Summary
Vi beskriver en teknik för profilering microRNAs i tidiga mus embryon. Detta protokoll övervinner utmaningen med låg cellinmatning och små RNA-anrikning. Denna analys kan användas för att analysera förändringar i miRNA uttryck över tiden i olika cell härstamningar av den tidiga musen embryot.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) är viktiga för den komplexa regleringen av cell öde beslut och utvecklingsmässiga timing. In vivo studier av bidraget av miRNAs under tidig utveckling är tekniskt utmanande på grund av det begränsande celltalet. Dessutom kräver många tillvägagångssätt att ett miRNA av intresse definieras i analyser som nordlig blotting, microarray och qPCR. Därför har uttrycket av många miRNAs och deras isoformer inte studerats under tidig utveckling. Här visar vi ett protokoll för små RNA sekvensering av sorterade celler från tidiga mus embryon för att möjliggöra relativt opartisk profilering av miRNAs i tidiga populationer av neurala crest celler. Vi övervinner utmaningarna med låg cellinmatning och storleksval under biblioteksberedningen med hjälp av förstärkning och gelbaserad rening. Vi identifierar embryonala ålder som en variabel redovisning av variation mellan replikat och steg-matchade mus embryon måste användas för att noggrant profil miRNAs i biologiska replikat. Våra resultat tyder på att denna metod i stort sett kan tillämpas på profil uttryck av miRNAs från andra härstamningar av celler. Sammanfattningsvis kan detta protokoll användas för att studera hur miRNAs reglerar utvecklingsprogram i olika cell härstamningar av den tidiga musen embryot.
Introduction
En central fråga i utvecklingsbiologin är hur en enda odifferentierad cell kan ge upphov till en hel organism med talrika komplexa celltyper. Under embryogenesen blir cellernas utvecklingspotential successivt begränsad när organismen utvecklas. Ett exempel är den neurala crest härstamning, som successivt skiljer från en multipotent cell befolkningen i olika terminal derivat, såsom perifera nervceller, glia, kraniala ben, och brosk. Neurala crest celler specificeras från ektodermen under gastrulation och sedan genomgå en epitelial till mesenchymal övergång och migrera genom embryot till diskreta platser i hela kroppen där de kommer att terminalt differentiera1. Årtionden av arbete har avslöjat en transkriptional gen reglerande nätverk, men mycket mindre är känt om mekanismerna för post-transkriptional reglering som styr tidpunkten för neurala crest utveckling.
Tidigare arbete tyder på att microRNAs (miRNAs) förtränga genuttryck för korrekt utvecklingsmässiga timing och cell beslut öde2,3,4,5,6. Studier av miRNAs i neurala crest utveckling har till stor del fokuserat på senare stadier av kraniofacial utveckling. Till exempel, miR-17 ~ 92 och miR-140 är kritiska för palatogenes under kraniofacial utveckling i mus och zebrafisk, respektive7,8. Bidraget av miRNAs till de tidigaste neurala crest öde beslut av embryot har inte undersökts grundligt. Studier av miRNAs i tidiga öde beslut har begränsats av tekniska utmaningar såsom det låga cellnummer som finns i tidiga embryon.
MiRNAs har profilerat in vitro från cellinjer med hjälp av embryoid organ i olika stadier av differentiering för att modellera tidig mus utveckling9. Undersökningen av små RNA in vivo under tidig däggdjursutveckling har varit relativt begränsad. Tidigare metoder för att profilera miRNAs har lett till partiskhet som en känd sekvens används för att analysera uttryck för en specifik miRNA i metoder som qPCR, microarrays och norra blots10. Nästa generations sekvensering och ständigt förbättrade molekylära verktyg möjliggör nu en relativt opartisk analys av miRNA-uttryck för att studera deras bidrag till tidig däggdjursutveckling och beslut om cellöde.
Här rapporterar vi en teknik för att skörda och sekvens små RNAs uttryckt i neurala crest celler från tidiga mus embryon som spänner gastrulation (E7.5) till början av organogenes (E9.5). Denna teknik är okomplicerad och kombinerar växling av härstamning, cellsortering och val av gelbaserad storlek för att förbereda små RNA-sekvenseringsbibliotek från ett minimalt antal celler för nästa generations sekvensering. Vi lyfter fram vikten för strikt somite skede matchning av embryon att lösa 6-timmars tidsintervall för att få en omfattande bild av miRNAs under de snabba förändringarna av tidig utveckling. Denna metod kan tillämpas i stor utsträckning på genetiska studier och utvecklingsstudier och undviker att samla embryon. Vi beskriver ett sätt att övervinna utmaningar av nuvarande metoder såsom miRNA anrikning med hjälp av gel-baserad rening, bibliotek kvantifiering, och minimera partiskhet som införts från PCR. Denna metod har använts för att identifiera miRNA uttryck mönster över tiden för att studera hur miRNAs kontroll utvecklingsmässiga timing i neurala krönet härstamning av mus embryon.
Protocol
All forskning och djur vård förfaranden godkändes av Baylor College of Medicine Institutionella Animal Care and Use kommittén och inrymt i Föreningen för bedömning och ackreditering av laboratorium Animal Care-godkända djur anläggning vid Baylor College of Medicine. Alla stammar bibehölls på C57BL6 bakgrund.
1. Embryo dissekering (E7.5-E9.5)
- Ta bort livmoderhorn från en gravid kvinnlig mus, sterilisera buken med 70% etanol där snittet ska göras.
- Rensa av livmodern genom att skölja med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Placera livmodern i en steril plast 10 cm maträtt.
- Med hjälp av mikrodissektion sax, separera varje decidua som innehåller region från varandra. Skala av livmodermuskeln och exponera alla deciduae. En efter en, ta bort decidua från varje embryo.
- Ta bort gulesäcken från varje embryo och spara för genotypning.
- Flytta alla embryon i en ny maträtt av färska PBS för bildbehandling.
- Ta en bild av hela kullen. Avbilda varje embryo för sig och räkna antalet somiter av varje embryo. Håll förstoringen och exponeringen (för fluorescens) densamma mellan experimenten.
OBS: Vi finner att 50-200 ms exponering är tillräcklig för fluorescens och att 20 ms är tillräcklig för ljusa fältinställning.
2. Embryo dissociation och cell sortering
- För varje embryo som ska sorteras från, gör följande.
- Halshugga strax ovanför otic placode för embryon äldre än E8.0 (om endast märkta celler i kranialregionen önskas). För E7.5 embryon, ta bort extraembryoniska strukturer (om bara embryot korrekt önskas).
- Flytta huvudet i en minimal volym PBS över till en ren brunn av en 48-brunnsplatta. Tillsätt 250 μL papain (27 U/mL). Pipett upp och ned försiktigt med hjälp av en p200.
- Kolla under mikroskopet och leta efter klumpar och enstaka celler.
- Upprepa mild pipettering upp och ner tills en enda cell suspension uppnås (vanligtvis tre omgångar pipettering upp och ner vilket bör motsvara mellan 30 s till 1 min för E7.5-E9.5).
- Släck med 250 μL av fetalt bovint serum (FBS).
- Upprepa steg 2.1.1-2.1.5 för varje embryo som skall sorteras.
- Filtrera 500 μL cell suspension genom en 35 μm nylon mesh filter lock röret för att ta bort klumpar.
- Ta filtratet och flytta till nya 1,5 mL rör och snurra på 200 x g i 5 min. Ta bort supernatant försiktigt och överför till nytt rör (spara tills levande celler är kända för att vara i pelleten).
- Resuspend cell pellet i 300 μL av PBS som innehåller 0,5-1% bovint serum albumin och hålla på is tills sortering (minimera tiden mellan nu och slutet av sortering).
- Om så önskas, ta 10 μL cell suspension och kombinera med 10 μL Trypan blå (0,4%) och räkna med hjälp av en hemocytometer för att identifiera ungefärlig cellkvantifiering och viabilitet som Trypan blå bara fläckar döda celler.
- Strax före sortering, filtrera varje prov igen genom ett filter lock rör och lägga TILL DAPI fläck för levande celler.
- Sortera varje prov i 500 μL RNA extraktionslyslösning (se Tabell över material) på cellsorterare med 70 μm munstycke.
- Blanda och förvara vid -80 °C tills alla prover skördas. Fortsätt från denna punkt endast när alla prover som behövs för ett experiment skördas för att minska den tekniska variationen mellan omgångar av biblioteksberedning.
3. RNA-utvinning
OBS: Protokollet är anpassat från RNA-isoleringssatsen; se Tabell över material.
- Tillsätt 500 μL RNA extraktionslyslösning (se Tabell över material) till varje prov för att göra den totala volymen 1000 μL.
- Tina varje prov i rumstemperatur.
- Vortexa varje prov i 1,5 min, se till att locket är säkert på varje rör innan homogenisering påbörjas. Inkubera homogenatet vid rumstemperatur (15–25 °C) i 5 min.
- Tillsätt 140 μL kloroform, kapsylrör säkert och skaka kraftigt i 15 s. Inkubera i rumstemperatur i 3 min.
- Centrifugera i 15 min vid 12 000 x g vid 4 °C. Överför den övre vattenfasen till ett nytt uppsamlingsrör på is. Överför inte någon interfas eller någon organisk fas. När man närmar sig den rosa organiska fasen, tippa röret till sidan och ta bort små alikvoter tills ingen tydlig vattenfas kan samlas in.
- Mät volymen RNA som innehåller vattenfas som samlats in från varje prov för korrekt beräkning i nästa steg.
- Tillsätt 1,5 volymer (vanligen 525 μL men kan vara något mer eller mindre) av 100% etanol och blanda noggrant genom pipettering.
- Pipett upp till 700 μL prov, inklusive eventuell fällning, till kolonn i ett 2 mL uppsamlingsrör. Stäng locket och centrifugen vid ≥ 8 000 x g i 15 s i rumstemperatur. Kassera genomflödet.
- Upprepa steg 3.8 med hjälp av återstoden av provet.
- Tvätta kolonnen enligt tillverkarens instruktioner. Torka kolonnen genom att snurra i full fart i 1 min. Överför kolonnen till ett nytt 1,5 mL uppsamlingsrör.
- Pipett 11 μL av nukleas fritt vatten på mitten av membranet. Låt sitta i rumstemperatur i 1 min. Snurra max hastighet i 1 min för att elera bort kolonnen.
- Mät RNA-koncentration med hjälp av en spektrofotometer och ett parallellt kapillärelektroforesinstrument (Table of Materials).
4. Biblioteksberedning
OBS: Protokollet är anpassat från små RNA bibliotek förberedelse kit handbok; se Tabell över material.
- Slutföra denaturering och 3' adapter ligatur som anges i den lilla RNA biblioteket förberedelse kit handboken med hjälp av 1/4 utspädning av 3 'adapter.
- Fortsätt till överskott 3'adapter borttagning.
- Slutföra adaptern utarmning som anges i den lilla RNA biblioteket förberedelse kit handboken. Var noga med att använda nyberedd 80% etanol för pärlarensningen och att all överskottsetanol avlägsnas helt strax före återfjädring i nukleasfritt vatten utan att pärlorna övertorkas (sprickbildning av pärlpellet observeras vid övertorkning).
- Fortsätt direkt till överskott adapter inaktivering.
- Fullborda överskottsadaptern inaktivering enligt vad som anges i den lilla RNA-biblioteket förberedelse kit handbok montering av alla reagenser på is.
- Fortsätt till 5' 4N adapter ligering.
- Komplett 5' adapter ligering som anges i den lilla RNA biblioteket förberedelse kit handbok är säker på att använda en 1 /4 utspädning av 5' adapter och montering av alla reagenser på is.
- Fortsätt till omvänd transkription.
- Komplett omvänd transkription-första strand syntes som anges i den lilla RNA biblioteket förberedelse kit handbok och var noga med att montera alla reagenser på is och inte hålla enzymet ur frysen under längre tidsperioder.
OBS: Vid denna punkt kan protokollet stoppas, med prover som förvaras över natten vid 4 °C. Alternativt fortsätta till PCR förstärkning. - Komplett PCR förstärkning genom att montera reagenserna som anges i små RNA bibliotek förberedelse kit handbok och minimera antalet PCR cykler. Antalet PCR-cykler bör bestämmas experimentellt för varje applicering och minsta antal cykler bör användas. Här använde vi 16 cykler för att framgångsrikt förstärka våra små RNA-bibliotek.
- Gå direkt till storleksval.
5. Storleksval
- Till varje prov, tillsätt 5 μL av 6x gel lastning färgämne och pipetten att blanda.
- Ladda 10 μL stege till gelens första brunn och lämna brunnen omedelbart till höger tom. Ladda alla av produkten från steg 5.1 på en 6% Tris/borat/etylendiaminetetraacetic syra – polyacrylamide gel (TBE-PAGE) och lämna 1 körfält i mellan varje prov.
OBS: Förvara behållaren som gelén kom in för efterföljande steg. - Kör gelen vid 150 V i ungefär 30-40 min i 0,5x TBE-rinnande buffert (tills det nedre färgämnesbandet är nära botten av gelén, 0,5-1 cm).
- Gör 1 L av färgningslösning medan gelen är igång: SYBR Gold utspätt 1:10,000 i 0,5x TBE.
- När gelen har kört klart (dvs. nedre färgämnesbandet är nära botten av gelén), ta försiktigt bort gelen från glasplattorna, och där man kan lägga till med orienteringen av gelen.
- Placera gel i brickan på dess originalförpackning. Ta bort 0,5x TBE och ersätt med infärgningslösningen från steg 5.5. Fläckgel i 15 min. Färgningstiden kan behöva ökas.
- Placera gelen på en UV-transilluminator, var noga med att inte rippa gelen och bibehålla orienteringen som noterats ovan (återfläcka för ytterligare tid om man inte tydligt kan se stegband).
- Bild gelen gång färgning är komplett på UV transilluminator med en kamera.
- Om en bättre bild krävs, använd först en annan avbildningsapparat än UV-transilluminatorn för att fånga en bild av gelen innan du skär ut banden på en UV-transilluminator som avbildning direkt på UV-transilluminatorn orsakar variabelfärgning av bakgrunden enligt figur 3A-B. Flytta inte gelén för många gånger eftersom den är känslig och kan riva.
- Identifiera och ta bort ~ 150 bp bandet med hjälp av en ren rakblad och placera i ren 1,5 mL rör. Skär inte ut ~130 bp-bandet (adapter dimer-produkten).
- Avbilda gelen igen efter att ha tagit bort de skivor som innehåller biblioteksprodukten i dokumentationssyfte.
- Snurra på mikrocentrifugrören som innehåller gelskivan med max hastighet i 30 s för att samla upp skivorna i botten av varje rör.
- Använd en p200-spets för varje prov för att krossa skivan av gel till minsta möjliga bitar. Mata ut varje spets i varje rör.
- Till varje rör, tillsätt 300 μL elueringsbuffert, var noga med att tvätta gelbits från sidan av röret och sätt tillbaka p200-spetsen och tvätta bort spetsen för varje prov.
- Placera elutingproverna i en skakinkubator inställd på 25 °C. Inkubera över natten med 1000 rpm skakningar. Ta bort rör från inkubator och snurra med max hastighet i 10 min vid rumstemperatur.
- Överför supernatanten som innehåller biblioteksprodukten till en 2 mL RNase-lycksalig 96 brunnsplatta. Var noga med att inte överföra någon gel.
- Tillsätt 50 μL rensning pärlor till varje prov och blanda genom pipettering. Omedelbart, tillsätt 350 μL isopropanol och blanda genom pipettering. Inkubera i rumstemperatur i 10 minuter med gungning.
- Pulsspinplåt till pelletspärlor och magnetisera sedan i 2 min. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten.
- Tillsätt 950 μL av 80% etanol. Inkubera i 30 s. Ta bort alla supernatant. Upprepa för totalt två etanoltvättar.
- Torka provet i 3 min. Vid detta steg noga med att ta bort eventuella kvarvarande etanol som samlar i botten av varje brunn (inte mer än en gång) och att inte övertorka pärlorna (övertorkning kommer att resultera i sprickbildning av pärla pelleten).
- Ta bort all kvarvarande vätska i botten av brunnen. Ta bort plattan från magnetstativ.
- Resuspend pelleten i 13 μL av resuspension buffert. Blanda genom pipetten tills homogen. Inkubera i 2 min och magnetisera sedan i 3 min.
- Överför 12 μL supernatant till ett rent rör eller brunn av ren platta för efterföljande lagring. Förvara alla provexemplar vid 4 °C över natten eller -20 °C lång sikt.
- Kontrollera storleken och koncentrationen av fragment som finns i varje bibliotek med hjälp av kapillärelektrofores hög känslighet DNA-analys. Bekräfta koncentrationen med mer än en metod.
OBS: Vi har då och då använt standardkänslighetssatsen för att undvika att överbelasta kapillärelektroforesen.
Representative Results
Med hjälp av det förfarande som demonstreras här har vi skördat embryon på E7.5, E8.5 och E9.5. Extraembryonska strukturer avlägsnades från alla embryon och sedan var embryon somite iscensatta för att lösa 6-timmars tidsintervaller (Bild 1A-1B). Med hjälp av principkomponentanalys för att gruppera prover baserat på likhet, finner vi att prover kluster efter ålder, belyser variationen som ett resultat av embryonala ålder och behovet av noggrann somite matchning för biologiska replikat (Figur 1C). Vi profilerade pluripotent epiblast vid E7.5, härstamning spåras premigratory och flyttande neurala crest celler med hjälp av Wnt1-Cre på E8.5 och flyttande neurala crest celler med hjälp av Sox10-Cre på E9.5 (Figur 1D). Här skördar vi specifikt hjärnskålen neurala krönet genom halshuggning embryot strax ovanför otic placode. En jämförelse av de två Cre-drivrutiner (Wnt1 och Sox10) som ofta används för att märka neurala crest celler bekräftar de markerar olika populationer i tidiga mus embryon (Figur 1E). Gating strategier användes för att få levande enda RFP positiva celler som sorterades direkt i RNA extraktionslys lösning (se Tabell of Materials) och lagras vid -80 °C (Figur 1F). Det är viktigt att hålla reda på hur många celler som skördats från varje prov.
RNA-isolering utfördes med hjälp av en modifierad version av RNA-kit-protokollet. Specifikt använder vi mini RNA-kolumnerna som ska lagras vid 4 °C. Dessa kolumner är användbara för eluting i en liten volym (11 μL) för att få den högsta möjliga koncentrationen av RNA från prover där cellinmatningen är begränsande. Av samma anledning är det viktigt att få alla vattenfasen efter fenol kloroform extraktion. Långsam pipettering och luta röret åt ena sidan medan insamling är avgörande för att maximera avkastningen. I detta förfarande kvantifierar vi RNA med hjälp av både en spektrofotometer, för att få information om salt/proteinförorening, och en kapillärelektrofores för att mäta koncentration (Figur 2). Spektrofotometern spår visar att RNA var isolerade med någon förorenande proteiner men har hög salthalt (Figur 2A-2B). Helst 260/280 förhållandet bör vara ~ 1,8 och 260/230 förhållandet bör vara >2,0. Den totala RNA-avkastningen mätt med spektrofotometern ökade inte med åldern mellan E8,5-E9.5. Detta beror på att spektrofotometerns upplösning inte är tillräckligt känslig för att detektera förändringar i RNA-koncentration från antalet celler som vi skördar, och vi rekommenderar att man använder den koncentrationsinformation som erhålls från kapillärelektroforesen (figur 2C). Kapillärelektroforesspåret kan användas för att uppskatta koncentrationen och storleken på RNA-fragmenten. Toppar <1000 nukleotider är ett tecken på nedbrytning. Den representativa spårningen överensstämmer med RNA som inte bryts ned. Toppar på 2000 nukleotider och 5100 nukleotider är 18s och 28s rRNA, respektive. Den lilla RNA-regionen ligger på ~150 nukleotider (Figur 2D).
Små RNA-sekvenseringsbibliotek förbereddes med hjälp av det lilla RNA-bibliotekets prep-kit som beskrivs i materialförteckningen. Här använder vi knappt hälften av det RNA som erhålls från varje prov (4 μL av 11 μL-elueringen, ~80-120 ng) som gör det möjligt att syntetisera RNA från varje prov. Här späder vi ut 3' och 5' små RNA-adaptrarna 1/4 för att sänka mängden adapter dimers närvarande och föreslår att adaptern ligering, rensning och omvänd transkription steg är klar så mycket som möjligt på ett kontinuerligt sätt. Vi har använt 16 PCR cykler för att förstärka biblioteken och föreslå att det minsta antalet PCR cykler för alla experiment vara empiriskt bestämda. Vid att avsluta överskott PCR cyklar, kunde en konstgjort blåsa upp den lästa räkningen av ett lowly uttryckt miRNA.
Storleksval är absolut nödvändigt att berika för bibliotek av miRNAs och inte adapter dimers, som vanligtvis är närvarande. Bibliotekets produktstorlek (150 bp) och adapterdynaser (130 bp) är mycket lika stora. Gelutsug används för att isolera de små RNA-sekvenseringsbiblioteken bort från adapterns dimrar (Bild 3). En bild av en PAGE-gel före excision visar att en mängd produktstorlekar finns i varje prov (Bild 3A). Det är viktigt att lämna ett körfält öppet mellan två prov eller en stege som lastas på gelen. Flyttningsfronten i gelens nederkant är något böjd vilket indikerar att det kan vara nödvändigt att köra med en långsammare hastighet om 150 bp-bandet är svårt att urskilja för alla prover. Denna representativa bild visar också ett överflöd av 150 bp produkt från den högre koncentrationen av positiv kontroll RNA (totalt RNA från hjärnan hos en råtta) som gick in i biblioteket prep jämfört med den som gick in i varje embryonalt prov. Den negativa kontrollen avslöjar att reagenserna var fria från förorenande nukleinsyraarter (Figur 3A). Excision av 150 bp bandet bör göras med ett rent rakblad och det område som samlas visas i figur 3B. Kapillärelektrofores spår före och efter storleksval visar den dramatiska förbättringen av renheten hos 150 bp biblioteket produkt med gel rening (Figur 3C-3D). Det är viktigt att notera att spåren i figur 3C-3D har provtoppar högre än markörerna, som tyder på överbelastning. I dessa fall kan storleken på fragmenten vara korrekt, men koncentrationen kan inte. Kvantifiering kan erhållas genom att späda ut biblioteken i markörernas omfång eller med hjälp av alternativa metoder. Vi finner en viss variation över alternativa metoder för bibliotekets kvantifiering och rekommenderar att flera metoder för kvantifiering empiriskt testas. Exakt kvantifiering av koncentrationen är väsentlig när man maximerar antalet prover som ska sekvenserades på en gång. Bibliotek kommer att spädas ner till 1,3 pM för sekvensering och i allmänhet var som helst från 15-25 prover kan sekvenseras på en gång på en 150 cykel sekvensering kit som ger ~ 140 miljoner läsningar. Detta resulterar i cirka 5 miljoner läsningar per prov. Generellt kartläggning priser är mellan 60-80%.
Figur 1: Skörda celler från musembryon för små RNA-sekvensering. (A) E8.5 mus embryo för att belysa avlägsnandet av gulesäcken och somiter som används för att bestämma stadiet av embryot (B) Somite iscensättning av musembryon för att fånga stadierna av neurala crest utveckling (C) Princip komponentanalys av bibliotek prepped från sorterade wildtype neurala crest celler visar att prover grupp efter ålder (D) Schematisk visar hur prover skördades med hjälp Wnt1-Cre på E8.5 för att märka pre label pre label migreratory och flyttande neurala crest celler och Sox10-Cre på E9.5 att märka endast flyttande neurala crest celler (E) Principkomponent analys av bibliotek prepped från sorterade wildtype neurala crest celler visar prover grupp tillsammans genom Cre-driver oavsett ålder (F) Gating strategi som används för att isolera RFP + neurala crest celler från E8.5 och E9.5 embryon med hjälp av FACS sortering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: RNA-isolering från E7.5-E9.5-musembryon. (A) Representativ spektrofotometer spår av en RNA-isolering från den yngsta etappen av embryot som vi har tillämpat detta protokoll. (B) Tabell som visar de representativa värden för RNA-kvalitet som erhållits från spektrofotometern. (C) Exempel på RNA skördas från sorterade neurala crest celler från embryon i varje ålder (D) Kapillärelektrofores spår visar god kvalitet RNA. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: miRNA-bibliotek före och efter storleksval. (A) TBE-PAGE gel som visar representativa små RNA-bibliotek för fyra prover och kontroller före och (B) efter 150 bp band excision. Pilarna representerar 150 bp bandet som skall strukits (C) Kapillärelektrofores spår av små RNA bibliotek före och (D) efter storleksval. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Utvecklingsprocesser kan gå snabbt, och celler genomgår många sekventiella specifikationer så att fånga en omfattande bild av miRNAs bidrar till tidiga öde beslut, mer specifik iscensättning behövs än den allmänt använda halvdag steg. En nyligen genomförd studie har utfört RNA sekvensering från Theiler steg 12 embryon som sträcker sig från att ha 3 till 6 somites11. Vi finner att under denna tidsperiod, de neurala crest cellerna anges (3 somites av ålder), delaminate (4 somites av ålder), och migrera (5-6 somites av ålder). Vi finner också att förutom Cre-föraren som används för att härstamning spårcell populationer, ålder är den största källan till variation mellan biologiska prover, och endast somite matchade embryon bör betraktas som replikat. Detta bör också beaktas vid jämförelse av transgena embryon med kontroller av vildtyp.
Tidigare metoder för att profilera miRNAs under tidig utveckling har använt mellan 10-100 ng av RNA-ingång för små RNA-sekvensering bibliotek beredning och har poolat flera embryon i ett prov13,14. Vi visar RNA isolering och bibliotek beredning från en enda E7.5 embryo eller från sorterade neurala crest celler vid E8.5 och E9.5 med hjälp av cirka 100 ng av totala RNA som ingång. Vid dissociating embryon för sortering, bör man noga med att titta på dissociation under ett mikroskop och släcka reaktionen att observera när enstaka celler erhålls. Vi finner att dissociation av hjärnskålen regionen E8.5-E9.5 embryon är nästan omedelbar med skonsam manuell pipettering som beskrivs i protokollet. För större vävnader och allt äldre embryon kan dissociationstiden vara längre beroende på vilken del embryots del som dissocieras. För E7.5-E9.5 embryon, klumpar av celler är väl synliga under mikroskopet och dissociationen bör fortsätta tills inga fler klumpar syns. Enstaka celler syns i lösning om du justerar fokus genom lösningen i din brunn var som helst från 5-10x. Tidigare metoder sortera celler direkt i lysbuffert för RNA-sekvensering för att prep bulk-RNA från ett lågt antal celler14. Här sorterar vi direkt in i RNA extraktionslyslösning så att RNA kan isoleras innan biblioteksberedningen påbörjas. Användning av minikolonner med 11 μL elueringsvolym tillåten för en tillräckligt hög RNA-koncentration så att en enda RNA-prep kunde delas mellan små RNA och bulk-RNA-sekvensering.
En nuvarande begränsning av de flesta små RNA-sekvenseringsmetoder är PCR-förstärkningen av konverterad cDNA. Vår metod inte övervinna denna begränsning, men vi kunde minimera antalet PCR cykler från 25-maximalt rekommenderas ner till 16 cykler. Denna minskning av förstärkning minskar artificiell förstärkning bias infördes av PCR. En annan källa till bias är ligering av adaptrar, där det är känt att specifika sekvenser som ligger i ändarna av adaptrar och miRNAs kan ligate tillsammans med större effektivitet än andra sekvenser. För att undvika detta, de adaptrar som används i detta protokoll har 4 slumpmässiga baser införlivas i slutet av varje adapter för att förhindra partiskhet i ligation reaktioner. Dessutom är ett annat vanligt problem mängden adapter-dimers som bildas när RNA-indata är låg. Biblioteket förberedelse kit innehåller åtgärder för att minska adapter dimer formation såsom adapter inaktivering och pärla rensningar för att ta bort överskottsadaptrar efter varje ligering. Vi spädde också 3' och 5 ' 4N adaptrar med 1 / 4 för att minska mängden adapter dimer som kan bildas. Vi fann att när den inte späds, 130 bp bandet intensitet ökar gör det svårt att skilja från 150 bp bandet som innehåller de önskade små RNA-bibliotek på en gel.
En annan aktuell utmaning att förbereda sekvensering bibliotek är korrekt kvantifiering av produkten före sekvensering. Vi har funnit att olika metoder ger varierande resultat på samma bibliotek. Vi föreslår att forskarna använder flera metoder för kvantifiering för att få en korrekt uppskattning av koncentrationen.
Detta protokoll kan tillämpas allmänt på genetiska, utvecklingsmässiga studier, eller andra tillämpningar där RNA skördas från ett lågt antal celler. Detta tillvägagångssätt förenklar tidsstudier genom att undvika sammanslagning av embryon och kan enkelt tillämpas på både icke-sorterade och sorterade celler.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt stöddes av Andrew McDonough B + Foundation och NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. är CPRIT Scholar i cancerforskning (RR150106) och V Scholar in Cancer Research (V Foundation). Författarna vill också erkänna Cytometry och cellsortering Core på BCM för att tillhandahålla utrustning som behövs för detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
- Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
- Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
- Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901 (2000).
- Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
- Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).
- Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
- Chugh, P., Dittmer, D. P.
- Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
- Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
- Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
- Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).
