Summary
نحن نصف تقنية لتوصيف microRNAs في الأجنة الماوس في وقت مبكر. هذا البروتوكول يتغلب على التحدي المتمثل في انخفاض مدخلات الخلايا وإثراء الحمض النووي الريبي الصغيرة. يمكن استخدام هذا الفحص لتحليل التغيرات في التعبير ميرنا مع مرور الوقت في أنساب الخلايا المختلفة للجنين الماوس المبكر.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) مهمة لتنظيم معقدة من القرارات مصير الخلية وتوقيت النمو. في دراسات الجسم الحي من مساهمة miRNAs خلال التنمية المبكرة هي صعبة من الناحية الفنية بسبب عدد الخلايا الحد. وعلاوة على ذلك، تتطلب العديد من المقاربات أن يتم تعريف الرنا ذات الاهتمام في عمليات الفحص مثل النشاف الشمالي، والمجهر، وQPCR. ولذلك، فإن التعبير عن العديد من miRNAs وisoforms لها لم تدرس خلال التنمية المبكرة. هنا، نحن نُظهر بروتوكولاً لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغير للخلايا المخزّنة من أجنة الماوس المبكرة لتمكين التنميط غير المتحيز نسبياً من الـ miRNAs في مجموعات السكان المبكرة من خلايا القمم العصبية. نحن التغلب على التحديات من انخفاض مدخلات الخلية واختيار حجم خلال إعداد المكتبة باستخدام التضخيم وتنقية على أساس هلام. نحن نحدد العمر الجنيني كمتغير المحاسبة للاختلاف بين النسخ المتماثلة والمرحلة مطابقة الأجنة الماوس يجب أن تستخدم لتحديد بدقة miRNAs في النسخ المتماثلات البيولوجية. تشير نتائجنا إلى أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على نطاق واسع على التعريف بالتعبير عن miRNAs من أنساب الخلايا الأخرى. باختصار، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة كيفية تنظيم miRNAs البرامج التنموية في أنساب الخلايا المختلفة من جنين الماوس المبكر.
Introduction
وثمة مسألة مركزية في علم الأحياء التنموية هو كيف يمكن لخلية واحدة غير متمايزة أن تؤدي إلى كائن حي كامل مع العديد من أنواع الخلايا المعقدة. خلال تكوين الجنين ، تصبح الإمكانات التنموية للخلايا مقيدة تدريجيًا مع تطور الكائن الحي. أحد الأمثلة هو النسب العصبي، الذي يميز تدريجيا من عدد الخلايا متعددة القدرات في المشتقات الطرفية المختلفة، مثل الخلايا العصبية الطرفية، glia، العظام القحفية، والغضاريف. يتم تحديد الخلايا العصبية من البكترودم أثناء التهليل الغازي ومن ثم الخضوع لنوبة ظهارية للانتقال الظهارية و تهاجر من خلال الجنين إلى مواقع منفصلة في جميع أنحاء الجسم حيث أنها سوف تفرق ميؤوس منها1. وقد كشفت عقود من العمل على شبكة تنظيمية جينية النسخية، ولكن أقل بكثير هو معروف عن آليات التنظيم ما بعد النسخ التي تتحكم في توقيت تطور القمة العصبية.
العمل السابق يشير إلى أن microRNAs (miRNAs) قمع التعبير الجيني التوقيت السليم للتنمية والخلايا مصير القرارات2,3,4,5,6. وقد ركزت الدراسات التي أجريت على الـ miRNAs في تطور قمة العصب إلى حد كبير على مراحل لاحقة من تطور القحف الوجهية. على سبيل المثال، مير-17 ~92 ومير-140 حاسمة لـ الحنكوج خلال التنمية القحفية في الماوس والحمار الوحشي، على التوالي7،,8. لم يتم التحقيق بدقة في مساهمة miRNAs في أقرب قرارات مصير القمة العصبية للجنين. وقد حدت الدراسات المتعلقة بالمقدرات في وقت مبكر من القرارات المصيرية بسبب التحديات التقنية مثل انخفاض عدد الخلايا الموجودة في الأجنة المبكرة.
وقد تم لمحة MiRNAs في المختبر من خطوط الخلية باستخدام الأجسام الجنينية في مراحل مختلفة من التمايز لنموذج تطوير الفأرة في وقت مبكر9. وكان فحص الرنا الرنا الصغير في الجسم الحي خلال تطور الثدييات المبكر محدودا نسبيا. وقد أدت الأساليب السابقة لتحديد miRNAs إلى التحيز كما يتم استخدام تسلسل معروف لتحليل التعبير عن ميرنا محددة في أساليب مثل qPCR، microarrays، ولطخات الشمالية10. الجيل القادم تسلسل وتحسين الأدوات الجزيئية من أي وقت مضى تسمح الآن لتحليل غير متحيز نسبيا للتعبير ميرنا لدراسة مساهمتها في التنمية الثدييات في وقت مبكر وقرارات مصير الخلية.
هنا، نحن الإبلاغ عن تقنية لحصاد وتسلسل RNAs الصغيرة التي أعرب عنها في الخلايا العليا العصبية من الأجنة الماوس في وقت مبكر تمتد gasتخulation (E7.5) إلى بداية تولد organogenesis (E9.5). هذه التقنية مباشرة و تجمع بين تتبع النسب، وفرز الخلايا، وتحديد الحجم القائم على الهلام لإعداد مكتبات تسلسل RNA صغيرة من عدد ضئيل من الخلايا لتسلسل الجيل التالي. نسلط الضوء على أهمية مطابقة مرحلة الرثوم الصارمة للأجنة لحل فترات زمنية مدتها 6 ساعات للحصول على رؤية شاملة للmiRNAs خلال التغيرات السريعة في النمو المبكر. يمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع على الدراسات الوراثية والتنموية وتجنب تجميع الأجنة. نحن نصف طريقة للتغلب على تحديات الأساليب الحالية مثل إثراء ميرنا باستخدام تنقية قائمة على الهلام، وتقدير كم المكتبة، وتقليل التحيز الناجم عن PCR. وقد استخدمت هذه الطريقة لتحديد أنماط التعبير ميرنا مع مرور الوقت لدراسة كيفية التحكم في توقيت النمو في النسب العصبي من أجنة الفئران.
Protocol
تمت الموافقة على جميع إجراءات البحث ورعاية الحيوان من قبل كلية بايلور للطب لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية و وضعها في جمعية تقييم واعتماد مرفق الحيوان المختبري المعتمد في كلية بايلور للطب. تم الحفاظ على جميع السلالات على خلفية C57BL6.
1- تشريح الجنين (E7.5-E9.5)
- إزالة قرون الرحم من فأرة الإناث الحوامل، وتعقيم البطن مع 70٪ الإيثانول حيث شق هو أن يتم.
- تنظيف قبالة الرحم عن طريق الشطف مع الفوسفات المالحة المخزنة (PBS). ضع الرحم في طبق بلاستيكي معقمة 10 سم.
- باستخدام مقص microdissection، فصل كل decidua التي تحتوي على منطقة من بعضها البعض. قشر قبالة عضلة الرحم وفضح جميع deciduae. واحدا تلو الآخر، وإزالة decidua من كل جنين.
- إزالة كيس صفار من كل جنين وحفظ لgenotyping.
- نقل جميع الأجنة في طبق جديد من برنامج تلفزيوني جديد للتصوير.
- التقاط صورة من القمامة بأكملها. صورة كل جنين على حدة، وتحسب عدد somites من كل جنين. الحفاظ على التكبير والتعرض (لفلوريسنس) نفسه بين التجارب.
ملاحظة: نجد أن التعرض 50-200 مللي ثانية كافية لفلوريسنس وأن 20 مللي ثانية كافية لإعداد المجال مشرق.
2. تفكك الجنين وفرز الخلايا
- لكل جنين ليتم فرزها من، قم بما يلي.
- قطع الرأس فقط فوق الرمز البريدي otic للأجنة أقدم من E8.0 (إذا كانت الخلايا المسماة فقط من المنطقة القحفية هي المطلوب). بالنسبة للجنين E7.5، قم بإزالة الهياكل غير المُكَرَبَة (إذا كان الجنين المناسب مرغوبًا فيه فقط).
- نقل الرأس في حجم الحد الأدنى من برنامج تلفزيوني إلى بئر نظيفة من لوحة 48-جيدا. إضافة 250 μL من papain (27 U / مل). الماصات صعودا وهبوطا بلطف باستخدام p200.
- تحقق تحت المجهر وابحث عن كتل وخلايا مفردة.
- كرر الأنابيب لطيف صعودا وهبوطا حتى يتحقق تعليق خلية واحدة (عادة ثلاث جولات من الأنابيب صعودا وهبوطا والتي ينبغي أن تساوي ما بين 30 s إلى 1 دقيقة لE7.5-E9.5).
- إخماد مع 250 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنين (FBS).
- كرر الخطوات 2.1.1-2.1.5 لكل جنين ليتم فرزه.
- تصفية 500 μL من تعليق الخلية من خلال 35 ميكرومتر نايلون شبكة مرشح سقف أنبوب لإزالة كتل.
- اتخاذ الترشيح والانتقال إلى أنبوب جديد 1.5 مل وتدور في 200 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant بعناية ونقلها إلى أنبوب جديد (حفظ حتى من المعروف أن الخلايا الحية في بيليه).
- Resuspend خلية بيليه في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.5-1٪ البوم الدم البقري والحفاظ على الجليد حتى الفرز (تقليل الوقت من الآن وحتى نهاية الفرز).
- إذا رغبت في ذلك، واتخاذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية والجمع مع 10 ميكرولتر من الأزرق Trypan (0.4٪) والعد باستخدام مقياس الهيموسيت لتحديد كمية الخلية التقريبية وقابلية البقاء كما Trypan الأزرق البقع فقط الخلايا الميتة.
- قبل الفرز، قم بتصفية كل عينة مرة أخرى من خلال أنبوب غطاء تصفية وإضافة وصمة دمبي للخلايا الحية.
- فرز كل عينة في 500 μL من تحلل استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد)على فارز الخلية مع فوهة 70 ميكرومتر.
- مزيج وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى يتم حصاد جميع العينات. ولا تنطلق من هذه النقطة إلا عندما تحصد جميع العينات اللازمة لإجراء تجربة ما للحد من التباين التقني بين جولات إعداد المكتبة.
3. RNA استخراج
ملاحظة: يتم تكييف البروتوكول من مجموعة العزل RNA; انظر جدول المواد.
- إضافة 500 μL من محلول استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد)إلى كل عينة لجعل الحجم الكلي 1000 ميكرولتر.
- ذوبان كل عينة في درجة حرارة الغرفة.
- دوامة كل عينة لمدة 1.5 دقيقة، والتأكد من أن الغطاء هو آمن على كل أنبوب قبل البدء في التجانس. احتضان تجانس في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
- إضافة 140 μL من الكلوروفورم، أنبوب الغطاء بأمان ويهز بقوة لمدة 15 s. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 12000 x ز عند 4 درجة مئوية. نقل المرحلة مائي العلوي إلى أنبوب جمع جديد على الجليد. لا تنقل أي مرحلة من المراحل البينية أو أي طور عضوي. عند الاقتراب من المرحلة العضوية الوردية ، قم بتلميح الأنبوب إلى الجانب وإزالة aliquots الصغيرة حتى لا يمكن جمع أي مرحلة مائي واضح.
- قياس حجم RNA التي تحتوي على مرحلة مائي جمعها من كل عينة لحساب الصحيح في الخطوة التالية.
- إضافة 1.5 وحدات التخزين (عادة 525 ميكرولتر ولكن قد يكون أكثر أو أقل قليلا) من الإيثانول 100٪ ومزيج جيدا عن طريق الأنابيب.
- ما يصل إلى 700 μL العينة، بما في ذلك أي راسب، في العمود في أنبوب جمع 2 مل. أغلق الغطاء والطرد المركزي عند ≥ 8000 x غم لمدة 15 s في درجة حرارة الغرفة. تجاهل التدفق من خلال.
- كرر الخطوة 3.8 باستخدام باقي العينة.
- اغسل العمود حسب إرشادات الشركة المصنعة. جفف العمود عن طريق الدوران بأقصى سرعة لمدة دقيقة. نقل العمود إلى أنبوب جمع جديد 1.5 مل.
- ماصة 11 ميكرولتر من المياه الحرة النوكلي على مركز الغشاء. اسمحوا الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. تدور سرعة قصوى لمدة 1 دقيقة ل elute قبالة العمود.
- قياس تركيز RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي وأداة متوازية لكهربية الشعيرات الدموية(جدول المواد).
4- إعداد المكتبة
ملاحظة: يتم تكييف البروتوكول من كتيب إعداد مكتبة RNA الصغيرة؛ انظر جدول المواد.
- إكمال denaturation و 3 'ربط محول كما هو مذكور في مكتبة RNA الصغيرة إعداد كتيب طقم باستخدام 1/4 تخفيف من محول 3'.
- متابعة إزالة المحول 3 'الزائدة.
- إكمال استنزاف محول كما هو مذكور في مكتبة RNA الصغيرة إعداد كتيب. تأكد من استخدام الإيثانول الطازجة 80٪ لتنظيف حبة وأن جميع الإيثانول الزائد تتم إزالتها تماما قبل إعادة التجفيف في المياه الخالية من النوى دون الإفراط في تجفيف الخرز (لوحظ تكسير من حبيبة حبة على الإفراط في التجفيف).
- تابع مباشرة إلى إلغاء تنشيط المحول الزائد.
- استكمال تعطيل محول الزائد كما جاء في مكتبة RNA الصغيرة إعداد عدة كتيب تجميع جميع الكواشف على الجليد.
- تابع إلى ربط محول 5'4N.
- استكمال 5 'ربط محول كما جاء في مكتبة RNA الصغيرة إعداد عدة كتيب يجري التأكد من استخدام تخفيف 1/4 من محول 5 'وتجميع جميع الكواشف على الجليد.
- تابع لعكس النسخ.
- استكمال النسخ العكسي التوليف حبلا الأولى كما جاء في مكتبة RNA الصغيرة عدة إعداد كتيب مع الحرص على تجميع جميع الكواشف على الجليد وعدم حفظ الإنزيم من الثلاجة لفترات طويلة من الزمن.
ملاحظة: في هذه المرحلة، قد يتم إيقاف البروتوكول، مع تخزين العينات بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية. بدلا من ذلك الاستمرار في تضخيم PCR. - استكمال التضخيم PCR عن طريق تجميع الكواشف كما هو مذكور في مكتبة RNA الصغيرة إعداد كتيب والتقليل من عدد دورات PCR. وينبغي أن يحدد على أساس تجريبي عدد دورات إعادة النظر في ال PCR لكل تطبيق، كما ينبغي استخدام العدد الأدنى من الدورات. هنا استخدمنا 16 دورة لتضخيم مكتباتنا الصغيرة RNA بنجاح.
- تابع مباشرة إلى تحديد الحجم.
5. اختيار الحجم
- إلى كل عينة، إضافة 5 ميكرولتر من 6x هلام تحميل صبغة وماصة لخلط.
- تحميل 10 ميكرولتر من سلم إلى بئر الأولى من هلام، وترك البئر على الفور إلى اليمين فارغة. تحميل كل من المنتج من الخطوة 5.1 على 6٪ تريس / بورات / Ethylenediaminetetraacetic حامض – هلام polyacrylamide (TBE-PAGE) وترك 1 حارة بين كل عينة.
ملاحظة: الاحتفاظ الحاوية التي جاء هلام في الخطوات اللاحقة. - تشغيل الجل في 150 V لمدة 30-40 دقيقة تقريبا في 0.5x TBE تشغيل العازلة (حتى انخفاض نطاق صبغة بالقرب من الجزء السفلي من هلام، 0.5-1 سم).
- جعل 1 لتر من حل تلطيخ في حين أن هلام قيد التشغيل: SYBR الذهب المخفف 1:10,000 في 0.5X TBE.
- عندما ينتهي الجل من الركض (أي انخفاض نطاق الصبغة بالقرب من الجزء السفلي من الجل) ، قم بإزالة الجل بعناية من اللوحات الزجاجية ، مع الإشارة إلى اتجاه الجل.
- ضع الجل في صينية عبوته الأصلية. إزالة 0.5x TBE واستبدالها مع حل تلطيخ من الخطوة 5.5. هلام وصمة عار لمدة 15 دقيقة. قد تحتاج إلى زيادة الوقت تلطيخ.
- ضع الجل على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية، مع الحرص على عدم مزق هلام والحفاظ على التوجه المذكورة أعلاه (إعادة وصمة عار لوقت إضافي إذا لم يكن من الممكن رؤية عصابات من سلم واضح).
- صورة الجل مرة واحدة تلطيخ كاملة على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية مع الكاميرا.
- إذا كان هناك حاجة إلى صورة أفضل، أولا استخدام جهاز التصوير غير transilluminator الأشعة فوق البنفسجية لالتقاط صورة من هلام قبل الاستغناء عن العصابات على transilluminator UV كما التصوير مباشرة على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية يسبب تلوين متغير من الخلفية كما هو مبين في الشكل 3A-B. لا تحرك الجل مرات عديدة جدا كما هو دقيق وربما المسيل للدموع.
- تحديد وإزالة ~ 150 بريتيش بتروليوم الفرقة باستخدام شفرة الحلاقة نظيفة ومكان في أنبوب 1.5 مل نظيفة. لا قطع خارج النطاق 130 بي بي ~(محول المنتج dimer).
- صورة هلام مرة أخرى بعد إزالة الشرائح التي تحتوي على المنتج المكتبة لأغراض التوثيق.
- تدور أنابيب microcentrifuge التي تحتوي على شريحة هلام في سرعة قصوى لمدة 30 s لجمع شرائح في الجزء السفلي من كل أنبوب.
- استخدام نصيحة p200 لكل عينة لسحق شريحة من هلام في أصغر بت ممكن. أخرج كل طرف في كل أنبوب.
- إلى كل أنبوب، إضافة 300 ميكرولتر من عازلة elution، مع الحرص على غسل بت هلام من جانب أنبوب وإعادة إرفاق تلميح p200 وغسل قبالة غيض لكل عينة.
- ضع عينات الارتجاج في حاضنة مهزّزة على 25 درجة مئوية. احتضان بين عشية وضحاها مع 1000 دورة في الدقيقة تهتز. إزالة الأنابيب من الحاضنة وتدور بسرعة قصوى لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل supernatant التي تحتوي على المنتج المكتبة إلى 2 مل RNase مجانا 96 لوحة جيدا. الحرص على عدم نقل أي هلام.
- إضافة 50 μL تنظيف الخرز إلى كل عينة ومزيج عن طريق pipetting. على الفور، إضافة 350 μL من ايزوبروبانول ومزيج عن طريق الأنابيب. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع هزاز.
- نبض تدور لوحة إلى الخرز بيليه ثم مغنطة لمدة 2 دقيقة. إزالة بعناية وتجاهل ناظر.
- إضافة 950 μL من 80٪ الإيثانول. احتضان لمدة 30 s. إزالة كل من افرا. كرر لمجموع اثنين من يغسل الإيثانول.
- جفف العينة لمدة 3 دقائق. في هذه الخطوة الحرص على إزالة أي الإيثانول المتبقية التي تجمع في الجزء السفلي من كل بئر (وليس أكثر من مرة واحدة) وعدم الإفراط في تجفيف الخرز (الإفراط في التجفيف سيؤدي إلى تكسير الكريه حبة).
- إزالة جميع السائل المتبقية في الجزء السفلي من البئر. إزالة لوحة من موقف المغناطيسي.
- Resuspend بيليه في 13 μL من العازلة resuspension. تخلط بواسطة ماصة حتى متجانسة. احتضان لمدة 2 دقيقة ثم مغنطة لمدة 3 دقائق.
- نقل 12 ميكرولتر من اابر إلى أنبوب نظيف أو بئر من لوحة نظيفة للتخزين اللاحقة. تخزين جميع العينات في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو -20 درجة مئوية على المدى الطويل.
- تحقق من حجم وتركيز الشظايا الموجودة في كل مكتبة باستخدام المقايسة الكهربائية الشعرية ذات الحساسية العالية. تأكيد التركيز مع أكثر من طريقة واحدة.
ملاحظة: لقد استخدمنا أحيانًا مجموعة الحساسية القياسية لتجنب زيادة الحمل على الكهرباء الشعرية.
Representative Results
باستخدام الإجراء الموضح هنا، قمنا بحصد أجنة في E7.5 و E8.5 و E9.5. تمت إزالة الهياكل خارج المقصف من جميع الأجنة ثم تم وضع أجنة في وضعيات حل فترات زمنية مدتها 6 ساعات(الشكل 1A-1B). باستخدام تحليل المكونات الرئيسية لتجميع العينات على أساس التشابه ، نجد أن العينات تتجمع حسب العمر ، مع تسليط الضوء على الاختلاف نتيجة للعمر الجنيني والحاجة إلى مطابقة somite دقيق للتكاثر البيولوجي(الشكل 1C). نحن لمحة عن epiblast متعددة القدرات في E7.5، النسب تتبع ما قبل التاريخ والخلايا العليا العصبية المهاجرة باستخدام Wnt1-Cre في E8.5 والخلايا العليا العصبية المهاجرة باستخدام Sox10-Cre في E9.5(الشكل 1D). هنا نحن حصاد على وجه التحديد قمة العصبية القحفية عن طريق قطع رأس الجنين فقط فوق الرمز البريدي otic. إن المقارنة بين هذين الـ Cre-drivers (Wnt1 و Sox10) اللذين يستخدمان بشكل متكرر لتسمية خلايا القمة العصبية تؤكد أنهما تميزان مجموعات مختلفة في أجنة الماوس المبكرة(الشكل 1E). واستخدمت استراتيجيات الغات للحصول على الخلايا الإيجابية RFP واحد الحية التي تم فرزها مباشرة في محلول استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد)وتخزينها في -80 درجة مئوية(الشكل 1F). من المهم تتبع عدد الخلايا التي تم حصادها من كل عينة.
تم إجراء عزل RNA باستخدام إصدار معدل من بروتوكول طقم RNA. على وجه التحديد، نستخدم أعمدة RNA المصغرة التي سيتم تخزينها عند 4 درجة مئوية. هذه الأعمدة مفيدة في التهيؤ في حجم صغير (11 ميكرولتر) للحصول على أعلى تركيز ممكن من RNA من العينات حيث يتم الحد من إدخال الخلايا. لهذا السبب نفسه، من المهم الحصول على كل من مرحلة مائي بعد استخراج الكلوروفورم الفينول. الأنابيب بطيئة وإمالة الأنبوب إلى جانب واحد في حين جمع حاسمة لتحقيق أقصى قدر من العائد. في هذا الإجراء، نقوم بتحديد كمية الحمض النووي الريبي باستخدام كل من مقياس الطيف الضوئي، للحصول على معلومات عن التلوث الملح/البروتيني، والكهرباء الشعرية لقياس التركيز(الشكل 2). يكشف التتبع الطيفي أن الحمض النووي الريبي كان معزولاً بدون بروتينات ملوثة ولكن يحتوي على نسبة عالية من الملح(الشكل 2A-2B). من الناحية المثالية يجب أن تكون نسبة 260/280 ~ 1.8 وينبغي أن تكون نسبة 260/230 >2.0. ولم يزد مجموع العائد من الحمض النووي الريبي كما يقاس بمقياس الطيف الضوئي مع تقدم العمر بين E8.5-E9.5. ويرجع ذلك إلى قرار من مقياس الطيف لا تكون حساسة بما يكفي للكشف عن التغيرات في تركيز الحمض النووي الريبي من عدد الخلايا التي نحن حصاد، ونوصي باستخدام معلومات التركيز التي تم الحصول عليها من الكهرباء الشعرية(الشكل 2C). يمكن استخدام أثر الكهرباء الشعرية لتقدير تركيز وحجم شظايا الحمض النووي الريبي. القمم < 1000 النيوكليوتيدات تدل على التحلل. تتبع تمثيلية متناسقة مع الجيش الملكي النيبالي التي لم يتم تدهورها. تبلغ الذروة عند 2000 نوكليوتيدات و5100 نوكليوتيدات 18s و 28s rrna، على التوالي. وتقع المنطقة الصغيرة RNA في ~ 150 النيوكليوتيدات (الشكل 2D).
تم إعداد مكتبات تسلسل RNA الصغيرة باستخدام مجموعة الإعداديات مكتبة RNA الصغيرة الموصوفة في جدول المواد. هنا نستخدم أقل من نصف الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من كل عينة (4 ميكرولتر من 11 ميكرولتر elution، ~ 80-120 نانوغرام) التي تمكن من أن يتم تصنيعها RNA- تسلسل المكتبات من RNA المتبقية من كل عينة. هنا نحن تمييع 3 'و 5' محولات RNA الصغيرة 1/4 لخفض كمية الخافتات محول الحالية وتشير إلى أن يتم الانتهاء من ربط محول، تنظيف، وعكس خطوات النسخ قدر الإمكان بطريقة مستمرة. استخدمنا 16 دورة PCR لتضخيم المكتبات ونقترح أن يتم تحديد الحد الأدنى من دورات PCR لأية تجربة تجريبية. من خلال استكمال دورات PCR الزائدة ، يمكن للمرء أن تضخيم مصطنع عدد القراءة من ميرنا أعرب عن المتواضع.
تحديد الحجم هو الحتمية لإثراء لمكتبات miRNAs و لا الخافتات، التي عادة ما تكون موجودة. حجم المنتج مكتبة (150 bp) ومحول الخافتات (130 bp) متشابهة جدا في الحجم. يتم استخدام استخراج هلام لعزل مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة بعيدا عن الخافتات محول (الشكل 3). صورة من هلام PAGE قبل الختان يظهر أن العديد من أحجام المنتج موجودة في كل عينة(الشكل 3A). من المهم ترك حارة واحدة مفتوحة بين أي عينتين أو سلم يتم تحميله على الجل. جبهة الهجرة في الجزء السفلي من الجل منحنية قليلا مما يشير إلى أن تشغيل بسرعة أبطأ قد يكون ضروريا إذا كان من الصعب التمييز بين الفرقة 150 BP لجميع العينات. هذه الصورة التمثيلية يظهر أيضا وفرة من 150 BP المنتج من تركيز أعلى من الحمض النووي الريبي (RNA مجموع من الدماغ من الفئران) التي ذهبت إلى الإعدادية المكتبة بالمقارنة مع تلك التي ذهبت إلى كل عينة الجنينية. وتكشف السيطرة السلبية أن الكواشف كانت خالية من أنواع الحمض النووي الملوثة (الشكل 3A). وينبغي أن يتم ختان النطاق 150 BP مع شفرة حلاقة نظيفة ويظهر في المنطقة التي تم جمعها في الشكل 3B. الشعيرية electrophoresis آثار قبل وبعد اختيار حجم تظهر تحسنا كبيرا من نقاء 150 bp مكتبة المنتج مع تنقية هلام(الشكل 3C-3D). ومن المهم ملاحظة أن آثار الشكل 3C-3D لها عينات من القمم أعلى من علامات، مما يدل على الحمولة الزائدة. في هذه الحالات، يمكن أن يكون حجم الشظايا دقيقًا، ولكن قد لا يكون التركيز. ويمكن الحصول على القياس الكمي عن طريق تخفيف المكتبات إلى نطاق العلامات أو استخدام طرق بديلة. نجد بعض التباين عبر الطرق البديلة للكمية المكتبية ونوصي بأن يتم اختبار طرق متعددة من القياس الكمي تجريبيا. يعد التحديد الكمي الدقيق للتركيز أمراً ضرورياً عند زيادة عدد العينات التي سيتم ترتيبها في وقت واحد. سيتم تخفيف المكتبات إلى 1.3 pM لتسلسل وعموما في أي مكان من 15-25 عينات يمكن أن تسلسل في وقت واحد على 150 دورة تسلسل عدة التي توفر ~ 140 مليون يقرأ. وهذا يؤدي إلى حوالي 5 ملايين قراءة لكل عينة. عموماً تتراوح معدلات رسم الخرائط بين 60-80%.
الشكل 1: حصاد الخلايا من أجنة الماوس لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغير. ( أ) E8.5 الجنين الماوس لتسليط الضوء على إزالة صفار الكيس و somites المستخدمة لتحديد مرحلة الجنين (B) Somite التدريج من أجنة الماوس لالتقاط مراحل التطور قمة العصبية (C) تحليل المكون الرئيسي للمكتبات من فرز الخلايا العصبية فرزها تظهر أن العينات المجموعة حسب العمر (D) التخطيطي تبين كيف تم حصاد العينات باستخدام Wnt1-Cre في E8.5 إلى تسمية ما قبل التاريخ والخلايا العصبية المهاجرة وSx10-Cre في E9.5 لتسمية فقط الخلايا العصبية المهاجرة (E) تحليل مكون أساسي للمكتبات المُعدة من خلايا القمة العصبية ذات النمط البري المفرزة التي تظهر العينات مجتمعة من قبل Cre-driver بغض النظر عن العمر (F) استراتيجية الغاتينغ المستخدمة لعزل خلايا القمم العصبية RFP + من E8.5 و E9.5 أجنة باستخدام FACS sorting. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عزل الحمض النووي الريبي من أجنة الماوس E7.5-E9.5. (أ)تتبع الطيفي التمثيلي لعزلة RNA عن أصغر مرحلة من مراحل الجنين التي طبقناها هذا البروتوكول. (B) جدول يوضح القيم التمثيلية لجودة الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من مقياس الطيف. (C) مثال للرنا المحصودة من خلايا القمة العصبية فرز من أجنة كل عمر (D) تتبع كهرباء الشعيرات الدموية تظهر نوعية جيدة RNA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مكتبات ميرنا قبل وبعد اختيار الحجم. (أ) TBE-PAGE هلام عرض مكتبات RNA صغيرة تمثيلية لأربع عينات والضوابط قبل و (B) بعد 150 BP band excision. الأسهم تمثل 150 بريتيش بتروليوم الفرقة إلى أن يكون استئصال (C) الشعرية electrophoresis تتبع مكتبة RNA صغيرة قبل و (D)بعد تحديد الحجم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يمكن أن تمضي العمليات التنموية بسرعة ، وتخضع الخلايا للعديد من المواصفات التسلسلية بحيث لالتقاط رؤية شاملة للمقدرات التي تساهم في قرارات مصير مبكرة ، هناك حاجة إلى تنظيم أكثر تحديدًا من الزيادة نصف اليومية المستخدمة على نطاق واسع. وقد أجريت دراسة حديثة تسلسل الحمض النووي الريبي من Theiler المرحلة 12 الأجنة التي تتراوح بين وجود 3 إلى 6 somites11. نجد أنه خلال هذه الفترة الزمنية ، يتم تحديد خلايا القمة العصبية (3 somites من العمر) ، delaminate (4 somites من العمر) ، والهجرة (5-6 somites من العمر). كما نجد أنه إلى جانب برنامج Cre-driver المستخدم في نسب مجموعات الخلايا المتتبعة، فإن العمر هو أكبر مصدر للتباين بين العينات البيولوجية، وينبغي اعتبار الأجنة المطابقة فقط من اليوميت على أنها تتكاثر. وينبغي أن يؤخذ ذلك أيضا في الاعتبار عند مقارنة الأجنة المعدلة وراثيا لضوابط النمط البري.
وقد استخدمت الأساليب السابقة لميرنا خلال التنمية المبكرة بين 10-100 نانوغرام من المدخلات RNA لإعداد مكتبة تسلسل الجيش الملكي النيبالي الصغيرة وتجميع أجنة متعددة في عينة واحدة13،14. نُظهر عزل الحمض النوويRNA وإعداد المكتبة من جنين E7.5 واحد أو من خلايا القمة العصبية المفرزة في E8.5 و E9.5 باستخدام ما يقرب من 100 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي كمدخلات. عند فصل الأجنة للفرز، ينبغي للمرء أن يأخذ الرعاية لمشاهدة تفكك تحت المجهر وإخماد رد فعل لمراقبة عندما يتم الحصول على خلايا واحدة. نجد أن تفكك منطقة الجمجمة من الأجنة E8.5-E9.5 هو لحظة تقريبا مع الأنابيب اليدوية لطيف كما هو موضح في البروتوكول. بالنسبة للأنسجة الأكبر والأجنة الأكبر سناً بشكل متزايد، قد يكون وقت الانفصام أطول اعتمادًا على جزء الجنين الذي يتم فصله. بالنسبة للجنين E7.5-E9.5، يمكن رؤية كتل من الخلايا بسهولة تحت المجهر وينبغي أن يستمر الانفصام حتى لا تظهر المزيد من الكتل. خلايا واحدة مرئية في الحل إذا قمت بضبط التركيز من خلال الحل في الخاص بك في أي مكان من 5-10x. أساليب سابقة فرز الخلايا مباشرة في عازلة تحلل لتسلسل RNA لإعدادية RNA بالجملة من عدد منخفض من الخلايا14. هنا نحن فرز مباشرة في محلول تحلل استخراج الحمض النووي الريبي بحيث يمكن عزل الجيش الملكي النيبالي قبل بدء إعداد المكتبة. استخدام أعمدة صغيرة مع 11 ميكرول حجم elution يسمح لتركيز RNA عالية بما فيه الكفاية بحيث يمكن تقسيم الإعدادية RNA واحد بين RNA الصغيرة وسلسلة RNA السائبة.
أحد القيود الحالية لمعظم أساليب تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة هو تضخيم PCR من cDNA المحولة. أسلوبنا لا يتغلب على هذا القيد، ولكن كنا قادرين على تقليل عدد دورات PCR من 25-الحد الأقصى الموصى بها وصولا الى 16 دورات. وهذا الانخفاض في التضخيم يقلل من تحيز التضخيم الاصطناعي الذي أدخله PCR. مصدر آخر للتحيز هو ربط المحولات ، حيث من المعروف أن تسلسلات محددة تقع في نهايات المحولات و miRNAs يمكن أن ligate جنبا إلى جنب مع كفاءة أكبر من تسلسلات أخرى. لتجنب هذا، يكون المحولات المستخدمة في هذا البروتوكول 4 أسس عشوائية دمجها في نهاية كل محول لمنع التحيز في التفاعلات الربط. بالإضافة إلى ذلك، مشكلة شائعة أخرى هي مقدار خافمات المحول التي تتشكل عند انخفاض الإدخال RNA. تتضمن مجموعة إعداد المكتبة خطوات لتقليل تكوين محول الخافت مثل تعطيل المحول وتنظيفات الخرز لإزالة المحولات الزائدة بعد كل ربط. نحن أيضا المخفف 3 'و 5' محولات 4N من قبل 1/4 لتقليل كمية من خافض محول التي يمكن أن تشكل. وجدنا أنه عندما لا تضعف، كثافة الفرقة 130 BP يزيد مما يجعل من الصعب التمييز من 150 بريتيش بتروليوم الفرقة التي تحتوي على مكتبات الحمض النووي الريبي الصغيرة المطلوب على هلام.
وثمة تحد آخر يواجه حاليا في إعداد مكتبات التسلسل هو التحديد الكمي الدقيق للمنتج قبل التسلسل. لقد وجدنا أن أساليب مختلفة تعطي نتائج متفاوتة على نفس المكتبة. نقترح أن يستخدم الباحثون طرقًا متعددة لتحديد الكمية للحصول على تقدير دقيق للتركيز.
يمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع على الدراسات الوراثية أو التنموية أو تطبيقات أخرى حيث يتم حصاد الحمض النووي الريبي من عدد قليل من الخلايا. ويبسط هذا النهج الدراسات الزمنية عن طريق تجنب تجميع الأجنة ويمكن تطبيقه بسهولة على الخلايا غير المفرزة والمرتبة.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا المشروع من قبل مؤسسة أندرو ماكدونو B + وNICH (R01- HD099252، R01-HD098131. R.J.P. هو باحث CPRIT في أبحاث السرطان (RR150106) والباحث الخامس في أبحاث السرطان (مؤسسة V). كما يود المؤلفون أن يعترفوا بـ "Cytometry" و"خلية فرز الـ"كور" في BCM لتوفير المعدات اللازمة لهذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
- Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
- Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
- Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901 (2000).
- Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
- Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).
- Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
- Chugh, P., Dittmer, D. P.
- Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
- Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
- Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
- Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).
