Summary
Descrevemos uma técnica para traçar perfis de microRNAs em embriões de camundongos primitivos. Este protocolo supera o desafio da baixa entrada celular e do pequeno enriquecimento do RNA. Este ensaio pode ser usado para analisar alterações na expressão miRNA ao longo do tempo em diferentes linhagens celulares do embrião do camundongo primitivo.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) são importantes para a complexa regulação das decisões de destino celular e do tempo de desenvolvimento. Estudos in vivo sobre a contribuição de miRNAs durante o desenvolvimento precoce são tecnicamente desafiadores devido ao número de células limitantes. Além disso, muitas abordagens exigem um miRNA de interesse a ser definido em ensaios como manchas do norte, microarray e qPCR. Portanto, a expressão de muitos miRNAs e seus isoformes não foram estudadas durante o desenvolvimento precoce. Aqui, demonstramos um protocolo para o sequenciamento de pequenas células classificadas de células classificadas de embriões de camundongos primitivos para permitir o perfil relativamente imparcial de miRNAs em populações primitivas de células de crista neural. Superamos os desafios da baixa entrada celular e seleção de tamanho durante a preparação da biblioteca usando amplificação e purificação baseada em gel. Identificamos a idade embrionária como uma variável que contabiliza a variação entre réplicas e embriões de camundongos em estágios devem ser usados para traçar com precisão miRNAs em réplicas biológicas. Nossos resultados sugerem que este método pode ser amplamente aplicado para traçar o perfil da expressão de miRNAs de outras linhagens de células. Em resumo, este protocolo pode ser usado para estudar como miRNAs regulam programas de desenvolvimento em diferentes linhagens celulares do embrião inicial do rato.
Introduction
Uma questão central da biologia do desenvolvimento é como uma única célula indiferenciada pode dar origem a um organismo inteiro com numerosos tipos de células complexas. Durante a embriogênese, o potencial de desenvolvimento das células torna-se progressivamente restrito à medida que o organismo se desenvolve. Um exemplo é a linhagem da crista neural, que se diferencia progressivamente de uma população celular multipotente em vários derivados terminais, como neurônios periféricos, glia, osso craniano e cartilagem. As células de crista neural são especificadas a partir do ectoderme durante a gastruação e, em seguida, passam por uma transição epitelial para a transição mesenquimal e migram através do embrião para locais discretos em todo o corpo onde irão diferenciar terminalmente1. Décadas de trabalho descobriram uma rede de regulação genética transcricional, mas muito menos se sabe sobre os mecanismos de regulação pós-transcrição que controlam o tempo de desenvolvimento de crista neural.
Trabalhos anteriores sugerem que microRNAs (miRNAs) reprimem a expressão genética para o tempo de desenvolvimento adequado e decisões de destino celular2,,3,4,,5,6. Estudos de miRNAs no desenvolvimento de crista neural têm se concentrado em grande parte em estágios posteriores do desenvolvimento craniofacial. Por exemplo, miR-17~92 e miR-140 são fundamentais para a palatogênese durante o desenvolvimento craniofacial em camundongos e zebrafish,respectivamente 7,8. A contribuição dos miRNAs para as primeiras decisões de destino da crista neural do embrião não foi investigada minuciosamente. Estudos de miRNAs em decisões de destino precoce têm sido limitados por desafios técnicos, como o baixo número de células presentes em embriões precoces.
MiRNAs foram perfiladas in vitro a partir de linhas celulares usando corpos embrióides em diferentes estágios de diferenciação para modelar o desenvolvimento precoce do mouse9. A investigação de pequenas RNAs in vivo durante o desenvolvimento precoce de mamíferos tem sido relativamente limitada. Métodos anteriores para traçar miRNAs levaram ao viés, pois uma sequência conhecida é usada para analisar a expressão de um miRNA específico em métodos como qPCR, microarrays e manchas do norte10. O sequenciamento da próxima geração e a melhoria das ferramentas moleculares agora permitem uma análise relativamente imparcial da expressão miRNA para estudar sua contribuição para o desenvolvimento precoce de mamíferos e decisões de destino celular.
Aqui, relatamos uma técnica para colher e sequenciar pequenas RNAs expressas em células de crista neural desde embriões de camundongos primitivos que abrangem gastrulação (E7.5) até o início da organogênese (E9.5). Esta técnica é simples e combina rastreamento de linhagem, classificação celular e seleção de tamanho baseado em gel para preparar pequenas bibliotecas de sequenciamento de RNA a partir de um número mínimo de células para sequenciamento de próxima geração. Destacamos a importância da rigorosa correspondência de estágios de embriões para resolver intervalos de tempo de 6 horas para obter uma visão abrangente das miRNAs durante as rápidas mudanças do desenvolvimento precoce. Este método pode ser amplamente aplicado a estudos genéticos e de desenvolvimento e evita o agrupamento de embriões. Descrevemos uma maneira de superar desafios dos métodos atuais, como o enriquecimento de miRNA usando purificação baseada em gel, quantificação de biblioteca e minimização do viés introduzido do PCR. Este método tem sido usado para identificar padrões de expressão de miRNA ao longo do tempo para estudar como miRNAs controlam o tempo de desenvolvimento na linhagem de crista neural de embriões de camundongos.
Protocol
Todos os procedimentos de pesquisa e cuidados com animais foram aprovados pelo Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee e abrigados na Associação de Avaliação e Acreditação de Instalações animais aprovadas pelo Laboratório de Cuidados com Animais na Baylor College of Medicine. Todas as cepas foram mantidas em fundo C57BL6.
1. Dissecção embrionária (E7.5-E9.5)
- Remova os chifres uterinos de uma fêmea grávida, esterilizando o abdômen com 70% de etanol onde a incisão deve ser feita.
- Limpe o útero enxaguando com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS). Coloque o útero em um prato de plástico estéril de 10 cm.
- Usando uma tesoura de microdisseção, separe cada região contendo decideua uma da outra. Retire o músculo uterino e exponha todos os deciduae. Um por um, remova a decidua de cada embrião.
- Remova o saco de gema de cada embrião e guarde para genotipagem.
- Mova todos os embriões para um novo prato de PBS fresco para imagem.
- Tire uma imagem de toda a ninhada. Imagem cada embrião individualmente e conte o número de somites de cada embrião. Mantenha a ampliação e exposição (para fluorescência) iguais entre os experimentos.
NOTA: Descobrimos que a exposição de 50-200 ms é adequada para fluorescência e que 20 ms é adequada para ajuste de campo brilhante.
2. Dissociação de embriões e triagem celular
- Para que cada embrião seja classificado, faça o seguinte.
- Decapitar um pouco acima do placode otic para embriões mais velhos que e8.0 (se forem desejadas apenas células rotuladas da região craniana). Para embriões E7.5, remova estruturas extraembriônicas (se apenas o embrião adequado for desejado).
- Mova a cabeça em um volume mínimo de PBS sobre para um poço limpo de uma placa de 48 poços. Adicione 250 μL de papain (27 U/mL). Pipeta para cima e para baixo suavemente usando um p200.
- Verifique sob o microscópio e procure por aglomerados e células únicas.
- Repita a tubulação suave para cima e para baixo até que uma única suspensão celular seja alcançada (geralmente três rodadas de pipetação para cima e para baixo que devem equivaler entre 30 s a 1 min para E7.5-E9.5).
- Sacie a saciar com 250 μL de soro bovino fetal (FBS).
- Repetir as etapas 2.1.1-2.1.5 para cada embrião a ser classificado.
- Filtrar 500 μL de suspensão celular através de um tubo de tampa de filtro de malha de nylon de 35 μm para remover aglomerados.
- Pegue o filtrado e mova-se para o novo tubo de 1,5 mL e gire a 200 x g por 5 min. Remova o supernatante cuidadosamente e transfira para um novo tubo (exceto até que as células vivas estejam na pelota).
- Resuspend cell pellet in 300 μL of PBS contendo 0,5-1% de albumina de soro bovino e manter no gelo até a classificação (minimizar o tempo entre agora e o fim da classificação).
- Se desejar, tome 10 μL de suspensão celular e combine com 10 μL de azul Trypan (0,4%) e contar usando um hemócito para identificar quantificação e viabilidade de células aproximadas como o azul trypan só mancha células mortas.
- Pouco antes de classificar, filtre cada amostra novamente através de um tubo de tampa de filtro e adicione a mancha DAPI para células vivas.
- Classifique cada amostra em 500 μL de solução de lise de extração de RNA (ver Tabela de Materiais) no classificador celular com bico de 70 μm.
- Misture e armazene a -80 °C até que todas as amostras sejam colhidas. Prossiga a partir deste ponto somente quando todas as amostras necessárias para um experimento forem colhidas para reduzir a variação técnica entre as rodadas de preparação da biblioteca.
3. Extração de RNA
NOTA: O protocolo é adaptado do kit de isolamento do RNA; ver Tabela de Materiais.
- Adicione 500 μL de solução de lise de extração de RNA (ver Tabela de Materiais) a cada amostra para fazer o volume total de 1000 μL.
- Descongele cada amostra à temperatura ambiente.
- Vórtice cada amostra por 1,5 min, certificando-se de que a tampa está segura em cada tubo antes de iniciar a homogeneização. Incubar o homogeneizar à temperatura ambiente (15-25 °C) por 5 minutos.
- Adicione 140 μL de clorofórmio, tubo de tampa com segurança e agite vigorosamente por 15 s. Incubar em temperatura ambiente por 3 minutos.
- Centrifugar por 15 min a 12.000 x g a 4 °C. Transfira a fase superior aquosa para um novo tubo de coleta no gelo. Não transfira nenhuma interfase ou qualquer fase orgânica. Ao se aproximar da fase orgânica rosa, incline o tubo para o lado e remova pequenas alíquotas até que nenhuma fase aquosa clara possa ser coletada.
- Meça o volume de RNA contendo fase aquosa coletada de cada amostra para o cálculo correto na próxima etapa.
- Adicione 1,5 volumes (geralmente 525 μL, mas pode ser ligeiramente mais ou menos) de 100% de etanol e misture bem por pipetação.
- Pipeta até 700 μL de amostra, incluindo qualquer precipitado, em coluna em um tubo de coleta de 2 mL. Feche a tampa e a centrífuga a ≥8.000 x g para 15 s em temperatura ambiente. Descarte o fluxo.
- Repita o passo 3.8 usando o restante da amostra.
- Lave a coluna de acordo com as instruções do fabricante. Seque a coluna girando a toda velocidade por 1 min. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta de 1,5 mL.
- Pipeta 11 μL de água livre nuclease no centro da membrana. Deixe descansar em temperatura ambiente por 1 min. Gire a velocidade máxima por 1 min para sair da coluna.
- Meça a concentração de RNA utilizando um espectrofotômetro e um instrumento de eletroforese capilar paralela(Tabela de Materiais).
4. Preparação da biblioteca
NOTA: O protocolo é adaptado do pequeno manual do kit de preparação da biblioteca RNA; ver Tabela de Materiais.
- Complete a desnaturação e a ligadura adaptador de 3' conforme indicado no pequeno manual do kit de preparação da biblioteca RNA usando diluição de 1/4 do adaptador de 3'.
- Continue a excesso de 3' remoção do adaptador.
- Complete o esgotamento do adaptador, conforme indicado no pequeno manual do kit de preparação da biblioteca RNA. Certifique-se de usar 80% de etanol recém-preparado para a limpeza das contas e que todo o excesso de etanol é completamente removido pouco antes da ressuspensão em água livre de nuclease sem secar demais as contas (a rachadura da pelota de contas é observada após a secagem excessiva).
- Proceda diretamente ao excesso de inativação do adaptador.
- Complete a inativação do adaptador em excesso, conforme indicado no pequeno manual de preparação da biblioteca RNA, montando todos os reagentes no gelo.
- Continue com a ligadura do adaptador de 5' 4N.
- Ligação adaptador completa de 5' conforme indicado no pequeno manual de preparação da biblioteca RNA, com certeza usará uma diluição de 1/4 do adaptador de 5' e montando todos os reagentes no gelo.
- Prossiga para reverter a transcrição.
- Síntese completa da transcrição reversa do primeiro fio, conforme indicado no pequeno manual de preparação da biblioteca RNA e tomando o cuidado de montar todos os reagentes no gelo e não manter a enzima fora do congelador por longos períodos de tempo.
NOTA: Neste ponto, o protocolo pode ser interrompido, com amostras armazenadas durante a noite a 4 °C. Alternativamente, continue a amplificação pcr. - Amplificação COMPLETA do PCR montando os reagentes conforme indicado no pequeno manual do kit de preparação da biblioteca RNA e minimizando o número de ciclos pcr. O número de ciclos pcr deve ser determinado experimentalmente para cada aplicação e o número mínimo de ciclos deve ser utilizado. Aqui usamos 16 ciclos para amplificar com sucesso nossas pequenas bibliotecas de RNA.
- Proceda diretamente à seleção de tamanho.
5. Seleção de tamanho
- A cada amostra, adicione 5 μL de corante de carregamento de gel de 6x e pipeta para misturar.
- Carregue 10 μL de escada até o primeiro poço do gel, deixando o poço imediatamente para a direita vazio. Carregue todo o produto desde o passo 5.1 em um ácido tris/borate/ethylenodiaminetetraactic de 6% – gel de poliacrilamida (TBE-PAGE) e deixe 1 faixa entre cada amostra.
NOTA: Mantenha o recipiente em que o gel entrou para as etapas subsequentes. - Execute o gel a 150 V por aproximadamente 30-40 min em 0,5x TBE em execução tampão (até que a faixa de corante inferior esteja perto da parte inferior do gel, 0,5-1 cm).
- Faça 1 L de solução de coloração enquanto o gel está funcionando: SYBR Gold diluído 1:10.000 em 0,5x TBE.
- Quando o gel terminar de funcionar (ou seja, a faixa de corante inferior está perto da parte inferior do gel), remova cuidadosamente o gel das placas de vidro, observando a orientação do gel.
- Coloque gel na bandeja de sua embalagem original. Remova o TBE 0,5x e substitua-o pela solução de coloração da etapa 5.5. Gel de mancha por 15 min. O tempo de coloração pode precisar ser aumentado.
- Coloque o gel em um transilluminador UV, tomando o cuidado de não rasgar o gel e mantendo a orientação acima (re-manchar por tempo adicional se bandas de escada não podem ser claramente vistas).
- Imagem do gel uma vez que a coloração é completa no transilluminator UV com uma câmera.
- Se for necessária uma imagem melhor, primeiro use um aparelho de imagem que não o transilluminador UV para capturar uma imagem do gel antes de cortar as bandas em um transilluminador UV como imagem diretamente no transilluminador UV causa a coloração variável do fundo como mostrado na Figura 3A-B. Não mova o gel muitas vezes, pois é delicado e pode rasgar.
- Identifique e remova a faixa de ~150 bp usando uma lâmina de barbear limpa e coloque em um tubo limpo de 1,5 mL. Não corte a faixa ~130 bp (produto adaptador dimer).
- Imagem do gel novamente depois de remover as fatias contendo o produto da biblioteca para fins de documentação.
- Gire os tubos de microcentrifuuge contendo a fatia de gel em velocidade máxima por 30 s para coletar as fatias na parte inferior de cada tubo.
- Use uma ponta p200 para cada amostra para esmagar a fatia de gel nos menores pedaços possíveis. Ejete cada ponta em cada tubo.
- A cada tubo, adicione 300 μL de tampão de elução, tomando cuidado para lavar pedaços de gel do lado do tubo e recolocar a ponta p200 e lavar a ponta para cada amostra.
- Coloque as amostras de eluição em uma incubadora de agitação a 25 °C. Incubar durante a noite com 1000 rpm tremendo. Remova os tubos da incubadora e gire a velocidade máxima por 10 minutos a temperatura ambiente.
- Transfira o supernatante contendo o produto da biblioteca para uma placa de 2 mL RNase livre de 96 poços. Tome cuidado para não transferir nenhum gel.
- Adicione 50 contas de limpeza de μL a cada amostra e misture por pipetação. Imediatamente, adicione 350 μL de isopropanol e misture por pipetação. Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos com balanço.
- Pulsar placa de rotação para contas de pelotas e, em seguida, magnetizar por 2 min. Remova cuidadosamente e descarte o supernaspe.
- Adicione 950 μL de 80% de etanol. Incubar por 30 s. Remova todo o supernatante. Repita para um total de duas lavagens de etanol.
- Seque a amostra por 3 minutos. Nesta etapa tome cuidado para remover qualquer etanol residual que recolhe na parte inferior de cada poço (não mais de uma vez) e não secar demais as contas (a secagem excessiva resultará em quebra da pelota de contas).
- Remova todo o líquido residual na parte inferior do poço. Remova a placa do suporte magnético.
- Resuspense a pelota em 13 μL de tampão de ressuspensão. Misture por pipeta até ficar homogêneo. Incubar por 2 minutos e depois magnetizar por 3 min.
- Transfira 12 μL de supernasal para um tubo limpo ou poço de placa limpa para armazenamento subsequente. Armazene todas as amostras a 4 °C durante a noite ou -20 °C a longo prazo.
- Verifique o tamanho e concentração dos fragmentos presentes em cada biblioteca usando o ensaio de DNA de eletroforese capilar de alta sensibilidade. Confirme a concentração com mais de um método.
NOTA: Ocasionalmente usamos o kit de sensibilidade padrão para evitar sobrecarregar a eletroforese capilar.
Representative Results
Usando o procedimento demonstrado aqui, colhemos embriões em E7.5, E8.5 e E9.5. Estruturas extraembriônicas foram removidas de todos os embriões e, em seguida, os embriões foram realizados para resolver intervalos de tempo de 6 horas(Figura 1A-1B). Utilizando a análise de componentes de princípio para agrupar amostras com base na similaridade, constata-se que as amostras agrupam por idade, destacando a variação como resultado da idade embrionária e a necessidade de correspondência cuidadosa de somite para réplicas biológicas(Figura 1C). Perfilamos o epiblasto pluripotente em E7.5, linhagem traçada células de crista neural prégratória e migratória usando Wnt1-Cre em E8.5 e células de crista neural migratória usando Sox10-Cre em E9.5 (Figura 1D). Aqui colhemos especificamente a crista neural craniana decapitando o embrião logo acima do código óptico. Uma comparação dos dois Cre-drivers (Wnt1 e Sox10) que são frequentemente usados para rotular células de crista neural confirma que eles marcam populações diferentes em embriões de camundongos precoces(Figura 1E). Foram utilizadas estratégias de gating para obter células positivas de RFP individuais vivas que foram classificadas diretamente na solução de lise de extração de RNA (ver Tabela de Materiais) e armazenadas a -80 °C(Figura 1F). É importante acompanhar quantas células foram colhidas de cada amostra.
O isolamento do RNA foi realizado utilizando-se uma versão modificada do protocolo do kit RNA. Especificamente, usamos as colunas mini RNA que devem ser armazenadas a 4 °C. Estas colunas são úteis para a eluição em um pequeno volume (11 μL) para obter a maior concentração possível de RNA a partir de amostras onde a entrada celular é limitante. Por essa mesma razão, é importante obter toda a fase aquosa após a extração do clorofórmio fenol. A tubulação lenta e inclinação do tubo para um lado durante a coleta são fundamentais para maximizar o rendimento. Neste procedimento, quantificamos o RNA utilizando um espectrofotômetro, para obter informações sobre contaminação de sal/proteína, e uma eletroforese capilar para medir a concentração(Figura 2). O traço espectrofotômetro revela que o RNA foi isolado sem contaminação de proteínas, mas tem alto teor de sal (Figura 2A-2B). O ideal é que a razão 260/280 seja ~1,8 e a razão 260/230 deve ser >2.0. O rendimento total do RNA medido pelo espectotômetro não aumentou com a idade entre E8,5-E9,5. Isso se deve à resolução do espectrofotômetro não ser sensível o suficiente para detectar alterações na concentração de RNA a partir do número de células que estamos colhendo, e recomendamos o uso das informações de concentração obtidas da eletroforese capilar(Figura 2C). O traço de eletroforese capilar pode ser usado para estimar concentração e tamanho dos fragmentos de RNA. Picos <1000 nucleotídeos são indicativos de degradação. O traço representativo é consistente com o RNA que não está degradado. Os picos em nucleotídeos de 2000 e 5100 nucleotídeos são 18s e 28s rRNA, respectivamente. A pequena região de RNA está localizada a ~150 nucleotídeos(Figura 2D).
Pequenas bibliotecas de sequenciamento de RNA foram preparadas usando o pequeno kit de preparação da biblioteca RNA descrito na Tabela de Materiais. Aqui usamos pouco menos da metade do RNA obtido de cada amostra (4 μL da elução de 11 μL, ~80-120 ng) que permite que bibliotecas de sequenciamento de RNA sejam sintetizadas a partir do RNA restante de cada amostra. Aqui diluimos os pequenos adaptadores de RNA de 3' e 5' 1/4 para diminuir a quantidade de dimers adaptadores presentes e sugerir que as etapas de ligadura, limpeza e transcrição reversa do adaptador sejam concluídas o máximo possível de forma contínua. Usamos 16 ciclos de PCR para amplificar as bibliotecas e sugerir que o número mínimo de ciclos de PCR para qualquer experimento seja empiricamente determinado. Ao completar ciclos de PCR em excesso, pode-se inflar artificialmente a contagem de leitura de um miRNA humildemente expresso.
A seleção de tamanho é imprescindível para enriquecer para bibliotecas de miRNAs e não dimers adaptadores, que normalmente estão presentes. O tamanho do produto da biblioteca (150 bp) e os dimers adaptadores (130 bp) são muito semelhantes em tamanho. A extração de gel é usada para isolar as pequenas bibliotecas de sequenciamento de RNA longe dos dimers adaptadores(Figura 3). Uma imagem de um gel PAGE antes da excisão mostra que uma infinidade de tamanhos de produtos estão presentes em cada amostra (Figura 3A). É importante deixar uma pista aberta entre duas amostras ou uma escada que é carregada no gel. A frente de migração na parte inferior do gel é ligeiramente curva, indicando que correr a uma velocidade mais lenta pode ser necessário se a banda de 150 bp for difícil de distinguir para todas as amostras. Esta imagem representativa também mostra uma abundância de 150 bp produto da maior concentração de RNA de controle positivo (RNA total do cérebro de um rato) que entrou na preparação da biblioteca em comparação com o que entrou em cada amostra embrionária. O controle negativo revela que os reagentes estavam livres de contaminar espécies de ácido nucleico(Figura 3A). A excisão da banda de 150 bp deve ser feita com uma lâmina de barbear limpa e a área coletada é mostrada na Figura 3B. Traços de eletroforese capilar antes e depois da seleção de tamanho mostram a melhoria dramática da pureza do produto da biblioteca de 150 bps com purificação de gel(Figura 3C-3D). É importante notar que os traços na Figura 3C-3D têm picos amostrais superiores aos marcadores, indicativos de sobrecarga. Nestes casos, o tamanho dos fragmentos pode ser preciso, porém a concentração pode não ser. A quantificação pode ser obtida diluindo as bibliotecas na faixa dos marcadores ou usando métodos alternativos. Encontramos alguma variação entre os métodos alternativos de quantificação da biblioteca e recomendamos que vários métodos de quantificação sejam testados empiricamente. A quantificação precisa da concentração é essencial ao maximizar o número de amostras a serem sequenciadas ao mesmo tempo. As bibliotecas serão diluídas até 1,3 pM para sequenciamento e geralmente em qualquer lugar entre 15 e 25 amostras podem ser sequenciadas ao mesmo tempo em um kit de sequenciamento de 150 ciclos que fornece ~140 milhões de leituras. Isso resulta em cerca de 5 milhões de leituras por amostra. Geralmente, as taxas de mapeamento estão entre 60-80%.
Figura 1: Colheita de células de embriões de camundongos para sequenciamento de RNA pequeno. (A) Embrião de camundongos E8.5 para destacar a remoção do saco de gema e somitas usados para determinar o estágio do embrião (B) Estadiamento de embriões de camundongos para capturar os estágios do desenvolvimento de crista neural (C) Análise de componentes de princípio de bibliotecas preparadas a partir de células de crista neural tipo selvagem classificadas mostrando que amostras de grupo por idade(D) Esquema mostrando como as amostras foram colhidas usando Wnt1-Cre em E8.5 label para premissa células de crista neuralgratory e migratória e Sox10-Cre em E9.5 para rotular apenas células de crista neural migratórias (E) Análise de componentes principais de bibliotecas preparadas a partir de células de crista neural tipo selvagem classificadas mostrando amostras agrupadas pelo Cre-driver independentemente da idade (F) Estratégia de gating usada para isolar células de crista neural RFP+ de embriões E8.5 e E9.5 usando facs de triagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Isolamento do RNA dos embriões de camundongos E7.5-E9.5. (A) Traço espectrômetro representativo de um isolamento de RNA do estágio mais jovem do embrião que aplicamos neste protocolo. (B) Tabela mostrando os valores representativos da qualidade do RNA obtidos a partir do espectrômetro. (C) Exemplo do RNA colhido de células de crista neural classificadas de embriões de cada idade(D) Traço de eletroforese capilar mostrando RNA de boa qualidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: bibliotecas miRNA antes e depois da seleção de tamanho. (A) Gel TBE-PAGE mostrando bibliotecas RNA pequenas representativas para quatro amostras e controles antes e (B) após a excisão de banda de 150 bp. As setas representam a banda de 150 bp a ser extirpada (C) traço de eletroforese capilar de pequena biblioteca RNA antes e (D) após a seleção de tamanho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Os processos de desenvolvimento podem prosseguir rapidamente, e as células estão passando por muitas especificações sequenciais, de modo que, para capturar uma visão abrangente das miRNAs que contribuem para decisões de destino precoce, é necessário um estágio mais específico do que o incremento de meio dia amplamente utilizado. Um estudo recente realizou sequenciamento de RNA a partir de embriões estágio 12 theiler que variam de 3 a 6 somites11. Descobrimos que durante esse período de tempo, as células da crista neural são especificadas (3 somites de idade), delaminadas (4 somitas de idade) e migram (5-6 somites de idade). Também descobrimos que, além do condutor de Cre usado para a linhagem de populações celulares, a idade é a maior fonte de variação entre amostras biológicas, e apenas embriões comidos por somite devem ser considerados como réplicas. Isso também deve ser levado em consideração ao comparar embriões transgênicos com controles de tipo selvagem.
Métodos anteriores para perfilar miRNAs durante o desenvolvimento precoce usaram entre 10-100 ng de entrada de RNA para a preparação da biblioteca de sequenciamento de RNA pequeno e juntaram vários embriões em uma amostra13,,14. Demonstramos o isolamento do RNA e a preparação da biblioteca de um único embrião E7.5 ou de células de crista neural classificadas em E8.5 e E9.5 usando aproximadamente 100 ng de RNA total como entrada. Ao dissociar embriões para classificação, deve-se tomar cuidado para observar a dissociação sob um microscópio e saciar a reação para observar quando células únicas são obtidas. Descobrimos que a dissociação da região craniana dos embriões E8.5-E9.5 é quase instantânea com tubos manuais suaves como descrito no protocolo. Para tecidos maiores e embriões cada vez mais antigos, o tempo de dissociação pode ser maior dependendo da parte do embrião ser dissociada. Para embriões E7.5-E9.5, aglomerados de células são facilmente visíveis sob o microscópio e a dissociação deve continuar até que não sejam visíveis mais aglomerados. Células únicas são visíveis em solução se você ajustar o foco através da solução em seu poço em qualquer lugar de 5-10x. Métodos anteriores classificam as células diretamente no tampão de lise para sequenciamento de RNA para preparar RNA em massa de um número baixo de células14. Aqui classificamos diretamente na solução de lise de extração de RNA para que o RNA possa ser isolado antes do início da preparação da biblioteca. O uso de mini colunas com volume de eluição de 11 μL permitiu uma concentração de RNA alta o suficiente, de forma que uma única preparação de RNA pudesse ser dividida entre o pequeno RNA e o sequenciamento de RNA a granel.
Uma limitação atual da maioria dos pequenos métodos de sequenciamento de RNA é a amplificação PCR do cDNA convertido. Nosso método não supera essa limitação, mas conseguimos minimizar o número de ciclos de PCR dos 25 máximos recomendados até 16 ciclos. Essa redução na amplificação diminui o viés de amplificação artificial introduzido pelo PCR. Outra fonte de viés é a ligadura dos adaptadores, onde se sabe que sequências específicas localizadas nas extremidades dos adaptadores e miRNAs podem se unir com maior eficiência do que outras sequências. Para evitar isso, os adaptadores utilizados neste protocolo possuem 4 bases aleatórias incorporadas no final de cada adaptador para evitar viés nas reações de ligadura. Além disso, outro problema comum é a quantidade de dimers adaptadores que se formam quando a entrada RNA é baixa. O kit de preparação da biblioteca inclui etapas para reduzir a formação de dimer adaptador, como a inativação do adaptador e limpeza de contas para remover o excesso de adaptadores após cada ligadura. Também diluímos os adaptadores de 3' e 5' 4N em 1/4 para reduzir a quantidade de dimer adaptador que pode se formar. Descobrimos que, quando não diluída, a intensidade da banda de 130 bp aumenta, dificultando a distinção da banda de 150 bp contendo as pequenas bibliotecas de RNA desejadas em um gel.
Outro desafio atual de preparar bibliotecas de sequenciamento é a quantificação precisa do produto antes do sequenciamento. Descobrimos que diferentes métodos dão resultados variados na mesma biblioteca. Sugerimos que os pesquisadores usem múltiplos métodos de quantificação para obter uma estimativa precisa da concentração.
Este protocolo pode ser amplamente aplicado a estudos genéticos, de desenvolvimento ou outras aplicações onde o RNA está sendo coletado de um baixo número de células. Essa abordagem simplifica os estudos temporais, evitando o agrupamento de embriões e pode ser facilmente aplicada em células não classificadas e classificadas.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este projeto foi apoiado pela Andrew McDonough B+ Foundation e pelo NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. é um Cprit Scholar in Cancer Research (RR150106) e V Scholar in Cancer Research (V Foundation). Os autores também gostariam de reconhecer o Núcleo de Citometria e Triagem celular da BCM para fornecer equipamentos necessários para este projeto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
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