Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

رصد بقاء فيروس الأنفلونزا خارج المضيف باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي

Published: February 20, 2021 doi: 10.3791/61133
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2,3
1Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Institut Pasteur, Unité Environnement et Risques Infectieux, Cellule d'Intervention Biologique d'Urgence (CIBU), 3Cellule Pasteur, Université de Paris

Summary

تم الإبلاغ هنا عن بروتوكول لقياس كمية الجسيمات الفيروسية المعدية باستخدام المراقبة في الوقت الفعلي للمعاوقة الكهربائية للخلايا المصابة. يتم تقديم تطبيق عملي لهذه الطريقة عن طريق تحديد مقدار تحلل فيروس الأنفلونزا A تحت معايير فيزيائية كيميائية مختلفة تحاكي الظروف البيئية.

Abstract

تمثل طرق قياس كمية جسيمات الفيروس جانبا حاسما في العديد من دراسات علم الفيروسات. على الرغم من وجود العديد من التقنيات الموثوقة ، إلا أنها إما تستغرق وقتا طويلا أو غير قادرة على اكتشاف الاختلافات الصغيرة. يظهر هنا بروتوكول لتحديد كمي دقيق للعيار الفيروسي من خلال تحليل اختلافات المعاوقة الكهربائية للخلايا المصابة في الوقت الفعلي. يتم قياس المعاوقة الخلوية من خلال أجهزة الاستشعار الحيوية للقطب الدقيق الذهبي الموجودة تحت الخلايا في الصفائح الدقيقة ، والتي يعتمد حجمها على عدد الخلايا وكذلك حجمها وشكلها. يسمح هذا البروتوكول بالتحليل في الوقت الفعلي لانتشار الخلايا وقابليتها للحياة والتشكل والهجرة مع حساسية محسنة. كما يقدم مثال على تطبيق عملي من خلال تحديد مقدار اضمحلال فيروس الأنفلونزا A (IAV) المقدم إلى مختلف المعلمات الفيزيائية والكيميائية التي تؤثر على العدوى الفيروسية بمرور الوقت (أي درجة الحرارة والملوحة ودرجة الحموضة). وبالنسبة لمثل هذه التطبيقات، يقلل البروتوكول من عبء العمل اللازم مع توليد بيانات كمية دقيقة لجسيمات الفيروسات المعدية. يسمح بمقارنة المنحدرات المعطلة بين مختلف IAV ، مما يعكس قدرتها على الاستمرار في بيئة معينة. هذا البروتوكول سهل التنفيذ ، وهو قابل للتكرار بشكل كبير ، ويمكن تطبيقه على أي فيروس ينتج تأثيرات cytopathic في زراعة الخلايا.

Introduction

يعتمد انتقال الفيروس على مزيج من عدة عوامل. بالنسبة للفيروس الذي يفرز في البيئة ، يعتمد انتقاله أيضا على القدرة على الاستمرار في ظروف خارج المضيف. ولذلك، فإن دراسة التعطيل الفيروسي بشكل عام هي خطوة حاسمة في مساعدة السلطات الصحية الوطنية وواضعي السياسات على تنفيذ تدابير المكافحة والسلامة الأحيائية.

زادت المعرفة حول استمرار الفيروس في البيئات الطبيعية والمختبرية بشكل كبير خلال العقد الماضي. وفي حالة فيروسات الأنفلونزا ألف، تخضع طرق انتقالها الجسيمات الفيروسية لمجموعة واسعة من الظروف البيئية. وعلى وجه التحديد، يمكن أن تنتقل عن طريق 1) الطرق البرازية الفموية عبر الماء (أي فيروسات الطيور)، أو 2) الاتصال المباشر أو غير المباشر عن طريق البؤر الملوثة، وكذلك الهباء الجوي وقطرات الجهاز التنفسي (أي فيروسات الدواجن والثدييات)1. على أي حال ، يتم تقديم IAV إلى مختلف المعلمات الفيزيائية والكيميائية (أي الرقم الهيدروجيني والملوحة ودرجة الحرارة والرطوبة) ، والتي تؤثر بسرعة إلى حد ما على عدواها 2،3،4،5،6،7،8،9. ومن الأهمية بمكان، لا سيما فيما يتعلق بالفيروسات الحيوانية المنشأ والفيروسات الوبائية، تقييم إمكانات العوامل البيئية في التأثير على ديناميات الفيروس ومخاطر التعرض له وانتقاله عبر الأنواع.

وحتى الآن، استخدمت تقنيات علم الفيروسات التقليدية (أي تحديد عيار الفيروس من خلال مقايسات اللويحات أو تقدير الجرعات المعدية لزراعة الأنسجة بنسبة 50 في المائة) لتقييم عدوى فيروس نقص المناعة البشرية بمرور الوقت؛ لكن هذه التقنيات تستغرق وقتا طويلا وتتطلب العديد من الإمدادات10،11،12. يعد قياس مقاومة الخلايا المصابة بمرور الوقت باستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة بمثابة أداة مفيدة لمراقبة بقاء IAV في ظروف بيئية مختلفة ، وكذلك تعطيل الفيروس بشكل عام. توفر هذه الطريقة بيانات موضوعية في الوقت الفعلي تحل محل الملاحظة البشرية الذاتية لتأثيرات اعتلال الخلايا. ويمكن استخدامه لتحديد معايرة الفيروسات، وبالتالي استبدال القياسات التقليدية بفترات ثقة أقل وتجنب مقايسات نقاط النهاية كثيفة العمالة.

توجد علاقة خطية بين نتائج المعايرة بالتحليل الحجمي التي تم الحصول عليها عن طريق قياس مقاومة الخلايا وطرق فحص البلاك الكلاسيكية أو TCID50. لذلك ، يمكن تحويل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة المعايرة بالتحليل الحجمي القائمة على المعاوقة بسهولة في قيم TCID50 أو pfu عن طريق إنشاء منحنى قياسي مع التخفيف التسلسلي للفيروس13،14،15،16،17. يمكن أيضا تحقيق الكشف عن الأجسام المضادة المحايدة الموجودة في عينات المصل وتحديدها كميا وفعاليتها باستخدام هذا النهج التجريبي18,19. وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام الفحوصات الخلوية القائمة على المعاوقة لفحص وتقييم المركبات المضادة للفيروسات ضد فيروسات الهربس ألفا المكافئة20.

وقد استخدمت هذه التكنولوجيا لتقييم ثبات ال IAVs في المياه المالحة عند درجات حرارة مختلفة وتحديد الطفرات في الهيماجلوتينين من IAV التي تزيد أو تقلل من ثبات IAV في البيئة21. وسيتطلب هذا الفحص عملا مكثفا إذا ما استخدم أساليب المعايرة بالتحليل الحجمي التقليدية. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذه المنهجية لأي فيروس له تأثير على مورفولوجيا الخلية ورقم الخلية وقوة ارتباط سطح الخلية. ويمكن أيضا أن تستخدم لمراقبة الثبات في مختلف الظروف البيئية (أي في الهواء أو في الماء أو على الأسطح).

البروتوكول الموصوف هنا يطبق بقاء IAV في الماء كمثال. تتعرض فيروسات الأنفلونزا البشرية لمعلمات فيزيائية كيميائية مختلفة خلال فترات طويلة. تم اختيار المياه المالحة (35 جم/لتر كلوريد الصوديوم) عند 35 درجة مئوية كنموذج بيئي بناء على النتائج السابقة9. يتم تحديد العدوى المتبقية للفيروسات المكشوفة كميا في نقاط زمنية مختلفة من خلال عدوى الخلايا. يتم زرع خلايا MDCK ، وهي نوع الخلية المرجعية لتضخيم IAV ، على 16 لوحة ميكروتيتر جيدة مغلفة بأجهزة استشعار microelectrode ومصابة بالفيروسات المكشوفة بعد 24 ساعة. يتم قياس مقاومة الخلية كل 15 دقيقة ويتم التعبير عنها كوحدة عشوائية تسمى مؤشر الخلية (CI). آثار اعتلال الخلايا التي يسببها فيروس الأنفلونزا ، الذي يعتمد معدل ظهوره بشكل مباشر على عدد الجسيمات الفيروسية المعدية التي تم تلقيحها إلى مزرعة الخلايا ، يؤدي إلى انخفاض CI ، والذي يتم تحديده لاحقا كميا على أنه قيمة CIT50. تتوافق هذه القيمة مع الوقت اللازم لقياس انخفاض بنسبة 50٪ من CI الأولي (أي قبل إضافة الفيروس). تسمح قيم CIT50 المحسوبة لعدة أوقات التعرض البيئي بخصم ميل تعطيل الفيروس بعد الانحدار الخطي لقيم CIT50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

التعامل مع جميع فيروسات الأنفلونزا وفقا لمتطلبات مستوى السلامة الأحيائية المناسبة (BSL-2 أو أعلى اعتمادا على النوع الفرعي). استخدم سلالات IAV ذات تاريخ مرور منخفض (أقل من 5x على خلايا MDCK) لضمان تباين منخفض بين التجارب.

1. إعداد الكواشف والمواد الأولية

  1. تحضير خلايا MDCK ووسط زراعة الخلايا المعقمة
    1. زراعة خلايا كلية الكلاب في مدينة داربي (MDCK) في وسط النسر المعدل (MEM) المكمل بمصل ربلة الساق الجنينية المعطل بالحرارة (FCS) والمضادات الحيوية (100 وحدة / مل البنسلين ، 100 ملغ / مل ستربتومايسين).
    2. بعد ذوبان الجليد ، تمر خلايا MDCK على الأقل 2x قبل إصابتها لضمان الشفاء التام (ولكن أقل من 30 ممرا لتجنب أي انجراف في الأنماط الظاهرية للخلايا).
    3. بذور 75 سم 2 قارورة (قوارير) زراعة الأنسجة التي تحتوي على 30 مل من 1x MEM معقمة مع 7.5 × 106 خلايا MDCK وحضانت عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 الرطبة 5٪.
  2. إعداد معدات مراقبة المعاوقة
    1. ضع الأداة في الحاضنة عند 35 درجة مئوية واتركها تسخن لمدة 2 ساعة على الأقل.
    2. قم بتوصيله بوحدة التحكم الموضوعة خارج الحاضنة.
    3. انتقل إلى إجراءات التنظيف على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة قبل البدء في ما تبقى من التجربة.
  3. إنتاج مخزونات IAV على خلايا MDCK
    1. لنشر وتضخيم فيروسات H1N1 ، قم بزرع خلايا MDCK 7.5 × 106 على قارورتين من زراعة الأنسجة 75 سم 2 واحتضنها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية للوصول إلى التقاء 90٪ -100٪.
    2. صب وسط زراعة الخلية من الطبقة الأحادية الخلية في قوارير 75 سم 2 . اغسل الخلايا ب 5 مل من 1x PBS المعقمة.
    3. قم بإزالة PBS وإضافة 5 مل من 1x PBS لغسل الخلايا مرة أخرى.
    4. قم بتسمية قارورة واحدة كعنصر تحكم وإزالة PBS قبل إضافة 15 مل من وسائط انتشار الفيروسات (1x MEM مع 0٪ FCS) بعناية على الطبقة الأحادية. احتضن هذه القارورة في حاضنة يتم الحفاظ عليها عند 35 درجة مئوية مع 5٪ CO2. استخدمه للمقارنة بعد 3 أيام من الانتشار.
    5. قم بإذابة قارورة واحدة من مخزون IAV في RT. قم بتخفيف الفيروس إلى التركيز المناسب في أنبوب 1.5 مل يحتوي على وسائط انتشار الفيروس (1x MEM مع 0٪ FCS).
    6. قم بإزالة 1x PBS من قارورة 75 سم 2 وإصابة خلايا MDCK بتعدد العدوى (MOI) من 1 × 10-3 أو 1 × 10-4 وحدات تشكيل لوحة لكل خلية (pfu / خلية) عن طريق إضافة 1 مل من الفيروس المخفف إلى الطبقة الأحادية الخلية.
    7. امتزاز الفيروس إلى خلايا MDCK لمدة 45 دقيقة في RT عن طريق تحريك القارورة بانتظام كل 15 دقيقة.
    8. قم بإزالة اللقاح بلطف وإضافة 15 مل من وسائط انتشار الفيروس لكل قارورة تحتوي على 1 ميكروغرام / مل TPCK-trypsin (التربسين / L-1-tosylamide-2-phenylethyl chloromethyl ketone) ، لشق الهيماجلوتينين الفيروسي HA0 إلى وحدات فرعية HA1 و HA2 (وهو حدث مطلوب لاندماج HA مع الغشاء الداخلي وإطلاق الجينوم الفيروسي)22.
    9. احتضان القوارير عند 35 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 3 أيام على الأقل لتكرار الفيروس.
    10. راقب خلايا MDCK تحت المجهر عند تكبير 40x وابحث عن تأثيرات اعتلال الخلايا (CPE) على الخلايا (من خلال مقارنتها بقارورة التحكم في الخلية). إذا لم يكن CPE مكتملا (أي أن حوالي 80٪ من الخلايا منفصلة عن الركيزة) ، فضع القوارير مرة أخرى في الحاضنة لمدة 24 ساعة إضافية.
    11. عند اكتمال CPE ، قم بصب السوبرنات الفائق لزراعة الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 10 دقائق لتكسير الحطام الخلوي.
    12. انقل المادة الفائقة الواضحة إلى أنبوب 15 مل وفيروسات ذرية أليكوت إلى قوارير مبردة معقمة تستخدم لمرة واحدة. ضع أنابيب التبريد على الفور عند -80 درجة مئوية لتجميد الفيروسات وتخزينها.

2. تحديد كمية الخلايا المناسبة لإصابة الخلايا

ملاحظة: أثناء جميع التجارب، احتفظ باللوحات على الأسطح غير الكهروستاتيكية في جميع الأوقات، مثل لفائف الورق من العبوة. اتبع القسم 2 أدناه لتحديد أنسب تركيز للخلايا المراد زرعها في لوحة microtiter الإلكترونية (المصممة على أنها E-Plate).

  1. قم بإعداد خلايا MDCK في قوارير 75 سم 2 للحصول على خلايا منقسمة حديثا (حوالي 80٪ التقاء) قبل 24 ساعة من التجربة.
  2. اغسل الخلايا ب 5 مل من 1x PBS وافصلها عن طريق إضافة 3 مل من محلول Trypsin-EDTA بنسبة 0.25٪.
  3. أضف 7 مل من وسط زراعة الخلايا الطازجة وعد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي مع تلطيخ أزرق تريبان.
  4. اضبط تركيز الخلية على 400000 خلية / مل باستخدام وسائط زراعة الخلايا. إجراء تخفيفات تسلسلية مزدوجة في أنابيب إضافية للحصول على كثافات خلية تبلغ 200000 ؛ 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; و 6250 خلية / مل. اضبط نطاق تخفيف الخلايا وفقا لنوع الخلية وسلوك نموها.
  5. اترك اللوحة الإلكترونية (جدول المواد) في RT لعدة دقائق وأضف 100 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. لا تلمس أقطاب اللوحة الإلكترونية.
  6. افتح الحوامل وأدخل الواجهة الأمامية لللوحة في جيب المهد لأداة قياس المعاوقة (جدول المواد). أغلق باب الحاضنة.
  7. افتح البرنامج.
    1. في "إعداد نمط التجربة الافتراضي"، اختر المهد (المهدات) المحدد وانقر نقرا مزدوجا على الصفحة العلوية، ثم أدخل اسم التجربة. انقر فوق "تخطيط" وأدخل معلومات العينة اللازمة لكل بئر محدد من اللوحة ؛ ثم انقر فوق "تطبيق" عند الانتهاء. انقر فوق "جدولة" | | "الخطوات" "إضافة خطوة". يضيف البرنامج تلقائيا خطوة من 1 ثانية لقياس مقاومة الخلفية (CI).
    2. انقر فوق "ابدأ / متابعة" في علامة التبويب "تنفيذ". انقر فوق "مؤامرة" ، وأضف جميع العينات عن طريق اختيار الآبار المناسبة ، وتأكد من أن CI بين -0.1 و 0.1 قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
  8. قم بإزالة اللوحة من المهد.
  9. أضف 100 ميكرولتر من كل تعليق خلوي من الخطوة 2.4 في تكرار إلى الآبار المناسبة و 100 ميكرولتر من وسائط الخلايا في الآبار المستخدمة كعناصر تحكم. اترك اللوحة E في غطاء التدفق الرقائقي لمدة 30 دقيقة في RT للسماح بتوزيع موحد للخلايا في قيعان الآبار.
  10. أدخل اللوحة E في جيب المهد. انقر فوق "جدولة" | "إضافة خطوة" في البرنامج وإدخال قيم لمراقبة الخلايا كل 30 دقيقة ل 200 تكرار. ثم حدد "ابدأ / متابعة".
  11. تحقق من بيانات CI ورسمها بالنقر فوق الزر "مؤامرة" في البرنامج. حدد تركيز الخلايا التي تكون قبل المرحلة الثابتة مباشرة 24 ساعة بعد البذر على اللوحة ، من أجل الحصول على الخلايا التي لا تزال في مرحلة النمو أثناء العدوى الفيروسية. يتم الوصول إلى المرحلة الثابتة عندما يكون CI في الحد الأقصى.

3. العلاقة بين قيم CIT50 وتعدد العدوى

  1. أضف 100 ميكرولتر من وسط ثقافة MEM 1x المعقم في كل بئر من اللوحة E. أدخل اللوحة الإلكترونية في جيب المهد للأداة عند 35 درجة مئوية. قم بقياس الخلفية كما هو موضح في الخطوة 2.7.
  2. قم بإزالة اللوحة E من المهد.
  3. البذور 3 × 104 من خلايا MDCK المنقسمة حديثا على كل بئر من لوحة microtiter الإلكترونية وتنمو لمدة 24 ساعة عند 35 درجة مئوية مع 5٪ CO2 بحيث تكون في مرحلة النسخ المتماثل أثناء عدوى IAV.
  4. إصابة خلايا MDCK بتخفيفات مختلفة بمقدار 10 أضعاف من عيار 6 log10 TCID50/mL المعروف لفيروس H1N1 ، باستخدام السحب العكسي للتكاثر باتباع الخطوات التالية:
    1. شطف خلايا MDCK 2x مع 100 ميكرولتر من MEM مع عدم وجود FCS (وسائط انتشار الفيروسات). كن على دراية بإزالة جميع الوسائط بعد الغسيل الثاني لتجنب المزيد من التخفيف من اللقاح.
    2. أضف 100 ميكرولتر من التعليق الفيروسي في كل بئر باستخدام ماصة أحادية القناة. لتجنب التلوث ، تابع بالبدء من اليسار إلى اليمين ثم من أعلى إلى أسفل في اللوحة ، مع تغطية الآبار المتبقية بالغطاء.
    3. أدخل اللوحة في جيب المهد للأداة عند 35 درجة مئوية. كن لطيفا لتجنب الحركات المفاجئة التي قد تؤدي إلى التلوث.
    4. ابدأ في مراقبة مقاومة الخلايا كل 15 دقيقة خلال 100 ساعة على الأقل كما هو موضح في الخطوة 2.10.
    5. بعد دورتي القياسات (أي 30 دقيقة) ، أوقف الجهاز مؤقتا بالنقر فوق "إيقاف مؤقت" في علامة التبويب "تنفيذ" وإزالة اللوحة E من المهد.
    6. أضف 1 ميكروغرام / مل TPCK-trypsin إلى وسائط انتشار الفيروس لشق الهيماجلوتينين الفيروسي.
    7. أضف 100 ميكرولتر من وسائط انتشار الفيروسات التي تحتوي على TPCK-trypsin في كل بئر وأدخل اللوحة E في جيب المهد.
    8. انقر فوق "ابدأ / متابعة" في علامة التبويب "تنفيذ".
      ملاحظة: لا تنس إنشاء عنصر تحكم سلبي يتوافق مع الخلايا المصابة الوهمية عن طريق استبدال التعليق الفيروسي بوسائط انتشار الفيروس.

4. حركية البقاء على قيد الحياة IAV

  1. تعريض IAV للمياه المقطرة المالحة عند 35 درجة مئوية واختبار عدواها بمرور الوقت عن طريق قياس انخفاض مقاومة الخلايا.
    1. تحضير الماء المقطر الملحي عن طريق إضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي من 35 جم / لتر في الماء المقطر. أضف 900 ميكرولتر من المياه المالحة إلى 2 مل من أنابيب التبريد.
    2. أضف 100 ميكرولتر من المخزون الفيروسي في المياه المالحة وضع أنابيب التبريد في حاضنة (35 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 1 ساعة أو 24 ساعة أو 48 ساعة.
    3. بذور 100 ميكرولتر (تحتوي على 3 × 104) من خلايا MDCK المنقسمة حديثا على لوحة ميكروتيتر 16 بئر وتنمو لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    4. إصابة الخلايا ب 100 ميكرولتر من الفيروسات المكشوفة (المخففة سابقا 10x في وسائط الزرع) باستخدام طريقة السحب العكسي للتكاثر عن طريق تكرار القسم 3.4.
  2. راقب مقاومة الخلايا كل 15 دقيقة لمدة 100 ساعة على الأقل.

5. تقييم فقدان العدوى

  1. تحديد قيم CIT50 لقياس انخفاض CI بسبب تأثيرات اعتلال الخلايا الناجمة عن الفيروس مع قيمة CIT50 .
    1. انقر فوق "مؤامرة" وأضف جميع العينات بالنقر فوق "إضافة الكل". تصدير النتائج إلى جدول بيانات بالنقر فوق "تصدير معلومات التجربة". النظر في CI الأولي كقيمة مقاومة خلوية تقاس بعد 5 ساعات من إصابة الخلايا بالفيروسات المكشوفة (أي 24 ساعة بعد بذر خلايا MDCK على لوحة E-plate microtiter).
    2. احسب قيمة CIT50 المقابلة للوقت اللازم لقياس انخفاض بنسبة 50٪ عن CI الأولي. لحساب قيمة CIT50 ، لاحظ قيمة CI عند 5 hpi لكل عينة. ثم ابحث عن النقطة الزمنية التي تساوي فيها قيمة CI نصف قيمة CI عند 5 hpi باستخدام دالات الفهرس والمطابقة في جدول البيانات.
  2. حساب متوسط ميل التعطيل
    1. حدد قيم CIT50 لكل تعليق فيروسي مكشوف ، في أوقات تعرض مختلفة (بالأيام).
    2. احسب ميل الانحدار الخطي من القيم المرسومة CIT50، والتي يشار إليها باسم منحدر التعطيل ويتم التعبير عنها في CIT50.day-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البيانات الخام التي تم الحصول عليها بعد 120 ساعة بتركيزات مختلفة من خلايا MDCK ، من 15000 إلى 120000 خلية لكل بئر ، موضحة في الشكل 1. بعد 24 ساعة ، تظهر مقاييس CI أن الخلايا في الآبار المزروعة ب 30000 خلية كانت لا تزال في المرحلة الأسية للنمو ، وتم استخدام تركيز الخلية هذا لمزيد من التجارب. يوضح الشكل 2 العلاقة الخطية بين قيم CIT50 والتعدد الأولي للعدوى. يتم استزراع خلايا MDCK لمدة 24 ساعة ، ثم تصاب بسلالة فيروسية A/Paris/2590/2009 H1N1 في تعدد مختلف من العدوى. يتم قياس CI الأولي بعد 5 ساعات من الإصابة.

يوضح الشكل 3 الإجراء التجريبي المستخدم في تجاربنا (اللوحة A). تظهر النتائج النموذجية التي تظهر انخفاض CI بسبب تأثير اعتلال الخلايا الناجم عن الفيروس على اللوحة B. هذه هي البيانات الخام التي تم الحصول عليها بعد معالجتها بواسطة البرنامج. تم حساب قيم CIT50 باستخدام جدول البيانات بعد تصدير البيانات. بعد حساب قيم CIT50 في نقاط زمنية مختلفة ، سمح تحليل الانحدار الخطي بتحديد الميل (اللوحة C). وهكذا تم الحصول على منحدرات تعطيل فيروسية لكل فيروس في كل حالة ، ثم تمت مقارنتها لتحديد الفيروسات التي تتمتع بأكبر قدر من الاستقرار في البيئة المدروسة.

ويبين الشكل 4 المنحدرات المعطلة للفيروسات المؤتلفة IAV التي تحمل العمود الفقري الوراثي الذي ينتمي إلى سلالة الفيروس A/WSN/1933 H1N1 و HA و NA من فيروس A/New Caledonia/20/1999 H1N1 (HA-NA/NC99). تم إدخال طفرات غير مترادفة في HA لدراسة التأثير على ثبات جسيمات الفيروس خارج المضيف في المياه المالحة.

من خلال مقارنة متوسط منحدرات التعطيل من تجارب مختلفة أجريت في ثلاثة أضعاف ، تمكنا من تحديد الأحماض الأمينية في HA التي كانت كافية للتأثير على الثبات الفيروسي خارج المضيف. كلما انخفض منحدر التعطيل ، كلما كان الفيروس أكثر استقرارا. وكمثال على ذلك، أدى استبدال HA/F453Y أو إدراج HA::K147 في HA لفيروس HA-NA/NC99 إلى زيادة كبيرة في متوسط منحدر التعطيل إلى 9.8 CIT50/day و 9.9 CIT50/day، على التوالي، مقارنة بالنوع البري HA (بمتوسط ميل تعطيل يبلغ 4.85 CIT50/day)، وبالتالي توليد طفرات غير مستقرة للغاية. وعلى النقيض من ذلك، لم يؤثر استبدال HA/T327A على الاستقرار الفيروسي عند 35 درجة مئوية في المياه المالحة (متوسط ميل التعطيل 6.6 CIT50/day). وبالتالي كانت المنهجية قوية بما يكفي لتحديد بقايا الأحماض الأمينية في البروتين السكري HA التي كانت تشارك في بقاء IAV خارج المضيف.

Figure 1
الشكل 1: معايرة الخلايا في اللوحة الإلكترونية ميكروتيتر.
تم زرع التخفيفات التسلسلية لخلايا MDCK على لوحات E-plates microtiter ، وتم مراقبة نمو الخلايا لمدة تصل إلى 100 ساعة (200 عملية مسح كل 30 دقيقة). تمثل النقاط الرمادية الانحرافات المعيارية ل CI المقاسة في نسختين. يبرز الخط الرأسي عند 24 ساعة أنه في الظروف الموصوفة ، سمح البذر الأولي ل 3 × 104 خلايا / بئر بزراعة حوالي 70٪ من الالتقاء في وقت الإصابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الانحدار الخطي بين قيم CIT50 والتعدد الأولي للعدوى.
تشير كل نقطة إلى قيمة CIT50 المحسوبة لإصابة الخلايا بمضاعفات مختلفة للعدوى. يمثل الخط الصلب ميل الانحدار الخطي (R2 = 0.99) ، وتمثل الخطوط المتقطعة فترات الثقة 95٪. وقد عدل هذا الرقم من منشور سابق(21). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحديد منحدر التعطيل.
(أ) تم تخفيف الجسيمات الفيروسية في المياه المالحة عند 35 درجة مئوية لمدة 0 أو 1 أو 2 أيام ، وتم رصد CI بشكل مستمر ورسمه كمؤشر خلوي. (ب) انخفاض CI كميا مع قيم CIT50 ، والتي يتم تمثيلها يدويا على البيانات الخام بواسطة خطوط متقطعة رأسية. يمثل كل منحنى تطور مقاومة الخلايا بعد الإصابة بالفيروسات التي تعرضت للمياه المالحة لأوقات متزايدة (الأحمر: الفيروس غير المكشوف ، الأصفر: التعرض 24 ساعة ، الأخضر: التعرض 48 ساعة ، الظلام: الخلايا المصابة الوهمية). تم قياس CI الأولي بعد 5 ساعات من العدوى (C) الانحدار الخطي لقيم CIT50 المستخدمة لحساب منحدر التعطيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تأثير الطفرات غير المترادفة في HA على ثبات IAV في المياه المالحة.
المنحدرات المعطلة للفيروسات المعاد تشكيلها التي تحمل HA من فيروس A/New Caledonia/20/1999 H1N1 مع (استبدال أو إدخال) أو بدون طفرة (HAWT). عرضت مخططات الصندوق توزيع منحدرات تعطيل واحدة (ستة أو ثمانية اعتمادا على الفيروس ، محسوبة من تجارب مستقلة مختلفة) تم الحصول عليها لكل فيروس مكشوف حول المتوسط (الخطوط الأفقية). تمت مقارنة متوسط منحدرات التعطيل باستخدام اختبار ANOVA (ns، p > 0.05، ****p < 0.0001). المرجع يتوافق مع الفيروس المعاد تشكيله الذي يحمل النوع البري HA ، والذي تتم مقارنة الفيروسات الأخرى به. وقد عدل هذا الرقم من منشور سابق(21). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RTCA هي تقنية قائمة على المعاوقة تستخدم بشكل متزايد لمراقبة خصائص الخلايا في الوقت الفعلي ، مثل التصاق الخلايا وانتشارها وهجرتها وسميتها الخلوية. في هذه الدراسة ، يتم إثبات قدرة هذه التكنولوجيا على تقييم بقاء IAV خارج المضيف من خلال قياس ميل تعطيل الفيروس. يتم استبدال التقنيات السريعة مثل TCID50 واختبارات البلاك بتقييم موضوعي في الوقت الفعلي لصلاحية الخلية ، مما يعكس تأثيرات اعتلال الخلايا التي يسببها الفيروس. على غرار TCID50 أو وحدة تشكيل البلاك (pfu) ، يرتبط CIT50 خطيا أيضا بتعدد العدوى (الشكل 2). من بين قيود هذا النهج ، تفشل هذه الطريقة في مراقبة الخلايا المصابة بفيروس غير مسبب للخلايا بدقة.

وكمثال على ذلك، فإن إدخال طفرة جديدة في الجينوم الفيروسي يمكن أن يخفف بقوة من الفيروس ويقلل من إمراضه الخلوية. وعلى النقيض من ذلك، فإن منحدر التعطيل المحسوب هنا مستقل عن تكاثر الفيروس وتوهين محتمل للفيروس، حيث أن هذا المنحدر مشتق من قيم CIT50 التي تم قياسها بعد نقاط زمنية مختلفة لتعطيل نفس الفيروس. هنا ، من المفترض أن الجسيمات الفيروسية التي لا تزال قادرة على إصابة الخلية بعد بروتوكول التعطيل هذا تشترك في نفس النمط الظاهري للتكرار مثل الفيروسات قبل التعطيل.

وعلى الرغم من ارتفاع التكاليف، فإن عبء العمل الذي يستخدم هذا النهج ينخفض إلى حد كبير، وهو أمر مفيد عندما يتطلب المشروع أداء الحركية، مع قياس النقاط الزمنية المتكررة وعلى مدى فترة طويلة من الزمن. كما هو الحال في كل بروتوكول ، تعتبر بعض الخطوات حاسمة ، ويجب إجراء التلاعب بعناية ودقة. يعد السحب العكسي خطوة حاسمة لضمان التوزيع الدقيق للوسائط ، ويجب إيلاء اهتمام خاص لتجنب أي تلوث. وبالمثل ، يجب أن تكون كمية الخلية الأولية هي نفسها بين كل تجربة ويجب تقييمها باستخدام عداد خلية آلي مع تلطيخ أزرق تريبان. أثناء مراقبة CI بواسطة الجهاز ، يجب أن يكون فتح الحاضنة محدودا قدر الإمكان.

إذا تم توفير الرعاية والاهتمام أثناء التجربة بحركة محدودة ، فإن خطر التلوث يصبح منخفضا ، وتكون النتائج قابلة للتكرار بشكل كبير. يختلف توزيع منحدرات التعطيل بين الفيروسات المختلفة اختلافا كبيرا ، لذلك يتم استخدام اختبار إحصائي غير بارامتري لمقارنة استمرار الفيروس. يمكن حساب متوسط منحدرات التعطيل لأي فيروسات تنتج تأثيرات اعتلال الخلايا في زراعة الخلايا ، مثل الفيروسات المعوية أو فيروس الإيبولا أو الفيروسات التاجية ، التي يتم حاليا دراسة استمرارها في الظروف البيئية (ومن المحتمل أن تستخدم طرق علم الفيروسات التقليدية). في المستقبل ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لمقارنة تكرار الفيروسات المختلفة ، والتحقيق في استوائية الفيروس لعدة خطوط خلوية في نفس الوقت ، ودراسة خطوات محددة من دورة الفيروس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25%Trypsin ThermoFisher 25200056
75 cm2 tissue culture flask Falcon 430641U
E-Plate 16 (6 plates) ACEA Biosciences, Inc 5469830001 E-plates are avalible in different packaging
FCS Life technologies (gibco) 10270-106
MEM 1X Life technologies (gibco) 31095029
PBS 1X Life technologies (gibco) 14040091
Penicillin-Streptomycin Life technologies (gibco) 11548876
TPCK-Trypsin Worthington LS003740
xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 ACEA Biosciences, Inc 380601310 The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, Suppl 2 42-51 (2013).
  2. Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
  3. Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
  4. Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
  5. Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
  6. Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
  7. Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
  8. Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 1 Suppl 285-289 (2007).
  9. Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
  10. Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments. , Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020).
  11. Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
  12. Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
  13. Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
  14. Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
  15. Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
  16. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  17. Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
  18. Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
  19. Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
  20. Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
  21. Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
  22. Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 168، فيروس الأنفلونزا أ، الاستمرارية، تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي، التعطيل الفيروسي، التأثير المسبب للأمراض الخلوية، القياس الكمي الفيروسي
رصد بقاء فيروس الأنفلونزا خارج المضيف باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Labadie, T., Grassin, Q.,… More

Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. C., Leclercq, I. Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (168), e61133, doi:10.3791/61133 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter