Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Aspergillus-Infektionsmodell bei Zebrafischlarven. Aspergillus Sporen werden mikroinjiziert in das Hinterhirn von Larven, und chemische Behandlung wird verwendet, um Immunsuppression zu induzieren. Das Fortschreiten der Infektion wird über eine tägliche Bildgebung überwacht, um das Pilzwachstum und die Immunantworten sowie die Aufzählung lebender Sporen durch Koloniebildbildung zu überwachen.
Abstract
Invasive Aspergillose (IA) ist eine der häufigsten Pilzinfektionen bei immungeschwächten Personen. Trotz der Verfügbarkeit von Antimykotika kann Feine >50% Mortalität bei infizierten immungeschwächten Patienten verursachen. Es ist entscheidend, sowohl Wirts- als auch Krankheitserregerfaktoren zu bestimmen, die zur Anfälligkeit für Infektionen und niedrigen Überlebensraten bei infizierten Patienten beitragen, um neuartige Therapeutika zu entwickeln. Angeborene Immunantworten spielen eine zentrale Rolle bei der Erkennung und Clearance von Aspergillus Sporen, obwohl wenig über die genauen zellulären und molekularen Mechanismen bekannt ist. Zuverlässige Modelle sind erforderlich, um detaillierte mechanistische Wechselwirkungen zwischen wirt und Pathogen zu untersuchen. Die optische Klarheit und genetische Traktionsfähigkeit von Zebrafischlarven machen sie zu einem faszinierenden Modell, um Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen mehrerer menschlicher Bakterieller und Pilzinfektionen in einem lebenden und intakten Wirt zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Larvenzebrafisch Aspergillus Infektionmodell. Erstens werden Aspergillus-Sporen isoliert und mittels Mikroinjektion in den Zebrafisch-Hinterhirn-Ventrikel injiziert. Dann werden chemische Inhibitoren wie immunsuppressive Medikamente direkt in das Larvenwasser aufgenommen. Es werden zwei Methoden zur Überwachung der Infektion bei injizierten Larven beschrieben, darunter die 1) Homogenisierung von Larven zur Aufzählung der Koloniebildenden Einheit (CFU) und 2) eine wiederholte, tägliche Live-Bildgebung. Insgesamt können diese Techniken verwendet werden, um das Fortschreiten der Aspergillus-Infektion in vivo mechanistisch zu analysieren und können auf verschiedene Wirtshintergründe und Aspergillus-Stämme angewendet werden, um Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen zu behören.
Introduction
Aspergillus fumigatus ist ein allgegenwärtiger sapraphytischer Pilz, und seine luftgetragenen Sporen können sowohl drinnen als auch draußen gefunden werden1. Diese Sporen werden von allen eingeatmet, aber effektiv aus der Lunge von immunkompetenten Individuen1,2gelöscht. Jedoch, Menschen mit veränderten Lungenerkrankungen wie Mukoviszidose kann bronchopulmonale Aspergillose aufgrund von Pilzkeimung in der Lunge entwickeln3. Die schwerste Form dieser Infektion, invasive Aspergillose (IA), betrifft immungeschwächte Individuen und beinhaltet das Wachstum des Pilzes in andere Organe2,3. IA führt zu >50% Tod von infizierten Patienten trotz der Verfügbarkeit von Anti-Pilz-Therapien4. Bei immunkompetenten Individuen spielen angeborene Immunantworten eine wichtige Rolle bei der Beseitigung der eingeatmeten Sporen1. Die spezifischen Mechanismen, die zu dieser angeborenen Immunclearance beitragen, sind jedoch nicht gut verstanden. Es ist wichtig, die zellulären und molekularen Mechanismen der wichtigsten angeborenen Immunzellen (d. h. Makrophagen und Neutrophilen) in der Clearance von Aspergillus zu verstehen, um neue therapeutische Strategien für IA zu finden.
Während Säugetiermodelle bei der Identifizierung von Pilzvirulenzfaktoren und Wirtsimmunreaktionen5,6von entscheidender Bedeutung waren, ist die visuelle Zugänglichkeit für Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene begrenzt. Gewebekulturexperimente können die komplexe multizelluläre Umgebung und die Wechselwirkungen, die bei ganzen Tieren existieren, nicht vollständig rekapitulieren7. Daher hat Zebrafisch popularität als alternativer Modellorganismus gewonnen, um diese Lücke zu füllen und die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen in einem lebenden, intakten Wirt über eine mehrtägige Infektion zu erleichtern8,9. Der angeborene Zebrafisch entwickelt sich bereits 24 h nach der Befruchtung (hpf)10, und das adaptive System benötigt 4–6 Wochen, um11zu entwickeln, was ein Zeitfenster bietet, in dem angeborene Immunantworten isoliert beurteilt werden können. Angeborene Immunantworten sind gut zwischen Menschen und Zebrafischen11konserviert. Zebrafische haben viele Eigenschaften, die die Untersuchung dieser Reaktionen erleichtern, einschließlich optischer Klarheit (die eine hochauflösende Live-Bildgebung intakter Wirte ermöglicht) und genetische Traktionsfähigkeit (was molekulare mechanistische Studien erleichtert).
Das hier beschriebene Larvenzebrafisch-Infektionsmodell Aspergillus wurde ursprünglich von Knox et al.12entwickelt. Es wurde vor kurzem von unserer Gruppe und anderen erweitert, um Wirtsimmunmechanismen12,13, Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen13,14,15, Mechanismen der Immunsuppression13,16,17, Pilzvirulenz18, und Anti-Pilz-Medikament Wirksamkeit19,20. Dieses Modell rekapituliert mehrere Aspekte der menschlichen Aspergillose. Während immunkompetente Larven resistent sind, können immungeschwächte Larven einer Infektion erliegen12,13,16,17.
In diesem Modell wird eine lokalisierte Infektion durch Injektion von Sporen in die Hinterhirn-Herzkammer von Larven, einem Gebiet weniger mit Phagozyten bevölkert, und Phagozyten Rekrutierung und Verhalten kann ausgewertet werden12,13. Es wird angenommen, dass Makrophagen als erste Verteidigungslinie gegen Aspergillus Sporen beim Menschen1 und Säugetiermodelle6,21. In ähnlicher Weise werden im Zebrafischmodell Makrophagen zu den injizierten Aspergillussporen rekrutiert, während Neutrophile sekundär als Reaktion auf das Hyphalwachstum rekrutiert werden12,13,22. Aus diesem Modell ist auch gelernt worden, dass Aspergillus nach mehr als 7 Tagen Infektion in immunkompetenten Wildtyplarven bestehen kann. Darüber hinaus kann der gesamte Verlauf der Infektion bei den gleichen lebenden Tieren durch tägliche konfokale Bildgebung verfolgt werden.
Dieses Protokoll beschreibt die Technik der Mikroinjektion, um Sporen in die Hinterhirnkammer von 2 Tagen nach der Befruchtung (2 dpf) Larven zu injizieren. Die Infektion wird dann für bis zu 7 Tage überwacht, da Zebrafischlarven bis zu 10 dpf ohne Fütterung leben können. Immunsuppression kann durch medikamentöse Behandlung induziert werden, und die Anwendung von Medikamenten auf die Larven wird auch beschrieben. Schließlich werden zwei Methoden beschrieben, um die Infektionsprogression zu verfolgen, einschließlich der Quantifizierung von KBE aus einzelnen Larven und einer täglichen Live-Bildgebung.
Protocol
Die Forscher sollten die Genehmigung für alle Tierversuche von den entsprechenden Tierpflege- und Einsatzausschüssen einholen. Repräsentative Daten, die in diesem Artikel gezeigt werden, stammen aus Experimenten, die im Rahmen von Protokollen durchgeführt wurden, die vom Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (AUP2018-070, AUP2019-012) genehmigt wurden.
1. Herstellung von Aspergillus sporen zur Injektion
- Berechnen Sie aus einer Aspergillus-Sporensuspension das Volumen, das benötigt wird, um 1 x 106 Sporen zu erhalten. Das Volumen sollte 20–100 l betragen; wenn nicht, eine 10-fache Verdünnung in 0,01% (v/v) sterilem Tween-20 (Tween-Wasser; Materialtabelle). Wenn das berechnete Volumen z. B. 5 l beträgt, erzeugen Sie eine 10-fache Verdünnung und verwenden Sie 50 l der verdünnten Lösung.
HINWEIS: Zwei Platten/Dehnung können vorbereitet werden, um mehr Sporen oder als Ersatz im Falle einer Kontamination zu sammeln. - 1 x 106Aspergillus Sporen auf einer Glukose-Minimal media (GMM) Platte(Materialtabelle) mit einem sterilen Einweg-L-förmigen Streuer in einem Biosicherheitsschrank verteilen. Vermeiden Sie eine Ausbreitung an den Rand der Platte. Bei 37 °C für 3–4 Tage inkubieren, wobei die Platte auf den Kopf gestellt wird.
- Bringen Sie am Tag der Entnahme steriles Miracloth und 50 ml konische Schläuche (zwei pro Sorte), frische Flaschen steriles Tween-Wasser (eine pro Sorte) und sterile Einweg-L-förmige Streuer in den Biosicherheitsschrank.
HINWEIS: Miracloth kann in Stücke von 8 in x 6 Stück geschnitten, in Folie eingewickelt und autoklaviert werden, um zu sterilisieren. - Legen Sie ein Stück Miracloth in jedem beschrifteten 50 ml kegelförmigen Rohr und Re-Cap. Nehmen Sie das restliche Miracloth-Paket aus der Haube.
- Teller in den Biosicherheitsschrank bringen. Öffnen Sie eine Platte, dann gießen Tween-Wasser auf der Oberseite, um etwa drei Viertel der Platte zu decken.
- Mit einem Einweg-L-förmigen Streuer, vorsichtig kratzen Sie die Oberfläche der Pilzkultur in einer Hin-und-Her-Bewegung, während sie die andere Hand verwenden, um die Platte zu drehen. Schrott, bis fast alle Sporen in das Tween-Wasser homogenisiert sind.
HINWEIS: Aufgrund der hohen Hydrophobie können Sporen "Puffs" erzeugen, wenn Tween-Wasser hinzugefügt wird oder während des Abkratzens. Es sollte sehr darauf geachtet werden, eine Kontamination von nahegelegenen Rohren oder Platten zu vermeiden. Es wird empfohlen, die Handschuhe zu wechseln und die Oberfläche mit 70% Ethanol zwischen der Extraktion verschiedener Stämme abzuwischen. - Nehmen Sie ein 50 ml kegelförmiges Rohr und entfernen Sie das Stück Miracloth. Falten Sie es in der Hälfte und machen Sie es in einen Filter in der Oberseite des 50 ml konischen Rohr sinfügte.
- Gießen Sie das Pilzhomogenat von der Platte über das Miracloth in das Rohr.
HINWEIS: Wenn zwei Platten einer Sorte vorbereitet sind, kratzen Sie beide Platten und gießen Sie sie in das gleiche konische Rohr. - Tween-Wasser gießen, um das Gesamtvolumen im konischen Rohr auf 50 ml zu erhöhen.
- Drehen Sie bei 900 x g für 10 min. Achten Sie darauf, Aerosolisierungsverhindernde Kappen in der Zentrifuge zu verwenden.
- Gießen Sie den Überstand in eine Bleichlösung von 10 %, um sie zu dekontaminieren. 50 ml steriles 1x PBS in das konische Rohr geben, dann wirbeln oder schütteln, um das Pellet wieder aufzuhängen.
- Drehen Sie wieder bei 900 x g für 10 min. Gießen Sie den Überstand ab und setzen Sie das Pellet in 5 ml sterilen 1x PBS wieder auf. Durch ein frisches Stück Miracloth in ein frisches 50 ml kegelförmiges Rohr filtern.
- 10-fach serielle Verdünnungen (10x, 100x, 1000x) des Pilzhomogenats in 1,7 ml Zentrifugenrohren (z.B. für die 10-fache Lösung mischen 100 l des Pilzhomogenats mit 900 l Tween-Wasser).
- Wählen Sie die erste Verdünnung, bei der die Sporen nicht sichtbar sind, wenn sie in Tween-Wasser eingeleitet werden, und verwenden Sie diese Verdünnung, um die Anzahl der Sporen mit einem Hämozytometer zu zählen.
- Berechnen Sie die Sporenkonzentration im hergestellten Pilzhomogenat (Wassersuspension) nach folgender Formel:
Konzentration (Sporen/ml) = Anzahl der Sporen in der Mitte 25 Boxen x Verdünnungsfaktor x 104 - Bereiten Sie einen 1 ml Vorrat von 1,5 x 108 Sporen/ml in sterilen 1x PBS in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr vor. Dieses Sporenpräparat kann bei 4 °C für 4 Wochen gelagert werden.
- Mischen Sie vor der Verwendung in Injektionen 20 l der Sporenzubereitung mit 10 l sterilem Phenolrot in einem 1,7 ml Zentrifugenrohr, um eine endgültige Sporenkonzentration von 1 x 108 Sporen/ml zu erreichen. Wirbel gründlich vor der Injektion.
HINWEIS: 1% phenolrote Lösung sollte filtersterilisiert und in Aliquots gelagert werden. - Für eine Mock-Injektion 20 l 1x PBS mit 10 l sterilem Phenolrot mischen.
2. Herstellung von Agarplatten zur Injektion
- 2% Agarose in E3 medium zubereiten und in einer Mikrowelle schmelzen.
- In eine 100 mm x 15 mm Petrischale (ca. 25 ml pro Platte) gießen, wirbeln, um die Platte gleichmäßig zu bedecken, und abkühlen lassen.
- Die Platte mit Paraffinfolie umwickeln und bei 4 °C invertiert aufbewahren.
- Bringen Sie die Platte vor der Injektion auf Raumtemperatur (RT).
- Gießen Sie 1 ml Filter sterilisierte2% Rinderserumalbumin (BSA) auf die Platte, kippen Sie die Platte zu verbreiten und decken Sie den gesamten Boden, und spülen Sie mit E3.
HINWEIS: 2% BSA-Lösung kann filtersterilisiert und als 1 ml Aliquots bei -20 °C gelagert werden. 2% BSA-Vorbehandlung verhindert, dass Larven an der Oberfläche der Agarose kleben. - E3 mit gepuffertem Tricain auf die Platte gießen und bis zur Injektion sitzen lassen.
3. Zebrafisch Larve Hindbrain Ventrikel Mikroinjektion
- Manuell dechoronische Larven mit Zangen bei 2 dpf in einer Petrischale.
HINWEIS: Die Dechorionation kann jederzeit von 1,5 dpf bis zum Zeitpunkt der Injektion durchgeführt werden. - Entfernen Sie so viel E3 wie möglich aus der Petrischale und fügen Sie gepufferte 300 g/ml Tricain e3 hinzu, um Larven zu beanten.
HINWEIS: Eine Stammlösung aus gepufferten 4 mg/ml Tricain in E3 kann bei 4 °C hergestellt und gelagert werden. Die Arbeitslösung kann durch Verdünnen von 4 ml der Lagerlösung bis zu 50 ml mit E3 hergestellt werden. - Verwenden Sie ein Mikroinjektions-Setup, das mit dem Druckinjektor, der Gegendruckeinheit, dem Fußschalter, dem Mikropipettehalter, dem Mikromanipulator und einem magnetischen Ständer und einer Platte geliefert wird, die alle mit einer Druckluftquelle verbunden sind (Materialtabelle).
- Öffnen Sie das Druckluftventil und schalten Sie den Mikroinjektor ein. Stellen Sie den Druck auf 25 PSI, die Pulsdauer auf 60 ms und die Gegendruckeinheit auf 1 PSI ein.
- Laden Sie eine Mikroinjektionsnadel mit einer Mikrolader-Pipettespitze (Materialtabelle) mit ca. 3–5 l vorbereiteter PBS- oder Sporensuspension mit Phenolrot. Montieren Sie die Nadel auf den Mikromanipulator.
HINWEIS: Mikroinjektionsnadeln können wie zuvor beschrieben23hergestellt werden. Das Stereomikroskop, das für Mikroinjektionen verwendet wird, sollte ein Augenstück-Absehen haben, um die Mikroinjektionsnadel zu kalibrieren. Das Absehen sollte mit einem Bühnenmikrometer kalibriert werden, und die Länge der Absehensskala sollte bestimmt werden. Der Durchmesser des Sporensuspensionstropfens, der aus der Nadel auswirft, wird gemessen, abhängig von der Anzahl der Hashes (des Absehens), die sich mit dem Tropfen überlappen. - Positionieren Sie den Mikromanipulator so, dass das Ende der Nadel bei der niedrigsten Vergrößerung unter dem Stereomikroskop sichtbar ist. Zoomen Sie auf die 4-fache Vergrößerung, wobei die Nadel im Blick behalten wird.
- Schneiden Sie mit scharfen Zangen das Ende der Nadel ab. Drücken Sie das Injektionspedal, um die Größe des Tröpfchens zu visualisieren, das herauskommt. Halten Sie Clipping zurück, bis 3 nL Sporensuspension injiziert wird (hier sind dies fünf Hashes).
- Bewegen Sie Mikromanipulator und Nadel aus dem Weg, um zu vermeiden, versehentlich die Nadel zu treffen, während die Larven auf der Injektionsplatte angeordnet sind.
- E3-Tricain egießen von der Injektionsplatte, dann mit einer Transferpipette 24 anästhesierte Larven auf die Injektionsplatte übertragen.
- Mit einem kleinen Werkzeug zur Manipulation von Zebrafischlarven (d.h. Haarschleifenwerkzeug oder Wimpernwerkzeug) ordnen Sie die Larven entsprechend der Richtung an, in die sie sich befinden. Platzieren Sie insbesondere alle nach rechts in einer Reihe und alle nach links in einer Reihe unten.
HINWEIS: Diese Anordnung ist schwierig, wenn zu viel Flüssigkeit auf der Platte ist, da die Larven fehl am Platz "schweben". Zu wenig Flüssigkeit ist aber auch problematisch, wenn die Injektionen lange dauern, da die Larven austrocknen oder die Anästhesie abnutzt. Daher sollte während des gesamten Mikroinjektionsprozesses sorgfältig auf die Flüssigkeitsmenge auf der Platte geachtet werden. - Passen Sie den Mikroskopzoom auf die niedrigste Vergrößerung an. Bringen Sie den Mikromanipulator zurück und ordnen Sie ihn so an, dass die Nadel in der Mitte des Sichtfeldes in einem Winkel von 30 °c bis 60° in der Nähe der Larven liegt.
- Zoomen Sie auf die höchste Vergrößerung und verwenden Sie Feinverstellknöpfe, um die Position der Nadel weiter anzupassen. Vergewissern Sie sich, dass sporen30 bis 70 Us-Streifen aus der Nadel kommen, indem Sie die Sporensuspension in die Flüssigkeit auf der Platte neben den Larven injizieren. Passen Sie bei Bedarf die Zeit und den Druck auf das Einspritz-Setup an.
HINWEIS: Dieser Test sollte nach fünf bis sechs Larven wiederholt werden, da die Anzahl der Sporen, die aus der Nadel kommen, im Laufe der Zeit zunehmen oder abnehmen kann. - Beginnend mit der Reihe, in der die Larven zur Nadel gerichtet sind, bewegen Sie die Platte so, dass die Nadel direkt über und in der Nähe der ersten Larven positioniert ist.
- Bewegen Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator, legen Sie die Nadel durch das Gewebe um die otische Vesikel, um durch in die Hinterhirn-Herzkammer zu durchdringen. Bewegen Sie die Platte mit der anderen Hand nach Bedarf, um die richtige Ausrichtung der Larve mit dem Winkel der Nadel zu erhalten.
- Überprüfen Sie visuell, ob sich das Ende der Nadel in der Mitte des Hinterhirnventrikels befindet, drücken Sie das Fußpedal, um Sporen zu injizieren, und ziehen Sie die Nadel sanft zurück.
HINWEIS: Der phenolrote Farbstoff sollte in erster Linie innerhalb der Hinterhirnkammer bleiben. Eine kleine Menge kann in das Mittelhirn gehen, aber es sollte nicht das Vorderhirn oder außerhalb des Gehirns erreichen. Wenn dies der Fall ist, ist das injizierte Volumen zu groß, und der Druck und die Zeit sollten entsprechend verringert werden, oder eine neue Nadel sollte kalibriert werden. - Bewegen Sie die Platte nach unten, injizieren Sie alle Larven in dieser Reihe. Drehen Sie dann die Platte um und injizieren Sie alle Larven in die andere Reihe.
HINWEIS: Erfolglos injizierte oder versehentlich beschädigte Larven können durch 1) Einspritzen in das Eigelb ein paar Mal markiert werden, um eine rote Markierung zu erstellen oder 2) ziehen Sie die Larve aus der Reihe mit der Nadel. - Bewegen Sie die Nadel wieder nach oben und aus dem Weg. Zoomen Sie auf eine niedrigere Vergrößerung des Mikroskops. Der phenolrote Farbstoff sollte weiterhin im Hinterhirn jeder Larve sichtbar sein.
- Zuerst ziehen Sie weg mit Haarschleifenwerkzeug und Pipette bis zu allen Larven mit erfolglosen Injektionen zu entsorgen. Die restlichen Larven in eine neue Petrischale geben, indem Sie sie mit frischem sterilem E3 und einer Transferpipte vom Teller waschen.
- Wiederholen Sie dies bei Bedarf für die gewünschte endgültige experimentelle Probennummer.
- Spülen Sie Larven mindestens 2x mit E3 und sorgen Sie für die Erholung von der Anästhesie.
- Um das Überleben ohne weitere Behandlung mit einer Transferpipette zu quantifizieren, übertragen Sie Larven in eine 96-Wellplatte (1 Larve pro Brunnen) in E3.
4. Ermittlung von injizierten und lebensfähigen Sporennummern
- Unmittelbar nach der Injektion, mit einer Transferpipette, nach dem Zufallsprinzip etwa acht der injizierten Larven pflücken und in 1,7 ml Zentrifugenrohre (eine Larve pro Rohr) übertragen.
- Larven mit Tricain einschläfern oder bei 4 °C für 0,5–2,0 h platzieren.
- Bereiten Sie 1 ml 1 mg/ml Ampicillin und 0,5 mg/ml Kanamycin-Antibiotikalösungen in sterilen 1x PBS vor. Die Restlösung kann bei 4 °C gelagert und später verwendet werden.
HINWEIS: Lagerlösungen von Ampicillin bei 100 mg/ml und Kanamycin 50 mg/ml können vorgefertigt, filtersterilisiert und in Aliquots bei -20 °C gelagert werden. Verdünnen Sie diese 100x in 1x PBS, um die Arbeitslösung zu erhalten. - Mit einer Pipette so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Zentrifugenrohr entfernen, die Larve zurücklassen und 90 L des 1x PBS mit Antibiotika hinzufügen.
HINWEIS: Antibiotika werden verwendet, um bakterielles Wachstum in GMM-Platten zu verhindern, die mit dem Zählen von Aspergillus-Kolonien stören können. - Larven in einem Gewebelyser bei 1.800 Schwingungen/min (30 Hz) für 6 min homogenisieren. Spin down bei 17.000 x g für 30 s.
- Etikett GMM Platten (eine Platte pro homogenisierte Larven). Mit einem Bunsenbrenner, um eine sterile Umgebung zu schaffen, pipette die homogenisierte Suspension von einem Rohr in die Mitte der GMM-Platte, dann mit einem Einweg-L-förmigen Streuer verteilen. Vermeiden Sie es, das Homogenat gegen die Felge auszubreiten.
- Inkubieren Sie die Platten 2–3 Tage lang bei 37 °C auf den Kopf und zählen Sie die Anzahl der gebildeten Kolonien (KBE).
- Um die Anzahl der Sporen während der Infektionszeit lebend zu messen, pflücken Sie Larven aus der 96-Wellplatte nach der Injektion (dpi) und übertragen Sie sie in Zentrifugenrohre. Lvenis und homogenisieren Larven, um sich auf GMM-Platten auszubreiten, wie in den Schritten 4.1–4.5 beschrieben.
5. Medikamentöse Behandlung von injizierten Larven
- Nach Abschnitt 4 die restlichen injizierten Larven in zwei 3,5-mm-Gerichte aufteilen: eines für die medikamentöse Behandlung und eines für die Kontrolle. Verwenden Sie etwa 24 infizierte Larven pro Zustand.
HINWEIS: Die 3,5 mm Geschirr können mit 2% fettfreier trockener Milch in Wasser behandelt, gespült, luftgetrocknet und vorher bei RT gelagert werden. Die Beschichtung mit Milch verhindert, dass Larven am Kunststoff kleben. - Bereiten Sie die gewünschte Wirkstofflösung und das Fahrzeug in E3 ohne Methylenblau in konischen Rohren entsprechend der erforderlichen Endkonzentration vor, dann gut mischen. Um beispielsweise das Überleben von Larven zu überwachen, die Dexamethason ausgesetzt sind, verwenden Sie 24 Larven (Replikationen) für Dexamethason und 24 für die Fahrzeugsteuerung, z. B. DMSO. Bereiten Sie 5 ml der Arzneimittellösung in der erforderlichen Konzentration vor. Hierbei wurden 5 ml 0,1% DMSO und 10 M Dexamethason verwendet, und 24 Larven/Bedingung wurden auf 200 l der Fahrzeug-/Drogenlösung/-larven übertragen.
- Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich aus einer Schale mit einer Transferpipette und fügen Sie vorgemischte E3 mit Fahrzeugsteuerung hinzu. Wiederholen Sie dies mit vorgemischtem E3, das die Behandlung von Interesse für die andere Schale enthält.
- Mit einer Pipette Larven in 96 Brunnenplatte (eine Larve pro Brunnen) übertragen. Überwachen Sie das Überleben der injizierten Larven, die dem Fahrzeug oder dem Medikament für 7 Tage ausgesetzt sind.
HINWEIS: Das Medikament kann nur am Tag der Infektion angewendet und während des gesamten Experiments auf den Larven gehalten oder täglich aufgefrischt werden.
6. Tägliche Abbildung infizierter Larven mit dem Zebrafisch Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging (zWEDGI)
- Stellen Sie sicher, dass Larven mit 100 N-Phenylthiourea (PTU) bei 24 hpf behandelt werden, um Pigmentierung zu verhindern, und dass PTU während des gesamten Experiments auf den Larven gehalten wird.
HINWEIS: PTU bei 75–100 m verhindert die Pigmentierung von Larven ohne grobe Entwicklungsfehler24. Jedoch, PTU kann mit einigen biologischen Prozessen stören25, und Forscher sollten im Voraus bestimmen, ob das Medikament kann alle Prozesse in Untersuchung beeinflussen. - Infizieren Sie transgene Larven mit markierten Zellpopulationen von Interesse bei 2 dpf mit Aspergillus Sporen entwickelt, um ein fluoreszierendes Protein auszudrücken, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Dann übertragen Sie infizierte Larven in Brunnen einer 48-Well-Platte in ca. 500 l/Well von E3 ohne Methylenblau.
HINWEIS: Hier wird eine 48-Well-Platte verwendet, da es einfacher ist, Larven während der wiederholten täglichen Bildgebung in und aus zu übertragen. - Am Tag der Bildgebung zwei 3,5-mm-Petrischalen zubereiten: eine mit 100 M PTU und eine mit E3-Tricain.
- E3-Tricain in die Kammern eines zWEDGI-Geräts26,27. Entfernen Sie unter dem Stereomikroskop Luftblasen aus den Kammern und den Rückhaltekanal mit einer P100-Mikropipette. Entfernen Sie alle überschüssigen E3-Tricaine, so dass es nur in den Kammern ist.
- Pipette eine Larve von der Platte mit einer Transferpipette. Wenn viel Flüssigkeit verwendet wird, um es zu entfernen, Pipette in eine 3,5 mm Schale mit E3-PTU enthalten. Dann, Pipette wieder, mit so wenig Flüssigkeit wie möglich, und in E3-Tricain übertragen.
- Warten Sie 30 s auf die Anästhesie und übertragen Sie sie dann in die Ladekammer der Verwundungs- und Einschlussvorrichtung (z.B. zWEDGI).
- Positionieren Sie unter dem Stereomikroskop die Larve. Verwenden Sie die Mikropipette P100, um E3-Tricain eaus aus der Wickelkammer zu entfernen und in die Ladekammer zu lassen, um den Schwanz der Larve in den Restriktionskanal zu bewegen. Stellen Sie sicher, dass die Larve auf ihrer seitlichen, dorsalen oder dorso-lateralen Seite positioniert ist, sodass das Hinterhirn mit einer invertierten Objektivlinse abgebildet werden kann.
- Bildlarve mit konfokaler Mikroskop.
- Nach der Bildgebung, mit der P100 Pipette, lassen Sie E3-Tricain e3-Tricain in die Wickelkammer, um die Larve aus dem rückhaltebaren Kanal in die Ladekammer zu schieben.
- Mit einer Transferpipette die Larve abholen und mit E3-Tricaine zurück in die Petrischale geben. Mit so wenig Flüssigkeit wie möglich, übertragen Sie es auf die Petrischale mit E3-PTU. Spülen Sie in PTU und übertragen Sie zurück in die 48 Well Platte.
Representative Results
Nach der Mikroinjektion von Aspergillus Sporen in das Hinterhirn von Zebrafischlarven, Infektion Ergebnis kann durch mehrere Assays gefolgt werden, einschließlich Überleben, KBE, und Live-Bildgebung. In einem Überlebenstest wurde die Anzahl der infizierten Larven, die 1–7 dpi überlebten, überwacht. Wenn Wildtyplarven unbehandelt blieben, wurde nur sehr wenig Tod beobachtet, wobei 80 %-100% der Larven das gesamte Experiment überlebten(Abbildung 1). Wenn Larven immunsuppressiv waren, z. B. durch Exposition gegenüber dem Kortikosteroid Dexamethason (10 M), wurde ein signifikant verringertes Überleben beobachtet (Abbildung 1).
Als KBE während des 7-tägigen Experiments von Wildtyplarven quantifiziert wurden, die mit A. fumigatus sporen infiziert waren, wurde die Persistenz von Sporen beobachtet, mit langsamer Clearance im Laufe der Zeit (Abbildung 2A). Die Anzahl der Sporen, die bei 1, 2, 3, 5 und 7 dpi überlebten, wurde auf die Anzahl der Sporen normalisiert, die bei 0 dpi injiziert wurden, um Persistenz und Clearance über Replikationen hinweg zu vergleichen (Abbildung 2B).
Transgene Fischlinien, die fluoreszierende Proteine in Leukozyten zusammen mit fluoreszierenden Protein-exezierenden Aspergillus-Sporen exezieren, können verwendet werden, um sowohl Leukozytenrekrutierung und -verhalten als auch Pilzkeimung und Wachstum zu visualisieren13. Wenn Makrophagen beschriftet wurden (z. B. Tg(mpeg1:H2B-GFP)), wurde in der Regel eine Makrophagenclusterbildung in 50 % der Larven beobachtet, beginnend mit 2–3 dpi (Abbildung 3A). Neutrophile (Tg(lyz:BFP)) Rekrutierung wurde in der Regel verzögert, tritt in erster Linie nach Pilzkeimung aufgetreten (Abbildung 3A). Während die Pilzbelastung während des gesamten Experiments in der Mehrzahl der Larven fortbestand (Abbildung 3A), wurde die Clearance beobachtet (Abbildung 3B). Bei einigen Larven wurde die Pilzbelastung außerhalb des Hinterhirns auch später bei einer Infektion beobachtet, aufgrund der Pilzverbreitung, wahrscheinlich in Makrophagen.
Das Gebiet um das otische Vesikel ist ein möglicher Ort, an dem diese Verbreitung zu finden ist (Abbildung 3C). Diese Beobachtungen wurden im Laufe des gesamten Experiments in mehreren Einzellarven quantifiziert (Abbildung 4). Typischerweise wurde die Keimung bei 60% der Larven um 5 dpi beobachtet (Abbildung 4A). Phagozyten-Cluster-Bereich, MakrophagenRekrutierung und Neutrophilrekrutierung variieren sowohl im Laufe der Zeit als auch über Larven hinweg, wobei einige Trends während des Experiments und einige Imkundungen im Laufe der Zeit(Abbildung 4B,C,D) liegen.
Abbildung 1: Repräsentative Überlebensanalyse infizierter Larven. Aspergillus-infizierteLarven wurden der Fahrzeugkontrolle (DMSO) oder Dexamethason (Dex) ausgesetzt, und das Überleben wurde überwacht. Daten stellen drei gepoolte Replikationen dar. Durchschnittliche Injektions-KBE: DMSO = 30, Dex = 29 (p-Wert und Hazard Ratio wurden durch Cox proportional hazard Regression Analysis berechnet, ****p < 0.0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative KBE zählt von einzelnen infizierten Larven unmittelbar nach der Injektion (0 dpi) und während des Infektionsverlaufs (2, 3, 5 und 7 dpi). Acht infizierte Larven wurden homogenisiert und plattiert, um die KBE für jeden Zeitpunkt zu zählen und zu replizieren. (A) Beispieldaten aus einer Replikation. Jeder Punkt stellt eine Larve dar, Balken stellen Mittelwerte für jeden Zeitpunkt dar. (B) Die KBE-Zählungen wurden auf die CFU-Anzahl bei 0 dpi für jede Replikation normalisiert, und drei Replikationen wurden gepoolt. Die Daten wurden zwischen experimentellen Bedingungen anhand der Varianzanalyse verglichen und in Form von geschätzten Grenzmitteln und Standardfehlern zusammengefasst. Asterix stellen eine statistische Signifikanz im Vergleich zu CFU bei 0 dpi dar (*p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder von Infektionsexperimenten. PTU-behandelte Larven mit fluoreszierenden Makrophagen (mpeg1:H2B-GFP) und Neutrophilen (lyz:BFP) wurden mit RFP-exezierenden A. fumigatusinjiziert. Lebende, infizierte Larven wurden wiederholt bei 2, 3 und 5 dpi auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Es werden Maximale Intensität Z-Projektionsbilder angezeigt. Schemata von Larven geben die Position der Bildgebung für jedes Panel an. Alle Skalenstäbe stellen 100 m dar, mit Ausnahme der eingesteckten Skalenstäbe, die 25 m betragen. (A) Die gezeigten Bilder stammen von einer einzelnen Larve, die bei 2, 3 und 5 dpi aufgenommen wurde, was einem typischen Infektionsverlauf entspricht. Insets zeigen Pilzkeimung an den Tagen 3 und 5. (B) Repräsentatives Bild der Untermenge der Larven, die die Infektion löschen können, mit geringer Pilzbelastung und nicht viel Entzündung bei 5 dpi. (C) Repräsentatives Bild der Gruppe von Larven, bei der sich die Infektion zu späteren Zeitpunkten aus dem Hinterhirn verbreitet. In diesem Bild, Pilze, Makrophagen, und Neutrophile können um und unter dem otischen Vesikel gefunden werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Quantifizierung von bildgebenden Experimenten. Bilder aus dem Versuchsaufbau in Abbildung 3 wurden auf Pilzkeimung und Leukozytenrekrutierung analysiert. (A) Larven wurden für das Vorhandensein von gekeimten Sporen an jedem Tag bewertet, und der Prozentsatz der Larven mit Keimung wurde berechnet. (B,C,D) Jede einzelne Larve wird als eine andere Farblinie dargestellt. Phagozyten-Cluster-Erscheinungsbild und -Größe (B), Makrophagenrekrutierung (C) und Neutrophilenrekrutierung (D) wurden im Laufe des 5-tägigen Experiments für jede Larve verfolgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Das hier beschriebene Infektionsmodell ist vorteilhaft für die Analyse der Wirtsimmunreaktionen, Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen und Pilzpathogenese12,13,14,15. Diese Informationen können aus der hochauflösenden Bildgebung von fluoreszierenden Pathogenen und Wirtszellen13,Larvenüberleben und KBE-Persistenz im Laufe der Zeit abgeleitet werden.
Die Mikroinjektionstechnik ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls und muss möglicherweise angepasst werden, wenn verschiedene Mikroinjektionsgeräte und -einstellungen verwendet werden. Insbesondere sind der Druck und die Zeit der Injektion zwei Hauptvariablen und können angepasst werden, um sicherzustellen, dass das von der Nadel ausgeworfene Volumen 3 nL beträgt. Die Größe der Nadel, die durch Clipping mit Zangen bestimmt wird, reguliert auch die Anzahl der Sporen, die injiziert werden; obwohl eine größere Öffnung Gewebeschäden an der Larve verursachen kann. Auf der anderen Seite lässt eine zu kleine Öffnung die relativ großen Sporen (>2 m) nicht heraus und kann zu einer Nadelverstopfung führen. In diesem Fall kann die Nadel zurückgelehnt werden, um eine etwas größere Öffnung zu haben.
Andere Protokolle für die Mikroinjektion von Bakterien nutzen PVP-40, um eine homogene Injektionsmischung aufrechtzuerhalten, aber wir haben keinen Vorteil bei der Verwendung dieses Trägers mit Aspergillus Sporen gefunden. Verstopfung der Nadel kann durch Wirbeln der Pilzzubereitung gründlich gemildert werden, um klumpende Klumpen vor dem Beladen der Nadel zu brechen. Manchmal kann ein Verstopfen in der Nadel auch durch vorübergehende Erhöhung des Drucks oder der Injektionszeit und Auslösen des Mikroinjektors, während sich die Nadel in der Flüssigkeit um die Larven befindet, entfernt werden. Der Druck und die Einspritzzeit sollten dann wieder auf ein früheres Niveau reduziert werden. In anderen Fällen kann ein Verstoclog nicht entfernt werden, und eine neue Nadel muss geladen und neu kalibriert werden.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Sporen pro Larve zu injizieren. Es ist bekannt, dass diese Zahl aufgrund der Konzentration der Sporenzubereitung und des injizierten Volumens recht gering ist. Es wurde jedoch empirisch festgestellt, dass dies die Anzahl der Sporen ist, die unter diesen Bedingungen injiziert werden. Warum dieser Unterschied auftritt, ist unbekannt, aber es kann durch Sporenklumpen in der Nadel sein. Unsere eigenen Versuche, eine größere Anzahl von Sporen zu injizieren, waren weitgehend erfolglos.
Um sicherzustellen, dass etwa 30–70 Sporen injiziert werden und die Konsistenz der Injektionen in allen Larven erhalten bleibt, überprüfen Sie die Anzahl der Sporen, indem Sie die Larven in die E3 einspritzen. Wiederholen Sie dies alle fünf bis sechs Larven während aller Injektionen. Wenn sich die Sporenzahl zu ändern scheint, kann der Druck und/oder die Injektionszeit eingestellt werden, um eine konsistente Anzahl von Sporen über mehrere Larven zu injizieren. Allerdings sollte darauf geachtet werden, dass die Injektionsdosis in erster Linie im Hinterhirn verbleibt und das Mittelhirn und das Vorderhirn nicht füllt.
Um eine lokalisierte Infektion zu gewährleisten, sollte die Sporensuspension in der Hinterhirnkammer enthalten sein. Dies kann durch die phenolrote Färbung kurz nach der Injektion visualisiert werden, obwohl die rote Farbe mit der Zeit diffundiert. Bei Injektionen wird der Bereich um das otische Vesikel verwendet, um den Ventrikel in einem Winkel von 45°–65° zu durchdringen und zu erreichen. Dieser Bereich hat keine Hauptblutgefäße, verursacht weniger Gewebeschäden, und heilt sofort. Wenn die Haut über dem Ventrikel durchbohrt ist, kann die Sporensuspension austreten, da die Nadel, die für Aspergillus Sporeninjektionen verwendet werden muss, größer ist, als die für bakterielle Suspensionen verwendet wird. Erfolglos injizierte oder versehentlich beschädigte Larven können durch Einspritzen in das Eigelb ein paar Mal markiert werden, um eine rote Markierung zu erstellen oder indem die Larve mit der Nadel aus der Reihe gezogen wird. Nachdem ein Satz Von Injektionen abgeschlossen ist, sollten diese Larven entfernt und entsorgt werden, bevor der Rest von der Platte gewaschen wird. E3 ohne Methylenblau wird verwendet, um Larven vor der Injektion zu beächen und auch Larven nach den Injektionen zu halten, da Methylenblau antimykotisch ist.
Zum Zeitpunkt der Injektion stellen die KBE-Zahlen die Anzahl der lebensfähigen Sporen innerhalb des infizierten Wirts dar. Wenn die Sporen jedoch zu Hyphen keimen, können diese während der Homogenisierung in separate lebensfähige "Pilzeinheiten" zerlegt werden und mehrere Kolonien hervorrufen. Oder eine ungebrochene mehrzellige Hypha kann zu einer einzigen Kolonie führen, was zu einer gemittelten, aber ungenauen Darstellung der Pilzlast führt. Dies kann durch die Kombination der KBE-Zahlen mit der Längsmikroskopie einzelner Larven gemildert werden, die visuelle Daten über das Schicksal der injizierten Sporen liefert.
Im Vergleich zum Säugetiersystem ist das Modell der Zebrafischlarveninfektion aufgrund seiner optischen Zugänglichkeit besonders bedeutsam. Die Rekrutierung und Reaktion angeborener Immunzellen kann innerhalb eines intakten Lebenden Wirts visualisiert werden. Dies kann mit genetischer oder chemischer Hemmung molekularer Targets integriert werden, um zu analysieren, wie jedes Ziel die Makrophagen- oder Neutrophilenreaktion gegen Aspergillussporen bei einem lebenden Tier beeinflusst.
Während die Zebrafisch Larve Aspergillus Infektionmodell weiterhin entscheidend bei der Beschreibung verschiedener Aspekte von IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, gibt es andere Bereiche der Expansion. Von der Wirtsseite aus wird es verwendet, um immunikuläre Immunantworten zu beschreiben, aber dies kann erweitert werden, um Immunmechanismen auf molekularer Ebene zu analysieren, indem es mit gezieltem Morpholino, CRISPR, stabilen mutierten Linien oder chemischer Exposition kombiniert wird. Eine Einschränkung ist, dass Homologe für alle bekannten angeborenen Immunwegkomponenten von Säugetieren bei Zebrafischen nicht identifiziert wurden.
Von der Pathogenseite aus wurden Virulenz verschiedener Arten und Stämme beschrieben. Ein vielversprechender Weg zukünftiger Forschung ist die Verwendung mutierter Aspergillus-Stämme, um zu testen, wie bestimmte Gene oder Proteine als Virulenzfaktoren beitragen. Dadurch können neuartige Antimykotika entwickelt werden, um diese Proteine gezielt zu nehmen. Aktuelle Anti-Pilz-Medikamente haben geringe Wirksamkeit bei menschlichen Patienten und es gibt wachsende Resistenz gegen diese Medikamente in Pilzen28. Dieses In-vivo-Modell kann verwendet werden, um zu untersuchen, warum diese Medikamente versagen und als Zwischenmodell, um die Wirksamkeit neuer Anti-Pilz-Medikamente zu testen. Insgesamt können die mit diesem Modell entdeckten Erkenntnisse die zukünftige Entwicklung wirksamer Behandlungen für Aspergillus-infiziertePatienten erleichtern.
Disclosures
Keine Konflikte oder finanziellen Interessen offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Allergy And Infectious Diseases der National Institutes of Health unter der Award-Nummer K22AI134677 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
| Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
| Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
| Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
| Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
| BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
| L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
| Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
| Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
| N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
| Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Media and Solutions | Components/Recipe | ||
| E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
| Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
| Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
| 20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
| Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
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