Summary
Vi beskriver en teknikk for profilering av microRNAs i tidlige museembryoer. Denne protokollen overvinner utfordringen med lav celleinndata og liten RNA-berikelse. Denne analysen kan brukes til å analysere endringer i miRNA-uttrykk over tid i forskjellige cellelinjer av det tidlige museembryoet.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er viktig for den komplekse reguleringen av celleskjebnebeslutninger og utviklingstiming. In vivo-studier av miRNAs bidrag under tidlig utvikling er teknisk utfordrende på grunn av det begrensende cellenummeret. Videre krever mange tilnærminger en miRNA av interesse for å bli definert i analyser som nordlig blotting, microarray, og qPCR. Derfor har uttrykket for mange miRNAs og deres isoformer ikke blitt studert under tidlig utvikling. Her demonstrerer vi en protokoll for små RNA-sekvensering av sorterte celler fra tidlige museembryoer for å muliggjøre relativt objektiv profilering av miRNAer i tidlige populasjoner av nevrale crestceller. Vi overvinner utfordringene med lav celleinndata og størrelsesvalg under bibliotekforberedelse ved hjelp av forsterkning og gelbasert rensing. Vi identifiserer embryonal alder som et variabelt regnskap for variasjon mellom repliker og stadium-matchet museembryoer må brukes til å nøyaktig profilere miRNAs i biologiske repliker. Våre resultater tyder på at denne metoden kan brukes bredt for å profilere uttrykket av miRNAs fra andre avstamninger av celler. Oppsummert kan denne protokollen brukes til å studere hvordan miRNAs regulerer utviklingsprogrammer i forskjellige cellelinjer av det tidlige museembryoet.
Introduction
Et sentralt spørsmål om utviklingsbiologi er hvordan en enkelt udifferensiert celle kan gi opphav til en hel organisme med mange komplekse celletyper. Under embryogenese blir utviklingspotensialet til celler gradvis begrenset etter hvert som organismen utvikler seg. Et eksempel er nevrale crest avstamning, som gradvis skiller fra en multipotent cellepopulasjon til ulike terminalderivater, for eksempel perifere nevroner, glia, kranial bein og brusk. Neural crest celler er spesifisert fra ectoderm under gastrulation og deretter gjennomgå en epitel til mesenchymal overgang og migrere gjennom embryoet til diskrete steder i hele kroppen hvor de vil terminalt skille1. Tiår med arbeid har avdekket et transkripsjonelt genreguleringsnettverk, men langt mindre er kjent om mekanismene for post-transkripsjonsregulering som styrer tidspunktet for neural crest utvikling.
Tidligere arbeid tyder på at microRNAs (miRNAs) undertrykker genuttrykk for riktig utviklingstiming og celleskjebnebeslutninger2,3,4,5,6. Studier av miRNAs i neural crest utvikling har i stor grad fokusert på senere stadier av kraniofacial utvikling. For eksempel er miR-17 ~ 92 og miR-140 kritiske for palatogenesis under kraniofacial utvikling i mus og sebrafisk,henholdsvis 7,8. Bidraget fra miRNAs til de tidligste nevrale crest skjebne beslutninger av embryoet har ikke blitt grundig undersøkt. Studier av miRNAs i tidlige skjebnebeslutninger har vært begrenset av tekniske utfordringer som det lave cellenummeret som finnes i tidlige embryoer.
MiRNAs har blitt profilert in vitro fra cellelinjer ved hjelp av embryolegemer på forskjellige stadier av differensiering for å modellere tidlig museutvikling9. Undersøkelsen av små RNA-er in vivo under tidlig pattedyrutvikling har vært relativt begrenset. Tidligere metoder for å profilere miRNAs har ført til skjevhet som en kjent sekvens brukes til å analysere uttrykk for en bestemt miRNA i metoder som qPCR, microarrays, og nordlige flekker10. Neste generasjons sekvensering og stadig bedre molekylære verktøy gjør det nå mulig for relativt objektiv analyse av miRNA-uttrykk for å studere deres bidrag til tidlig pattedyrutvikling og celleskjebnebeslutninger.
Her rapporterer vi en teknikk for å høste og sekvensere små RNA-er uttrykt i nevrale crestceller fra tidlige museembryoer som spenner over gastrulation (E7.5) til begynnelsen av organogenese (E9.5). Denne teknikken er enkel og kombinerer avstamning sporing, celle sortering, og gel-basert størrelse valg for å forberede små RNA sekvensering biblioteker fra et minimalt antall celler for neste generasjon sekvensering. Vi understreker viktigheten av streng somite stadium matching av embryoer for å løse 6-timers tidsintervaller for å få et omfattende syn på miRNAs under de raske endringene i tidlig utvikling. Denne metoden kan brukes mye på genetiske og utviklingsstudier og unngår pooling av embryoer. Vi beskriver en måte å overvinne utfordringer med nåværende metoder som miRNA-berikelse ved hjelp av gelbasert rensing, bibliotekkvantifisering og minimere skjevhet introdusert fra PCR. Denne metoden har blitt brukt til å identifisere miRNA uttrykksmønstre over tid for å studere hvordan miRNAs kontrollere utviklingstiming i neural crest avstamning av museembryoer.
Protocol
Alle forsknings- og dyrepleieprosedyrer ble godkjent av Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee og plassert i Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care-godkjent dyrevernsanlegg ved Baylor College of Medicine. Alle stammer ble opprettholdt på C57BL6 bakgrunn.
1. Embryo disseksjon (E7.5-E9.5)
- Fjern livmorhorn fra en gravid kvinnelig mus, sterilisere magen med 70% etanol hvor snittet skal gjøres.
- Rengjør livmoren ved å skylle med fosfatbufret saltvann (PBS). Legg livmoren i en steril plast 10 cm tallerken.
- Ved hjelp av mikrodisseksjon saks, skille hver decidua inneholder regionen fra hverandre. Skrell av livmormuskelen og eksponer alle deciduae. En etter en, fjern decidua fra hvert embryo.
- Fjern eggeplommesekken fra hvert embryo og spar for genotyping.
- Flytt alle embryoer inn i en ny rett med fersk PBS for avbildning.
- Ta et bilde av hele kullet. Bilde hvert embryo individuelt og telle antall somites av hvert embryo. Hold forstørrelsen og eksponeringen (for fluorescens) det samme mellom eksperimenter.
MERK: Vi finner at 50-200 ms eksponering er tilstrekkelig for fluorescens og at 20 ms er tilstrekkelig for lysfeltinnstilling.
2. Embryodissosiasjon og cellesortering
- For hvert embryo som skal sorteres fra, gjør følgende.
- Decapitate like over otic placode for embryoer eldre enn E8.0 (hvis bare merkede celler i kranialregionen er ønsket). For E7,5 embryoer, fjern ekstraembryoniske strukturer (hvis bare embryoet er ønskelig).
- Flytt hodet i et minimalt volum pbs over til en ren brønn på en 48-brønns plate. Tilsett 250 μL papain (27 E/ml). Pipetten opp og ned forsiktig ved hjelp av en p200.
- Sjekk under mikroskopet og se etter klumper og enkeltceller.
- Gjenta skånsom pipettering opp og ned til en enkelt celle suspensjon er oppnådd (vanligvis tre runder pipettering opp og ned som skal likestille mellom 30 s til 1 min for E7,5-E9.5).
- Slukke med 250 μL fosterbovin serum (FBS).
- Gjenta trinn 2.1.1-2.1.5 for hvert embryo som skal sorteres.
- Filtrer 500 μL cellefjæring gjennom et 35 μm nylonnettingfilterdekselrør for å fjerne klumper.
- Ta filtratet og gå over til nytt 1,5 ml rør og spinn på 200 x g i 5 min. Fjern supernatant nøye og overfør til nytt rør (lagre til levende celler er kjent for å være i pellet).
- Resuspend cellepellet i 300 μL PBS som inneholder 0,5-1% storfe serum albumin og holde på is til sortering (minimere tiden mellom nå og slutten av sortering).
- Hvis ønskelig, ta 10 μL cellefjæring og kombinere med 10 μL Trypan blå (0,4%) og telle ved hjelp av et hemocytometer for å identifisere omtrentlig celle kvantifisering og levedyktighet som Trypan blå bare flekker døde celler.
- Like før sortering filtrerer du hver prøve på nytt gjennom et filterdekselrør og legger til DAPI-flekk for levende celler.
- Sorter hver prøve i 500 μL RNA ekstraksjonslysoppløsning (se Materialtabell) på cellesortering med 70 μm dyse.
- Bland og oppbevar ved -80 °C til alle prøvene høstes. Fortsett fra dette punktet bare når alle prøvene som trengs for et eksperiment høstes for å redusere teknisk variasjon mellom runder med bibliotekforberedelse.
3. RNA ekstraksjon
MERK: Protokollen er tilpasset fra RNA-isolasjonssettet; se Materialse tabell.
- Tilsett 500 μL RNA ekstraksjonslysoppløsning (se Materialtabell) i hver prøve for å gjøre det totale volumet 1000 μL.
- Tin hver prøve ved romtemperatur.
- Vortex hver prøve i 1,5 min, og pass på at hetten er godt på hvert rør før du starter homogenisering. Inkuber homogenatet ved romtemperatur (15–25 °C) i 5 min.
- Tilsett 140 μL kloroform, hetterøret sikkert og rist kraftig i 15 s. Inkuber ved romtemperatur i 3 min.
- Sentrifuge i 15 min ved 12 000 x g ved 4 °C. Overfør den øvre vandige fasen til et nytt oppsamlingsrør på is. Ikke overfør interfase eller organisk fase. Når du nærmer deg den rosa organiske fasen, tipp røret til side og fjern små aliquots til ingen klar vandig fase kan samles inn.
- Mål volumet av RNA som inneholder vandig fase samlet inn fra hvert utvalg for riktig beregning i neste trinn.
- Tilsett 1,5 volumer (vanligvis 525 μL, men kan være litt mer eller mindre) av 100% etanol og bland godt ved pipettering.
- Pipette opptil 700 μL prøve, inkludert eventuelle utfelling, i kolonne i en 2 ml oppsamlingsrør. Lukk lokket og sentrifugen ved ≥ 8000 x g i 15 s ved romtemperatur. Kast gjennomstrømningen.
- Gjenta trinn 3.8 ved hjelp av resten av prøven.
- Vask kolonnen i henhold til produsentens instruksjoner. Tørk kolonnen ved å spinne i full hastighet i 1 min. Overfør kolonnen til et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør.
- Pipette 11 μL kjernefritt vann på midten av membranen. La sitte ved romtemperatur i 1 min. Spinn maksimal hastighet i 1 min for å elute av kolonnen.
- Mål RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer og et parallelt kapillærelektroforeseinstrument (Materialsekk ).
4. Bibliotek forberedelse
MERK: Protokollen er tilpasset fra håndbok for håndbok for håndbok for 1000 RNA-biblioteksforberedelsessett. se Materialse tabell.
- Fullfør denningen og 3' adapter ligation som angitt i den lille RNA bibliotek forberedelse kit håndbok ved hjelp av 1/4 fortynning av 3 'adapter.
- Fortsett til overflødig 3 'adapter fjerning.
- Fullfør adapteruttømmingen som angitt i den lille RNA-bibliotekets håndbok for 1000-biblioteket. Pass på å bruke nylaget 80% etanol for perleoppryddingen og at alt overflødig etanol fjernes helt like før gjenopplivingen i kjernefritt vann uten å tørke perlene (sprekkdannelse av perlepellet observeres ved overtørking).
- Fortsett direkte til overflødig adapteraktivering.
- Fullfør overflødig adapteraktivering som angitt i det lille RNA-bibliotekets forberedelsessett håndbok som monterer alle reagenser på is.
- Fortsett til 5' 4N adapter ligation.
- Fullfør 5'adapter ligation som angitt i den lille RNA bibliotek forberedelse kit håndboken å bruke en 1/4 fortynning av 5 'adapter og montering alle reagenser på is.
- Fortsett med å reversere transkripsjonen.
- Fullfør omvendt transkripsjon-første trådsyntese som angitt i den lille RNA bibliotek forberedelse kit håndbok og ta vare på å montere alle reagenser på is og ikke holde enzymet ut av fryseren i lengre perioder.
MERK: På dette tidspunktet kan protokollen stoppes, med prøver lagret over natten ved 4 °C. Alternativt fortsette til PCR forsterkning. - Fullfør PCR-forsterkning ved å montere reagensene som angitt i den lille RNA-bibliotekets håndbok for lakkeringssett og minimere antall PCR-sykluser. Antall PCR-sykluser bør være eksperimentelt bestemt for hvert program, og minimum antall sykluser bør brukes. Her brukte vi 16 sykluser for å kunne forsterke våre små RNA-biblioteker.
- Fortsett direkte til størrelsesvalg.
5. Størrelse valg
- Til hver prøve, tilsett 5 μL 6x gel lasting fargestoff og pipette å blande.
- Legg 10 μL stige til den første brønnen av gelen, slik at brønnen umiddelbart til høyre tom. Last alt produktet fra trinn 5.1 på en 6% Tris / borate / etyenediaminetetraacetic acid - polyacrylamide gel (TBE-PAGE) og la 1 kjørefelt mellom hver prøve.
MERK: Oppbevar beholderen som gelen kom inn for senere trinn. - Kjør gelen ved 150 V i ca. 30-40 min i 0,5x TBE løpebuffer (til det nedre fargebåndet er nær bunnen av gelen, 0,5-1 cm).
- Lag 1 l fargingsløsning mens gelen kjører: SYBR Gold fortynnet 1:10,000 i 0,5x TBE.
- Når gelen er ferdig med å kjøre (det vil vil at det nedre fargebåndet er nær bunnen av gelen), fjern forsiktig gelen fra glassplatene, og legg til gelens orientering.
- Legg gelen i skuffen på originalemballasjen. Fjern 0,5x TBE og bytt ut med fargeoppløsningen fra trinn 5.5. Flekkgel i 15 min. Fargingstiden må kanskje økes.
- Plasser gelen på en UV-transilluminator, pass på å ikke rive gelen og opprettholde orienteringen nevnt ovenfor (re-flekk i ekstra tid hvis bånd av stigen ikke kan sees tydelig).
- Bilde gelen når fargingen er fullført på UV-transilluminator med et kamera.
- Hvis et bedre bilde er nødvendig, må du først bruke et annet bildeapparat enn UV-transilluminatoren til å ta et bilde av gelen før du kutter ut båndene på en UV-transilluminator, da bildebehandling direkte på UV-transilluminatoren forårsaker den variable fargen på bakgrunnen som vist i figur 3A-B. Ikke flytt gelen for mange ganger da den er delikat og kan rive.
- Identifiser og fjern ~150 bp-båndet ved hjelp av et rent barberblad og plasser det rene 1,5 ml-røret. Ikke klipp ut det ~130 bp-båndet (adapterdnederprodukt).
- Bilde gelen igjen etter at du har fjernet skivene som inneholder bibliotekproduktet for dokumentasjonsformål.
- Spinn mikrocentrifugerørene som inneholder gelskiven ved maksimal hastighet i 30-årene for å samle skivene nederst på hvert rør.
- Bruk en p200-spiss for hver prøve for å knuse gelskiven i de minste bitene som er mulig. Løs ut hver spiss i hvert rør.
- Til hvert rør legger du til 300 μL elutionbuffer, må vaske gelbiter fra siden av røret og feste p200-spissen på nytt og vaske av spissen for hver prøve.
- Plasser eluting prøvene i en risting inkubator satt til 25 °C. Inkuber over natten med 1000 rpm risting. Fjern rørene fra inkubatoren og spinn ved maksimal hastighet i 10 min ved romtemperatur.
- Overfør det supernatante som inneholder bibliotekproduktet til en 2 ml RNase-fri 96-brønnplate. Vær forsiktig med å ikke overføre noen gel.
- Tilsett 50 μL opprydding perler til hver prøve og bland ved pipettering. Tilsett umiddelbart 350 μL isopropanol og bland ved pipettering. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter med gynge.
- Pulsspinnplate til pelletperler og magnetiser deretter i 2 min. Fjern og kast overnatanten forsiktig.
- Tilsett 950 μL på 80% etanol. Inkuber i 30 s. Fjern alle de overnaturlige. Gjenta for totalt to etanol vasker.
- Tørk prøven i 3 min. På dette trinnet ta vare på å fjerne eventuelle gjenværende etanol som samler på bunnen av hver brønn (ikke mer enn én gang) og å ikke overtørke perlene (overtørking vil resultere i sprekkdannelse av perlepellet).
- Fjern all restvæske på bunnen av brønnen. Fjern platen fra magnetstativet.
- Resuspend pellet i 13 μL av resuspensjonbuffer. Bland med pipette til homogen. Inkuber i 2 min og magnetiser deretter i 3 min.
- Overfør 12 μL supernatant til et rent rør eller en ren platebrønn for påfølgende oppbevaring. Oppbevar alle prøvene ved 4 °C over natten eller -20 °C på lang sikt.
- Kontroller størrelsen og konsentrasjonen av fragmenter som finnes i hvert bibliotek ved hjelp av kapillærelektroforese høy følsomhet DNA analyse. Bekreft konsentrasjonen med mer enn én metode.
MERK: Vi har tidvis brukt standard følsomhetssett for å unngå overbelastning av kapillærelektroforese.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren demonstrert her, har vi høstet embryoer på E7.5, E8.5 og E9.5. Ekstraembryoniske strukturer ble fjernet fra alle embryoer og deretter embryoer ble somite iscenesatt for å løse 6-timers tidsintervaller (figur 1A-1B). Ved hjelp av prinsippkomponentanalyse for å gruppere prøver basert på likhet, finner vi at prøver klynger etter alder, fremhever variasjonen som følge av embryonal alder og behovet for forsiktig somite matching for biologiske repliker (Figur 1C). Vi profilerte pluripotent epiblast på E7.5, avstamning spores premigratory og trekkfugl nevrale crest celler ved hjelp av Wnt1-Cre på E8.5 og migrerende nevrale crest celler ved hjelp av Sox10-Cre på E9.5 (Figur 1D). Her høster vi spesielt kranial neural crest ved å halshugge embryoet like over otic placode. En sammenligning av de to Cre-driverne (Wnt1 og Sox10) som ofte brukes til å merke nevrale crest celler bekrefter at de markerer forskjellige populasjoner i tidlige museembryoer (figur 1E). Gating strategier ble brukt til å oppnå live enkelt RFP positive celler som ble sortert direkte i RNA ekstraksjon lysis løsning (se Table of Materials) og lagret ved -80 °C ( Figur1F). Det er viktig å holde oversikt over hvor mange celler som ble høstet fra hver prøve.
RNA-isolasjon ble utført ved hjelp av en modifisert versjon av RNA-settprotokollen. Spesielt bruker vi mini RNA-kolonnene som skal lagres ved 4 °C. Disse kolonnene er nyttige for eluting i et lite volum (11 μL) for å oppnå høyest mulig konsentrasjon av RNA fra prøver der celleinngang begrenser. Av samme grunn er det viktig å oppnå all vandig fase etter fenolklorformekstraksjon. Langsom pipettering og vipperøret til den ene siden mens innsamling er avgjørende for å maksimere utbyttet. I denne prosedyren kvantifiserer vi RNA ved hjelp av både et spektrofotometer, for å få informasjon om salt / proteinforurensning, og en kapillær elektroforese for å måle konsentrasjon (figur 2). Spektrofotometeret spor viser at RNA ble isolert uten forurensende proteiner, men har høyt saltinnhold (Figur 2A-2B). Ideelt sett bør forholdet mellom 260/280 være ~1,8 og forholdet mellom 260/230 bør være > 2,0. Det totale RNA-utbyttet målt ved spektrofotometeret økte ikke med alderen mellom E8,5-E9,5. Dette skyldes oppløsningen av spektrofotometeret ikke å være følsom nok til å oppdage endringer i RNA konsentrasjon fra antall celler som vi høster, og vi anbefaler å bruke konsentrasjonsinformasjonen hentet fra kapillær elektroforese (figur 2C). Kapillærelektroforesespor kan brukes til å estimere konsentrasjon og størrelse på RNA-fragmentene. Topper <1000 nukleotider indikerer nedbrytning. Den representative sporingen er i samsvar med RNA som ikke er degradert. Topper på 2000 nukleotider og 5100 nukleotider er henholdsvis 18 og 28s rRNA. Den lille RNA-regionen ligger på ~150 nukleotider (figur 2D).
Små RNA sekvensering biblioteker ble prepped ved hjelp av den lille RNA bibliotek prep kit beskrevet i Table of Materials. Her bruker vi bare mindre enn halvparten av RNA hentet fra hvert utvalg (4 μL av 11 μL elution, ~ 80-120 ng) som gjør at RNA-sekvensering biblioteker som skal syntetiseres fra de resterende RNA fra hvert utvalg. Her fortynner vi de 3' og 5 ' små RNA-adapterne 1/4 for å senke mengden adapterdydere tilstede og foreslå at adapterligation, opprydding og omvendt transkripsjonstrinn fullføres så mye som mulig på en kontinuerlig måte. Vi har brukt 16 PCR sykluser for å forsterke bibliotekene og foreslå at det minste antall PCR sykluser for ethvert eksperiment bestemmes empirisk. Ved å fullføre overflødige PCR sykluser, man kan kunstig blåse opp leseantallet av en lavt uttrykt miRNA.
Størrelsesvalg er viktig for å berike for biblioteker av miRNAs og ikke adapter dimers, som vanligvis finnes. Bibliotekets produktstørrelse (150 bp) og adapterdydere (130 bp) er svært like i størrelse. Gelekstraksjon brukes til å isolere de små RNA-sekvenseringsbibliotekene vekk fra adapterdyderne (figur 3). Et bilde av en PAGE gel før eksisjon viser at en rekke produktstørrelser er til stede i hver prøve (Figur 3A). Det er viktig å la ett kjørefelt stå åpent mellom to prøver eller en stige som er lastet på gelen. Migrasjonsfronten nederst på gelen er litt buet som indikerer at det kan være nødvendig å kjøre med lavere hastighet hvis 150 bp-båndet er vanskelig å skille for alle prøver. Dette representative bildet viser også en overflod av 150 bp produkt fra høyere konsentrasjon av positiv kontroll RNA (total RNA fra hjernen til en rotte) som gikk inn i biblioteket prep sammenlignet med det som gikk inn i hver embryonale prøve. Den negative kontrollen viser at reagensene var fri for forurensende nukleinsyrearter (figur 3A). Excision av 150 bp bandet bør gjøres med et rent barberblad og området samlet er vist i figur 3B. Kapillærelektroforese spor før og etter størrelse valg viser dramatisk forbedring av renheten av 150 bp bibliotek produkt med gel rensing (Figur 3C-3D). Det er viktig å merke seg at sporene i figur 3C-3D har prøvetopper høyere enn markørene, noe som indikerer overbelastning. I disse tilfellene kan størrelsen på fragmentene være nøyaktig, men konsentrasjonen kan ikke. Kvantifisering kan oppnås ved å fortynne bibliotekene i rekkevidden av markørene eller ved hjelp av alternative metoder. Vi finner en viss variasjon på tvers av alternative metoder for bibliotek kvantifisering og anbefaler at flere kvantifiseringsmetoder testes empirisk. Nøyaktig kvantifisering av konsentrasjon er avgjørende når du maksimerer antall prøver som skal sekvenseres på en gang. Biblioteker vil bli fortynnet ned til 1,3 pM for sekvensering og generelt alt fra 15-25 prøver kan sekvenseres på en gang på en 150 syklus sekvensering kit som gir ~ 140 millioner leser. Dette resulterer i om lag 5 millioner leser per prøve. Vanligvis tilordning priser er mellom 60-80%.
Figur 1: Høsting av celler fra museembryoer for små RNA-sekvensering. (A) E8.5 museembryo for å markere fjerning av eggeplommesekken og somites som brukes til å bestemme embryoets stadium (B) Somite iscenesettelse av museembryoer for å fange stadier av neural crest utvikling (C) Prinsippkomponentanalyse av biblioteker klargjort fra sorterte wildtype neural crest celler som viser at prøver gruppe etter alder (D) Skjematisk viser hvordan prøver ble høstet ved hjelp av Wnt1-Cre på E8.5 for å merke premigratoriske og trekkgående nevrale crestceller og Sox10-Cre på E9.5 for å merke bare migrerende nevrale crestceller ( E )Prinsippkomponentanalyseav biblioteker som er klargjort fra sorterte wildtype neural crest-celler som viser prøver grupper sammen av Cre-driver uavhengig av alder (F) Gating-strategi som brukes til å isolere RFP + nevrale crestceller fra E8.5 og E9.5 embryoer ved hjelp av FACS-sortering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: RNA isolasjon fra E7.5-E9.5 museembryoer. (A)Representativ spektrofotometer spor av en RNA isolasjon fra den yngste fasen av embryo som vi har brukt denne protokollen. (B) Tabell som viser de representative verdiene av RNA-kvalitet hentet fra spektrofotometeret. (C) Eksempel på RNA høstet fra sorterte nevrale crest celler fra embryoer i hver alder (D) Kapillær elektroforese spor som viser god kvalitet RNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: miRNA biblioteker før og etter størrelsesvalg. (A) TBE-PAGE gel som viser representative små RNA biblioteker for fire prøver og kontroller før og (B) etter 150 bp band excision. Pilene representerer 150 bp-båndet som skal skåret ut (C) Kapillær elektroforese spor av små RNA-bibliotek før og (D) etter størrelsesvalg. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Utviklingsprosesser kan fortsette raskt, og celler gjennomgår mange sekvensielle spesifikasjoner slik at for å fange en omfattende visning av miRNAs bidra til tidlige skjebnebeslutninger, er det nødvendig med mer spesifikk iscenesettelse enn den mye brukte halvdagsøkningen. En fersk studie har utført RNA sekvensering fra Theiler stadium 12 embryoer som spenner fra å ha 3 til 6 somites11. Vi finner at i løpet av denne perioden er nevrale crest-cellene spesifisert (3 somites av alder), delaminate (4 somites of age), og migrere (5-6 somites av alder). Vi finner også at i tillegg til Cre-driveren som brukes til avstamning sporcellepopulasjoner, alder er den største kilden til variasjon mellom biologiske prøver, og bare somite matchet embryoer bør betraktes som replikerer. Dette bør også tas i betraktning ved sammenligning av transgene embryoer med wildtype kontroller.
Tidligere metoder for å profilere miRNAs under tidlig utvikling har brukt mellom 10-100 ng av RNA-inngang for små RNA sekvensering bibliotek forberedelse og har samlet flere embryoer i en prøve13,14. Vi demonstrerer RNA-isolasjon og bibliotekforberedelse fra et enkelt E7.5-embryo eller fra sorterte nevrale crestceller på E8,5 og E9,5 ved hjelp av ca. 100 ng av totalt RNA som inngang. Når de dissosierer embryoer for sortering, bør man passe på å se dissosiasjonen under et mikroskop og slukke reaksjonen for å observere når enkeltceller oppnås. Vi finner at dissosiasjon av kranialregionen E8.5-E9.5 embryoer er nesten umiddelbar med mild manuell pipettering som beskrevet i protokollen. For større vev og stadig eldre embryoer kan dissosiasjonstiden være lengre avhengig av hvilken del av embryoet som blir dissosiert. For E7.5-E9.5 embryoer er klumper av celler lett synlige under mikroskopet, og dissosiasjonen skal fortsette til det ikke er flere klumper er synlige. Enkeltceller er synlige i løsningen hvis du justerer fokuset gjennom løsningen i brønnen din alt fra 5-10x. Tidligere metoder sorterer celler direkte inn i lysisbuffer for RNA-sekvensering for å forberede bulk RNA fra et lavt antall celler14. Her sorterer vi direkte inn i RNA utvinning lysis løsning slik at RNA kan isoleres før starten av biblioteket forberedelse. Bruk av minikolonner med 11 μL elutionvolum tillatt for en høy nok RNA-konsentrasjon slik at en enkelt RNA-prep kan deles mellom liten RNA og bulk RNA-sekvensering.
En nåværende begrensning av de fleste små RNA sekvensering metoder er PCR forsterkning av konvertert cDNA. Vår metode overvinner ikke denne begrensningen, men vi var i stand til å minimere antall PCR sykluser fra 25-maksimum anbefalt ned til 16 sykluser. Denne reduksjonen i forsterkning reduserer kunstig forsterkningsbias introdusert av PCR. En annen kilde til bias er ligation av adaptere, hvor det er kjent at bestemte sekvenser som ligger i endene av adaptere og miRNAs kan ligate sammen med større effektivitet enn andre sekvenser. For å unngå dette har adapterne som brukes i denne protokollen 4 tilfeldige baser innlemmet på slutten av hver adapter for å forhindre skjevhet i ligation reaksjoner. I tillegg er et annet vanlig problem mengden av kort dimers som danner når RNA-inndataene er lav. Bibliotekets forberedelsessett inkluderer trinn for å redusere adapterduserdannelse som adapteraktivering og perleopprydding for å fjerne overflødige adaptere etter hver ligation. Vi fortynnet også 3' og 5' 4N-adaptere med 1/4 for å redusere mengden adapterduser som kan dannes. Vi fant ut at når den ikke fortynnes, øker 130 bp-båndintensiteten, noe som gjør det vanskelig å skille fra 150 bp-båndet som inneholder de ønskede små RNA-bibliotekene på en gel.
En annen aktuell utfordring med å forberede sekvenseringsbiblioteker er nøyaktig kvantifisering av produktet før sekvensering. Vi har funnet ut at ulike metoder gir varierende resultater på samme bibliotek. Vi foreslår at forskerne bruker flere kvantifiseringsmetoder for å få en nøyaktig estimering av konsentrasjon.
Denne protokollen kan brukes mye på genetiske, utviklingsstudier eller andre anvendelser der RNA høstes fra et lavt antall celler. Denne tilnærmingen forenkler timelige studier ved å unngå pooling av embryoer og kan enkelt brukes på både ikke-sorterte og sorterte celler.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av Andrew McDonough B + Foundation og NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. er en CPRIT Scholar in Cancer Research (RR150106) og V Scholar in Cancer Research (V Foundation). Forfatterne ønsker også å anerkjenne Cytometry og Cell Sorting Core på BCM for å gi utstyr som er nødvendig for dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
- Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
- Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
- Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901 (2000).
- Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
- Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).
- Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
- Chugh, P., Dittmer, D. P.
- Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
- Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
- Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
- Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).
