Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ניטור הישרדות וירוס שפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת

Published: February 20, 2021 doi: 10.3791/61133
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2,3
1Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Institut Pasteur, Unité Environnement et Risques Infectieux, Cellule d'Intervention Biologique d'Urgence (CIBU), 3Cellule Pasteur, Université de Paris

Summary

דיווח כאן הוא פרוטוקול לכימות של חלקיקים ויראליים זיהומיות באמצעות ניטור בזמן אמת של עכבה חשמלית של תאים נגועים. יישום מעשי של שיטה זו מוצג על ידי כימות שפעת A וירוס ריקבון תחת פרמטרים פיסיקוכימיים שונים המחקים תנאים סביבתיים.

Abstract

שיטות לכימות חלקיקי וירוס מייצגות היבט קריטי של מחקרים וירולוגיים רבים. למרות שקיימות מספר טכניקות אמינות, הן גוזלות זמן רב או אינן מסוגלות לזהות וריאציות קטנות. מוצג כאן פרוטוקול לכימות מדויק של טיטר ויראלי על ידי ניתוח וריאציות עכבה חשמלית של תאים נגועים בזמן אמת. עכבה תאית נמדדת באמצעות ביו-סנסורים מיקרואלקטרודים מזהב הממוקמים מתחת לתאים במיקרופלסטיק, שבהם הגודל תלוי במספר התאים, כמו גם בגודלם ובצורתם. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח בזמן אמת של התפשטות תאים, כדאיות, מורפולוגיה והגירה עם רגישות מוגברת. כמו כן מסופקת דוגמה ליישום מעשי על ידי כימות הריקבון של וירוס שפעת A (IAV) שהוגש לפרמטרים פיסיקוכימיים שונים המשפיעים על זיהום ויראלי לאורך זמן (כלומר, טמפרטורה, מליחות, pH). עבור יישומים כאלה, הפרוטוקול מפחית את עומס העבודה הדרוש תוך יצירת נתוני כימות מדויקים של חלקיקי וירוס זיהומיות. זה מאפשר השוואה של מדרונות אי-השבתה בין IAV שונים, אשר משקף את יכולתם להתמיד בסביבה נתונה. פרוטוקול זה קל לביצוע, ניתן לשחזור מאוד, והוא יכול להיות מיושם על כל וירוס המייצר אפקטים ציטופתיים בתרבית התא.

Introduction

העברת וירוס מסתמכת על שילוב של מספר גורמים. עבור וירוס המופרש בסביבה, העברתו תלויה גם ביכולת להתמיד בתנאים מחוץ למארח. לימוד אי-ההשבתה הנגיפית באופן כללי הוא, אם כן, צעד מכריע בסיוע לרשויות הבריאות הלאומיות ולקובעי המדיניות ליישם אמצעי בקרה ובטיחות ביולוגית.

הידע על התמדה בנגיף בהגדרות טבעיות ומעבדה גדל במידה ניכרת בעשור האחרון. במקרה של וירוסי שפעת A (IAV), נתיבי ההולכה שלהם מגישים חלקיקים ויראליים למגוון רחב של תנאים סביבתיים. באופן ספציפי, הם יכולים להיות מועברים באמצעות 1) מסלולים צואתיים דרך מים (כלומר, וירוסי עופות), או 2) מגע ישיר או עקיף על ידי fomites מזוהמים, כמו גם אירוסולים וטיפות נשימה (כלומר, עופות ווירוסים יונקים)1. בכל מקרה, IAV מוגשים לפרמטרים פיסיקוכימיים שונים (כלומר, pH, מליחות, טמפרטורה ולחות), אשר משפיעים פחות או יותר במהירות על הזיהום שלהם2,3,4,5,5,6,7,8,9. יש חשיבות רבה, במיוחד לגבי וירוסים זואונוטיים ומגיפה, כדי להעריך את הפוטנציאל של גורמים סביבתיים להשפיע על הדינמיקה של וירוס ואת הסיכונים של חשיפה והעברה בין מינים.

עד כה, טכניקות וירולוגיה מסורתיות (כלומר, קביעת טיטר ויראלי באמצעות בדיקות פלאק או 50% תרבות רקמות הערכת מינון זיהומיות) שימשו להערכת זיהום IAV לאורך זמן; אבל טכניקות אלה גוזלות זמן רב ודורשות אספקה רבה 10,11,12. מדידת עכבה תאים נגועים לאורך זמן עם microelectrodes משמש ככלי שימושי כדי לפקח על הישרדות IAV בתנאים סביבתיים שונים, כמו גם איון ויראלי בכלל. שיטה זו מספקת נתונים אובייקטיביים בזמן אמת המחליפים התבוננות אנושית סובייקטיבית של השפעות ציטופתיות. זה יכול לשמש כדי לקבוע את טיטר וירוס, ובכך להחליף מדידות מסורתיות עם מרווחי ביטחון נמוכים יותר והימנעות בדיקות נקודות קצה אינטנסיביות עבודה.

קיים מתאם ליניארי בין תוצאות טיטרציה המתקבלות על ידי מדידה של עכבה בתא ועל ידי בדיקת פלאק קלאסית או שיטות TCID50. לכן, נתונים המתקבלים בשיטת טיטרציה מבוססת עכבה ניתן לשנות בקלות ערכי TCID50 או pfu על ידי יצירת עקומה סטנדרטית עם דילול סדרתי של הנגיף13,14,14,15,16,17. זיהוי, כימות ויעילות של נטרול נוגדנים הנמצאים בדגימות סרום ניתן להשיג גם באמצעות גישה ניסיונית זו18,19. לאחרונה, בדיקות תאיות מבוססות עכבה שימשו כדי לסנן ולהעריך תרכובות אנטי ויראליות נגד Equid alphaherpesviruses20.

טכנולוגיה זו שימשה להערכת ההתמדה של IAVs במים מלוחים בטמפרטורות שונות וכדי לזהות מוטציות hemagglutinin של IAV להגדיל או להקטין את ההתמדה IAV בסביבה21. סינון כזה ידרוש עבודה נרחבת אם משתמשים בשיטות טיטרציה מסורתיות. עם זאת, ניתן להשתמש במתודולוגיה זו עבור כל וירוס בעל השפעה על מורפולוגיה של תאים, מספר תא ועוצמת ההתקשרות של פני התא. זה יכול לשמש גם כדי לפקח על התמדה בתנאים סביבתיים שונים (כלומר, באוויר, במים, או על משטחים).

הפרוטוקול המתואר כאן מיישם את הישרדות IAV במים כדוגמה. נגיפי שפעת אנושית נחשפים לפרמטרים פיזיקוכימיים שונים בתקופות ממושכות. מי מלוחים (35 גרם / L NaCl) בטמפרטורה של 35 °C (35 °F) נבחרו כמודל הסביבתי בהתבסס על תוצאות קודמות9. הדבקה שיורית של וירוסים חשופים מכמתת בנקודות זמן שונות באמצעות זיהום תאים. תאי MDCK, סוג תא הייחוס להגברת IAV, נזרעים על 16 לוחות מיקרוטיטר היטב מצופים בחיישני מיקרואלקטרודים ומודבקים בווירוסים חשופים 24 שעות מאוחר יותר. עכבה תאית נמדדת כל 15 דקות ומתבטאת כיחידה שרירותית הנקראת אינדקס התא (CI). השפעות ציטוטפתיות הנגרמות על ידי וירוס שפעת, שקצב הופעתו תלוי ישירות במספר החלקיקים הנגיפיים הזיהומיים המחוסנים לתרבית התאים, מוביל לירידה ב- CI, אשר לאחר מכן מכמת כערך CIT50 . ערך זה מתאים לזמן הדרוש כדי למדוד הפחתה של 50% מה- CI הראשוני (כלומר, לפני הוספת וירוס). ערכי CIT50 המחושב עבור מספר פעמים חשיפה סביבתית מאפשרים ניכוי של שיפוע ההשבתה של וירוס לאחר רגרסיה ליניארית של ערכי CIT50 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

לטפל בכל וירוסי שפעת על פי דרישות רמת בטיחות ביולוגית מתאימה (BSL-2 ומעלה בהתאם לסוג המשנה). השתמש בזני IAV עם היסטוריית מעבר נמוכה (פחות מפי 5 בתאי MDCK) כדי להבטיח שונות נמוכה בין ניסויים.

1. הכנת ריאגנטים וחומרי התחלה

  1. הכנת תאי MDCK ומדיום תרבית תאים סטריליים
    1. טפחו תאי כליות כלבים של מאדין-דארבי (MDCK) במדיום של הנשר (MEM) שעבר שעברי (FCS) עם 10% חום עם סרום עגל עוברי מומת (FCS) ואנטיביוטיקה (100 יחידות/מ"ל פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין).
    2. לאחר הפשרה, מעבר תאי MDCK לפחות 2x לפני הדבקתם כדי להבטיח התאוששות מלאה (אבל פחות מ 30 קטעים כדי למנוע כל סחיפה פנוטיפים התא).
    3. זרע 75 cm2 רקמות תרבית בקבוקונים המכילים 30 מ"ל של סטרילי 1x MEM עם 7.5 x 106 תאי MDCK ודגרה ב 37 °C (5° C) בחממה לחה 5% CO2 .
  2. הכנת ציוד ניטור עכבה
    1. מניחים את המכשיר באינקובטור בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס ומאפשרים לו להתחמם לפחות 2 שעות.
    2. חבר אותו ליחידת הבקרה הממוקמת מחוץ לאינקובטור.
    3. המשך להליכי ניקוי כפי שהומלץ על ידי היצרן לפני תחילת שארית הניסוי.
  3. ייצור מניות IAV בתאי MDCK
    1. כדי להפיץ ולהגביר וירוסי H1N1, זרע 7.5 x 106 תאי MDCK על שני צלוחיות תרבית רקמות 75 cm2 ודגר במשך 24 שעות ב 37 °C (37 °F) כדי להגיע 90%-100% מפגש.
    2. Decant מדיום תרבית התא מן monolayer התא ב 75 ס"מ2 בקבוקונים. לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של סטרילי 1x PBS.
    3. הסר PBS והוסף 5 מ"ל של 1x PBS כדי לשטוף את התאים שוב.
    4. סמן בקבוקון אחד כפקד והסר PBS לפני הוספת 15 מ"ל של מדיית הפצת וירוסים (1x MEM עם 0% FCS) בזהירות על monolayer. דגירה בקבוקון זה בחממה מתוחזקת ב 35 °C (5 ° F) עם 5% CO2. השתמש בו להשוואה לאחר 3 ימים של התפשטות.
    5. להפשיר בקבוקון אחד של מניית IAV ב RT. לדלל את הנגיף לריכוז המתאים בצינור 1.5 מ"ל המכיל מדיה להפצת וירוס (1x MEM עם 0% FCS).
    6. הסר 1x PBS מן הבקבוקון 75 cm2 ולהדביק תאי MDCK בריבוי של זיהום (MOI) של 1 x 10-3 או 1 x 10-4 פלאק להרכיב יחידות לכל תא (pfu / תא) על ידי הוספת 1 מ"ל של הנגיף המדולל למונולייר התא.
    7. וירוס adsorb לתאי MDCK במשך 45 דקות ב RT על ידי ערבוב הבקבוק באופן קבוע כל 15 דקות.
    8. הסר בעדינות את האינקולום והוסף 15 מ"ל של מדיית התפשטות וירוסים לכל בקבוקון המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל TPCK-טריפסין (טריפסין / L-1-tosylamide-2-פנילתיל כלורמתיל קטון), כדי לבקע את ההמגלוטינין הנגיפי HA0 לתוך יחידות המשנה HA1 ו- HA2 (אירוע הנדרש עבור היתוך HA עם הקרום האנדוסומלי ושחרור הגנום הנגיפי)22.
    9. לדגור על הבקבוקונים ב 35 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2 לפחות 3 ימים כדי לשכפל את הנגיף.
    10. התבונן בתאי MDCK תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40 וחפש אפקטים ציטופתיים (CPE) על התאים (על ידי השוואה לבקבוק בקרת התא). אם CPE אינו שלם (כלומר, כ -80% מהתאים מנותקים מהמצע), החזירו את הבקבוקונים לאינקובטור למשך 24 שעות נוספות.
    11. כאשר CPE הושלם, decant תרבית התא supernatant וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות כדי גלולה את הפסולת התאית.
    12. מעבירים את הסופר-נרטיב המובהק לצינור 15 מ"ל ווירוסי צאצאי aliquot לבקבוקונים קריוגניים סטריליים לשימוש חד פעמי. מיד למקם את cryotubes ב -80 °C (80 °F) כדי להקפיא ולמלאי וירוסים.

2. קביעת כמות תאים מתאימה להדבקת תאים

הערה: במהלך כל הניסויים, שמור את הלוחות על משטחים לא אלקטרוסטטיים בכל עת, כגון עטיפות הנייר מהאריזה. בצע את סעיף 2 להלן כדי לקבוע את הריכוז המתאים ביותר של תאים להיות זרעים בלוח microtiter אלקטרוני (תוכנן כמו E-צלחת).

  1. הכינו תאי MDCK בבקבוקונים בגודל 75 ס"מ2 כדי להשיג תאים מפוצלים טריים (כ-80% מפגש) 24 שעות לפני הניסוי.
  2. לשטוף תאים עם 5 מ"ל של 1x PBS ולנתק אותם על ידי הוספת 3 מ"ל של 0.25% פתרון טריפסין-EDTA.
  3. הוסיפו 7 מ"ל של תרבית תאים טריים בינוניים וספרו תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי עם כתמים כחולים טריפאן.
  4. התאם את ריכוז התא ל-400,000 תאים/מ"ל עם מדיית תרבית תאים. בצע דילול סדרתי כפול בצינורות נוספים כדי לקבל צפיפות תאים של 200,000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; ו-6,250 תאים/מ"ל. התאם את טווח הדילול של התאים בהתאם לסוג התא והתנהגות הצמיחה שלהם.
  5. השאר את צלחת E (טבלת חומרים) ב RT במשך מספר דקות ולהוסיף 100 μL של מדיה תרבית התא לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית. אל תיגע באלקטרודות של הצלחת האלקטרונית.
  6. פתחו את העריסות והכניסו את הקצה הקדמי של הצלחת לכיס העריסה של מכשיר מדידת העכבה (שולחן החומרים). סגור את דלת האינקובטור.
  7. פתח את התוכנה.
    1. בתיבה "הגדרת תבנית ניסוי המהווה ברירת מחדל", בחר את העריסה שנבחרה ולחץ פעמיים על הדף העליון ולאחר מכן הזן את שם הניסוי. לחץ על "פריסה" והזן את המידע לדוגמה הדרוש עבור כל באר שנבחרה של הצלחת; לאחר מכן, לחץ על "החל" בסיום. לחץ על "תזמון" | "צעדים" | "הוסף צעד". התוכנה מוסיפה באופן אוטומטי שלב של 1 s כדי למדוד את עכבה הרקע (CI).
    2. לחץ על "התחל/המשך" בכרטיסייה "בצע". לחץ על "עלילה", להוסיף את כל הדגימות על ידי בחירת הבארות המתאימות, ולהבטיח CI הוא בין -0.1 ו 0.1 לפני שתמשיך לשלב הבא.
  8. הסר את הצלחת מהעריסה.
  9. הוסף 100 μL של כל השעיית תא משלב 2.4 כפול לבארות המתאימות ו 100 μL של מדיה סלולרית בבארות המשמשות פקדים. השאירו את צלחת E במכסה המנוע זרימה למינאר במשך 30 דקות ב RT כדי לאפשר חלוקה אחידה של התאים בתחתית הבארות.
  10. הכנס את הצלחת האלקטרונית לכיס העריסה. לחץ על "תזמון" | "הוסף שלב" בתוכנה והזן ערכים לניטור תאים כל 30 דקות במשך 200 חזרות. לאחר מכן, בחר "התחל/המשך".
  11. בדוק והתווה את נתוני CI על ידי לחיצה על כפתור "התווה" בתוכנה. בחר את ריכוז התאים שנמצאים ממש לפני השלב הנייח 24 שעות לאחר זריעה על הצלחת, על מנת להשיג תאים שעדיין נמצאים בשלב גידול במהלך זיהום ויראלי. שלב נייח הוא הגיע כאשר CI הוא במקסימום שלה.

3. מתאם בין ערכי CIT50 לבין ריבוי הזיהום

  1. הוסף 100 μL של סטרילי 1x MEM תרבות בינוני בכל באר של צלחת E. הכנס צלחת אלקטרונית לכיס העריסה של המכשיר בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס. מדוד את הרקע כמתואר בשלב 2.7.
  2. הסר את הצלחת האלקטרונית מהעריסה.
  3. זרע 3 x 104 של תאי MDCK מפוצלים טריים על כל באר של צלחת microtiter אלקטרונית ולגדל אותם במשך 24 שעות ב 35 °C (35 °F) עם 5% CO2 כך שהם נמצאים בשלב שכפול במהלך זיהום IAV.
  4. להדביק תאי MDCK עם דילולים שונים פי 10 של ידוע 6 log10 TCID50 / mL titer של וירוס H1N1, באמצעות צינורות הפוכים לשחזור על ידי ביצוע השלבים הבאים:
    1. לשטוף את תאי MDCK 2x עם 100 μL של MEM ללא FCS (מדיה להפצת וירוסים). שים לב להסרת כל המדיה לאחר הכביסה השנייה כדי למנוע דילול נוסף של האינוקלום.
    2. הוסף 100 μL של השעיה ויראלית בכל באר באמצעות פיפטה ערוץ יחיד. כדי למנוע זיהום, להמשיך על ידי התחלה משמאל לימין ולאחר מכן מלמעלה למטה בצלחת, תוך כיסוי הבארות הנותרות עם המכסה.
    3. הכנס את הצלחת לכיס העריסה של המכשיר ב 35 °C (50 °F). הייה עדין כדי למנוע תנועות פתאומיות שעלולות להוביל לזיהומים.
    4. התחל לפקח על עכבה תא כל 15 דקות במהלך לפחות 100 שעות כמתואר בשלב 2.10.
    5. לאחר שני מחזורי המדידות (כלומר, 30 דקות), השהה את המנגנון על ידי לחיצה על "השהה" בכרטיסייה "ביצוע" והסר את הצלחת האלקטרונית מהעריסה.
    6. הוסף 1 מיקרוגרם / מ"ל TPCK-טריפסין למדיית התפשטות הנגיף כדי לבקע את המגלוטין הנגיפי.
    7. הוסף 100 μL של מדיה להפצת וירוס המכיל TPCK-טריפסין לתוך כל באר ולהכניס את E-צלחת לכיס העריסה.
    8. לחץ על "התחלה/המשך" בכרטיסיה "ביצוע".
      הערה: אל תשכח ליצור פקד שלילי המתאים לתאים נגועים בחיקוי על ידי החלפת ההשעיה הנגיפית במדיה של הפצת וירוסים.

4. קינטיקה הישרדותית IAV

  1. לחשוף IAV למים מזוקקים מלוחים ב 35 °C (50 °F) ולבדוק את הזיהום שלהם לאורך זמן על ידי מדידת ירידה בעכבה התא.
    1. הכן מים מזוקקים מלוחים על ידי הוספת NaCl לריכוז סופי של 35 גרם / ליטר במים מזוקקים. מוסיפים 900 μL של מים מלוחים לתוך 2 מ"ל cryotubes.
    2. הוסף 100 μL של מלאי ויראלי במים מלוחים ומניחים את cryotubes בחממה (35 °C (35 °C (5% CO2) עבור 1 h, 24 שעות, או 48 שעות.
    3. זרע 100 μL (המכיל 3 x 104) של תאי MDCK מפוצלים טריים על צלחת microtiter 16 היטב לגדול במשך 24 שעות ב 37 °C (37 °C ( (5% CO2).
    4. להדביק תאים עם 100 μL של וירוסים חשופים (בעבר מדולל 10x במדיה תרבותית) באמצעות שיטת צנרת הפוכה לשחזור על ידי חזרה על סעיף 3.4.
  2. ניטור עכבה תא כל 15 דקות לפחות 100 שעות.

5. הערכה של אובדן זיהום

  1. קביעת ערכי CIT50 לכימות CI להקטין עקב השפעות ציטופתיות הנגרמות על ידי וירוס עם הערך CIT50 .
    1. לחץ על "התוויה" והוסף את כל הדוגמאות על-ידי לחיצה על "הוסף הכל". יצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה על "ייצוא פרטי ניסוי". שקול CI ראשוני כערך עכבה תאית נמדד 5 שעות לאחר זיהום התא על ידי וירוסים חשופים (כלומר, 24 שעות לאחר זריעת תאי MDCK על צלחת E microtiter).
    2. חשב ערך CIT50 המתאים לזמן הדרוש כדי למדוד ירידה של 50% מה- CI הראשוני. כדי לחשב את ערך CIT50 , שים לב לערך CI ב- 5 כ"ס עבור כל דגימה. לאחר מכן, מצא את נקודת הזמן שבה ערך CI שווה למחצית מערך CI ב- 5 hpi באמצעות האינדקס והתאם פונקציות בגיליון האלקטרוני.
  2. חישוב מדרון ההשבתה הממוצע
    1. קבעו את ערכי CIT50 עבור כל השעיה ויראלית חשופה, בזמני חשיפה שונים (בימים).
    2. חשב שיפוע רגרסיה ליניארי מערכים מותווים של CIT50, המכונה שיפוע ההשבתה ובא לידי ביטוי ב- CIT50.day-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נתונים גולמיים המתקבלים לאחר 120 שעות עם ריכוזים שונים של תאי MDCK, מ-15,000 ל-120,000 תאים לבאר, מוצגים באיור 1. לאחר 24 שעות, מדדי CI מראים כי תאים בבארות זרעו עם 30,000 תאים היו עדיין בשלב המעריכי של צמיחה, וריכוז התא הזה שימש לניסויים נוספים. איור 2 ממחיש את המתאם הליניארי בין ערכי CIT50 לבין ריבוי הזיהום הראשוני. תאי MDCK הם תרבית במשך 24 שעות, ולאחר מכן נגועים A / פריז / 2590 / 2009 H1N1 זן ויראלי בריבוי שונה של זיהום. CI הראשוני נמדד 5 שעות לאחר זיהום.

איור 3 ממחיש את ההליך הניסיוני שבו נעשה שימוש בניסויים שלנו (לוח A). תוצאות אופייניות המציגות ירידה CI עקב אפקט ציטופתי הנגרמת על ידי וירוס מוצגות בלוח B. אלה נתונים גולמיים שהתקבלו לאחר עיבוד על ידי התוכנה. ערכי CIT50 חושבו באמצעות הגיליון האלקטרוני לאחר ייצוא הנתונים. לאחר חישוב ערכי CIT50 בנקודות זמן שונות, ניתוח רגרסיה ליניארית אפשר קביעת השיפוע (לוח C). לפיכך, מדרונות אי-ההשבתה הנגיפית הושגו עבור כל וירוס בכל מצב, ולאחר מכן הושוו לזיהוי וירוסים בעלי היציבות הגדולה ביותר בסביבה הנחקרת.

איור 4 מראה מדרונות של וירוסים רקומביננטיים של IAV הנושאים עמוד שדרה גנטי השייך לזן נגיף A/WSN/1933 H1N1 ו-HA ו-NA מנגיף A/New Caledonia/20/1999 H1N1 (HA-NA/NC99). מוטציות לא נרדפות ב- HA הוצגו כדי לחקור את ההשפעה על התמדה חלקיקי וירוס מחוץ לפונדקאי במים מלוחים.

על ידי השוואת מדרונות אי-השבתה ממוצעים מניסויים שונים שבוצעו בשלושה עותקים, הצלחנו לזהות חומצות אמינו ב- HA שהספיקו כדי להשפיע על ההתמדה הנגיפית מחוץ לפונדקאי. ככל שמדרונות ההשבתה נמוכים יותר, כך הנגיף יציב יותר. כדוגמה, ההחלפה HA / F453Y או HA::K147 החדרה ב HA של נגיף HA-NA / NC99 גרמה לעלייה משמעותית במדרון ההשבתה הממוצע ל -9.8 CIT50 ליום ו - 9.9 CIT50 ליום, בהתאמה, בהשוואה ל- HA מסוג פראי (עם מדרון אי-השבתה ממוצע של 4.85 CIT50 ליום), ובכך יצרה מוטציות מאוד לא יציבות. לעומת זאת, החלפת HA / T327A לא השפיעה על היציבות הנגיפית בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס במים מלוחים (מדרון אי-השבתה ממוצע של 6.6 CIT50 ליום). המתודולוגיה הייתה אפוא חזקה מספיק כדי לזהות שאריות חומצות אמינו בגליקופרוטאין HA שהיו מעורבים בהישרדות IAV מחוץ לפונדקאי.

Figure 1
איור 1: טיטרציה של תאים במיקרוטיטר E-plate.
דילול סדרתי של תאי MDCK נזרעו על לוחות E microtiter, וצמיחת התא היה במעקב עד 100 שעות (200 גורף כל 30 דקות). נקודות אפורות מייצגות את סטיות התקן של CI הנמדדות בכפילות. הקו האנכי ב 24 שעות מדגיש כי בתנאים המתוארים, זריעה ראשונית של 3 x 104 תאים / גם אפשר תרבות של סביב 70% מפגש בזמן הזיהום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: רגרסיה ליניארית בין ערכי CIT50 לבין ריבוי ראשוני של זיהום.
כל נקודה מציינת את ערך CIT50 המחושב עבור זיהום של תאים עם ריבוי שונה של זיהום. הקו המוצק מייצג את שיפוע הרגרסיה הליניארית (R2 = 0.99), וקווים מקווקווים מייצגים את מרווחי הביטחון של 95%. נתון זה השתנה מפרסום קודם21. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: קביעת מדרון ההשבתה.
(A) חלקיקים ויראליים היו מדוללים במים מלוחים ב 35 °C (5 °F) במשך 0, 1, או 2 ימים, ו CI היה במעקב ברציפות ושורטט כמדד התא. (ב) ירידה CI מכמתת עם ערכי CIT50 , המיוצגים באופן ידני על הנתונים הגולמיים על-ידי קווים מקווקווים אנכיים. כל עקומה מייצגת את האבולוציה של עכבה בתאים לאחר הידבקות בווירוסים שנחשפו למים מלוחים לזמנים הולכים וגדלים (אדום: וירוס לא חשוף, צהוב: חשיפה של 24 שעות, ירוק: חשיפה של 48 שעות, כהה: תאים נגועים מדומים). CI ראשוני נמדד 5 שעות לאחר זיהום (C) רגרסיה ליניארית של ערכי CIT50 המשמשים לחישוב שיפוע ההשבתה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ההשפעה של מוטציות שאינן נרדפות ב-HA על התמדה של IAV במים מלוחים.
מדרונות השבתה של וירוסים reassortant הנושאים HA מ A / קלדוניה החדשה / 20/1999 H1N1 וירוס עם (החלפה או הכנסה) או ללא מוטציה (HAWT). Boxplots הציג את ההתפלגות של מדרונות אי-השבתה יחידים (שישה או שמונה בהתאם לנגיף, מחושב מניסויים עצמאיים שונים) המתקבלים עבור כל וירוס חשוף סביב הממוצע (קווים אופקיים). מדרונות ההשבתה הממוצעים הושוו באמצעות בדיקת ANOVA (ns, p > 0.05, ****p < 0.0001). השופט מתאים לנגיף reassortant נושא wildtype HA, שנגדו משווים וירוסים אחרים. נתון זה השתנה מפרסום קודם21. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RTCA היא טכנולוגיה מבוססת עכבה המשמשת יותר ויותר לניטור בזמן אמת של תכונות התא, כגון דבקות בתאים, התפשטות, הגירה וציטוטוקסיות. במחקר זה, היכולת של טכנולוגיה זו להעריך את הישרדות IAV מחוץ למארח מודגמת על ידי מדידת מדרון אי-השבתת וירוסים. טכניקות קפדניות כגון TCID50 ובדיקות פלאק מוחלפות על ידי הערכה אובייקטיבית בזמן אמת של הכדאיות של התא, ובכך לשקף השפעות ציטופתיות הנגרמות על ידי הנגיף. בדומה ליחידת יצירת הפלאק TCID50 או הפלאק (pfu), גם ה-CIT50 מתואמים באופן ליניארי עם ריבוי הזיהום (איור 2). בין המגבלות של גישה זו, שיטה זו אינה מצליחה לפקח במדויק על תאים נגועים בווירוס לא ציטופתוגניים.

כדוגמה, הכנסת מוטציה חדשה לגנום הנגיפי יכולה להחליש מאוד וירוס ולהפחית את הציטופתוגניות שלו. לעומת זאת, מדרון ההשבתה המחושב כאן אינו תלוי בשכפול וירוסים ובהנחתת וירוסים פוטנציאלית, שכן שיפוע זה נגזר מערכי CIT50 הנמדדים לאחר נקודות זמן שונות של אי-השבתה של אותו וירוס. כאן, ההנחה היא אפוא כי חלקיקים ויראליים שעדיין מסוגלים להדביק תא לאחר פרוטוקול השבתה זה חולקים את אותו פנוטיפ שכפול כמו וירוסים לפני ההשבתה.

למרות עלויות גבוהות יותר, עומס העבודה באמצעות גישה זו מופחת במידה ניכרת, וזה יתרון כאשר פרויקט דורש ביצועים של קינטיקה, עם נקודות זמן תכופות מדידה על פני תקופה ארוכה של זמן. כמו בכל פרוטוקול, כמה צעדים הם קריטיים, ומניפולציות חייבות להתבצע בזהירות ובדיוק. צנרת הפוכה היא צעד מכריע כדי להבטיח חלוקה מדויקת של התקשורת, ויש להקדיש תשומת לב מיוחדת כדי למנוע כל זיהום. כמו כן, כמות התא הראשונית חייבת להיות זהה בין כל ניסוי ויש להעריך אותה באמצעות מונה תאים אוטומטי עם כתמים כחולים טריפאן. במהלך ניטור CI על ידי המנגנון, פתיחת האינקובטור צריך להיות מוגבל ככל האפשר.

אם טיפול ותשומת לב מסופקים במהלך הניסוי עם תנועה מוגבלת, אז הסיכון לזיהום הופך נמוך, ואת התוצאות הן מאוד לשחזור. התפלגות מדרונות ההשבתה בין וירוסים שונים באופן משמעותי, ולכן בדיקה סטטיסטית לא פרמטרית משמשת להשוואת התמדה בווירוסים. ניתן לחשב מדרונות אי-השבתה ממוצעים עבור כל וירוס המייצר השפעות ציטופתיות בתרבית התאים, כגון וירוסים אנטריים, אבולבירוס או נגיפי קורונה, שהתמדהם בתנאים סביבתיים נחקרת כעת (וסביר להניח באמצעות שיטות וירולוגיה מסורתיות). בעתיד, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להשוות את השכפול של וירוסים שונים, לחקור טרופיזם וירוס עבור מספר קווי תאים בו זמנית, וללמוד שלבים ספציפיים של מחזור הנגיף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25%Trypsin ThermoFisher 25200056
75 cm2 tissue culture flask Falcon 430641U
E-Plate 16 (6 plates) ACEA Biosciences, Inc 5469830001 E-plates are avalible in different packaging
FCS Life technologies (gibco) 10270-106
MEM 1X Life technologies (gibco) 31095029
PBS 1X Life technologies (gibco) 14040091
Penicillin-Streptomycin Life technologies (gibco) 11548876
TPCK-Trypsin Worthington LS003740
xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 ACEA Biosciences, Inc 380601310 The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, Suppl 2 42-51 (2013).
  2. Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
  3. Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
  4. Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
  5. Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
  6. Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
  7. Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
  8. Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 1 Suppl 285-289 (2007).
  9. Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
  10. Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments. , Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020).
  11. Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
  12. Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
  13. Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
  14. Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
  15. Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
  16. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  17. Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
  18. Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
  19. Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
  20. Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
  21. Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
  22. Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).

Tags

אימונולוגיה וזיהום בעיה 168 וירוס שפעת A התמדה ניתוח תאים בזמן אמת איון ויראלי אפקט פתוגניים של תאים כימות ויראלי
ניטור הישרדות וירוס שפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Labadie, T., Grassin, Q.,… More

Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. C., Leclercq, I. Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (168), e61133, doi:10.3791/61133 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter