Summary
Rapportert her er en protokoll for kvantifisering av smittsomme viruspartikler ved hjelp av sanntidsovervåking av elektrisk impedans av infiserte celler. En praktisk anvendelse av denne metoden presenteres ved å kvantifisere influensa Et virus forfaller under forskjellige fysisk-kjemiske parametere som etterligner miljøforhold.
Abstract
Metoder for viruspartikkel kvantifisering representerer et kritisk aspekt av mange virologistudier. Selv om det finnes flere pålitelige teknikker, er de enten tidkrevende eller ute av stand til å oppdage små variasjoner. Presentert her er en protokoll for presis kvantifisering av viral titer ved å analysere elektriske impedansvariasjoner av infiserte celler i sanntid. Cellulær impedans måles gjennom gullmikroelrode biosensorer som ligger under cellene i mikroplater, hvor størrelsen avhenger av antall celler samt deres størrelse og form. Denne protokollen tillater sanntidsanalyse av celleproliferasjon, levedyktighet, morfologi og migrasjon med forbedret følsomhet. Også gitt er et eksempel på en praktisk anvendelse ved å kvantifisere forfallet av influensa Et virus (IAV) sendt til ulike fysisk-kjemiske parametere som påvirker viral infektivitet over tid (dvs. temperatur, saltholdighet og pH). For slike applikasjoner reduserer protokollen arbeidsmengden som trengs, samtidig som den genererer presise kvantifiseringsdata for smittsomme viruspartikler. Det tillater sammenligning av inaktiveringsbakker blant forskjellige IAV, noe som gjenspeiler deres evne til å vedvare i gitt miljø. Denne protokollen er enkel å utføre, er svært reproduserbar, og kan brukes på ethvert virus som produserer cytopatiske effekter i cellekulturen.
Introduction
Overføringen av et virus er avhengig av kombinasjonen av flere faktorer. For et virus som utskilles i miljøet, avhenger overføringen også av evnen til å vedvare under forhold utenfor verten. Å studere viral inaktivering generelt er derfor et avgjørende skritt for å hjelpe nasjonale helsemyndigheter og beslutningstakere med å iverksette kontroll- og biosikkerhetstiltak.
Kunnskapen om virusvarighet i naturlige og laboratoriemiljøer har økt betydelig det siste tiåret. Når det gjelder influensa A-virus (IAV), sender overføringsrutene deres virale partikler til et bredt spekter av miljøforhold. Spesielt kan de overføres via 1) fekal-orale ruter gjennom vann (dvs. fuglevirus), eller 2) direkte eller indirekte kontakt med forurensede fiender, samt aerosoler og respiratoriske dråper (dvs. fjærfe og pattedyrvirus)1. I alle fall sendes IAV til ulike fysisk-kjemiske parametere (dvs. pH, saltholdighet, temperatur og fuktighet), som mer eller mindre raskt påvirker deres infektivitet2,3,4,5,6,7,8,9. Det er av stor betydning, spesielt når det gjelder zoonotiske og pandemivirus, å vurdere potensialet for miljøfaktorer for å påvirke virusdynamikken og risikoen for eksponering og overføring på tvers av arter.
Så langt har tradisjonelle virologiteknikker (dvs. viral titerbestemmelse gjennom plakkanalyser eller 50% vevskultur smittsom doseestimering) blitt brukt til å vurdere IAV-infektivitet over tid; men disse teknikkene er tidkrevende og krever mange forsyninger10,11,12. Måling av infiserte celler impedans over tid med mikroelektroder fungerer som et nyttig verktøy for å overvåke IAV-overlevelse under forskjellige miljøforhold, samt viral inaktivering generelt. Denne metoden gir objektive sanntidsdata som erstatter subjektiv menneskelig observasjon av cytopatiske effekter. Den kan brukes til å bestemme virustitrering, og dermed erstatte tradisjonelle målinger med lavere konfidensintervaller og unngå arbeidsintensive endepunktanalyser.
Det er en lineær korrelasjon mellom titreringsresultater oppnådd ved måling av celleimpedans og ved klassiske plakkanalyse- eller TCID50-metoder. Derfor kan data oppnådd med impedansbasert titreringsmetode enkelt transformeres i TCID50- eller pfu-verdier ved å skape en standardkurve med seriell fortynning av viruset13,14,15,16,17. Deteksjon, kvantifisering og effekt av nøytraliserende antistoffer tilstede i serumprøver kan også oppnås ved hjelp av denne eksperimentelle tilnærmingen18,19. Mer nylig har impedansbaserte cellulære analyser blitt brukt til å screene og evaluere antivirale forbindelser mot Equid alfaherpesvirus20.
Denne teknologien har blitt brukt til å evaluere utholdenheten til IAVer i saltvann ved forskjellige temperaturer og for å identifisere mutasjoner i hemagglutinin av IAV som øker eller reduserer IAV-utholdenhet i miljøet21. Slik screening vil kreve omfattende arbeid ved bruk av tradisjonelle titreringsmetoder. Denne metodikken kan imidlertid brukes for alle virus som har innvirkning på cellemorfologi, cellenummer og celleoverflatefestestyrke. Den kan også brukes til å overvåke utholdenhet under ulike miljøforhold (dvs. i luften, i vann eller på overflater).
Protokollen beskrevet her gjelder IAV-overlevelse i vann som eksempel. Humane influensavirus blir utsatt for forskjellige fysisk-kjemiske parametere i lengre perioder. Saltvann (35 g/L NaCl) ved 35 °C ble valgt som miljømodell basert på tidligere resultater9. Gjenværende infektivitet av eksponerte virus kvantifiseres på forskjellige tidspunkter gjennom celleinfeksjon. MDCK-celler, referansecelletypen for IAV-forsterkning, er sådd på 16 brønnmikrotiterplater belagt med mikroelektrodesensorer og infisert av eksponerte virus 24 timer senere. Celleimpedans måles hvert 15. Cytopatiske effekter indusert av influensaviruset, hvis utbruddshastighet avhenger direkte av antall smittsomme viruspartikler inokulert til cellekulturen, fører til CI-reduksjon, som senere kvantifiseres som CIT50-verdien . Denne verdien tilsvarer tiden som er nødvendig for å måle en reduksjon på 50 % fra den første KI-en (dvs. før virustilsetning). CIT50-verdier beregnet for flere miljøeksponeringstider tillater fradrag av inaktiveringshellingen av et virus etter lineær regresjon av CIT50-verdier .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Håndter alle influensavirus i henhold til passende krav til biosikkerhetsnivå (BSL-2 eller høyere, avhengig av undertypen). Bruk IAV-stammer med lav passasjehistorikk (mindre enn 5x på MDCK-celler) for å sikre lav variasjon mellom eksperimenter.
1. Tilberedning av reagenser og startmaterialer
- Fremstilling av MDCK-celler og sterilt cellekulturmedium
- Dyrk Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler i modifisert Eagles medium (MEM) supplert med 10% varme inaktivert fosterkalv serum (FCS) og antibiotika (100 enheter / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin).
- Etter opptining, passasje MDCK celler minst 2x før smitte dem for å sikre fullstendig utvinning (men mindre enn 30 passasjer for å unngå drift i celle fenotyper).
- Frø 75 cm2 vevskulturflaske(er) som inneholder 30 ml steril 1x MEM med 7,5 x 106 MDCK-celler og inkuberer ved 37 °C i fuktet 5 % CO2-inkubator .
- Utarbeidelse av impedansovervåkingsutstyr
- Plasser instrumentet i inkubatoren ved 35 °C og la det varmes opp i minst 2 timer.
- Koble den til kontrollenheten som er plassert utenfor inkubatoren.
- Fortsett til rengjøringsprosedyrene som anbefalt av produsenten før du starter resten av eksperimentet.
- Produksjon av IAV-aksjer på MDCK-celler
- For å forplante og forsterke H1N1-virus, frø 7,5 x 106 MDCK-celler på to 75 cm2 vevskulturflasker og inkubere i 24 timer ved 37 ° C for å nå 90% - 100% samløp.
- Dekanter cellekulturmediet fra cellemonolayeren i 75 cm2 kolber. Vask cellene med 5 ml steril 1x PBS.
- Fjern PBS og tilsett 5 ml 1x PBS for å vaske cellene igjen.
- Merk en kolbe som kontroll og fjern PBS før du legger til 15 ml virusutbredelsesmedier (1x MEM med 0% FCS) forsiktig på monolayeren. Inkuber denne kolben i en inkubator opprettholdt ved 35 °C med 5 % CO2. Bruk den til sammenligning etter 3 dager med forplantning.
- Tine ett hetteglass med IAV-lager ved RT. Fortynn viruset til riktig konsentrasjon i et 1,5 ml rør som inneholder virusutbredelsesmedier (1x MEM med 0% FCS).
- Fjern 1x PBS fra 75 cm2 kolbe og infiser MDCK-celler ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 1 x 10-3 eller 1 x 10-4 plakkdannende enheter per celle (pfu / celle) ved å legge til 1 ml av det fortynnede viruset til cellemonolayeren.
- Adsorbvirus til MDCK-celler i 45 min ved RT ved å røre kolben regelmessig hvert 15.
- Fjern inokulumet forsiktig og tilsett 15 ml virusutbredelsesmedier per kolbe som inneholder 1 μg/ml TPCK-trypsin (trypsin/L-1-tosylamide-2-fenylet hylgrometyl keton), for å spalte viral hemagglutinin HA0 i HA1 og HA2 underenheter (en hendelse som kreves for HA-fusjon med endosommembranen og frigjøring av viral genom)22.
- Inkuber kolbeene ved 35 °C og 5 % CO2 i minst 3 dager for å gjenskape viruset.
- Følg MDCK-celler under et mikroskop ved 40x forstørrelse og se etter cytopatiske effekter (CPE) på cellene (ved å sammenligne med cellekontrollflasken). Hvis CPE ikke er komplett (dvs. rundt 80% av cellene er løsrevet fra substratet), legg kolbeene tilbake i inkubatoren i ytterligere 24 timer.
- Når CPE er fullført, dekanterer du cellekulturens supernatant og sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter for å pelletse det cellulære avfallet.
- Overfør den klargjorte supernatanten til et 15 ml rør og aliquot avkomvirus til engangs sterile kryogene hetteglass. Plasser straks kryorørene ved -80 °C for å fryse og lagre virus.
2. Bestemmelse av passende cellemengde for infeksjon av celler
MERK: Under alle eksperimenter må platene alltid holdes på ikke-elektrostatiske overflater, for eksempel papirinnpakningen fra emballasjen. Følg avsnitt 2 nedenfor for å finne den mest hensiktsmessige konsentrasjonen av celler som skal sås i den elektroniske mikrotiterplaten (designet som E-Plate).
- Forbered MDCK-celler i 75 cm2 kolber for å oppnå nydelte celler (ca. 80% samløp) 24 timer før eksperimentet.
- Vask celler med 5 ml 1x PBS og løsne dem ved å tilsette 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA-løsning.
- Tilsett 7 ml fersk cellekulturmedium og tell celler ved hjelp av en automatisert celleteller med trypan blå flekker.
- Juster cellekonsentrasjonen til 400 000 celler/ml med cellekulturmedier. Utfør to ganger seriell fortynning i ekstra rør for å oppnå celletetthet på 200.000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; og 6250 celler/ml. Juster fortynningsområdet til cellene i henhold til celletypen og deres vekstatferd.
- La E-platen (Materialbord) stå på RT i flere minutter og tilsett 100 μL cellekulturmedier til hver brønn ved hjelp av en flerkanals pipette. Ikke berør elektrodene på E-platen.
- Lås opp holderne og sett platens fremre ende inn i vuggelommen på impedansmålingsinstrumentet (Materialbord). Lukk døren til inkubatoren.
- Åpne programvaren.
- I "Standard oppsett av eksperimentmønster" velger du de valgte holderne og dobbeltklikker på den øverste siden, og deretter skriver du inn navnet på eksperimentet. Klikk på "Layout" og skriv inn nødvendig eksempelinformasjon for hver valgte brønn på platen; Klikk deretter på "Bruk" når du er ferdig. Klikk på "Planlegg" | "Trinn" | "Legg til et trinn". Programvaren legger automatisk til et trinn på 1 s for å måle bakgrunnsimpedansen (CI).
- Klikk på "Start / Fortsett" i "Kjør" -fanen. Klikk på "Plot", legg til alle prøver ved å velge de aktuelle brønnene, og sørg for at CI er mellom -0,1 og 0,1 før du går videre til neste trinn.
- Fjern platen fra holderen.
- Tilsett 100 μL av hver celleoppheng fra trinn 2,4 i duplikat til de aktuelle brønnene og 100 μL cellemedier i brønner som brukes som kontroller. La E-platen stå i laminær strømningshette i 30 min ved RT for å muliggjøre jevn fordeling av cellene i bunnen av brønnene.
- Sett E-platen inn i holderlommen. Klikk på "Planlegg" | "Legg til trinn" i programvaren og skriv inn verdier for å overvåke celler hvert 30. Velg deretter "Start / Fortsett".
- Sjekk og plott CI-dataene ved å klikke på "Plot" -knappen i programvaren. Velg konsentrasjonen av celler som er like før den stasjonære fasen 24 timer etter sådd på platen, for å oppnå celler som fortsatt er i en voksende fase under virusinfeksjon. Stasjonær fase nås når KI er på sitt maksimale.
3. Korrelasjon mellom CIT50-verdier og multiplisitet av infeksjon
- Tilsett 100 μL sterilt 1x MEM-kulturmedium i hver brønn på E-platen. Sett E-plate inn i holderlommen på instrumentet ved 35 °C. Mål bakgrunnen som beskrevet i trinn 2.7.
- Fjern E-platen fra holderen.
- Frø 3 x 104 av nysplittede MDCK-celler på hver brønn av den elektroniske mikrotiterplaten og vokse dem i 24 timer ved 35 °C med 5 % CO2 , slik at de er i en replikerende fase under IAV-infeksjon.
- Infiser MDCK-celler med forskjellige 10 ganger fortynninger av en kjent 6 log10 TCID50/ml titer av H1N1-virus, ved hjelp av omvendt pipettering for reproduserbarhet ved å følge trinnene nedenfor:
- Skyll MDCK-cellene 2x med 100 μL MEM uten FCS (virusutbredelsesmedier). Vær oppmerksom på å fjerne alle medier etter den andre vasken for å unngå ytterligere fortynning av inokulumet.
- Tilsett 100 μL viral suspensjon i hver brønn ved hjelp av enkanals pipette. For å unngå forurensning, fortsett med å starte fra venstre mot høyre og deretter topp til bunn i platen, mens du dekker de resterende brønnene med lokket.
- Sett platen inn i holderlommen på instrumentet ved 35 °C. Vær forsiktig for å unngå plutselige bevegelser som potensielt fører til forurensninger.
- Begynn å overvåke celleimpedans hvert 15.
- Etter de to syklusene med målinger (dvs. 30 min), stans apparatet midlertidig ved å klikke på "Pause" i "Utfør" -fanen og fjern E-platen fra holderen.
- Tilsett 1 μg/ml TPCK-trypsin i virusutbredelsesmediet for å spalte viral hemagglutinin.
- Tilsett 100 μL virusutbredelsesmedier som inneholder TPCK-trypsin i hver brønn, og sett E-platen inn i vuggelommen.
- Klikk på "Start / Fortsett" i "Kjør" -fanen.
MERK: Ikke glem å lage en negativ kontroll som tilsvarer mock-infiserte celler ved å erstatte viral suspensjon med virusutbredelsesmedier.
4. IAV overlevelse kinetikk
- Utsett IAV for saltvann destillert vann ved 35 °C og test for deres infektivitet over tid ved å måle celleimpedansreduksjonen.
- Forbered saltvann destillert vann ved å legge NaCl til en endelig konsentrasjon på 35 g / l i destillert vann. Tilsett 900 μL saltvann i 2 ml kryorør.
- Tilsett 100 μL viral bestand i saltvann og legg kryorørene i en inkubator (35 °C, 5 % CO2) i 1 t, 24 timer eller 48 timer.
- Frø 100 μL (inneholder 3 x 104) nydelte MDCK-celler på en 16 brønn mikrotiterplate og vokser i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Infiser celler med 100 μL eksponerte virus (tidligere fortynnet 10x i kulturmedier) ved hjelp av omvendt pipetteringsmetode for reproduserbarhet ved å gjenta avsnitt 3.4.
- Overvåk celleimpedans hvert 15.
5. Evaluering av tap av infektivitet
- Bestemmelse av CIT50-verdier for å kvantifisere CI-reduksjon på grunn av virusinduserte cytopatiske effekter med CIT50-verdien .
- Klikk på "Plot" og legg til alle eksemplene ved å klikke på "Legg til alle". Eksporter resultatene til et regneark ved å klikke på "Eksporter eksperimentinformasjon". Vurder første CI som cellulær impedansverdi målt 5 timer etter celleinfeksjon ved eksponerte virus (dvs. 24 timer etter sådd av MDCK-celler på mikrotiter E-platen).
- Beregn CIT50-verdien som tilsvarer den nødvendige tiden for å måle en 50 % reduksjon fra den første KI-en. Hvis du vil beregne CIT50-verdien , noterer du ci-verdien til 5 hpi for hvert utvalg. Deretter finner du tidspunktet der CI-verdien er lik halvparten av CI-verdien ved 5 hpi ved hjelp av indeks- og samsvarsfunksjonene i regnearket.
- Beregning av gjennomsnittlig inaktiveringshelling
- Bestemme CIT50-verdier for hver eksponerte virusfjæring, på forskjellige eksponeringstider (i dager).
- Beregn en lineær regresjonshelling fra de inntegnede CIT50-verdiene, referert til som inaktiveringshellingen og uttrykt i CIT50.day-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rådata innhentet etter 120 timer med ulike konsentrasjoner av MDCK-celler, fra 15 000 til 120 000 celler per brønn, er vist i figur 1. Etter 24 timer viser CI-tiltak at celler i brønner sådd med 30.000 celler fortsatt var i den eksponentielle vekstfasen, og denne cellekonsentrasjonen ble brukt til videre eksperimenter. Figur 2 illustrerer den lineære sammenhengen mellom CIT50-verdier og den første multiplisiteten av infeksjon. MDCK-celler dyrkes i 24 timer, deretter smittet med A / Paris / 2590 / 2009 H1N1 virusstamme ved en annen multiplisitet av infeksjon. Første KI måles 5 timer etter infeksjon.
Figur 3 illustrerer den eksperimentelle prosedyren som brukes i våre eksperimenter (panel A). Typiske resultater som viser CI-reduksjon på grunn av virusindusert cytopatisk effekt er vist på panel B. Dette er rådata innhentet etter å ha blitt behandlet av programvaren. CIT50-verdier ble beregnet ved hjelp av regnearket etter eksport av dataene. Etter beregning av CIT50-verdier på forskjellige tidspunkter tillot en lineær regresjonsanalyse bestemmelse av hellingen (panel C). Virale inaktiveringsbakker ble dermed oppnådd for hvert virus i hver tilstand, og ble deretter sammenlignet med å identifisere virus som hadde størst stabilitet i det studerte miljøet.
Figur 4 viser inaktiveringsskråninger av IAV-rekombinante virus med en genetisk ryggrad som tilhører viruset A/WSN/1933 H1N1 og en HA og NA fra A/New Caledonia/20/1999 H1N1-viruset (HA-NA/NC99). Ikke-synonyme mutasjoner i HA ble introdusert for å studere virkningen på viruspartikkelvarighet utenfor verten i saltvann.
Ved å sammenligne gjennomsnittlige inaktiveringsbakker fra ulike eksperimenter utført i triplikat, kunne vi identifisere aminosyrer i HA som var tilstrekkelige til å påvirke viral utholdenhet utenfor verten. Jo lavere inaktiveringsbakken er, jo mer stabilt er viruset. Som et eksempel, HA/F453Y-substitusjonen eller HA::K147-innsettingen i HA-NA/NC99-viruset førte til en betydelig økning i gjennomsnittlig inaktiveringshelling til henholdsvis 9,8 CIT50/dag og 9,9 CIT50/dag, sammenlignet med villtype HA (med en gjennomsnittlig inaktiveringshelling på henholdsvis 4,85 CIT50/dag), og dermed generere svært ustabile mutanter. TIL sammenligning påvirket ikke HA/T327A-substitusjonen virusstabilitet ved 35 °C i saltvann (gjennomsnittlig inaktiveringshelling på 6,6 CIT50/dag). Metodikken var dermed kraftig nok til å identifisere aminosyrerester i HA-glykoproteinet som var involvert i IAV-overlevelse utenfor verten.
Figur 1: Celletitrering i mikrotiter E-plate.
Serielle fortynninger av MDCK-celler ble sådd på mikrotiter E-plater, og cellevekst ble overvåket i opptil 100 timer (200 feier hver 30. min). Grå prikker representerer standardavvikene for KI målt i duplikat. Den vertikale linjen ved 24 h fremhever at ved de beskrevne forholdene tillot første såing av 3 x 104 celler / brønn en kultur på rundt 70% samløp på infeksjonstidspunktet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Lineær regresjon mellom CIT50-verdier og første multiplisitet av infeksjon.
Hvert punkt indikerer CIT50-verdien beregnet for infeksjon av celler med forskjellige multiplikasjoner av infeksjon. Den heltrukne linjen representerer den lineære regresjonshellingen (R2 = 0,99), og stiplede linjer representerer konfidensintervallene på 95 %. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bestemmelse av inaktiveringshelling.
(A) Virale partikler ble fortynnet i saltvann ved 35 °C i 0, 1 eller 2 dager, og CI ble overvåket kontinuerlig og plottet som celleindeks. (B) CI reduserer kvantifisert med CIT50-verdiene, som representeres manuelt på rådataene av vertikale stiplede linjer. Hver kurve representerer utviklingen av celleimpedans etter infeksjon med virus som ble utsatt for saltvann i økende tider (rød: ikke-eksponert virus, gul: 24 timers eksponering, grønn: 48 h eksponering, mørk: mock-infiserte celler). Første KI ble målt 5 timer etter infeksjon (C) Lineær regresjon av CIT50-verdier som brukes til å beregne inaktiveringshellingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Virkningen av ikke-synonyme mutasjoner i HA på IAV-utholdenhet i saltvann.
Inaktiveringsbakker av reassorterende virus med HA fra A/New Caledonia/20/1999 H1N1-virus med (substitusjon eller innsetting) eller uten mutasjon (HAWT). Boxplots viste fordelingen av enkle inaktiveringsbakker (seks eller åtte avhengig av viruset, beregnet fra forskjellige uavhengige eksperimenter) oppnådd for hvert eksponert virus rundt gjennomsnittet (horisontale linjer). Gjennomsnittlige inaktiveringsbakker ble sammenlignet med en ANOVA-test (ns, p > 0,05, ****p < 0,0001). Ref tilsvarer reassortantviruset som bærer wildtype HA, mot hvilke andre virus sammenlignes. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RTCA er en impedansbasert teknologi som i økende grad brukes til sanntidsovervåking av celleegenskaper, for eksempel celletilslutning, spredning, migrasjon og cytotoksisitet. I denne studien er kapasiteten til denne teknologien til å vurdere IAV-overlevelse utenfor verten demonstrert ved å måle virusinaktiveringshelling. Raske teknikker som TCID50 og plakkanalyser erstattes av objektiv sanntidsvurdering av celle levedyktighet, og reflekterer dermed cytopatiske effekter indusert av viruset. I likhet med TCID50 eller plakkdannende enhet (pfu) er CIT50 også lineært korrelert med multiplisiteten av infeksjon (figur 2). Blant begrensningene i denne tilnærmingen klarer denne metoden ikke å nøyaktig overvåke celler som er infisert med ikke-cytopatogene virus.
Som et eksempel kan innføring av ny mutasjon i det virale genomet sterkt dempe et virus og redusere cytopatogenenisiteten. Inaktiveringshellingen som beregnes her, er derimot uavhengig av virusreplikering og en potensiell virusdemping, da denne skråningen er avledet fra CIT50-verdier målt etter forskjellige tidspunkter for inaktivering av samme virus. Her antas det dermed at viruspartikler som fortsatt er i stand til å infisere en celle etter denne inaktiveringsprotokollen, deler samme replikasjonsfenotype som virus før inaktiveringen.
Til tross for høyere kostnader reduseres arbeidsmengden ved hjelp av denne tilnærmingen betydelig, noe som er fordelaktig når et prosjekt krever ytelse av kinetikk, med mål hyppige tidspunkter og over lang tid. Som i hver protokoll er noen trinn kritiske, og manipulasjoner må utføres med forsiktighet og presisjon. Omvendt pipettering er et avgjørende skritt for å sikre presis utlevering av media, og det må tas særlig hensyn for å unngå forurensning. På samme måte må den første cellemengden være den samme mellom hvert eksperiment og må vurderes ved hjelp av en automatisert celleteller med trypan blå farging. Under overvåking av CI av apparatet, bør åpningen av inkubatoren begrenses så mye som mulig.
Hvis omsorg og oppmerksomhet blir gitt under eksperimentet med begrenset bevegelse, blir forurensningsrisikoen lav, og resultatene er svært reproduserbare. Fordelingen av inaktiveringsbakker mellom forskjellige virus er betydelig forskjellig, så en ikke-parametrisk statistisk test brukes til å sammenligne virusvarighet. Gjennomsnittlige inaktiveringsbakker kan beregnes for virus som produserer cytopatiske effekter i cellekulturen, for eksempel enteriske virus, ebolavirus eller koronavirus, hvis utholdenhet i miljøforholdene for tiden studeres (og sannsynligvis ved hjelp av tradisjonelle virologimetoder). I fremtiden kan denne metoden også brukes til å sammenligne replikering av forskjellige virus, undersøke virustropisme for flere cellelinjer samtidig, og studere spesifikke trinn i virussyklusen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J.
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 1 Suppl 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments. , Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
