde bir defada sıralanabilir. Bu da örnek başına yaklaşık 5 milyon okuma ile sonuçlanır. Genellikle haritalama oranları% 60-80 arasındadır.
Şekil 1: Fare embriyolarından küçük RNA dizilimi için hücrelerin toplanması. (A) E8.5 fare embriyosu, embriyonun evresini belirlemek için kullanılan yolk kesesinin ve somitlerin çıkarılmasını vurgulamak için (B) Nöral krest gelişiminin aşamalarını yakalamak için fare embriyolarının somit evrelemesi (C) Sıralanmış yabani tip krest hücrelerinden hazırlanmış kütüphanelerin prensip bileşen analizi, örneklerin yaşa göre gruplandığını gösteren (D) Şematik örneklerin E8.5'te Wnt1-Cre kullanılarak nasıl toplandığını gösteren etiket premigratory ve migratory nöral krest hücreleri ve Sox10-Cre E9.5 sadece göçmen nöral krest hücreleri etiketlemek için (E) Sıralanmış yabani tip nöral krest hücrelerinden örnek grup gösteren kütüphanelerin İlke bileşen analizi ne olursa olsun yaş (F) Gating stratejisi E8.5 ve E9.5 embriyolardan RFP + nöral krest hücrelerini izole etmek için kullanılan FACSsıralama kullanarak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: E7.5-E9.5 fare embriyolarından RNA izolasyonu. (A) Bu protokolü uyguladığımız embriyonun en genç evresinden bir RNA izolasyonunun temsili spektrofotometre izi. (B) Spektrofotometreden elde edilen RNA kalitesinin temsili değerlerini gösteren tablo. (C) Her yaştaki embriyolardan sıralanmış nöral krest hücrelerinden alınan RNA örneği(D) Kılcal elektroforez izi kaliteli RNA'yı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: miRNA kitaplıkları boyut seçiminden önce ve sonra. (A) TBE-PAGE jel dört örnek ve kontroller için temsili küçük RNA kütüphaneleri gösteren önce ve (B) sonra 150 bp bant eksizyon. Oklar 150 bp bandı excised temsil (C) Kapiller elektroforez küçük RNA kütüphane önce ve (D) boyut seçiminden sonra iz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Gelişimsel süreçler hızla ilerleyebilir ve hücreler miRNA'ların erken kader kararlarına katkıda bulunan kapsamlı bir görünümünü yakalamak için yaygın olarak kullanılan yarım günlük artıştan daha spesifik evreleme gerektiren birçok sıralı spesifikasyondan geçmektedir. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada Theiler evre 12 embriyolar olan 3 ila 6 somites11sahip Arasında RNA sıralama yaptı. Biz bu süre boyunca, nöral krest hücreleri belirtilir (3 yaş somites), delaminate (4 yaş somites), ve göç (5-6 yaş somites). Ayrıca hücre popülasyonlarını takip etmek için kullanılan Cre-driver'ın yanı sıra, yaşın biyolojik örnekler arasındaki en büyük varyasyon kaynağı olduğunu ve sadece somit uyumlu embriyoların kopya olarak düşünülmesi gerektiğini görüyoruz. Transgenik embriyolar ile yabani tip kontrolleri karşılaştırılırken de bu göz önünde bulundurulmalıdır.
Erken gelişim sırasında profil miRNA'lar için önceki yöntemler küçük RNA sıralama kütüphane hazırlama için RNA girişi 10-100 ng arasında kullanmış ve bir örnek içine birden fazla embriyo havuzlu var13,14. RNA izolasyonunu ve kütüphane hazırlığını tek bir E7.5 embriyosu veya E8.5 ve E9.5'teki sıralanmış nöral krest hücrelerinden toplam RNA'nın yaklaşık 100 ng'sini girdi olarak kullanarak gösteriyoruz. Embriyoları sıralamak için ayrıştırırken, bir mikroskop altında ayrışma izlemek ve tek hücre elde edildiğinde gözlemlemek için reaksiyon söndürmek dikkat etmelisiniz. E8.5-E9.5 embriyolarının kranial bölgesinin kopması protokolde açıklandığı gibi nazik manuel pipetleme ile neredeyse anında olduğunu görüyoruz. Daha büyük dokular ve giderek daha yaşlı embriyolar için, ayrışma süresi embriyonun ayrıştırılan kısmına bağlı olarak daha uzun olabilir. E7.5-E9.5 embriyoları için mikroskop altında hücre kümeleri kolayca görülebilir ve daha fazla küme ler görünene kadar bölünme devam etmelidir. 5-10x arasında herhangi bir yerde de çözüm aracılığıyla odak ayarlarsanız tek hücreler çözüm görünür. Önceki yöntemler, kütleli RNA'yı düşük sayıdaki hücreden hazırlamak için RNA sıralaması için hücreleri doğrudan lysis arabelleği olarak sıralar14. Burada, kütüphane hazırlığı başlamadan önce RNA'nın izole edilebilmeleri için doğrudan RNA çıkarma lysis çözeltisine sıralıyoruz. 11 μL elüsyon hacmine sahip mini sütunların kullanımı, tek bir RNA hazırlığının küçük RNA ve toplu RNA sıralaması arasında bölünebileceği kadar yüksek bir RNA konsantrasyonuna izin verdi.
En küçük RNA sıralama yöntemlerinin güncel sınırlamalarından biri, dönüştürülmüş cDNA'nın PCR amplifikasyonudur. Yöntemimiz bu sınırlamanın üstesinden gelmez, ancak önerilen maksimum 25 döngüden 16 döngüye kadar PCR döngülerinin sayısını en aza indirebildik. Amplifikasyondaki bu azalma PCR tarafından sunulan yapay amplifikasyon önyargılarını azaltır. Bir diğer sapma kaynağı da bağdaştırıcıların ve miRNA'ların uçlarında bulunan belirli dizilerin diğer dizilere göre daha fazla verimlilikle bir araya gelebildiği bilinmektedir. Bunu önlemek için, bu protokolde kullanılan bağdaştırıcılar ligasyon reaksiyonlarında önyargıyı önlemek için her bağdaştırıcının sonunda 4 rasgele baz almıştır. Ayrıca, başka bir ortak sorun RNA girişi düşük olduğunda oluşturan bağdaştırıcı dimers miktarıdır. Kütüphane hazırlama kiti, her ligasyondan sonra fazla bağdaştırıcıları kaldırmak için adaptör inaktivasyonu ve boncuk temizleme gibi adaptör dimer oluşumunu azaltmak için adımlar içerir. Ayrıca 3' ve 5' 4N adaptörleri 1/4 oranında seyrelterek oluşabilen bağdaştırıcı dimer miktarını azalttık. Seyreltilmediğinde, 130 bp bant yoğunluğunun arttığını ve bir jel üzerinde istenilen küçük RNA kitaplıklarını içeren 150 bp bandından ayırt etmeyi zorlaştırdığını bulduk.
Sıralama kitaplıklarını hazırlamanın bir diğer güncel zorluğu da sıralamadan önce ürünün doğru niceliğidir. Farklı yöntemlerin aynı kütüphanede farklı sonuçlar verdiğini bulduk. Araştırmacıların konsantrasyonu doğru tahmin etmek için birden fazla nicelik metodlarını kullanmalarını öneriyoruz.
Bu protokol yaygın olarak genetik, gelişimsel çalışmalara veya RNA'nın düşük sayıda hücreden hasat edildiği diğer uygulamalara uygulanabilir. Bu yaklaşım, embriyoların biraraya gelmekten kaçınarak zamansal çalışmaları basitleştirir ve hem sıralanmış hem de sıralanmış hücrelere kolayca uygulanabilir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu proje Andrew McDonough B+ Vakfı ve NIH (R01-HD099252, R01-HD098131) tarafından desteklendi. R.J.P. Kanser Araştırmaları (RR150106) cprit bursu ve Kanser Araştırmaları (V Vakfı) V Bursu üyesidir. Yazarlar ayrıca bu proje için gerekli ekipman sağlamak için BCM de Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdek kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
- Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
- Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
- Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901 (2000).
- Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
- Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).
- Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
- Chugh, P., Dittmer, D. P.
- Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
- Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
- Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
- Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).
