Summary
Denne protokollen beskriver en Aspergillus infeksjonsmodell i sebrafisk larver. Aspergillus sporer mikroinjisert i bakbrain av larver, og kjemisk behandling brukes til å indusere immunsuppresjon. Infeksjonsprogresjon overvåkes via et daglig bildeoppsett for å overvåke soppvekst og immunresponser samt opplisting av levende sporer ved kolonidannende enhet plating.
Abstract
Invasiv aspergillose (IA) er en av de vanligste soppinfeksjonene blant immunkompromitterte individer. Til tross for tilgjengeligheten av antifungale legemidler, kan IA forårsake >50% dødelighet hos infiserte immunkompromitterte pasienter. Det er avgjørende å bestemme både verts- og patogenfaktorer som bidrar til infeksjonsfølsomhet og lave overlevelsesrater hos infiserte pasienter for å utvikle nye terapeutiske stoffer. Medfødte immunresponser spiller en sentral rolle i anerkjennelse og clearance av Aspergillus sporer, selv om lite er kjent om de eksakte cellulære og molekylære mekanismene. Pålitelige modeller er nødvendig for å undersøke detaljerte mekanistiske interaksjoner mellom verten og patogenet. Den optiske klarheten og genetiske tractability av sebrafisk larver gjør dem til en spennende modell for å studere vertspatogen interaksjoner av flere menneskelige bakterielle og soppinfeksjoner i en levende og intakt vert. Denne protokollen beskriver en larval sebrafisk Aspergillus infeksjonsmodell. For det første isoleres Aspergillus-sporer og injiseres i sebrafisken hindbrain ventrikel via mikroinjeksjon. Deretter tilsetts kjemiske hemmere som immundempende legemidler direkte til larvevannet. To metoder for å overvåke infeksjonen i injiserte larver er beskrevet, inkludert 1) homogenisering av larver for kolonidannende enhet (CFU) opplisting og 2) et gjentatt, daglig levende bildeoppsett. Totalt sett kan disse teknikkene brukes til mekanistisk å analysere progresjonen av Aspergillus-infeksjon in vivo og kan brukes på forskjellige vertsbakgrunner og Aspergillus-stammer for å forhøre vertspatogeninteraksjoner.
Introduction
Aspergillus fumigatus er en allestedsnærværende saprofytisk sopp, og dens luftbårne sporer finnes både innendørs og utendørs1. Disse sporene inhaleres av alle, men blir effektivt ryddet fra lungene til immunokogene individer1,2. Imidlertid kan personer med endrede lungesykdommer som cystisk fibrose utvikle bronkopulmonal aspergillose på grunn av soppspredning i lungene3. Den mest alvorlige formen for denne infeksjonen, invasiv aspergillose (IA), påvirker immunkompromitterte individer og innebærer vekst av soppen i andre organer2,3. IA fører til >50% død av infiserte pasienter til tross for tilgjengeligheten av anti-soppbehandlinger4. Hos immunompende individer spiller medfødte immunresponser en viktig rolle i å rydde de inhalerte sporene1. Imidlertid er de spesifikke mekanismene som bidrar til denne medfødte immunclearance ikke godt forstått. Det er viktig å forstå de cellulære og molekylære mekanismene til store medfødte immunceller (dvs. makrofager og nøytrofiler) i clearance av Aspergillus for å finne nye terapeutiske strategier for IA.
Mens pattedyrmodeller har vært medvirkende til å identifisere soppvirulensfaktorer og være vert for immunresponser5,6, er visuell tilgjengelighet begrenset for vertspatogeninteraksjoner på cellenivå. Vevskultureksperimenter kan ikke fullt ut rekapitulere det komplekse multi-cellulære miljøet og interaksjoner som eksisterer hos hele dyr7. Derfor har sebrafisk blitt populært som en alternativ modellorganisme for å fylle dette gapet og lette studiet av vertspatogeninteraksjoner i en levende, intakt vert over en flerdagers infeksjon8,9. Sebrafisk medfødt immunsystem utvikler seg så tidlig som 24 h post-befruktning (hpf)10, og det adaptive systemet tar 4-6 uker å utvikle11, og gir et tidsvindu der medfødte immunresponser kan vurderes isolert. Medfødte immunresponser er godt bevart mellom mennesker og sebrafisk11. Sebrafisk har mange kvaliteter som letter undersøkelsen av disse svarene, inkludert optisk klarhet (som muliggjør høyoppløselig levende bildebehandling av intakte verter) og genetisk tractability (som letter molekylære mekanistiske studier).
Larval sebrafish Aspergillus infeksjonsmodell beskrevet her ble opprinnelig utviklet av Knox et al.12. Det har nylig blitt utvidet av vår gruppe og andre for å undersøke vert immunmekanismer12,13, host-patogen interaksjoner13,14,15, mekanismer for immunsuppresjon13,16,17, sopp virulens18, og anti-sopp narkotika effekt19,20. Denne modellen recapitulates flere aspekter av menneskelig aspergillose. Mens immunotokmpente larver er resistente, kan immunkompromitterte larver bukke under for infeksjon12,13,16,17.
I denne modellen etableres en lokalisert infeksjon ved å injisere sporer i larvens bakbrain ventrikel, et område som er mindre befolket med fagocytter, og fagocyttrekruttering og oppførsel kan evalueres12,13. Det antas at makrofager fungerer som første forsvarslinje mot Aspergillus sporer hos mennesker1 og pattedyr modeller6,21. På samme måte, i sebrafiskmodellen, rekrutteres makrofager til de injiserte Aspergillus-sporene, mens nøytrofiler rekrutteres sekundært som svar på hyphalvekst12,13,22. Fra denne modellen har det også blitt lært at Aspergillus kan vedvare i wildtype immunkompetente larver etter mer enn 7 dager med infeksjon. Videre kan hele infeksjonsforløpet følges i de samme levende dyrene ved daglig konføling.
Denne protokollen beskriver teknikken for mikroinjeksjon for å injisere sporer i hindbrain ventrikelen på 2 dager etter befruktning (2 dpf) larver. Infeksjonen overvåkes deretter i opptil 7 dager, da sebrafisk larver kan leve opptil 10 dpf uten fôring. Immunsuppresjon kan induseres ved narkotikabehandling, og anvendelsen av narkotika til larver er også beskrevet. Til slutt beskrives to metoder for å følge infeksjonsprogresjon, inkludert kvantifisering av CFUer fra individuelle larver og et daglig live bildeoppsett.
Protocol
Forskeren bør få godkjenning for alle dyreforsøk fra de aktuelle dyrepleie- og brukskomiteene. Representative data som vises i denne artikkelen er fra eksperimenter utført under protokoller godkjent av Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (AUP2018-070, AUP2019-012).
1. Tilberedning av Aspergillus sporer til injeksjon
- Fra en Aspergillus spore suspensjon, beregn volumet som trengs for å oppnå 1 x 106 sporer. Volumet skal være 20-100 μL; Hvis ikke, produsere en 10x fortynning i 0,01% (v / v) steril Tween-20 (Tween-vann; Tabell over materialer). For eksempel, hvis det beregnede volumet er 5 μL, produserer du en 10x fortynning og bruker 50 μL av den fortynnede løsningen.
MERK: To plater/stamme kan tilberedes for å samle flere sporer eller som reserve ved forurensning. - Spred 1 x10 6Aspergillus-sporer på en glukose minimal medieplate (GMM) (Materialbord) med en steril engangs L-formet spreder i et biosikkerhetsskap. Unngå å spre seg til platens marg. Inkuber ved 37 °C i 3–4 dager, med platen vendt opp ned.
- På innsamlingsdagen, ta med steril miracloth og 50 ml koniske rør (to per stamme), friske flasker sterilt Tween-vann (en per stamme) og sterile engangs L-formede spredere til biosikkerhetsskapet.
MERK: Miracloth kan kuttes i ~8 i x 6 i stykker, innpakket i folie og autoklaveres for sterilisering. - Plasser ett stykke miracloth i hver merket 50 ml konisk rør og hette igjen. Ta den gjenværende miracloth-pakken ut av hetten.
- Ta plater inn i biosikkerhetsskapet. Åpne en tallerken, og hell deretter Tween-vann på toppen for å dekke omtrent tre fjerdedeler av platen.
- Bruk en engangs L-formet spreder, skrap forsiktig overflaten av soppkulturen i en frem og tilbake bevegelse, mens du bruker den andre hånden til å rotere platen. Skrap til nesten alle sporene er homogenisert i Tween-vannet.
MERK: På grunn av høy hydrofobitet kan sporer skape "puffs" når Tween vann tilsettes eller under skraping. Det må utvises stor forsiktighet for å unngå forurensning av rør eller plater i nærheten. Det anbefales å bytte hansker og tørke av overflaten med 70% etanol mellom utvinning av forskjellige stammer. - Ta en 50 ml konisk rør og fjern miraclothstykket. Brett den i to og gjør den til et filter satt inn i toppen av det koniske røret på 50 ml.
- Hell sopphomogenatet fra platen over miracloth i røret.
MERK: Hvis det fremstilles to plater med en stamme, skrap begge platene og hell dem i samme koniske rør. - Hell Tween-vann for å bringe det totale volumet i det koniske røret til 50 ml.
- Spinn på 900 x g i 10 min. Sørg for å bruke aerosoliseringsforebyggende hetter i sentrifugen.
- Hell av supernatanten i ~10% blekemiddeloppløsning for å dekontamineres. Hell 50 ml steril 1x PBS i det koniske røret, deretter virvel eller rist for å gjenopplive pelletsen.
- Spinn igjen på 900 x g i 10 min. Hell av supernatanten og resuspend pellet i 5 ml steril 1x PBS. Filtrer gjennom et friskt stykke miracloth i et friskt 50 ml konisk rør.
- Lag 10 ganger seriell fortynning (10x, 100x, 1000x) av sopphomogenatet i 1,7 ml sentrifugerør (f.eks. for 10x-løsningen blander du 100 μL av sopphomogenatet med 900 μL Tween-vann).
- Velg den første fortynning der sporene ikke er synlige når den slippes ut i Tween-vann og bruk denne fortynning for å telle antall sporer ved hjelp av et hemocytometer.
- Beregn sporekonsentrasjonen i det tilberedte sopphomogenatet (vannoppheng) ved hjelp av følgende formel:
Konsentrasjon (sporer/ml) = Antall sporer i midtre 25 bokser x fortynningsfaktor x 104 - Forbered et 1 ml lager på 1,5 x 108 sporer/ml i steril 1x PBS i et 1,7 ml mikrosenterrør. Dette sporpreparatet kan lagres ved 4 °C i ca. 4 uker.
- Før bruk i injeksjoner, bland 20 μL av sporpreparatet med 10 μL 1% steril fenolrød i et 1,7 ml sentrifugerør for å oppnå en endelig sporekonsentrasjon på 1 x 108 sporer / ml. Virvel grundig før injeksjon.
MERK: 1% fenol rød oppløsning skal filtreres steriliseres og lagres i aliquots. - For en mock injeksjon, bland 20 μL av 1x PBS med 10 μL 1% steril fenol rød.
2. Tilberedning av agarplater til injeksjon
- Forbered 2% agarose i E3 medium og smelte i en mikrobølgeovn.
- Hell i en Petri-tallerken på 100 mm x 15 mm (~25 ml per tallerken), virvle for å dekke platen jevnt og la den avkjøles.
- Pakk platen med parafinfilm og oppbevar den invertert ved 4 °C.
- Før injeksjon, ta platen til romtemperatur (RT).
- Hell ~1 ml filtersterilisert 2% bovint serumalbumin (BSA) på platen, vipp platen for å spre og dekke hele bunnen, og skyll med E3.
MERK: 2% BSA-oppløsning kan filtreres steriliseres og lagres som 1 ml aliquots ved -20 °C. 2% BSA-forbehandling forhindrer larver i å holde seg til overflaten av agarose. - Hell E3 med bufret trikain på tallerkenen og la den sitte til injeksjon.
3. Sebrafisk larve hindbrain ventrikel mikroinjeksjon
- Dechorionate larver manuelt med tang ved 2 dpf i en Petri-tallerken.
MERK: Dechorionation kan utføres når som helst fra 1,5 dpf til injeksjonstidspunktet. - Fjern så mye E3 som mulig fra Petri-parabolen og tilsett bufret 300 μg/ml trikain i E3 for å bedøve larver.
MERK: En lagerløsning med bufret trikain på 4 mg/ml i E3 kan fremstilles og oppbevares ved 4 °C. Arbeidsløsningen kan gjøres ved å fortynne 4 ml av lagerløsningen opp til 50 ml med E3. - Bruk et mikroinjeksjonsoppsett som følger med trykkinjektoren, ryggtrykkenheten, fotbryteren, mikropipetteholderen, mikromanipulatoren og et magnetisk stativ og en plate, som alle er koblet til en kilde til trykkluft (Materialbord).
- Åpne trykkluftventilen og slå på mikroinjektoren. Sett trykket til ~25 PSI, pulsvarighet til 60 ms og backpressure-enhet til 1 PSI.
- Legg en mikroinjeksjonsnål ved hjelp av en pipettespiss for mikroloader (Materialbord) med ca. 3–5 μL tilberedt PBS eller sporfjæring med fenolrød. Monter nålen på mikromanipulatoren.
MERK: Mikroinjeksjonsnåler kan fremstilles som beskrevet tidligere23. Stereomikroskopet som brukes til mikroinjeksjoner, bør ha et retitelstykke for å kalibrere mikroinjeksjonsnålen. Retikulen skal kalibreres med et scenemikrometer, og lengden på retitelskalaen (μm) bør bestemmes. Diameteren på sporefjæringsdråpen som utløser fra nålen måles avhengig av antall hashes (av reticle) som overlapper med dråpen. - Plasser mikromanipulatoren slik at enden av nålen er synlig ved laveste forstørrelse under stereomikroskopet. Zoom til 4x forstørrelse, og hold nålen synlig.
- Bruk skarpe tang, klipp enden av nålen. Trykk på injeksjonspedalen for å visualisere størrelsen på dråpen som kommer ut. Fortsett å klippe tilbake til ~ 3 nL sporfjæring injiseres (her er dette fem hashes).
- Flytt mikromanipulator og nål ut av veien for å unngå å treffe nålen ved et uhell mens larvene er ordnet på injeksjonsplaten.
- Hell E3-Tricaine av injeksjonsplaten, og overfør deretter ~ 24 bedøvede larver til injeksjonsplaten med så lite E3 som mulig ved hjelp av en overføringspipet.
- Bruk et lite verktøy for å manipulere sebrafisk larver (dvs. hårsløyfeverktøy eller øyenvippeverktøy), ordne larver i henhold til retningen de vender mot. Spesielt plasser alle vendt mot høyre i en rad, og alle vendt mot venstre i en rad nedenfor.
MERK: Dette arrangementet er vanskelig hvis det er for mye væske på platen, da larvene vil "flyte" ut av sted. Imidlertid er for lite væske også problematisk hvis injeksjonene tar lang tid, da larvene kan tørke ut eller anestesi slites av. Dermed bør det tas nøye hensyn til mengden væske på platen gjennom hele mikroinjeksjonsprosessen. - Juster mikroskopzoomen til laveste forstørrelse. Ta mikromanipulatoren tilbake og ordne slik at nålen er nær larver, i en ~ 30 ° - 60 ° vinkel, midt i synsfeltet.
- Zoom inn på den høyeste forstørrelsen og bruk finjusteringsknapper for å justere nålens posisjon ytterligere. Kontroller at ~30-70 sporer kommer ut av nålen ved å injisere sporfjæringen i væsken på platen ved siden av larvene. Juster om nødvendig tiden og trykket på injeksjonsoppsettet.
MERK: Denne testen bør gjentas etter hver femte til seks larver, da antall sporer som kommer ut av nålen kan øke eller redusere over tid. - Begynn med raden der larvene vender mot nålen, flytt platen slik at nålen er rett over og plassert nær de første larver.
- Flytte nålen med mikromanipulatoren, sett nålen gjennom vevet rundt otic vesicle å pierce gjennom i hindbrain ventrikel. Flytt platen med den andre hånden etter behov for å få riktig orientering av larven med nålens vinkel.
- Kontroller visuelt at enden av nålen er i midten av bakre ventrikel, trykk på fotpedalen for å injisere sporer og trekk forsiktig tilbake nålen.
MERK: Fenolrød fargestoff skal primært holde seg innenfor bakre ventrikel. En liten mengde kan gå inn i midbrain, men det bør ikke nå forebrain eller utenfor hjernen. Hvis det gjør det, er volumet som injiseres for stort, og trykket og tiden skal reduseres tilsvarende, eller en ny nål skal kalibreres. - Flytte ned platen, injisere alle larver i den raden. Snu deretter platen og injiser alle larver i den andre raden.
MERK: Mislykket injisert eller ved et uhell skadede larver kan markeres med 1) injisere i eggeplommen et par ganger for å skape et rødt merke eller 2) dra larven ut av raden med nålen. - Flytt nålen opp og ut av veien igjen. Zoom ut til en lavere forstørrelse på mikroskopet. Fenolrød fargestoffet skal fortsatt være synlig i bakbrain av hver larve.
- Trekk først unna med hårsløyfeverktøy og pipette opp for å avhende larver med mislykkede injeksjoner. Overfør de resterende larver til en ny Petri-tallerken ved å vaske dem av platen med fersk steril E3 og en overføringspipet.
- Gjenta etter behov for det endelige eksperimentelle prøvenummeret du ønsker.
- Skyll larver minst 2x med E3 og sørg for utvinning fra anestesi.
- For å kvantifisere overlevelse uten videre behandling, ved hjelp av en overføringspipette, overfør larver til en 96 brønnplate (1 larve per brønn) i E3.
4. Etablering av injiserte og levedyktige sportall
- Umiddelbart etter injeksjon, ved hjelp av en overføringspipette, velger du tilfeldig omtrent åtte av de injiserte larver og overfører dem til 1,7 ml sentrifugerør (en larve per rør).
- Avlive larver med trikain eller ved å plassere dem ved 4 °C i 0,5–2,0 time.
- Forbered 1 ml 1 mg/ml ampicillin og 0,5 mg/ml kanamycinantibiotiske løsninger i sterile 1x PBS. Restløsningen kan oppbevares ved 4 °C og brukes senere.
MERK: Lagerløsninger av ampicillin ved 100 mg/ml og kanamycin 50 mg/ml kan forhåndslagres, filtreres steriliseres og oppbevares i aliquots ved -20 °C. Fortynn disse 100x i 1x PBS for å oppnå arbeidsløsningen. - Bruk en pipette, fjern så mye væske som mulig fra sentrifugerøret, la larven ligge og tilsett 90 μL av 1x PBS med antibiotika.
MERK: Antibiotika brukes til å forhindre bakterievekst i GMM-plater som kan forstyrre tellingen av Aspergillus-kolonier. - Homogeniser larver i et vev lyser ved 1800 svingninger / min (30 Hz) i 6 min. Spinn ned på 17.000 x g i 30 s.
- Etikett GMM-plater (en tallerken per homogeniserte larver). Bruk en Bunsen-brenner til å skape et sterilt miljø, pipette den homogeniserte fjæringen fra ett rør til midten av GMM-platen, og spred deretter ved hjelp av en engangs L-formet spreder. Unngå å spre homogenatet mot kanten.
- Inkuber platene opp ned ved 37 °C i 2–3 dager og tell antall kolonier som dannes (CFU).
- For å måle antall sporer levende i infeksjonsperioden, velg larver fra 96 brønnplaten ved 1-7 dager etter injeksjon (dpi) og overfør dem til sentrifugerør. Avlive og homogenisere larver for å spre seg på GMM-plater som beskrevet i trinn 4.1-4.5.
5. Legemiddelbehandling av injiserte larver
- Etter § 4, del de resterende injiserte larver i to 3,5 mm retter: en for legemiddelbehandling og en for kontrollen. Bruk ca 24 infiserte larver per tilstand.
MERK: De 3,5 mm rettene kan behandles med 2% ikke-fett tørr melk i vann, skyllet, lufttørket og lagret på RT på forhånd. Belegg med melk vil forhindre larver som holder seg til plasten. - Forbered ønsket legemiddelløsning og kjøretøyet i E3 uten metylenblå i koniske rør i henhold til den endelige konsentrasjonen som kreves, og bland deretter godt. For eksempel, for å overvåke overlevelsen av larver utsatt for deksametason, bruk 24 larver (replikerer) for deksametason og 24 for kjøretøykontrollen, for eksempel DMSO. Forbered 5 ml av legemiddelløsningen ved ønsket konsentrasjon. Her ble det brukt 5 ml 0,1% DMSO og 10 μM deksametason, og 24 larver/tilstand ble overført til ~ 200 μL av kjøretøyet / legemiddelløsningen / larver.
- Fjern så mye væske som mulig fra en tallerken med en overføringspipette og tilsett forhåndsmikset E3 som inneholder kjøretøykontroll. Gjenta med forhåndsmikset E3 som inneholder behandling av interesse for den andre retten.
- Bruk en pipette, overfør larver til 96 brønnplater (en larve per brønn). Overvåk overlevelsen av injiserte larver utsatt for kjøretøyet eller stoffet i 7 dager.
MERK: Stoffet kan påføres utelukkende på infeksjonsdagen og holdes på larver for hele eksperimentet eller kan oppdateres daglig.
6. Daglig avbildning av infiserte larver ved hjelp av sebrafisk wounding og entrapment enhet for vekst og avbildning (zWEDGI)
- Sørg for at larver behandles med 100 μM N-fenylthiourea (PTU) ved 24 hkf for å forhindre pigmentering og at PTU holdes på larver for hele eksperimentet.
MERK: PTU ved 75-100 μM forhindrer pigmentering av larver uten grove utviklingsfeil24. Imidlertid kan PTU forstyrre noen biologiske prosesser25, og forskere bør på forhånd avgjøre om stoffet kan påvirke noen prosesser som undersøkes. - Infiser transgene larver med merkede cellepopulasjoner av interesse ved 2 dpf med Aspergillus-sporer konstruert for å uttrykke et fluorescerende protein, som beskrevet i avsnitt 3. Overfør deretter infiserte larver til brønner av en 48 brønnplate i ca. 500 μL / brønn av E3 uten metylenblå.
MERK: En 48 brønnplate brukes her, fordi det er lettere å overføre larver inn og ut av under gjentatt daglig bildebehandling. - På dagen for avbildning, lag to 3,5 mm Petri-retter: en med 100 μM PTU og en med E3-trikain.
- Legg E3-trikain i kamrene på en zWEDGI-enhet26,27. Fjern luftbobler fra kamrene og begrensningskanalen ved hjelp av en P100 mikropipette under stereomikroskopet. Fjern all overflødig E3-trikain, så det er det bare i kamrene.
- Pipette opp en larve fra platen ved hjelp av en overføringspipette. Hvis mye væske brukes til å fjerne den, pipette i en 3,5 mm tallerken som inneholder E3-PTU. Deretter pipetterer du opp igjen, bruker så lite væske som mulig, og overføres til E3-trikain.
- Vent ~30 s for bedøvelse, og overfør deretter til lastekammeret til sår- og entrapmentenheten (f.eks. zWEDGI).
- Under stereomikroskopet, plasser larven. Bruk P100 mikropipetten til å fjerne E3-trikain fra sårkammeret og slipp inn i lastekammeret for å flytte larvens hale inn i begrensningskanalen. Forsikre deg om at larven er plassert på sin laterale, dorsale eller dorso-laterale side, slik at hindbrain kan avbildes med en omvendt objektiv linse.
- Bilde larve med et konfokalt mikroskop.
- Etter avbildning, med P100 pipette, slipp E3-trikain inn i sårkammeret for å skyve larven fra begrensningskanalen inn i lastekammeret.
- Bruk en overføringspipette, plukk opp larven og overfør den tilbake til Petri-parabolen med E3-Tricaine. Bruk så lite væske som mulig, overfør den til Petri-parabolen med E3-PTU. Skyll i PTU og overfør tilbake til 48 brønnplaten.
Representative Results
Etter mikroinjeksjon av Aspergillus sporer inn i bakbrain av sebrafisk larver, infeksjon utfall kan etterfølges av flere analyser, inkludert overlevelse, CFUer, og levende avbildning. I en overlevelsesanalyse ble antall infiserte larver som overlevde 1-7 dpi overvåket. Når wildtype larver ble forlatt ubehandlet, ble det observert svært lite død, med ~ 80% -100% av larver som overlevde hele eksperimentet (Figur 1). Hvis larver ble immunsupprimert, for eksempel ved eksponering for kortikosteroid-stoffet deksametason (10 μM), ble det observert betydelig redusert overlevelse (Figur 1).
Da CFUer ble kvantifisert gjennom hele det 7 dagers eksperimentet fra wildtype larver infisert med A. fumigatus sporer, ble utholdenhet av sporer observert, med langsom klaring over tid (Figur 2A). Antall sporer som overlevde ved 1, 2, 3, 5 og 7 dpi ble normalisert til antall sporer injisert ved 0 dpi for å sammenligne utholdenhet og klaring på tvers av replikeringer (Figur 2B).
Transgene fiskelinjer som uttrykker fluorescerende proteiner i leukocytter sammen med fluorescerende protein-uttrykkende Aspergillus-sporer, kan brukes til å visualisere både leukocyttrekruttering og oppførsel samt soppspredning og vekst13. Når makrofager ble merket (f.eks. Tg(mpeg1:H2B-GFP)), ble makrofagklynger i ~ 50% av larver vanligvis observert, fra 2-3 dpi (figur 3A). Nøytrofil (Tg(lyz:BFP))rekruttering ble vanligvis forsinket, hovedsakelig etter at soppspredning har skjedd (Figur 3A). Mens soppbyrden vedvarte for hele eksperimentet i de fleste larver (Figur 3A), ble det observert klaring (Figur 3B). I noen larver ble soppbyrde utenfor hindbrain også observert senere i infeksjon, på grunn av soppformidling, sannsynligvis i makrofager.
Området rundt otic vesicle er et mulig sted hvor denne formidlingen finnes (Figur 3C). Disse observasjonene ble kvantifisert i flere individuelle larver i løpet av hele eksperimentet (Figur 4). Vanligvis ble spiring sett i ~ 60% av larver med 5 dpi (Figur 4A). Fagocyttklyngeområdet, makrofagrekruttering og nøytrofilrekruttering varierer både over tid og på tvers av larver, med en viss trending gjennom hele eksperimentet og noe løsning over tid (Figur 4B, C, D).
Figur 1: Representativ overlevelsesanalyse av infiserte larver. Aspergillus-infisertelarver ble utsatt for kjøretøykontroll (DMSO) eller deksametason (Dex), og overlevelse ble overvåket. Data representerer tre grupperte replikeringer. Gjennomsnittlig injeksjons-CFUer: DMSO = 30, Dex = 29 (p-verdi og fareforhold ble beregnet ved Cox proporsjonale fare regresjonsanalyse, ****p < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativ CFU teller fra individuelle infiserte larver umiddelbart etter injeksjon (0 dpi) og under infeksjonskurs (2, 3, 5 og 7 dpi). Åtte infiserte larver ble homogenisert og belagt for å telle CFU for hvert tidspunkt og replikere. (A) Eksempeldata fra én replikering. Hvert punkt representerer en larve, barer representerer midler for hvert tidspunkt. (B) CFU-tellingene ble normalisert til CFU-antallet med 0 ppt for hver replikering, og tre replikeringer ble gruppert. Data ble sammenlignet mellom eksperimentelle forhold ved hjelp av variansanalyse og oppsummert i form av estimerte marginale midler og standardfeil. Asterix representerer statistisk signifikans sammenlignet med CFU ved 0 ppt (*p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder fra smitteforsøk. PTU-behandlede larver med fluorescerende makrofager (mpeg1:H2B-GFP) og nøytrofiler (lyz:BFP) ble injisert med RFP-uttrykkende A. fumigatus. Levende, infiserte larver ble avbildet gjentatte ganger ved 2, 3 og 5 dpi på et konfokalt mikroskop. Bilder med maksimal intensitet Z-projeksjon vises. Skjemaer av larver indikerer plassering av avbildning for hvert panel. Alle skalastenger representerer 100 μm, bortsett fra innfelte skalastenger, som er 25 μm. (A) Bilder vist er fra en enkelt larve tatt ved 2, 3 og 5 dpi, som representerer en typisk infeksjonsprogresjon. Innsett viser soppspredning på dag 3 og 5. (B) Representativt bilde av undergruppe av larver som kan fjerne infeksjonen, med lav soppbyrde og ikke mye betennelse ved 5 dpi. (C) Representativt bilde av undergruppe av larver der infeksjon sprer seg ut av hindbrain på senere tidspunkter. I dette bildet kan sopp, makrofager og nøytrofiler bli funnet rundt og under otic vesicle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativ kvantifisering av bildeforsøk. Bilder fra eksperimentelt oppsett i figur 3 ble analysert for soppspredning og leukocyttrekruttering. (A) Larver ble scoret for tilstedeværelse av spire sporer på hver dag, og prosentandelen larver med spiring ble beregnet. (B,C,D) Hver enkelt larve er representert som en annen fargelinje. Fagocyttklyngeutseende og størrelse (B), makrofagrekruttering (C) og nøytrofilrekruttering (D) ble fulgt i løpet av 5-dagerseksperimentet for hver larve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Infeksjonsmodellen beskrevet her er gunstig for å analysere vertens immunresponser, vertspatogeninteraksjoner og sopppatogenese12,13,14,15. Denne informasjonen kan avledes fra høyoppløselig avbildning av fluorescerende merkede patogener og vertsceller13, larvaloverlevelse og CFU-utholdenhet over tid.
Mikroinjeksjonsteknikken er avgjørende for suksessen til denne protokollen og må kanskje justeres ved bruk av forskjellige mikroinjeksjonsutstyr og oppsett. Spesielt er trykket og injeksjonstiden to store variabler og kan justeres for å sikre at volumet som kastes ut av nålen er ~ 3 nL. Størrelsen på nålen som bestemt ved å klippe den med tang regulerer også antall sporer som injiseres; Selv om en større åpning kan forårsake vevsskade på larven. På den annen side vil for liten åpning ikke tillate de relativt store sporene (>2 μm) ut og kan føre til nålstopping. Hvis dette skjer, kan nålen gjenvinnes for å ha en litt større åpning.
Andre protokoller for mikroinjeksjon av bakterier bruker PVP-40 for å opprettholde en homogen injeksjonsblanding, men vi har ikke funnet noen fordel ved å bruke denne bæreren med Aspergillus-sporer. Tilstopping av nålen kan reduseres ved å virvelisere sopppreparatet grundig for å bryte klumper før du laster nålen. Noen ganger kan en tilstopping i nålen også løsnes ved å midlertidig øke trykket eller injeksjonstiden og utløse mikroinjektoren mens nålen er i væsken rundt larvene. Trykk- og injeksjonstiden bør deretter reduseres igjen til tidligere nivåer. I andre tilfeller kan en tilstopping ikke fjernes, og en ny nål må lastes og kalibreres på nytt.
Denne protokollen er designet for å injisere ~ 30-70 sporer per larve. Det er kjent at basert på konsentrasjonen av sporepreparatet og volumet som injiseres, er dette tallet ganske lavt. Det har imidlertid blitt empirisk funnet at dette er antall sporer injisert under disse forholdene. Hvorfor denne forskjellen oppstår er ukjent, men det kan skyldes spore klumping i nålen. Våre egne forsøk på å injisere et større antall sporer har i stor grad vært mislykket.
For å sikre at ca 30-70 sporer injiseres og opprettholder konsistensen av injeksjonene gjennom alle larver, kontroller antall sporer ved å injisere på E3 rundt larver. Gjenta dette hver femte til seks larver gjennom alle injeksjonene. Hvis sporetallet ser ut til å endre seg, kan trykk- og/eller injeksjonstiden justeres for å injisere et konsekvent antall sporer over flere larver. Det bør imidlertid utvises forsiktighet ved at injeksjonsdosen forblir primært i hindbrain og ikke fyller midbrain og forebrain.
For å sikre en lokalisert infeksjon, bør sporfjæringen være inneholdt i hindbrain ventrikelen. Dette kan visualiseres av fenol rød farging like etter injeksjonen, selv om den røde fargen diffuserer med tiden. For injeksjoner brukes regionen rundt den otiske vesicleen til å gjennombore og nå ventrikelen i en 45°-65 ° vinkel. Dette området har ingen hovedblodkar, forårsaker mindre vevsskade, og helbreder umiddelbart. Hvis huden over ventrikelen er gjennomboret, kan sporfjæringen lekkes ut, fordi nålen som må brukes til Aspergillus sporeinjeksjoner er større enn den som brukes til bakterielle suspensjoner. Mislykket injisert eller ved et uhell skadede larver kan markeres ved å injisere i eggeplommen et par ganger for å skape et rødt merke eller ved å dra larven ut av raden med nålen. Etter at et sett med injeksjoner er fullført, bør disse larvene fjernes og kastes før resten vaskes av platen. E3 uten metylenblå brukes til å bedøve larver før injeksjon og også holde larve etter injeksjonene, fordi metylenblå er anti-sopp.
På injeksjonstidspunktet representerer CFU-tellinger antall levedyktige sporer i den infiserte verten. Men hvis sporene spiser i hyphae, kan disse deles opp i separate levedyktige "soppenheter" under homogenisering og kan gi opphav til flere kolonier. Eller en ubrutt multicellulær hypha kan gi opphav til en enkelt koloni, noe som resulterer i en gjennomsnittlig, men upresis, representasjon av soppbyrden. Dette kan reduseres ved å kombinere CFU-tellingene med langsgående mikroskopi av individuelle larver, som gir visuelle data om skjebnen til injiserte sporer.
Sammenlignet med pattedyrsystemet er sebrafisk larveinfeksjonsmodellen spesielt viktig på grunn av sin optiske tilgjengelighet. Rekruttering og respons av medfødte immunceller kan visualiseres i en levende intakt vert. Dette kan innlemmes med genetisk eller kjemisk inhibering av molekylære mål for å analysere hvordan hvert mål påvirker makrofag- eller nøytrofilreaksjonen mot Aspergillus-sporer i et levende dyr.
Mens sebrafisk larven Aspergillus infeksjonsmodell fortsetter å være medvirkende til å beskrive ulike aspekter av IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, er det andre utvidelsesområder. Fra vertssiden brukes den til å beskrive immunresponser på cellenivå, men dette kan utvides til å analysere immunmekanismer på molekylært nivå ved å kombinere den med målrettet morfiolino, CRISPR, stabile mutantlinjer eller kjemisk eksponering. En advarsel er at homologer for alle kjente pattedyr medfødte immunveiskomponenter ikke er identifisert i sebrafisk.
Fra patogensiden er virulens av forskjellige arter og stammer beskrevet. En lovende mulighet for fremtidig forskning er bruken av mutante Aspergillus-stammer for å teste hvordan spesifikke gener eller proteiner bidrar som virulensfaktorer. Dermed kan nye anti-soppmedisiner utvikles for å målrette disse proteinene. Nåværende anti-soppmedisiner har lav effekt hos menneskelige pasienter, og det er økende motstand mot disse stoffene i sopp28. Denne in vivo-modellen kan brukes til å undersøke hvorfor disse stoffene mislykkes og som en mellomliggende modell for å teste effekten av nye anti-soppmedisiner. Samlet sett kan funnene som oppdages ved hjelp av denne modellen lette fremtidig utvikling av effektive behandlinger for Aspergillus-infisertepasienter.
Disclosures
Ingen konflikter eller økonomiske interesser å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Allergy And Infectious Diseases of the National Institutes of Health under prisnummer K22AI134677. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
| Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
| Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
| Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
| Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
| BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
| L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
| Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
| Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
| N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
| Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Media and Solutions | Components/Recipe | ||
| E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
| Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
| Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
| 20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
| Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
References
- Latge, J. P.
- Denning, D. W.
- Dagenais, T. R., Keller, N. P. Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).
- Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections. Journal de Mycologie Médicale. 29 (1), 84-96 (2019).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).
- Behnsen, J., et al. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathogens. 3 (2), 13 (2007).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Rosowski, E. E., et al. The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections. Journal of Fungi. 4 (4), (2018).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).
- Knox, B. P., et al. Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae. Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).
- Rosowski, E. E., et al. Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing. PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229 (2018).
- Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination. Scientific Reports. 9 (1), 12791 (2019).
- Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment. PLoS Biology. 17 (9), 3000113 (2019).
- Herbst, S., et al. Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus. EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).
- Shah, A., et al. Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).
- Jain, S., et al. Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).
- Jones, C. N., et al. Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 644 (2019).
- Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).
- Herbst, S., et al. A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis. Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).
- Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae. Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. Journal of Visualized Experiments. (98), e52788 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
- Huemer, K., et al. Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
- Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. Update on Antifungal Drug Resistance. Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).
