Summary
Este protocolo describe un modelo de infección por Aspergillus en larvas de pez cebra. Las esporas de Aspergillus se microinyectan en el cerebro posterior de las larvas, y el tratamiento químico se utiliza para inducir la inmunosupresión. La progresión de la infección se supervisa a través de una configuración de imágenes diaria para controlar el crecimiento de hongos y las respuestas inmunitarias, así como la enumeración de esporas vivas por la colonia que forma el revestimiento de la unidad.
Abstract
La aspergilosis invasiva (AI) es una de las infecciones fúngicas más comunes entre los individuos inmunodeprimidos. A pesar de la disponibilidad de fármacos antimicóticos, la AI puede causar >50% de mortalidad en pacientes inmunodeprimidos infectados. Es crucial determinar los factores del anfitrión y del patógeno que contribuyen a la susceptibilidad de la infección y a las tarifas de supervivencia bajas en pacientes infectados para desarrollar la terapéutica nueva. Las respuestas inmunes innatas juegan un papel fundamental en el reconocimiento y el aclaramiento de las esporas de Aspergillus, aunque poco se sabe sobre los mecanismos celulares y moleculares exactos. Se requieren modelos confiables para investigar las interacciones mecanicistas detalladas entre el huésped y el patógeno. La claridad óptica y la capacidad de tracción genética de las larvas de pez cebra las convierten en un modelo intrigante para estudiar las interacciones huésped-patógeno de múltiples infecciones bacterianas y fúngicas humanas en un huésped vivo e intacto. Este protocolo describe un modelo larval de la infección del aspergillus del pez cebra. En primer lugar, las esporas de Aspergillus se aíslan e inyectan en el ventrículo del cerebro posterior del pez cebra a través de la microinyección. Luego, los inhibidores químicos como los fármacos inmunosupresores se agregan directamente al agua larvaria. Dos métodos para supervisar la infección en larvas inyectadas se describen, incluyendo el 1) homogeneización de las larvas para la enumeración de la unidad de formación de la colonia (CFU) y 2) una configuración viva repetida, diaria de la proyección de imagen. En general, estas técnicas se pueden utilizar para analizar mecánicamente la progresión de la infección por Aspergillus in vivo y se pueden aplicar a diferentes fondos del huésped y cepas de Aspergillus para interrogar las interacciones huésped-patógeno.
Introduction
Aspergillus fumigatus es un hongo saprofítico ubicuo, y sus esporas en el aire se pueden encontrar tanto en interiores como en exteriores1. Estas esporas son inhaladas por todos, pero se eliminan eficazmente de los pulmones de los individuos inmunocompetentes1,2. Sin embargo, las personas con afecciones pulmonares alteradas como la fibrosis quística pueden desarrollar aspergilosis broncopulmonar debido a la germinación fúngica en los pulmones3. La forma más grave de esta infección, la aspergilosis invasiva (IA), afecta a individuos inmunodeprimidos e implica el crecimiento del hongo en otros órganos2,3. La AI conduce a >50% de muerte de pacientes infectados a pesar de la disponibilidad de terapias antifúngicas4. En individuos inmunocompetentes, las respuestas inmunitarias innatas juegan un papel importante en la eliminación de las esporas inhaladas1. Sin embargo, los mecanismos específicos que contribuyen a este aclaramiento inmune innato no se entienden bien. Es importante entender los mecanismos celulares y moleculares de las principales células inmunitarias innatas (es decir, macrófagos y neutrófilos) en el aclaramiento de Aspergillus con el fin de encontrar nuevas estrategias terapéuticas para la AI.
Mientras que los modelos de mamíferos han sido fundamentales en la identificación de factores de virulencia fúngica y respuestas inmunes del huésped5,6,la accesibilidad visual es limitada para las interacciones huésped-patógeno a nivel celular. Los experimentos de cultivo de tejidos no pueden recapitular completamente el complejo entorno multicelular y las interacciones que existen en animales enteros7. Por lo tanto, el pez cebra ha ganado popularidad como un organismo modelo alternativo para llenar este vacío y facilitar el estudio de las interacciones huésped-patógeno en un huésped vivo e intacto a través de una infección de variosdías 8,9. El sistema inmune innato del pez cebra se desarrolla tan pronto como 24 h después de la fertilización (hpf)10,y el sistema adaptativo tarda 4-6 semanas en desarrollarse11,proporcionando una ventana de tiempo en la que las respuestas inmunes innatas se pueden evaluar de forma aislada. Las respuestas inmunitarias innatas están bien conservadas entre los humanos y el pez cebra11. El pez cebra tiene muchas cualidades que facilitan la investigación de estas respuestas, incluyendo la claridad óptica (que permite la obtención de imágenes vivas de alta resolución de huéspedes intactos) y la capacidad de tracción genética (que facilita los estudios mecánicos moleculares).
El modelo larval de infección por Aspergillus de pez cebra descrito aquí fue desarrollado originalmente por Knox et al.12. Recientemente ha sido ampliado por nuestro grupo y otros para investigar los mecanismos inmunes del huésped12,13,las interacciones huésped-patógeno13,14,15,los mecanismos de inmunosupresión13,16,17,la virulencia fúngica18,y la eficacia de los fármacos antifúngicos19,20. Este modelo recapitula múltiples aspectos de la aspergilosis humana. Mientras que las larvas inmunocompetentes son resistentes, las larvas inmunocomprometidas pueden sucumbir a la infección12,13,16,17.
En este modelo, se establece una infección localizada mediante la inyección de esporas en el ventrículo del cerebro posterior de la larva, un área menos poblada de fagocitos, y se puede evaluar el reclutamiento y el comportamiento de los fagocitos12,13. Se cree que los macrófagos actúan como la primera línea de defensa contra las esporas de Aspergillus en humanos1 y modelos mamíferos6,21. Del mismo modo, en el modelo de pez cebra, los macrófagos se reclutan para las esporas de Aspergillus inyectadas, mientras que los neutrófilos se reclutan secundariamente en respuesta al crecimiento hifal12,13,22. A partir de este modelo, también se ha aprendido que aspergillus puede persistir en larvas inmunocompetentes de tipo salvaje después de más de 7 días de infección. Además, el curso entero de la infección se puede seguir en los mismos animales vivos por proyección de imagen confocal diaria.
Este protocolo describe la técnica de microinyección para inyectar esporas en el ventrículo del cerebro posterior de 2 días de larvas post-fertilización (2 dpf). La infección se monitorea hasta por 7 días, ya que las larvas de pez cebra pueden vivir hasta 10 dpf sin alimentarse. La immunosupresión se puede inducir por el tratamiento de la droga, y el uso de drogas a las larvas también se describe. Finalmente, dos métodos para seguir la progresión de la infección se describen, incluyendo la cuantificación de CCU de larvas individuales y una configuración diaria de imágenes en vivo.
Protocol
Los investigadores deben obtener la aprobación para todos los experimentos con animales de los comités apropiados de cuidado y uso de animales. Los datos representativos que se muestran en este artículo provienen de experimentos realizados bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Clemson (AUP2018-070, AUP2019-012).
1. Preparación de esporas de Aspergillus para inyección
- A partir de una suspensión de esporas de Aspergillus, calcule el volumen necesario para obtener 1 x 106 esporas. El volumen debe ser de 20–100 μL; si no, producir una dilución de 10x en Tween-20 estéril al 0,01% (v/v); Tabla de Materiales). Por ejemplo, si el volumen calculado es de 5 μL, producir una dilución de 10x y utilizar 50 μL de la solución diluida.
NOTA: Se pueden preparar dos placas/cepa para recolectar más esporas o como repuesto en caso de contaminación. - Esparcir 1 x 106esporasde Aspergillus en una placa de medios mínimos de glucosa (GMM)(Tabla de Materiales)con un esparcidor estéril desechable en forma de L en un gabinete de bioseguridad. Evite extenderse al margen de la placa. Incubar a 37 °C durante 3-4 días, con la placa boca abajo.
- El día de la recolección, traiga el miracloth estéril y los tubos cónicos de 50 ml (dos por cepa), botellas frescas de agua Tween estéril (una por cepa) y esparcidores estériles desechables en forma de L al gabinete de bioseguridad.
NOTA: Miracloth se puede cortar en ~ 8 en x 6 en pedazos, envuelto en papel de aluminio y autoclavado para esterilizar. - Coloque una pieza de miracloth en cada tubo cónico de 50 mL etiquetado y vuelva a tapar. Saque el paquete de miracloth restante de la campana.
- Traiga placas al gabinete de bioseguridad. Abra una placa, luego vierta agua de interpolación en la parte superior para cubrir aproximadamente tres cuartas partes de la placa.
- Usando un esparcidor desechable en forma de L, raspe suavemente la superficie del cultivo de hongos en un movimiento de ida y vuelta, mientras usa la otra mano para girar la placa. Raspe hasta que casi todas las esporas se homogeneicen en el agua de preadolescente.
NOTA: Debido a la alta hidrofobicidad, las esporas pueden crear "caladas" cuando se agrega agua de interpolación o durante el raspado. Se debe tener mucho cuidado para evitar la contaminación de los tubos o placas cercanas. Se aconseja cambiar los guantes y limpiar la superficie con etanol al 70% entre la extracción de diferentes cepas. - Tome un tubo cónico de 50 mL y retire el pedazo de miracloth. Dóblelo por la mitad y consérértalo en un filtro insertado en la parte superior del tubo cónico de 50 mL.
- Vierta el homogeneato fúngico de la placa sobre el miracloth en el tubo.
NOTA: Si se preparan dos placas de una cepa, raspe ambas placas y viertalas en el mismo tubo cónico. - Vierta Tween-water para llevar el volumen total en el tubo cónico a 50 mL.
- Girar a 900 x g durante 10 min. Asegúrese de usar tapas que previenen la aerosolización en la centrifugadora.
- Vierta el sobrenadante en ~ 10% solución de lejía para descontaminar. Vierta 50 mL de PBS estéril 1x en el tubo cónico, luego vórtice o agitación para resuspend el pellet.
- Girar de nuevo a 900 x g durante 10 min. Vierta el sobrenadante y resuspend el pellet en 5 mL de PBS estéril 1x. Filtre a través de un pedazo fresco de miracloth en un tubo cónico fresco de 50 mL.
- Haga diluciones seriales de 10 veces (10x, 100x, 1000x) del homogeneato de hongos en tubos centrífugos de 1,7 mL (por ejemplo, para la solución 10x, mezcle 100 μL del homogeneato fúngico con 900 μL de agua de preadolescente).
- Elija la primera dilución en la que las esporas no son visibles cuando se descarga en el agua de interpolación y utilice esta dilución para contar el número de esporas utilizando un hemocitómetro.
- Calcule la concentración de esporas en el homogeneato fúngico preparado (suspensión de agua) utilizando la siguiente fórmula:
Concentración (esporas/mL) = Número de esporas en el centro de 25 cajas x factor de dilución x 104 - Preparar un stock de 1 mL de 1,5 x 108 esporas/mL en PBS estéril de 1x en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Esta preparación de esporas se puede almacenar a 4 °C durante ~ 4 semanas.
- Antes de su uso en inyecciones, mezcle 20 μL de la preparación de esporas con 10 μL de fenol estéril al 1% en un tubo centrífugo de 1,7 mL para lograr una concentración final de esporas de 1 x 108 esporas/mL. Vórtice a fondo antes de la inyección.
NOTA: La solución de color rojo fenol al 1% debe esterilizarse con filtro y almacenarse en alícuotas. - Para un simulacro de inyección, mezcle 20 μL de 1x PBS con 10 μL de rojo fenol estéril al 1%.
2. Preparación de placas de agar para inyección
- Preparar agarosa al 2% en medio E3 y fundir en un microondas.
- Verter en una placa de Petri de 100 mm x 15 mm (~ 25 mL por plato), girar para cubrir la placa uniformemente y dejar enfriar.
- Envuelva la placa con película de parafina y guárdelo invertido a 4 °C.
- Antes de la inyección, lleve la placa a temperatura ambiente (RT).
- Vierta ~ 1 mL de filtro esterilizado al 2% de albúmina sérica bovina (BSA) sobre la placa, incline la placa para extender y cubrir toda la parte inferior, y enjuague con E3.
NOTA: La solución de BSA al 2% puede esterilizarse por filtro y almacenarse como alícuotas de 1 mL a -20 °C. El pretratamiento de BSA al 2% evita que las larvas se peguen a la superficie de la agarosa. - Vierta E3 con tricaína tamponada sobre el plato y déjelo reposar hasta la inyección.
3. Microinyección del ventrículo de la larva del cerebro posterior del pez cebra
- Decorionato manual de larvas con fórceps a 2 dpf en una placa de Petri.
NOTA: La decorionación se puede realizar en cualquier momento desde 1.5 dpf hasta el momento de la inyección. - Retire la mayor cantidad de E3 posible de la placa de Petri y agregue 300 μg/mL tricaine tamponados en E3 para anestesiar las larvas.
NOTA: Una solución común de tricaína tamponada de 4 mg/mL en E3 se puede preparar y almacenar a 4 °C. La solución de trabajo se puede hacer diluyendo 4 mL de la solución común hasta 50 mL con E3. - Utilice una configuración de microinyección suministrada con el inyector de presión, la unidad de contrapresión, el pedal, el soporte de micropipeta, el micromanipulador y un soporte y placa magnéticos, todos conectados a una fuente de aire comprimido(Tabla de materiales).
- Abra la válvula de aire comprimido y encienda el microinyector. Establezca la presión en ~25 PSI, la duración del pulso en 60 ms y la unidad de contrapresión en 1 PSI.
- Cargue una aguja de microinyección usando una punta de pipeta de microcargador(Tabla de materiales)con aproximadamente 3-5 μL de PBS preparado o suspensión de esporas con rojo fenol. Monte la aguja en el micromanipulador.
NOTA: Las agujas de microinyección se pueden preparar como se describió anteriormente23. El microscopio estéreo utilizado para las microinyecciones debe tener una retícula ocular para calibrar la aguja de microinyección. La retícula debe calibrarse con un micrómetro de etapa y debe determinarse la longitud de la escala de retícula (μm). El diámetro de la gota de suspensión de esporas que expulsa de la aguja se mide en función del número de hashes (de la retícula) que se superponen con la gota. - Coloque el micromanipulador de modo que el extremo de la aguja esté a la vista con el aumento más bajo el microscopio estéreo. Zoom a 4x aumento, manteniendo la aguja a la vista.
- Con pinzas afiladas, recorte el extremo de la aguja. Presione el pedal de inyección para visualizar el tamaño de la gota que sale. Mantenga el recorte hacia atrás hasta que se inyecten ~ 3 nL de suspensión de esporas (aquí, esto es cinco hashes).
- Mueva el micromanipulador y la aguja fuera del camino para evitar golpear accidentalmente la aguja mientras las larvas están dispuestas en la placa de inyección.
- Vierta E3-Tricaine fuera de la placa de inyección, luego transfiera ~ 24 larvas anestesiadas a la placa de inyección con el menor E3 posible usando una pipeta de transferencia.
- Usando una pequeña herramienta para manipular larvas de pez cebra (es decir, herramienta de lazo de cabello o herramienta de pestañas), organice las larvas de acuerdo con la dirección en la que se enfrentan. Específicamente, coloque todo mirando a la derecha en una fila, y todos mirando a la izquierda en una fila a continuación.
NOTA: Esta disposición es difícil si hay demasiado líquido en el plato, ya que las larvas "flotarán" fuera de lugar. Sin embargo, muy poco líquido también es problemático si las inyecciones toman mucho tiempo, ya que las larvas pueden secarse o la anestesia desaparecer. Por lo tanto, se debe prestar especial atención a la cantidad de líquido en la placa a lo largo de todo el proceso de microinyección. - Ajuste el zoom del microscopio al aumento más bajo. Traiga el micromanipulador de vuelta y arregle para que la aguja esté cerca de las larvas, en un ángulo de ~ 30 ° a 60 °, en el centro del campo de visión.
- Acerque el zoom al aumento más alto y use perillas de ajuste finas para ajustar aún más la posición de la aguja. Verifique que ~30-70 esporas estén saliendo de la aguja inyectando la suspensión de esporas en el líquido en la placa junto a las larvas. Ajuste el tiempo y la presión en la configuración de la inyección, si es necesario.
NOTA: Esta prueba debe repetirse después de cada cinco a seis larvas, ya que el número de esporas que salen de la aguja puede aumentar o disminuir con el tiempo. - Comenzando con la fila en la que las larvas están mirando hacia la aguja, mueva la placa para que la aguja esté directamente encima y colocada cerca de las primeras larvas.
- Moviendo la aguja con el micromanipulador, inserte la aguja a través del tejido alrededor de la vesícula ótica para perforar a través del ventrículo del cerebro posterior. Mueva la placa con la otra mano según sea necesario para obtener la orientación correcta de la larva con el ángulo de la aguja.
- Verifique visualmente que el extremo de la aguja esté en el centro del ventrículo del cerebro posterior, presione el pedal del pie para inyectar esporas y retraiga suavemente la aguja.
NOTA: El tinte rojo fenol debe permanecer principalmente dentro del ventrículo del cerebro posterior. Una pequeña cantidad puede entrar en el mesencéfalo, pero no debe llegar al cerebro anterior o fuera del cerebro. Si lo hace, el volumen que se inyecta es demasiado grande, y la presión y el tiempo deben disminuirse en consecuencia, o se debe calibrar una nueva aguja. - Bajando por la placa, inyecte todas las larvas en esa fila. Luego, gire la placa e inyecte todas las larvas en la otra fila.
NOTA: Las larvas inyectadas sin éxito o dañadas accidentalmente pueden ser marcadas por 1) inyectar en la yema un par de veces para crear una marca roja o 2) arrastrar la larva fuera de la fila con la aguja. - Mueva la aguja hacia arriba y fuera del camino de nuevo. Aleje el zoom a un aumento más bajo en el microscopio. El tinte rojo fenol todavía debe ser visible en el cerebro posterior de cada larva.
- Primero, tire con la herramienta de lazo del cabello y la pipeta para deshacerse de cualquier larva con inyecciones fallidas. Transfiera las larvas restantes a una nueva placa de Petri lavándolas del plato con E3 estéril fresco y una pipeta de transferencia.
- Repita según sea necesario para el número de muestra experimental final deseado.
- Enjuague las larvas al menos 2 veces con E3 y asegure la recuperación de la anestesia.
- Para cuantificar la supervivencia sin ningún tratamiento adicional, utilizando una pipeta de transferencia, transfiera las larvas a una placa de 96 pozos (1 larva por pozo) en E3.
4. Establecimiento de números de esporas inyectadas y viables
- Inmediatamente después de la inyección, usando una pipeta de transferencia, recoja aleatoriamente alrededor de ocho de las larvas inyectadas y transfiéralos a tubos centrífugos de 1,7 mL (una larva por tubo).
- Eutanasiar las larvas con tricaína o colocándolas a 4 °C durante 0,5–2,0 h.
- Preparar 1 mL de 1 mg/mL de ampicilina y 0,5 mg/mL de kanamicina en 1x PBS estéril. La solución sobrante se puede almacenar a 4 °C y utilizarse más tarde.
NOTA: Las soluciones de ampicilina a 100 mg/mL y kanamicina 50 mg/mL pueden prefabricadas, esterilizarse con filtro y almacenarse en alícuotas a -20 °C. Diluir estos 100x en 1x PBS para obtener la solución de trabajo. - Usando una pipeta, retire la mayor cantidad de líquido posible del tubo de la centrífuga, dejando atrás la larva y agregue 90 μL del PBS 1x con antibióticos.
NOTA: Los antibióticos se utilizan para prevenir el crecimiento bacteriano en las placas GMM que pueden interferir con el recuento de colonias de Aspergillus. - Homogeneizar larvas en un liser tisular a 1.800 oscilaciones/min (30 Hz) durante 6 min. Gire hacia abajo a 17.000 x g durante 30 s.
- Etiquetar placas GMM (una placa por larva homogeneizada). Usando un quemador Bunsen para crear un ambiente estéril, pipetee la suspensión homogeneizada de un tubo a la mitad de la placa GMM, luego esparcido usando un esparcidor desechable en forma de L. Evite esparcir el homogeneato contra el borde.
- Incubar las placas al revés a 37 °C durante 2-3 días y contar el número de colonias formadas (UFC).
- Para medir el número de esporas vivas durante el período de infección, recoja las larvas de la placa de 96 pozos a los 1-7 días después de la inyección (dpi) y transfiéralos a tubos centrífugos. Eutanasia y homogeneización de las larvas para que se propaguen en las placas GMM como se describe en los pasos 4.1–4.5.
5. Tratamiento farmacológico de larvas inyectadas
- Después de la sección 4, divida las larvas inyectadas restantes en dos platos de 3,5 mm: uno para el tratamiento farmacológico y otro para el control. Use alrededor de 24 larvas infectadas por afección.
NOTA: Los platos de 3,5 mm se pueden tratar con leche seca sin grasa al 2% en agua, enjuagar, secar al aire y almacenar en RT de antemano. El recubrimiento con leche evitará que las larvas se peguen al plástico. - Prepare la solución de medicamento deseada y el vehículo en E3 sin azul de metileno en tubos cónicos de acuerdo con la concentración final requerida, luego mezcle bien. Por ejemplo, para monitorear la supervivencia de las larvas expuestas a la dexametasona, use 24 larvas (réplicas) para la dexametasona y 24 para el control del vehículo, como DMSO. Preparar 5 mL de la solución de la droga a la concentración requerida. Aquí, se utilizaron 5 mL de DMSO al 0,1% y 10 μM de dexametasona, y se transfirieron 24 larvas/condición a ~200 μL del vehículo/solución farmacológica/larvas.
- Retire la mayor cantidad de líquido posible de un plato con una pipeta de transferencia y agregue el E3 premezclado que contiene el control del vehículo. Repetir con E3 premezclado que contenga el tratamiento de interés para el otro plato.
- Usando una pipeta, transfiera las larvas a la placa de 96 pozos (una larva por pozo). Controlar la supervivencia de las larvas inyectadas expuestas al vehículo o al fármaco durante 7 días.
NOTA: El medicamento se puede aplicar únicamente el día de la infección y mantenerse en las larvas durante todo el experimento o se puede actualizar diariamente.
6. Imágenes diarias de larvas infectadas utilizando el dispositivo de heridas y atrapamiento de pez cebra para el crecimiento y la obtención de imágenes (zWEDGI)
- Asegúrese de que las larvas se tratan con 100 μM de N-fenilthiourea (PTU) a 24 hpf para evitar la pigmentación y que la PTU se mantiene en las larvas durante todo el experimento.
NOTA: La PTU a 75–100 μM previene la pigmentación de las larvas sin ningún defecto grave del desarrollo24. Sin embargo, la PTU puede interferir con algunos procesos biológicos25, y los investigadores deben determinar de antemano si el fármaco puede afectar a algún proceso bajo investigación. - Infectar larvas transgénicas con poblaciones celulares etiquetadas de interés a 2 dpf con esporas de Aspergillus diseñadas para expresar una proteína fluorescente, como se describe en la sección 3. Luego, transfiera las larvas infectadas a pozos de una placa de 48 pozos en aproximadamente 500 μL/pozo de E3 sin azul de metileno.
NOTA: Aquí se utiliza una placa de 48 pozos, porque es más fácil transferir larvas dentro y fuera de ella durante las imágenes diarias repetidas. - El día de la toma de imágenes, prepare dos placas de Petri de 3,5 mm: una con PTU de 100 μM y otra con E3-tricaína.
- Añadir E3-tricaína en las cámaras de un dispositivo zWEDGI26,27. Bajo el microscopio estéreo, retire las burbujas de aire de las cámaras y el canal de sujeción utilizando una micropipeta P100. Retire todo el exceso de E3-tricaine, por lo que es sólo en las cámaras.
- Pipetee una larva de la placa usando una pipeta de transferencia. Si se usa mucho líquido para eliminarlo, pipetee en un plato de 3,5 mm que contenga E3-PTU. Luego, pipetee de nuevo, usando la menor dosis de líquido posible, y transfiera a E3-tricaine.
- Espere ~ 30 s para la anestesia, luego transfiera a la cámara de carga del dispositivo de heridas y atrapamiento (por ejemplo, zWEDGI).
- Bajo el microscopio estéreo, coloque la larva. Utilice la micropipeta P100 para eliminar la E3-tricaína de la cámara de heridas y liberarla en la cámara de carga para mover la cola de la larva hacia el canal de restricción. Asegúrese de que la larva esté posicionada en su lado lateral, dorsal o dorso-lateral, de modo que el cerebro posterior se pueda fotoreccionar con una lente objetiva invertida.
- Larva de la imagen con un microscopio confocal.
- Después de la toma de imágenes, con la pipeta P100, suelte E3-tricaine en la cámara de heridas para empujar la larva desde el canal de sujeción hacia la cámara de carga.
- Usando una pipeta de transferencia, recoger la larva y transferirla de nuevo a la placa de Petri con E3-Tricaine. Usando el menor líquido posible, transfiéralo a la placa de Petri con E3-PTU. Enjuague en PTU y transfiera de nuevo a la placa de 48 pozos.
Representative Results
Después de la microinyección de las esporas de Aspergillus en el cerebro posterior de las larvas de pez cebra, el resultado de la infección puede ser seguido por múltiples ensayos, incluyendo supervivencia, UFC, y la proyección de imagen viva. En un ensayo de supervivencia, se monitorizó el número de larvas infectadas que sobrevivieron de 1 a 7 ppp. Cuando las larvas de tipo salvaje no se trataron, se observó muy poca muerte, con ~ 80%-100% de las larvas sobreviviendo a la totalidad del experimento (Figura 1). Si las larvas estaban inmunosuprimidas, por ejemplo por exposición al fármaco corticosteroide dexametasona (10 μM), se observó una disminución significativa de la supervivencia (Figura 1).
Cuando se cuantificaron las UFC a lo largo del experimento de 7 días a partir de larvas de tipo salvaje infectadas con esporas de A. fumigatus, se observó persistencia de esporas, con un aclaramiento lento a lo largo del tiempo(Figura 2A). El número de esporas que sobrevivieron a 1, 2, 3, 5 y 7 dpi se normalizó al número de esporas inyectadas a 0 dpi para comparar la persistencia y el aclaramiento a través de réplicas (Figura 2B).
Las líneas de peces transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en leucocitos junto con esporas fluorescentes de Aspergillus que expresan proteínas pueden utilizarse para visualizar tanto el reclutamiento y el comportamiento de los leucocitos como la germinación y el crecimiento de hongos13. Cuando los macrófagos fueron etiquetados (por ejemplo, Tg(mpeg1:H2B-GFP)), el agrupamiento de macrófagos en ~ 50% de las larvas se observó típicamente, comenzando en 2-3 dpi (Figura 3A). El reclutamiento de neutrófilos(Tg( lyz:BFP))se retrasó típicamente, ocurriendo principalmente después de que se haya producido la germinación de hongos (Figura 3A). Mientras que la carga fúngica persistió durante todo el experimento en la mayoría de las larvas (Figura 3A), se observó el aclaramiento (Figura 3B). En algunas larvas, la carga fungicida fuera del cerebro posterior también fue observada más adelante en la infección, debido a la difusión fungicida, probablemente en macrófagos.
El área alrededor de la vesícula ótica es un posible lugar donde se puede encontrar esta diseminación (Figura 3C). Estas observaciones se cuantificaron en múltiples larvas individuales a lo largo de todo el experimento (Figura 4). Típicamente, la germinación se observó en ~ 60% de las larvas por 5 dpi (Figura 4A). El área del grupo de fagocitos, el reclutamiento de macrófagos y el reclutamiento de neutrófilos varían tanto con el tiempo como entre las larvas, con algunas tendencias al alza a lo largo del experimento y otras que se resuelven con el tiempo (Figura 4B, C, D).
Figura 1: Análisis representativo de supervivencia de larvas infectadas. Aspergillus- las larvas infectadas fueron expuestas al control del vehículo (DMSO) o al dexamethasone (Dex), y la supervivencia fue supervisada. Los datos representan tres réplicas agrupadas. CDU de inyección promedio: DMSO = 30, Dex = 29 (el valor p y el cociente de riesgos se calcularon mediante análisis de regresión de riesgo proporcional de Cox, ****p < 0,0001). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Recuentos representativos de UFC de larvas infectadas individuales inmediatamente después de la inyección (0 dpi) y durante el curso de la infección (2, 3, 5 y 7 dpi). Ocho larvas infectadas fueron homogeneizadas y plateadas para contar la UFC para cada punto de tiempo y replicarse. (A) Datos de ejemplo de una réplica. Cada punto representa una larva, las barras representan medios para cada punto de tiempo. (B)Los recuentos de UFC se normalizaron al recuento de UFC a 0 ppp para cada réplica, y se agruparon tres réplicas. Los datos se compararon entre las condiciones experimentales mediante el análisis de varianza y se resumieron en términos de medias marginales estimadas y errores estándar. Astérix representa significación estadística comparada a CFU en 0 dpi (*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de experimentos de infección. Las larvas PTU-tratadas con los macrófagos fluorescentes (mpeg1: H2B-GFP) y los neutrófilos (lyz: BFP) fueron inyectados con RFP-expresando el fumigatus del A.. Las larvas vivas, infectadas fueron fotodas en varias ocasiones en 2, 3, y 5 dpi en un microscopio confocal. Se muestran imágenes de proyección Z de intensidad máxima. Los esquemas de las larvas indican la ubicación de las imágenes para cada panel. Todas las barras de escala representan 100 μm, excepto las barras de escala insertadas, que son de 25 μm.(A) Las imágenes mostradas son de una sola larva tomada a 2, 3 y 5 dpi, lo que representa una progresión típica de la infección. Las inserciones muestran germinación de hongos en los días 3 y 5. (B)Imagen representativa de subconjunto de larvas que pueden despejar la infección, con baja carga fúngica y no mucha inflamación a 5 dpi. (C) Imagen representativa de un subconjunto de larvas en el que la infección se disemina fuera del cerebro posterior en momentos posteriores. En esta imagen, los hongos, los macrófagos y los neutrófilos se pueden encontrar alrededor y debajo de la vesícula ótica. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4: Cuantificación representativa de los experimentos de imagen. Las imágenes de la configuración experimental en la Figura 3 fueron analizadas para la germinación de hongos y el reclutamiento de leucocitos. (A)Las larvas fueron puntuadas por la presencia de esporas germinadas en cada día, y se calculó el porcentaje de larvas con germinación. (B,C,D) Cada larva individual se representa como una línea de color diferente. El aspecto y el tamaño del racimo del fagocito (b), el reclutamiento del macrófago (c), y el reclutamiento del neutrófilo (d) fueron seguidos durante el curso del experimento de 5 días para cada larva. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Discussion
El modelo de infección descrito aquí es beneficioso para analizar las respuestas inmunitarias del huésped, las interacciones huésped-patógeno y la patogénesis fúngica12,13,14,15. Esta información se puede derivar de la proyección de imagen de alta resolución de patógenos fluorescente-marcados y de células huesped13,de la supervivencia larval, y de la persistencia de CFU en un plazo.
La técnica de microinyección es fundamental para el éxito de este protocolo y puede ser necesario ajustar cuando se utilizan diferentes equipos de microinyección y configuraciones. En particular, la presión y el tiempo de inyección son dos variables principales y se pueden ajustar para garantizar que el volumen expulsado por la aguja sea de ~ 3 nL. El tamaño de la aguja según lo determinado por el recorte con fórceps también regula el número de esporas que se inyectan; aunque, una abertura más grande puede causar daño tisular a la larva. Por otro lado, una abertura demasiado pequeña no permitirá que las esporas relativamente grandes (>2 μm) salgan y puede conducir a la obstrucción de la aguja. Si esto ocurre, la aguja se puede volver a recortar para tener una abertura ligeramente más grande.
Otros protocolos para la microinyección de bacterias utilizan PVP-40 para ayudar a mantener una mezcla de inyección homogénea, pero no hemos encontrado ninguna ventaja en el uso de este portador con esporas de Aspergillus. La obstrucción de la aguja se puede mitigar mediante el vórtice de la preparación de hongos a fondo para romper cualquier grupo antes de cargar la aguja. A veces, un zueco en la aguja también se puede desalojar aumentando temporalmente la presión o el tiempo de inyección y activando el microinyector mientras la aguja está en el líquido que rodea a las larvas. La presión y el tiempo de inyección deben disminuirse de nuevo a los niveles anteriores. En otros casos, no se puede quitar una obstrucción y es necesario cargar y recalibrar una nueva aguja.
Este protocolo está diseñado para inyectar ~30-70 esporas por larva. Se sabe que en base a la concentración de la preparación de las esporas y el volumen inyectado, este número es bastante bajo. Sin embargo, se ha encontrado empíricamente que este es el número de esporas inyectadas en estas condiciones. Se desconoce por qué se produce esta diferencia, pero puede deberse a la agrupación de esporas en la aguja. Nuestros propios intentos de inyectar un mayor número de esporas han sido en gran medida infructuosos.
Para asegurarse de que se inyectan entre 30 y 70 esporas y mantener la consistencia de las inyecciones en todas las larvas, compruebe el número de esporas inyectando en el E3 que rodea a las larvas. Repita esto cada cinco a seis larvas a lo largo de todas las inyecciones. Si el recuento de esporas parece cambiar, la presión y/o el tiempo de inyección se pueden ajustar para inyectar un número constante de esporas a través de múltiples larvas. Sin embargo, se debe tener cuidado de que la dosis de inyección permanezca principalmente en el cerebro posterior y no llene el mesencéfalo y el cerebro anterior.
Para asegurar una infección localizada, la suspensión de la espora se debe contener dentro del ventrículo del cerebro posterior. Esto se puede visualizar por la tinción de rojo fenol justo después de la inyección, aunque el color rojo se difunde con el tiempo. Para las inyecciones, la región alrededor de la vesícula ótica se utiliza para perforar y llegar al ventrículo en un ángulo de 45°-65°. Esta área no tiene vasos sanguíneos principales, causa menos daño tisular y se cura instantáneamente. Si la piel sobre el ventrículo está perforada, la suspensión de esporas se puede filtrar, porque la aguja que se debe usar para las inyecciones de esporas de Aspergillus es más grande que la que se usa para suspensiones bacterianas. Las larvas inyectadas sin éxito o dañadas accidentalmente se pueden marcar inyectando en la yema un par de veces para crear una marca roja o arrastrando la larva fuera de la fila con la aguja. Después de que se complete un conjunto de inyecciones, estas larvas deben eliminarse y desecharse antes de que el resto se lave del plato. E3 sin azul de metileno se utiliza para anestesiar las larvas antes de la inyección y también mantener la larva después de las inyecciones, porque el azul de metileno es antifúngico.
En el momento de la inyección, los recuentos de UFC representan el número de esporas viables dentro del huésped infectado. Sin embargo, si las esporas germinan en hifas, estas se pueden dividir en "unidades fúngicas" viables separadas durante la homogeneización y pueden dar lugar a múltiples colonias. O bien, una hifa multicelular ininterrumpida puede dar lugar a una sola colonia, lo que resulta en una representación promediada, pero imprecisa, de la carga fúngica. Esto se puede mitigar combinando los recuentos de UFC con microscopía longitudinal de larvas individuales, que proporciona datos visuales del destino de las esporas inyectadas.
En comparación con el sistema de mamíferos, el modelo de infección por larvas de pez cebra es particularmente significativo debido a su accesibilidad óptica. El reclutamiento y la respuesta de las células inmunes innatas se pueden visualizar dentro de un huésped vivo intacto. Esto se puede incorporar con la inhibición genética o química de dianas moleculares para analizar cómo cada diana afecta a la reacción de macrófagos o neutrófilos contra las esporas de Aspergillus en un animal vivo.
Mientras que el modelo de infección por aspergillus larva de pez cebra sigue siendo fundamental en la descripción de diferentes aspectos de IA12,13, 14,15, 16,17, 18,19,20,22,hay otras áreas de expansión. Desde el lado del huésped, se utiliza para describir las respuestas inmunes a nivel celular, pero esto se puede ampliar para analizar los mecanismos inmunes a nivel molecular combinándolo con morfolino dirigido, CRISPR, líneas mutantes estables o exposición química. Una advertencia es que los homólogos para todos los componentes conocidos de la vía inmune innata de mamíferos no se han identificado en el pez cebra.
Desde el lado patógeno, se ha descrito la virulencia de diferentes especies y cepas. Una vía prometedora de investigación futura es el uso de cepas mutantes de Aspergillus para probar cómo genes o proteínas específicas contribuyen como factores de virulencia. De tal modo, las drogas antifúngicas nuevas se pueden desarrollar para apuntar estas proteínas. Los fármacos antifúngicos actuales tienen baja eficacia en pacientes humanos y existe una creciente resistencia a estos fármacos en hongos28. Este modelo in vivo se puede utilizar para investigar por qué estos fármacos fallan y como un modelo intermedio para probar la eficacia de nuevos fármacos antifúngicos. En general, los hallazgos descubiertos utilizando este modelo pueden facilitar el desarrollo futuro de tratamientos efectivos para los pacientes infectados con Aspergillus.
Disclosures
No hay conflictos o intereses financieros que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio K22AI134677. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
| Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
| Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
| Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
| Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
| BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
| L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
| Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
| Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
| N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
| Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Media and Solutions | Components/Recipe | ||
| E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
| Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
| Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
| 20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
| Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
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