Summary
Этот протокол описывает модель инфекции Aspergillus у личинок зебры. Споры Аспергилла микроинъекции в задний мозг личинок, и химическая обработка используется для индуцирования иммуносупрессии. Прогрессирование инфекции контролируется с помощью ежедневной установки изображений для мониторинга грибкового роста и иммунных реакций, а также перечисления живых спор путем формирования единицы покрытия колонии.
Abstract
Инвазивный аспергиллез (ИА) является одним из наиболее распространенных грибковых инфекций среди людей с ослабленным иммунитетом. Несмотря на наличие противогрибковых препаратов, ИА может >50% смертности у инфицированных пациентов с ослабленным иммунитетом. Крайне важно определить как принимающие, так и патогенные факторы, способствующие восприимчивости к инфекции и низким показателям выживаемости инфицированных пациентов, с тем чтобы разработать новые терапевтические препараты. Врожденные иммунные реакции играют ключевую роль в распознавании и разрешении спор Aspergillus, хотя мало что известно о точных клеточных и молекулярных механизмах. Для изучения подробных механистических взаимодействий между хозяином и патогеном необходимы надежные модели. Оптическая ясность и генетическая уротворяемость личинок зебры делают их интригующей моделью для изучения взаимодействия хозяина и патогена нескольких бактериальных и грибковых инфекций человека в живом и нетронутом хозяине. Этот протокол описывает личинородную модель инфекции зебры Аспергиллус. Во-первых, споры Aspergillus изолированы и вводятся в желудочек заднего мозги зебры через микроинъекцию. Затем химические ингибиторы, такие как иммуносупрессивные препараты добавляются непосредственно в личиночинок воды. Описаны два метода мониторинга инфекции в инъекционных личинках, в том числе 1) гомогенизация личинок для колонии формирования единицы (CFU) перечисления и 2) повторяется, ежедневно живой установки изображения. В целом, эти методы могут быть использованы для механистического анализа прогрессирования инфекции Aspergillus in vivo и могут быть применены к различным фонового хозяина и штаммов Aspergillus для допроса хост-патоген взаимодействия.
Introduction
Aspergillus fumigatus является вездесущим сапрофитным грибком, и его споры в воздухе можно найти как в помещении, так и на открытомвоздухе 1. Эти споры вдыхаются всеми, но эффективно очищается от легких иммунокомпетентных лиц1,2. Тем не менее, люди с измененными условиями легких, таких как муковисцидоз может развиться бронхолегочных аспергиллез из-за грибкового прорастания влегких 3. Наиболее тяжелая форма этой инфекции, инвазивный аспергиллез (ИА), поражает людей с ослабленным иммунитетом и включает в себя рост грибкав другие органы 2,3. ИА приводит >50% смерти инфицированных пациентов, несмотря на наличие противогрибковых методовлечения 4. У иммунокомпетентных людей врожденные иммунные реакции играют важную роль в очистке вдыхаемых спор1. Тем не менее, конкретные механизмы, которые способствуют этому врожденному иммунному зазору, не очень хорошо понятны. Важно понимать клеточные и молекулярные механизмы основных врожденных иммунных клеток (т.е. макрофагов и нейтрофилов) при расчистке Аспергилла, чтобы найти новые терапевтические стратегии для ИА.
В то время как модели млекопитающих сыграли важную роль в выявлении грибковых факторов вирулентностии иммунных реакций хозяина 5,6,визуальная доступность ограничена для взаимодействия хозяина и патогена на клеточном уровне. Эксперименты по культуре тканей не могут полностью резюмировать сложную многоклеточную среду и взаимодействия, которые существуют у целыхживотных 7. Таким образом, зебрафиш приобрел популярность в качестве альтернативной модели организма, чтобы заполнить этот пробел и облегчить изучение хост-патоген взаимодействия в живой, нетронутыми хозяина через многодневнуюинфекцию 8,9. Зебрафиш врожденной иммунной системы развивается уже 24 ч после оплодотворения (hpf)10, и адаптивная система занимает 4-6 недель,чтобы разработать 11, обеспечивая окно времени, в котором врожденные иммунные реакции могут быть оценены в изоляции. Врожденные иммунные реакции хорошо сохранены между людьми и зебрами11. Зебрафиш обладает многими качествами, которые облегчают исследование этих реакций, включая оптическую ясность (которая позволяет получить живое изображение нетронутых хозяев с высоким разрешением) и генетическую трактовку (которая облегчает молекулярные механистические исследования).
Личинородная зебрафишА Аспергилла, описанная здесь, была первоначально разработана Компанией Нокс идр. 12. Недавно она была расширена нашей группой идругими для изучения принимающих иммунных механизмов 12,13,хост-патоген взаимодействия 13,14,15, механизмы иммуносупрессии13,16,17, грибковые вирулентность18, и противогрибковые эффективности препарата19,20. Эта модель резюмирует несколько аспектов аспергиллоза человека. В то время как иммунокомпетентные личинки устойчивы, личинки с ослабленным иммунитетом могут поддаться инфекции12,13,16,17.
В этой модели, локализованная инфекция устанавливается путем введения спор в желудочек заднего бора личинки, область менее населены фагоцитов, и фагоцитов набора и поведения могут быть оценены12,13. Считается, что макрофаги выступают в качестве первой линии защиты от спор Аспергиллау людей 1 имлекопитающих моделей 6,21. Аналогичным образом, в модели зебры, макрофаги набираются в инъекционных спор Aspergillus, в то время как нейтрофилы набираются второй в ответ на ростгипхала 12,13,22. Из этой модели, было также узнать, что Aspergillus может сохраняться в диком типе иммунокомпетентных личинок после более чем 7 дней инфекции. Кроме того, за всем течением инфекции могут следить те же живые животные с помощью ежедневной конфокальной визуализации.
Этот протокол описывает метод микроинъекции для введения спор в желудочек заднего мозга 2 дней после оплодотворения (2 dpf) личинок. Инфекция затем контролируется на срок до 7 дней, как личинки зебры могут жить до 10 dpf без кормления. Иммуносупрессия может быть вызвана медикаментозным лечением, а также описано применение препаратов к личинкам. Наконец, описаны два метода контроля за прогрессированием инфекции, включая количественную оценку CFUs от отдельных личинок и ежедневную установку живой визуализации.
Protocol
Исследователи должны получить одобрение на все эксперименты на животных от соответствующих комитетов по уходу за животными и их использованию. Репрезентативные данные, показанные в этой статье, являются результатом экспериментов, выполненных в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Клемсона (AUP2018-070, AUP2019-012).
1. Подготовка спор Aspergillus для инъекций
- Из подвески споры Aspergillus вычислите объем, необходимый для получения 1 x10 6 спор. Объем должен быть 20-100 йл; если нет, произвести 10x разбавления в 0,01% (V /v) стерильные Tween-20 (Tween-вода; Таблица материалов). Например, если расчетный объем составляет 5 мкл, произвести 10-х разбавления и использовать 50 МКЛ разбавленного раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Две пластины / напряжение могут быть подготовлены для сбора больше спор или в качестве запасных в случае загрязнения. - Распространение 1 х 106спор Aspergillus на одной глюкозы минимальных средств массовой информации (GMM) пластины (Таблица материалов) со стерильным одноразовым L-образным распространитель в биобезопасности кабинета. Избегайте распространения на краю пластины. Инкубация при 37 градусов по Цельсию в течение 3-4 дней, с пластиной лицом вверх дном.
- В день сбора, принести стерильные miracloth и 50 мл конические трубки (два на штамм), свежие бутылки стерильной Tween-воды (один на штамм), и стерильные одноразовые L-образные распределители в биобезопасности шкаф.
ПРИМЕЧАНИЕ: Miracloth можно нарезать на 8 евро в х 6 на куски, завернутые в фольгу, и autoclaved стерилизовать. - Поместите один кусок miracloth в каждом помечены 50 мл конической трубки и повторно колпачок. Вывими оставшийся пакет с миратом из капюшона.
- Принесите тарелки в шкаф биобезопасности. Откройте одну тарелку, а затем залить Tween-воды на вершине, чтобы покрыть около трех четвертей пластины.
- Используя одноразовый L-образный распространитель, аккуратно соскребать поверхность грибковой культуры в спину и вперед движения, используя другую руку, чтобы повернуть пластину. Очистить, пока почти все споры гомогенизированы в Tween-воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за высокой гидрофобности, споры могут создавать "затяжки", когда вода Tween добавляется или во время соскабливания. Следует придать большое значение для того, чтобы избежать загрязнения близлежащих труб или пластин. Рекомендуется менять перчатки и стереть поверхность 70% этанола между извлечением различных штаммов. - Возьмите один 50 мл конической трубки и удалить кусок miracloth. Сложите его пополам и сделать его в фильтр вставляется в верхней части 50 мл конической трубки.
- Налейте грибковый гомогенат из тарелки над мира тканью в трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если две пластины одного штамма подготовлены, соскребать обе пластины и залить их в ту же коническую трубку. - Налейте Tween-вода, чтобы довести общий объем в конической трубки до 50 мл.
- Спин при 900 x g в течение 10 мин. Убедитесь в том, чтобы использовать аэрозолизации предотвращения шапки в центрифуге.
- Слейте супернатант в 10% отбеливатель раствор для обеззараживания. Налейте 50 мл стерильных 1x PBS в коническую трубку, затем вихрь или встряхнуть, чтобы повторно гранулы.
- Спин снова на 900 х г в течение 10 мин. Слейте супернатант и повторно посовелите гранулы в 5 мл стерильных 1x PBS. Фильтр через свежий кусок miracloth в свежем 50 мл конической трубки.
- Сделайте 10-кратное серийное разбавление (10x, 100x, 1000x) грибкового гомогената в 1,7 мл центрифуговых трубок (например, для 10x раствора, смешайте 100 МКЛ грибкового гомогената с 900 йл Tween-water).
- Выберите первое разбавление, в котором споры не видны, когда он сбрасывается в Tween-воды и использовать это разбавление для подсчета количества спор с помощью гемоцитометра.
- Рассчитайте концентрацию спор в подготовленном грибковом гомогенате (водяная подвеска) по следующей формуле:
Концентрация (споры/мл) - Количество спор в средних 25 коробках x фактор разбавления x 104 - Подготовка 1 мл запас 1,5 х 108 спор / мл в стерильных 1x PBS в 1,7 мл микроцентрифуг трубки. Этот препарат споры может храниться при 4 градусов по Цельсию в течение 4 недель.
- Перед использованием в инъекциях, смешать 20 йл препарата споры с 10 йл 1% стерильных фенол красный в 1,7 мл центрифуги трубки для достижения окончательной концентрации спор 1 х 108 спор / мл. Вихрь тщательно перед инъекцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1% фенол красный раствор должен быть фильтр-стерилизованы и хранятся в aliquots. - Для макета инъекции, смешать 20 йл 1x PBS с 10 йл 1% стерильных фенол красный.
2. Подготовка агарных пластин для инъекций
- Приготовьте 2% агарозы в среде E3 и растопитесь в микроволновой печи.
- Налейте в 100 мм х 15 мм Петри блюдо (25 мл на тарелку), вихрь, чтобы покрыть тарелку равномерно, и дайте остыть.
- Оберните пластину парафиновой пленкой и храните перевернутую при 4 градусах Цельсия.
- Перед инъекцией доветь тарелку до комнатной температуры (RT).
- Налейте 1 мл фильтра стерилизованных 2% бычьей сыворотки альбумин (BSA) на тарелку, наклонить пластину, чтобы распространить и покрыть все дно, и промыть E3.
ПРИМЕЧАНИЕ: 2% BSA решение может быть фильтр-стерилизованы и хранятся как 1 мл aliquots при -20 градусов по Цельсию 2% BSA предварительной обработки предотвращает личинки от прилипания к поверхности агарозы. - Налейте E3 с буферной tricaine на тарелку и дайте ему сидеть до инъекции.
3. Зебрафиш личинка заднего кишечника микроинъекции
- Вручную дехорионатные личинки с миппами при 2 dpf в чашке Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дехорионация может быть выполнена в любое время от 1,5 dpf до времени инъекции. - Удалите как можно больше E3 из чашки Петри и добавьте буферный 300 мкг/мл tricaine в E3 для анестезии личинок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовый раствор буферной 4 мг/мл tricaine в E3 может быть подготовлен и сохранен при 4 градусах Цельсия. Рабочий раствор можно сделать, разбавляя 4 мл раствора бульона до 50 мл с E3. - Используйте микроинъекцию установки поставляется с инжектором давления, блок давления спины, footswitch, держатель микропайпта, микроманипулятор, и магнитный стенд и пластина, все подключены к источнику сжатого воздуха (Таблица материалов).
- Откройте сжатый воздушный клапан и включите микроинъектор. Установите давление до 25 PSI, продолжительность импульса до 60 мс, и блок обратного давления до 1 PSI.
- Загрузите микроинъекцию иглы с помощьюмикрозагрузчик пипетки отзыв ( Таблица материалов ) около 3-5 йл подготовленных PBS или споры подвески с фенол красный. Намонтай иглу на микроманипулятор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроинъекции иглы могут быть подготовлены, как описаноранее 23. Стерео микроскоп, используемый для микроинъекций, должен иметь кусок глаза для калибровки микроинъекции иглы. Стихель должна быть откалиброванной со сценическим микрометром, а длина шкалы стихла (МК) должна быть определена. Диаметр капли суспензии споры, которая выбрасывается из иглы измеряется в зависимости от количества хэшей (рескулы), которые перекрываются с каплей. - Распоить микроманипулятор так, чтобы конец иглы был в поле зрения при самом низком увеличении под стерео микроскопом. Увеличьте масштаб до 4x увеличения, сохраняя иглу в поле зрения.
- Используя острые типсы, зарезать конец иглы. Нажмите педаль впрыска, чтобы визуализировать размер капли, которая выходит. Продолжайте отсеив назад, пока не будет введено 3 nL подвески спор (здесь это пять хэшей).
- Перемещение микроманипулятора и иглы в сторону, чтобы избежать случайного попадания иглы в то время как личинки расположены на инъекционной пластине.
- Налейте E3-Tricaine от инъекционной пластины, а затем передать 24 анестезированной личинки в инъекционные пластины с как мало E3 возможно с помощью передачи пипетки.
- Используя небольшой инструмент для манипулирования личинками зебры (т.е. инструментом петли волос или инструментом для ресниц), расположить личинки в соответствии с направлением, в котором они сталкиваются. В частности, поместите все лицом вправо в один ряд, и все лицом влево в ряд ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это расположение трудно, если есть слишком много жидкости на пластине, так как личинки будут "плавать" из места. Однако, слишком мало жидкости также проблематично, если инъекции занять много времени, так как личинки могут высохнуть или анестезии стираются. Таким образом, следует уделять пристальное внимание количеству жидкости на пластине на протяжении всего процесса микроинъекции. - Отрегулируйте масштабирование микроскопа до самого низкого увеличения. Принесите микроманипулятор обратно и организовать так, что игла близка к личинкам, под углом 30 "-60", в середине поля зрения.
- Увеличьте масштаб до самого высокого увеличения и используйте ручки тонкой регулировки для дальнейшей регулировки положения иглы. Убедитесь, что споры 30-70 фунтов стерлингов выходят из иглы путем введения суспензии спор в жидкость на пластине рядом с личинками. При необходимости отрегулируйте время и давление на установку инъекций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест должен быть повторен после каждых пяти-шести личинок, так как количество спор, выходят из иглы может увеличиваться или уменьшаться с течением времени. - Начиная с ряда, в котором личинки обращены к игле, переместив пластину так, чтобы игла была прямо над и расположена рядом с первыми личинками.
- Перемещение иглы с микроманипулятором, вставьте иглу через ткань вокруг otic пузырьков, чтобы пробить через в желудочек заднего мозга. Переместив пластину другой рукой по мере необходимости, чтобы получить правильную ориентацию личинки под углом иглы.
- Визуально убедитесь, что конец иглы находится в центре желудочка заднего мозги, нажмите педаль ноги, чтобы ввести споры и осторожно втягивать иглу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол красный краситель должен в первую очередь оставаться в пределах желудочка заднего мозги. Небольшое количество может пойти в середине мозга, но она не должна достигать forebrain или вне мозга. Если это так, объем впрыскивается слишком велик, и давление и время должно быть уменьшено соответствующим образом, или новая игла должна быть откалиброванной. - Двигаясь вниз по тарелке, ввимить все личинки в этом ряду. Затем поверните пластину вокруг и введать все личинки в другой ряд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неудачно вводили или случайно поврежденных личинок могут быть отмечены 1) инъекционных в желток пару раз, чтобы создать красную метку или 2) перетаскивания личинки из ряда с иглой. - Перемещение иглы вверх и в сторону снова. Увеличьте масштаб до более низкого увеличения на микроскопе. Фенол красный краситель должен по-прежнему быть видны в задний мозг каждой личинки.
- Во-первых, отойти с волос петли инструмент и пипетки до распоряжаться любых личинок с неудачными инъекциями. Перенесите оставшиеся личинки в новую чашку Петри, смыв их со пластины свежим стерильным E3 и переносным трубочим.
- Повторите по мере необходимости для окончательного экспериментального номера образца желаемого.
- Промыть личинки по крайней мере 2x с E3 и обеспечить восстановление после анестезии.
- Для количественной оценки выживаемости без дальнейшего лечения, используя переносную пипету, перенесите личинки в пластину 96 колодец (1 личинка на колодец) в E3.
4. Создание инъекционных и жизнеспособных номеров спор
- Сразу после инъекции, используя переносную пипетку, случайным образом подбирают около восьми вводимых личинок и передают их в центрифуги 1,7 мл (одна личинка на трубку).
- Эвтанизировать личинки с трикайном или поместив их на 4 градуса по Цельсию на 0,5-2,0 ч.
- Приготовьте 1 мл 1 мг/мл ампициллина и 0,5 мг/мл канамицина антибиотиков в стерильных 1x PBS. Оставшийся раствор можно хранить при 4 градусах Цельсия и использовать позже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовые растворы ампициллина при 100 мг/мл и канамицин 50 мг/мл могут быть готовы, фильтр-стерилизованы и храниться в алицитах при -20 градусах Цельсия. Разбавить эти 100x в 1x PBS, чтобы получить рабочее решение. - Используя пипетку, удалите как можно больше жидкости из центрифуги трубки, оставив личинку позади и добавьте 90 МКЛ 1x PBS с антибиотиками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики используются для предотвращения роста бактерий в пластинах ГММ, которые могут помешать подсчету колоний Аспергилла. - Гомогенизируйте личинки в лизере ткани при 1800 колебаниях/мин (30 Гц) в течение 6 мин. Спин вниз на 17000 х г на 30 с.
- Этикетка GMM пластин (одна пластина на гомогенизированных личинок). Используя горелку Bunsen для создания стерильной среды, пипетка однородной подвески от одной трубки до середины пластины GMM, а затем распространять с помощью одноразового L-образного распространителя. Избегайте распространения гомогената против обода.
- Инкубировать пластины вверх дном при 37 градусов по Цельсию в течение 2-3 дней и подсчитать количество колоний формируется (CFU).
- Чтобы измерить количество спор жив во время периода инфекции, выбрать личинки из 96 хорошо пластины на 1-7 дней после инъекции (dpi) и передать их в центрифуг трубки. Эвтанизировать и гомогенизировать личинки для распространения на пластинах GMM, как описано в шагах 4.1-4.5.
5. Лекарственное лечение инъекционных личинок
- После раздела 4 разделите оставшиеся инъекционные личинки на две 3,5 мм посуды: одну для лечения наркотиками и одну для контроля. Используйте около 24 инфицированных личинок в состоянии.
ПРИМЕЧАНИЕ: 3,5 мм блюда можно лечить 2% обезжиренного сухого молока в воде, промыть, высушить воздухом, и хранить на RT заранее. Покрытие молоком предотвратит личинки прилипания к пластику. - Подготовка желаемого лекарственного раствора и транспортного средства в E3 без метиленового синего в конических трубках в соответствии с конечной требуемой концентрацией, а затем хорошо перемешать. Например, для контроля выживаемости личинок, подвергшихся воздействию дексаметазона, используйте 24 личинки (реплицы) для дексаметазона и 24 для управления транспортным средством, такие как DMSO. Приготовьте 5 мл раствора препарата при необходимой концентрации. Здесь было использовано 5 мл 0,1% ДМСО и 10 МКМ дексаметазон, а 24 личинки/условие были переведены в 200 мкл раствора/личинок транспортного средства/лекарства.
- Удалите как можно больше жидкости из одного блюда с помощью перенесите пипетку и добавьте предварительно смешанный E3, содержащий управление транспортным средством. Повторите с предварительно смешанным E3, содержащим лечение интереса для другого блюда.
- Используя пипетки, перенесите личинки в 96 хорошо пластины (одна личинка на колодец). Мониторинг выживаемости инъекционных личинок, подвергшихся воздействию транспортного средства или препарата в течение 7 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат может применяться исключительно в день заражения и храниться на личинках в течение всего эксперимента или может обновляться ежедневно.
6. Ежедневная визуализация инфицированных личинок с помощью зебры Раны и захвата устройства для роста и визуализации (zWEDGI)
- Убедитесь, что личинки обрабатываются 100 МКМ N-фенилтиуреа (PTU) при 24 л.с., чтобы предотвратить пигментацию и что ПТУ хранится на личинках в течение всего эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: PTU на 75-100 МК предотвращает пигментацию личинок без каких-либо грубых дефектов развития24. Тем не менее, PTU может вмешиваться в некоторыебиологические процессы 25, и исследователи должны заранее определить, может ли препарат повлиять на любые процессы, в настоящее время. - Заразить трансгенных личинок с помеченными популяциями клеток, представляющих интерес на 2 dpf со спорами Aspergillus инженерии, чтобы выразить флуоресцентный белок, как описано в разделе 3. Затем перенесите инфицированные личинки в скважины пластины из 48 скважин примерно в 500 йл/колодец E3 без метиленового синего цвета.
ПРИМЕЧАНИЕ: 48 хорошо пластины используется здесь, потому что легче передавать личинки в и из во время повторных ежедневных изображений. - В день визуализации приготовьте две 3,5-мм чашки Петри: одну со 100 ПТУ и одну с E3-tricaine.
- Добавить E3-трикаин в камеры устройства zWEDGI26,27. Под стерео микроскопом удалите пузырьки воздуха из камер и удерживающих каналов с помощью микропипы P100. Удалите все излишки E3-трикаина, так что это только в камерах.
- Pipette до одной личинки из пластины с помощью передачи пипетки. Если для его удаления используется много жидкости, пипетка в тарелку диаметром 3,5 мм, содержащую Е3-ПТУ. Затем, пипетка снова, используя как можно меньше жидкости, как это возможно, и передачи в E3-трикаин.
- Подождите 30 с для обезболивания, а затем перенесите в погрузочную камеру устройства для ран и захвата (например, zWEDGI).
- Под стерео микроскопом распоить личинку. Используйте микропайпта P100, чтобы удалить E3-трикаин из раневой камеры и выпустить в погрузочную камеру, чтобы переместить хвост личинки в канал ограничения. Убедитесь, что личинка расположена на боковой, спинной или спинной стороне, так что задний мозг может быть изображен с перевернутой объективом цели.
- Личинка изображения с конфокальцентом.
- После визуализации, с P100 пипетки, отпустите E3-трикаин в раняющую камеру, чтобы подтолкнуть личинку из сдерживающего канала в погрузочную камеру.
- Используя перенесите пипетку, возьмите личинку и перенесите ее обратно в чашку Петри с E3-Tricaine. Используя как можно меньше жидкости, перенесите ее в чашку Петри с помощью E3-PTU. Промыть в PTU и передать обратно в 48 хорошо пластины.
Representative Results
После микроинъекции спор Аспергилла в задний мозг личинок зебры, за исходом инфекции может последовать несколько анализов, включая выживаемость, CFUs и живую визуализацию. В анализе выживаемости, количество инфицированных личинок выживших 1'7 dpi был проверен. Когда личинки дикоготипа остались без лечения, наблюдалось очень мало смерти, при этом 80%–100% личинок выжили в полном объеме в ходеэксперимента (рисунок 1). Если личинки были иммунодепрессанты, например, при воздействии кортикостероидного препарата дексаметазон (10 МКМ), то наблюдалось значительное снижениевыживаемости (рисунок 1).
Когда CFUs были количественно в течение 7-дневного эксперимента от личинок дикого типа, инфицированных спорами A. fumigatus, настойчивость спор наблюдалась, с медленным зазором с течением времени (Рисунок 2A). Количество спор, выживших в 1, 2, 3, 5 и 7 dpi были нормализовыированы до числа спор, введенных в 0 dpi для сравнения стойкости и зазора через репликации (Рисунок 2B).
Трансгенные линии рыб, выражаюющие флуоресцентные белки в лейкоцитах вместе с флуоресцентными белками,выражая споры Aspergillus могут быть использованы для визуализации как лейкоцитов набора и поведения, а также грибкового прорастанияи роста 13. Когда макрофаги были помечены (например, Tg(mpeg1:H2B-GFP)), макрофаг кластеризации в 50% личинок, как правило, наблюдается, начиная с 2-3 dpi (Рисунок 3A). Набор нейтрофила(Tg(lyz:BFP)) обычно задерживается, происходит в основном после грибкового прорастания(рисунок 3A). В то время как грибковое бремя сохранялось в течение всего эксперимента в большинстве личинок(рисунок 3A), клиренс наблюдался (Рисунок 3B). В некоторых личинках грибковое бремя за пределами заднего бора также наблюдалось позже при инфекции, из-за грибкового распространения, вероятно, в макрофагах.
Область вокруг otic vesicle является одним из возможных мест, где это распространение можно найти(рисунок 3C). Эти наблюдения были количественно в нескольких отдельных личинок в течение всего эксперимента (Рисунок 4). Как правило, прорастание было замечено в 60% личинок на 5 dpi(рисунок 4A). Область кластера фагоцитов, набор макрофагов и набор нейтрофилов меняются как с течением времени, так и между личинками, при этом некоторые тенденции на протяжении всего эксперимента и некоторые решения стечением времени (рисунок 4B,C, D).
Рисунок 1: Репрезентативный анализ выживаемости инфицированных личинок. Аспергиллы-инфицированныеличинки подвергались воздействию управления транспортным средством (DMSO) или дексаметазона (Dex), и выживание контролировалось. Данные представляют собой три объединяются репликации. Средние впрыски CUS: DMSO No 30, Dex No 29 (коэффициент p-значения и опасности были рассчитаны на основе анализа пропорциональной регрессии опасности Кокса, < 0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель CFU рассчитывает от отдельных инфицированных личинок сразу после инъекции (0 dpi) и во время инфекционного курса (2, 3, 5 и 7 dpi). Восемь инфицированных личинок были гомогенизированы и помыты для подсчета CFU для каждой точки времени и репликации. (A)Пример данных из одной репликации. Каждая точка представляет собой одну личинку, бары представляют средства для каждой точки времени. (B)CFU отсчеты были нормализованы к отсчету CFU на 0 dpi для каждого replicate, и 3 реплицирования были соединенны. Данные сравнивались между экспериментальными условиями с использованием анализа дисперсии и суммируются с точки зрения расчетных предельных средств и стандартных ошибок. Астерикс представляют статистическую значимость по сравнению с CFU на 0 dpi (p < 0,05, < 0,01, < 0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения из инфекционных экспериментов. Обработанные ПТУ личинки с флуоресцентными макрофагами (mpeg1:H2B-GFP) и нейтрофилами (lyz:BFP) были введены с RFP-экспрессингом A. fumigatus. На конфокальных микроскопах неоднократно изображения инфицированных личинок были изображены на 2, 3 и 5 dpi. Отображается максимальная интенсивность проекционных изображений. Схемы личинок указывают расположение изображений для каждой панели. Все полосы шкалы представляют собой 100 мкм, за исключением вставочковых полос масштаба, которые составляют 25 мкм.(A) Изображения показаны из одной личинки, взятой в 2, 3 и 5 dpi, что представляет собой типичный прогрессии инфекции. В сетках посмотреть грибковое прорастание в дни 3 и 5. (B)Представительное изображение подмножества личинок, которые могут очистить инфекцию, с низким грибковым бременем и не так много воспаления на 5 dpi. (C)Репрезентативное изображение подмножества личинок, в которых инфекция распространяется из заднего мозговых в более поздние моменты времени. На этом изображении грибок, макрофаги и нейтрофиловы можно найти вокруг и ниже otic везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативная количественная оценка экспериментов с визуализацией. Изображения из экспериментальной установки на рисунке 3 были проанализированы для грибкового прорастания и набора лейкоцитов. (A)Личинки были забиты за наличие проросший споры на каждый день, и процент личинок с прорастанием был рассчитан. (B,C,D) Каждая отдельном личинка представлена как различная цветовая линия. В течение 5-дневного эксперимента для каждой личинки соблюдались появление и размер кластера фагоцитов (B), набор макрофагов (C) и набор нейтрофилов (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Описанная здесь модель инфекции полезна для анализа иммунных реакций хозяина, взаимодействий хозяина и патогенезагрибка 12,13,14,15. Эта информация может быть получена из высокого разрешения изображения флуоресцентных помеченных патогенов ипринимающих клеток 13, личинок выживания, и CFU настойчивость с течением времени.
Метод микроинъекции имеет решающее значение для успеха этого протокола и, возможно, потребуется корректировать при использовании различных микроинъекции оборудования и установок. В частности, давление и время инъекций являются двумя основными переменными и могут быть скорректированы таким образом, чтобы объем, выбрасываемый иглой, составил 3 нл. Размер иглы, определяемый путем отсечения ее типсами, также регулирует количество вводимых спор; хотя, большее отверстие может привести к повреждению тканей личинки. С другой стороны, слишком мало отверстия не позволит относительно большие споры (>2 мкм) и может привести к засорения иглы. Если это происходит, игла может быть отступает, чтобы иметь немного больше открытия.
Другие протоколы для микроинъекции бактерий использовать PVP-40, чтобы помочь сохранить однородную смесь инъекций, но мы не нашли никакого преимущества в использовании этого перевозчика со спорами Aspergillus. Засорение иглы может быть смягчено путем вихревого грибкового приготовления тщательно разорвать любые сгустки до загрузки иглы. Иногда, засорение в игле также может быть выбито путем временно увеличивать давление или время впрыска и вызывать микроинъектор пока игла находится в жидкости окружая личинки. Давление и время инъекций должны быть затем снова снижены до предыдущих уровней. В других случаях засорение не может быть удалено, и новая игла должна быть загружена и перекалибровка.
Этот протокол предназначен для введения 30-70 спор на личинку. Известно, что исходя из концентрации препарата споры и объема вводимых, это число довольно низкое. Тем не менее, было эмпирически установлено, что это количество спор, введенных в этих условиях. Почему эта разница возникает неизвестно, но это может быть связано со спорами слипания в игле. Наши собственные попытки внедрить большее количество спор в значительной степени оказались безуспешными.
Чтобы обеспечить около 30-70 спор вводятся и поддерживать консистенцию инъекций во всех личинок, проверить количество спор путем введения на E3 окружающих личинок. Повторите это каждые пять-шесть личинок на протяжении всех инъекций. Если количество спор, кажется, меняется, давление и / или время инъекции могут быть скорректированы, чтобы придать последовательное количество спор через несколько личинок. Однако следует позаботиться о том, чтобы доза инъекции остается в основном в задней части и не заполнял среднебранный и предтечу.
Для обеспечения локализованной инфекции, споры суспензии должны содержаться в желудочкового отверстия заднего дюйма. Это может быть визуализировано фенол красный окрашивания сразу после инъекции, хотя красный цвет рассеивается со временем. Для инъекций, область вокруг otic везикулы используется для прокалывки и достичь желудочка под углом 45 "-65". Эта область не имеет основных кровеносных сосудов, вызывает меньше повреждений тканей, и заживает мгновенно. Если кожа над желудочим пронзили, споры подвески могут быть просочились, потому что игла, которая должна быть использована для инъекций спор Aspergillus больше, чем используется для бактериальных суспензий. Неудачно введенные или случайно поврежденные личинки могут быть отмечены путем введения в желток пару раз, чтобы создать красную метку или путем перетаскивания личинки из ряда с иглой. После того, как набор инъекций завершен, эти личинки должны быть удалены и утилизированы, прежде чем остальные смываются с тарелки. E3 без метиленового синего используется для обезболивания личинок до инъекций, а также сохранить личинки после инъекций, потому что метиленовый синий является противогрибковым.
На момент инъекции количество CFU представляет количество жизнеспособных спор внутри инфицированного хозяина. Однако, если споры прорастают в гифа, они могут быть разбиты на отдельные жизнеспособные "грибковые единицы" во время гомогенизации и может привести к нескольким колониям. Или непрерывная многоклеточная гифа может привести к одной колонии, что приведет к усредняемому, но неточному представлению грибкового бремени. Это можно смягчить путем объединения колов CFU с продольной микроскопией отдельных личинок, которая обеспечивает визуальные данные о судьбе инъекционных спор.
По сравнению с системой млекопитающих, модель заражения личинками зебры особенно значительна из-за своей оптической доступности. Набор и реакция врожденных иммунных клеток можно визуализировать в живом нетронутом хозяине. Это может быть включено с генетическим или химическим ингибированием молекулярных целей, чтобы проанализировать, как каждая цель влияет на макрофаг или нейтрофиловую реакцию против спор Аспергилла у живого животного.
В то время как зебрафиш личинки Аспергилл инфекции модель продолжает играть важную роль в описании различных аспектовИА 12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, Есть и другие области расширения. Со стороны хозяина, он используется для описания клеточного уровня иммунной реакции, но это может быть расширена для анализа иммунных механизмов на молекулярном уровне, сочетая его с целевыми морфолино, CRISPR, стабильные линии мутантов, или химического воздействия. Одно предостережение заключается в том, что гомологи для всех известных млекопитающих врожденных компонентов иммунного пути не были определены в зебры.
Со стороны патогена, вирулентность различных видов и штаммов были описаны. Перспективным направлением будущих исследований является использование штаммов мутантов Aspergillus для проверки того, как конкретные гены или белки способствуют в качестве факторов вирулентности. Таким образом, новые противогрибковые препараты могут быть разработаны для целевой этих белков. Текущие противогрибковые препараты имеют низкую эффективность у пациентов с человеком и растет устойчивость к этим препаратам вгрибах 28. Эта модель in vivo может быть использована для исследования причин неудачи этих препаратов и в качестве промежуточной модели для проверки эффективности новых противогрибковых препаратов. В целом, результаты, обнаруженные с помощью этой модели, могут способствовать дальнейшему развитию эффективных методов лечения пациентов, инфицированныхАспергиллом.
Disclosures
Никаких конфликтов или финансовых интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Национальных институтов здравоохранения под номером K22AI134677. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точки зрения Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
| Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
| Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
| Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
| Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
| BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
| L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
| Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
| Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
| N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
| Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Media and Solutions | Components/Recipe | ||
| E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
| Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
| Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
| 20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
| Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
References
- Latge, J. P.
- Denning, D. W.
- Dagenais, T. R., Keller, N. P. Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).
- Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections. Journal de Mycologie Médicale. 29 (1), 84-96 (2019).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).
- Behnsen, J., et al. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathogens. 3 (2), 13 (2007).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Rosowski, E. E., et al. The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections. Journal of Fungi. 4 (4), (2018).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).
- Knox, B. P., et al. Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae. Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).
- Rosowski, E. E., et al. Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing. PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229 (2018).
- Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination. Scientific Reports. 9 (1), 12791 (2019).
- Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment. PLoS Biology. 17 (9), 3000113 (2019).
- Herbst, S., et al. Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus. EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).
- Shah, A., et al. Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).
- Jain, S., et al. Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).
- Jones, C. N., et al. Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 644 (2019).
- Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).
- Herbst, S., et al. A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis. Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).
- Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae. Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. Journal of Visualized Experiments. (98), e52788 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
- Huemer, K., et al. Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
- Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. Update on Antifungal Drug Resistance. Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).
