Summary
Um projeto de microtrama para pesquisa de rastreador de 15N é descrito para acomodar múltiplos eventos de amostragem de plantas e solos na estação. São apresentados procedimentos de coleta e processamento de amostras de solo e plantas, incluindo protocolos de moagem e pesagem, para análise de 15N.
Abstract
Muitos estudos de fertilizantes nitrogenados avaliam o efeito global de um tratamento em medições de fim de temporada, como rendimento de grãos ou perdas cumulativas n. Uma abordagem estável de isótopos é necessária para acompanhar e quantificar o destino do fertilizante derivado N (FDN) através do sistema de cultura do solo. O objetivo deste artigo é descrever um projeto de pesquisa de pequeno porte utilizando microtramas enriquecidas de 15N não confinadas para múltiplos eventos de amostragem de solo e plantas ao longo de duas estações de cultivo e fornecer protocolos de coleta, manuseio e processamento de amostras para análise total de 15N. Os métodos foram demonstrados usando um estudo replicado do centro-sul de Minnesota plantado em milho(Zea mays L.). Cada tratamento consistia em seis linhas de milho (76 cm de espaçamento de linha) de 15,2 m de comprimento com uma microtrama (2,4 m por 3,8 m) embutida em uma extremidade. A ureia de grau de fertilizante foi aplicada a 135 kg N∙ha-1 no plantio, enquanto o microempresário recebeu ureia enriquecida a 5 átomos % 15N. Amostras de solo e plantas foram colhidas várias vezes durante toda a estação de cultivo, tomando o cuidado de minimizar a contaminação cruzada usando ferramentas separadas e separando fisicamente amostras não enriquecidas e enriquecidas durante todos os procedimentos. Amostras de solo e plantas foram secas, moída para passar por uma tela de 2 mm e, em seguida, moída a uma consistência semelhante a farinha usando um moinho de pote de rolo. Estudos rastreadores requerem planejamento adicional, tempo de processamento amostral e trabalho manual, e incorrem em custos mais elevados para materiais enriquecidos em 15N e análise de amostras do que os estudos tradicionais n. No entanto, utilizando a abordagem de equilíbrio de massa, estudos rastreadores com múltiplos eventos amostrais na estação permitem ao pesquisador estimar a distribuição de FDN através do sistema de culturas de solo e estimar fdn não contabilizado do sistema.
Introduction
O uso de nitrogênio de fertilizantes (N) é essencial na agricultura para atender às demandas alimentares, fibras, rações e combustíveis de uma população global crescente, mas as perdas de N dos campos agrícolas podem impactar negativamente a qualidade ambiental. Como n passa por muitas transformações no sistema de culturas do solo, uma melhor compreensão do ciclismo N, utilização de culturas e o destino geral do fertilizante N são necessários para melhorar as práticas de manejo que promovam a eficiência do uso de N e minimizem as perdas ambientais. Os estudos tradicionais de fertilizantes N concentram-se principalmente no efeito de um tratamento em medições de fim de temporada, como rendimento da cultura, absorção de N em relação à taxa N aplicada (eficiência aparente do uso de fertilizantes) e solo residual N. Embora esses estudos quantifiquem os insumos, saídas e eficiências globais do sistema N, eles não podem identificar nem quantificar N no sistema de cultura do solo derivado de fontes de fertilizantes ou do solo. Uma abordagem diferente usando isótopos estáveis deve ser usada para rastrear e quantificar o destino do fertilizante derivado N (FDN) no sistema de cultura do solo.
O nitrogênio tem dois isótopos estáveis, 14N e 15N, que ocorrem na natureza em uma razão relativamente constante de 272:1 para 14N/15N1 (concentração de 0,366 átomo % 15N ou 3600 ppm 15N2,,3). A adição de 15N de fertilizante enriquecido aumenta o teor total de 15N do sistema de solo. Como 15N mistura de fertilizante enriquecido com solo não enriquecido N, a variação medida da razão de 14N/15N permite aos pesquisadores rastrear a FDN no perfil do solo e na cultura3,,4. Um saldo de massa pode ser calculado medindo a quantidade total de rastreador de 15N no sistema e cada uma de suas partes2. Como os fertilizantes enriquecidos de 15N são significativamente mais caros que os fertilizantes convencionais, microtraídos enriquecidos de 15N são frequentemente incorporados dentro das parcelas de tratamento. O objetivo deste artigo de métodos é descrever um projeto de pesquisa de pequeno porte utilizando microtramas para múltiplos eventos de amostragem de solo e plantas na estação para milho (Zea mays L.) e apresentar protocolos para preparação de amostras de plantas e solos para análise total de 15N. Esses resultados podem então ser usados para estimar a eficiência do uso de fertilizantes N e criar uma contabilidade parcial do orçamento N para a FDN no solo a granel e na cultura.
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Protocol
1. Descrição do site de campo
NOTA: Ao realizar testes de campo de rastreamento de 15N, os locais selecionados devem minimizar a variação devido ao solo, topografia e características físicas5. A contaminação cruzada pode ocorrer após o movimento lateral do solo devido à inclinação, translocação eólica ou de água, enquanto a distribuição vertical do solo N pode ser impactada pelo fluxo de água subsuperficial e drenagem de telhas6.
- Descreva o campo experimental, incluindo manejo passado (por exemplo, culturas e lavouras anteriores), latitude e longitude, propriedades físicas e químicas do solo (por exemplo, análise textural do solo, condições iniciais de fertilidade, pH e densidade a granel do solo).
- Registo as coordenadas gps para o local de pesquisa e os cantos de campo.
- Descrever o manejo da estação de crescimento, incluindo o manejo de pragas e doenças (uso de herbicidas, inseticidas ou fungicidas), o gerenciamento da fertilidade do solo (incluindo taxa, origem, colocação e tempo de aplicação), lavoura, eventos de irrigação e quantidades e gerenciamento de resíduos.
- À medida que o crescimento das culturas e o micróbio mediado N transformações são afetadas pela umidade do solo, temperatura do solo e temperatura do ar, informações climáticas recordes, incluindo altas e baixas temperaturas diárias, precipitação diária e umidade do solo e temperaturas em várias profundidades que refletem as profundidades de amostragem do solo.
2. Projeto de enredo
- Plante seis linhas de milho (~86.000 plantas ha-1) em espaçamento de 76 cm com uma dimensão final de parcela de 15,2 m por 4,6 m.
- Estabeleça áreas fronteiriças a 1,5 m de cada extremidade da dimensão longitudinal (0-1,5 m, 13,7-15,2 m) e uma área de fronteira adicional de 1,5 m de comprimento (9,8-11,3 m) ao lado das áreas de amostragem e colheita(Figura 1).
- Designe as linhas 2 e 3 como a área de amostragem de plantas e solos na estação (1,5-9,8 m) e as linhas 4 e 5 como área de colheita (1,5-9,8 m) para a produção de grãos de milho.
- Estabeleça uma área de microtrama (11,3-13,7 m) com dimensões de 2,4 m por 3,8 m centradas na dimensão da largura. Colete todas as amostras de plantas e solo enriquecidas de 15N desta área, deixando 0,38 m de borda não amostrada nas dimensões de comprimento e largura para minimizar os efeitos da borda(Figura 2).
- Delineie o enredo de tratamento e cantos de microtrama com diferentes bandeiras coloridas.
3. Precauções de solo e amostra vegetal
- Utilize equipamentos e áreas de processamento dedicados para materiais não enriquecidos e enriquecidos. A contaminação de materiais não enriquecidos (fertilizantes, solo ou planta) por materiais enriquecidos e vice-versa pode afetar drasticamente os resultados.
- Coletar e processar 15N enriqueceu amostras de solo e plantas em ordem de menor a mais alto enriquecimento esperado de 15N para minimizar a contaminação cruzada. Certifique-se de que superfícies de trabalho, luvas, utensílios e máquinas sejam completamente limpos entre cada amostra para minimizar a contaminação cruzada da transferência da amostra.
- Minimizar o tráfego de pés em microtramas para evitar a contaminação de áreas de amostragem não polidas. Use revestimentos de sapato protetores ao acessar microtramas e remova-as ao sair da área do microplot.
4. 15N enriquecido preparação e aplicação de fertilizantes
- Seguindo as diretrizes apresentadas pelo Ref. 2 para fertilizantes 15N estudos de eficiência de uso (F15NUE), diluir 10 átomos % 15N enriqueceu a ureia para 5 átomos % 15N enriquecido ureia e dissolver em 2 L de água desionizada para garantir o enriquecimento uniforme do fertilizante ureia.
NOTA: A concentração necessária de 15N de fertilizante enriquecido depende dos objetivos do estudo agronômico. Se a concentração de fertilizante enriquecido de 15N exceder as exigências do pesquisador, a concentração de fertilizantes de estoque poderá ser diluída com fertilizante convencional similar utilizando a seguinte fórmula3.
X2 =[C1/C2) - 1] × X1
X2 é a massa do fertilizante convencional nãorico, X1 é a massa do fertilizante rastreador, C1 é a concentração isotópica [expressa como excesso de átomo % (átomo medido % enriquecimento menos a concentração de fundo natural assumida como 0,3663 átomo %)] do fertilizante rastreador original, e C2 é a concentração isotópica da mistura final. Como exemplo, dado 100 g de 10 átomos % ureia enriquecida, 92,7 g de fertilizante convencional não enriquecido seria necessário para uma concentração isotópica final de 5 átomos %;
X2 = {[10-0,3663)/5] - 1} × 100. - Analise a solução para concentração de 15N para verificar o enriquecimento. Os autores utilizaram os serviços analíticos prestados pela UC Davis Stable Isótopos Facility.
NOTA: As reações do regime solo-vegetal-micróbio às adições de fertilizantes podem ser afetadas pela forma física de fertilizante. Dependendo das metas do estudo, a solução de ureia pode ser aplicada como líquido ou desidratado para reformar cristais. Os cristais podem ser compactados em um bolo usando uma prensa Carver a 10.000 psi, seguido por esmagar o bolo e triagem das partículas para o tamanhodesejado 3. - Aplique uniformemente as soluções de ureia enriquecida de 15N aos microtramas usando um pulverizador de CO2 de mochila calibrada(Figura 3A). Se forem utilizadas várias taxas N ou níveis de enriquecimento, considere usar pulverizadores de CO2 designados para cada nível de enriquecimento ou use um único pulverizador e aplique soluções do menor ao maior enriquecimento para minimizar a contaminação cruzada do tratamento.
- Incorpore fertilizantes contendo ureia com lavoura leve, ancinhos manuais ou pelo menos 0,6 cm de irrigação dentro de 24 horas de aplicação para minimizar o potencial de perda de volatilização.
- Nenhum fertilizante de ureia enriquecido de 15N adicional é aplicado no microtrama durante a segunda temporada de crescimento. Aplique ureia convencional não enriquecida a todo o tratamento para evitar uma resposta diferencial no crescimento do milho devido ao nitrogênio.
5. Processamento de amostras de campo: biomassa de milho acima do solo
- Em cada estágio de amostragem, colete uma amostra composta de planta de milho de seis acima de solo de dentro da área de amostragem (15N não polida) e uma amostra composta de planta de milho de seis acima do solo do microplot enriquecido de 15N. Pelo menos duas plantas devem separar cada planta amostrada para evitar alterar significativamente a dinâmica de crescimento das plantas. Os autores coletaram amostras de plantas nos estágios de desenvolvimento fisiológico de milho V8 e R111 e na maturidade fisiológica(Figura 2).
- Seguindo os princípios descritos nas etapas 3.1 e 3.2, corte v8 e R1 acima da biomassa do solo (≤5 cm por ≤5 cm); um triturador de lixo de quintal é uma opção satisfatória. Coloque biomassa picada em tecido rotulado ou sacos de papel e seque em um forno de ar forçado a 60 °C até massa constante. Registo o peso seco de biomassa(Figura 3B).
- Partição fisiologicamente maduro plantas de milho em stover (todos os tecidos vegetativos, incluindo folhas, cascas e talos), frações de grãos e espigas. Pique e seque em um forno de ar forçado a 60 °C até massa constante. Regisso o peso seco de biomassa.
- Dentro do microplodo, corte todos os talos de milho na superfície do solo, amarre em um feixe, rotule de acordo com a trama e retire do campo(Figura 3C). Ajuste as bandeiras de canto de microtrama para estar quase alinhada com a superfície do solo para minimizar o risco de remoção pela combinação durante a colheita ou plantio pós-colheita.
- Colher grãos da área de colheita e reportar rendimento em 15,5% de teor de umidade12. Colher áreas de pesquisa remanescentes com um enredo combinar.
- Recolei biomassa não polida da área de microtrama. Pique e reaplique a biomassa de microtrama acima do solo para o enredo correto(Figura 3D).
- Incorpore resíduos na superfície do solo com lavoura tomando cuidado para minimizar o transporte de resíduos de solo e milho dentro ou fora da área de microtrama. Substitua as bandeiras de canto de microtrama removidas devido à lavoura.
- Plante milho do segundo ano nas mesmas linhas que o milho do primeiro ano.
- Coletar biomassa de milho acima do segundo ano apenas na maturidade fisiológica e processar como amostras de milho do primeiro ano, conforme descrito na etapa 5.3. Coletar amostras de microtramas do centro da área de microtrama (1,52 m por 0,76 m) para evitar qualquer diluição potencial de sinal após a lavoura(Figura 2). Colher grãos da área de colheita e reportar rendimento em 15,5% de teor de umidade.
- Seguindo os princípios das etapas 3.1 e 3.2, misture e triture completamente de 100 a 200 g de material vegetal seco para passar por uma peneira de 2 mm. Misture completamente o material moído e armazene uma subsample em um envelope de moeda rotulado para processamento posterior.
NOTA: Uma fábrica de Thomas Wiley é uma opção satisfatória para moagem de tecidos vegetais, enquanto uma Fábrica de Laboratório Perten 3610 é uma opção satisfatória para moer grãos.
ATENÇÃO: As pessoas que moem amostras de plantas devem usar proteção de ouvido e estar protegidas contra inalação de poeira usando um Respirador facial de filtragem de partículas N95 aprovado pelo Instituto Nacional de Segurança e Saúde Ocupacional do Instituto Nacional de Segurança e Saúde Ocupacional.
6. Processamento de amostras de campo: solo
- Colete amostras de solo do primeiro ano 8 dias após a aplicação de fertilizantes enriquecidos de 15N, V8, R1 e pós-colheita antes da lavoura. Coletar amostras de solo do segundo ano na pré-planta e pós-colheita. Devido a restrições logísticas de amostragem, os autores coletaram amostras de solo na estação de 0 a 15, 15 a 30-, e profundidades de 30 a 60 cm, amostras de solo pós-colheita de 0 a 15, 15 a 30, 30 a 60, e 60 a 90 cm de profundidade, e amostras de solo pré-vegetal do segundo ano a 0-30, 30 a 60, 60 a 120 cm de profundidade.
NOTA: Se uma sonda de solo é incapaz de coletar um núcleo de solo à profundidade mais profunda desejada como um único núcleo, colete núcleos de profundidade mais profundos dos mesmos furos que as profundezas superiores descartando o topo de 1 cm de solo para evitar a contaminação do solo que cai das profundezas superiores.- Colete uma amostra de solo composto de quatro núcleos (1,8 cm de diâmetro) da área de amostragem não enriquecida em V8 e R1 usando uma sonda manual. Colete um núcleo na linha de milho e três núcleos entre as linhas de milho.
- Colete uma amostra de solo composto de dois núcleos (5 cm de diâmetro) da área de amostragem não enriquecida na pré-planta e pós-colheita usando uma sonda hidráulica.
- Colete uma amostra de solo composto de 15 núcleos (1,8 cm de diâmetro) da área de microtrama 8 dias após a aplicação de fertilizante enriquecido de 15N, V8 e R1 usando uma sonda manual. Colecione de três a quatro núcleos na linha de milho e de 11 a 12 núcleos entre as linhas de milho.
NOTA: Os solos são extremamente heterogêneos. O maior número de núcleos coletados dentro do microplot enriquecido fornece uma melhor estimativa do verdadeiro enriquecimento de 15N do solo N13. - Colete uma amostra de solo composto de três núcleos (5 cm de diâmetro) da área de microtrama na pré-planta e pós-colheita usando uma sonda hidráulica.
- Homogeneize cada amostra de solo composto em um balde e coloque-a em um saco de papel pré-rotulado.
- Amostras de solo seco a 35 °C em um forno de ar forçado até massa constante. Triture cada amostra para passar por uma peneira de 2 mm. Um moedor de solo mecânico é satisfatório se puder ser completamente limpo entre cada amostra.
NOTA: As amostras de solo podem ser secas ao ar espalhando amostras em bandejas em uma camada fina. As bandejas devem estar em uma área livre de contaminação por fontes externas n. Amostras não enriquecidas e enriquecidas devem ser fisicamente separadas para evitar a contaminação cruzada.
ATENÇÃO: As pessoas que moem amostras de solo devem usar proteção auditiva e estar protegidas da inalação de poeira usando um Respirador facial de filtragem de partículas N95 aprovado pelo Instituto Nacional de Segurança e Saúde Ocupacional do Instituto Nacional de Segurança e Saúde Ocupacional.
7. Processamento de amostras de laboratório: moer amostras de solo e plantas
- Amostras de plantas moída secas (2 mm) durante a noite em um forno a 60 °C.
- Seguindo os princípios descritos na etapa 3, triture amostras de plantas secas ou material do solo para uma consistência fina, semelhante à farinha. Um moinho de pote de rolo é uma opção satisfatória.
NOTA: O moinho de frascos dos autores é um sistema de correia transportadora personalizado que pode processar 54 potes de rolo por vez.- Encha cada pote de rolo (frasco de vidro borossilicato de 250 mL com tampa de rosca) com 10 a 20 g de amostra de planta moída ou solo e sete hastes de aço inoxidável (8,5 cm de comprimento, 0,7 cm de diâmetro).
- Enrole os potes de rolo a 0,4 x g por 6-24 h ou até que as amostras tenham uma consistência fina, semelhante à farinha.
- Transfira o material finamente moído para um frasco de cintilação de 20 mL limpo e rotulado.
- Entre cada amostra, lave potes de rolo, barras de aço inoxidável e tampas com água e sabão para remover qualquer resíduo.
- Mergulhe potes de rolo e tampas em um banho de ácido HCl de 5% (preparado de 36-38% de estoque concentrado) durante a noite14.
ATENÇÃO: O ácido clorídrico é corrosivo. Pode causar queimaduras graves na pele, danos oculares, e é prejudicial se inalado. Use sempre roupas de proteção, luvas e proteção dos olhos e rostos. Flush contatou o tecido completamente com água. Use sempre um recipiente secundário no transporte de ácidos. Adicione sempre ácido à água, pois essa reação é exotérmica. Neutralizar imediatamente os derramamentos de ácido com bicarbonato de sódio.
NOTA: Um grande banho de ácido pode ser preparado como 100 L de 5% HCl em um recipiente plástico de 208 L. Prepare vários volumes menores em um capô de fumaça e, em seguida, transfira as soluções para o recipiente de plástico. Substitua a solução a cada três meses. - Enxágüe três potes e tampas com água deionizada e ar seco.
- Mergulhe as hastes de aço inoxidável em um banho naOH de 0,05 M (preparado dissolvendo 2 g de NaOH em 1 L de água desionizada) durante a noite14. Prepare um novo banho naOH de 0,05 M todos os dias.
ATENÇÃO: Hidróxido de sódio pode causar queimaduras graves na pele e danos oculares. Use sempre roupas protetoras e proteção ocular. Remova imediatamente as roupas contaminadas e enxágue a pele ou os olhos com água por vários minutos. - Enxágüe as hastes em água quente da torneira por 5 minutos. Decantar e enxaguar triplamente as hastes com água deionizada. Deixe as hastes secarem em uma bandeja forrada com papel toalha.
- Mergulhe potes de rolo e tampas em um banho de ácido HCl de 5% (preparado de 36-38% de estoque concentrado) durante a noite14.
8. Pesar amostras de plantas e solos para análise total n e 15N
- Analise algumas amostras representativas de plantas e solos para o teor total de N (por exemplo, análise de combustão15). Calcule a massa amostral que fornece conteúdo N adequado para análise de 15N de acordo com as especificações do analisador.
NOTA: Os autores utilizaram os serviços analíticos prestados pela UC Davis Stable Isótopos Facility. Os pesos amostrais enriquecidos foram otimizados para 20 μg de N com um máximo de 100 μg de N. - Organize amostras semelhantes do enriquecimento de 15N mais baixo e mais esperado. Duplique cada oitava a décima segunda amostra em cada corrida para verificar a precisão da amostra. Inclua pelo menos uma amostra de verificação por corrida16.
- Rotule uma placa limpa de 96 poços e tampa equipada com anéis individuais de evaporação de poços. Corte um cartão de índice limpo para caber apenas dentro da tampa para evitar o movimento da amostra entre os poços durante o transporte.
- Usando luvas de nitrito, limpe a microescala, superfícies de trabalho, espátula e fórceps com lenços de laboratório e etanol. Coloque utensílios limpos em um Kimwipe no banco do laboratório.
NOTA: Amostras não enriquecidas e enriquecidas devem ser processadas usando balanças e utensílios separados para evitar contaminação cruzada. - Use fórceps para colocar uma cápsula de estanho pré-formada de 5 mm x 9 mm em uma superfície de trabalho limpa, como um bloco de aço inoxidável com poço de 5 mm x 8 mm. Bata suavemente a cápsula no poço para reformar a forma cilíndrica e achatar o fundo da cápsula, se necessário.
NOTA: Como as massas amostrais serão muito pequenas, o risco de contaminação da amostra é alto. Nunca toque nas cápsulas com luvas. Descarte a cápsula se tocar em qualquer superfície que não seja as fórceps, superfície de trabalho limpa, panela de pesar de escala ou placa de 96 poços. - Use fórceps para disparar suavemente o topo 1 mm da cápsula para facilitar a manipulação. Para evitar danos na escala ao reencamas o peso da cápsula, passe o mouse e solte a cápsula de 1 a 2 mm acima da panela de pesagem de microescala. Tare a cápsula. Use fórceps para devolver a cápsula à superfície de trabalho limpa.
- Use uma espátula para adicionar cuidadosamente a massa necessária de material de amostra finamente moída à cápsula. Evite derramar material amostral na superfície externa da cápsula ou nas superfícies de trabalho.
- Usando fórceps, amasse lentamente o terço superior da cápsula e dobre para selar. Usando fórceps, continue dobrando e comprimindo a cápsula em uma forma esférica, tomando cuidado para não perfurar ou rasgar a lata.
NOTA: Amostras com baixo teor N podem exigir volumes amostrais que excedam a capacidade da cápsula de 5x9 mm. Cápsulas maiores (por exemplo, 9 mm x 10 mm) podem ser usadas nestes casos. - Use fórceps para soltar a cápsula embrulhada várias vezes a partir de uma altura de 1 cm em uma superfície limpa e escura ou espelho para verificar se há vazamentos. Se não aparecer poeira, pese a amostra usando a mesma técnica descrita na etapa 8.6. Regisso peso amostral. Coloque a cápsula em uma placa de 96 poços e regise a colocação do poço.
- Se a poeira aparecer na superfície escura, regisite o peso da amostra. Enrole a amostra em uma segunda cápsula de lata, verifique novamente os vazamentos e coloque-a em uma placa limpa de 96 poços.
NOTA: Se a cápsula embrulhada for muito grande para caber em uma placa de 96 poços, use uma placa de 24 ou 48 poços.
- Se a poeira aparecer na superfície escura, regisite o peso da amostra. Enrole a amostra em uma segunda cápsula de lata, verifique novamente os vazamentos e coloque-a em uma placa limpa de 96 poços.
- Entre as amostras, limpe cada um dos utensílios e superfícies com etanol e lenços umedecidos de laboratório prestando especial atenção às bordas de espátula e fórceps.
- Fixar a tampa na placa de 96 poços usando fita adesiva e armazenar em um desiccador.
9. Cálculos
- Calcule a massa de N (kg∙ha-1) contida nas amostras de plantas ou solos utilizando as seguintes equações.
- Calcule a fração de fertilizante N(Nf),fertilizante derivado N(FDN),e o solo derivado N (SDN) para amostras de plantas e solo17.
onde A é o átomo % 15N enriquecimento. -
- Calcular fertilizante 15N eficiência de uso17.
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Representative Results
Os resultados apresentados neste artigo vêm de um site de campo criado em 2015 no Centro de Pesquisa e Extensão do Sul da Universidade de Minnesota, localizado perto de Waseca, MN. O local foi gerenciado como uma rotação de milho-soja [Glycine max (L.) Merr] antes de 2015, mas foi gerenciado como uma rotação de milho-milho durante as temporadas de crescimento de 2015 e 2016. O solo era um loam de argila Nicollet (fina-loamy, misto, superativo, mesic Aquic Hapludolls)-Webster clay loam (fine-loamy, misto, superativo, mesic Typic Endoaquolls) complexo. A fertilidade do solo foi gerenciada de acordo com as diretrizes da universidade, exceto a N18. Vários tratamentos de fertilizante n foram organizados em um projeto de bloco completo randomizado com quatro replicações, mas apenas a taxa N∙ha-1 aplicada como ureia no plantio é apresentada neste artigo. A densidade a granel do solo foi medida no centro de 0 a 15- 15- 15- 30- 30- 30- 60-, 60-90-, e 60- a 120 cm camadas de profundidade de duas amostras de profundidade de 5 cm por replicação usando o método do núcleo intacto19. A densidade a granel foi mediada em profundidade entre as replicações e assumida como constante em todo o campo. A configuração do enredo e amostras de plantas e solos foram coletadas e processadas conforme descrito na seção de protocolo.
Total (FDN + SDN) biomassa acima do solo N aumentou a cada evento amostral sucessivo ao longo da primeira temporada de crescimento(Figura 4). A concentração de Fertilizantes derivados N foi maior no início da estação de cultivo, representando 44 ± 4% (erro padrão médio ± ) da biomassa total acima do solo N em V8 e diminuiu a cada período amostral sucessivo(Figura 4A). No entanto, a SDN foi consistentemente a maior fração de biomassa acima do solo N ilustrando a importância da oferta de solo N para o crescimento ideal do milho. Na maturidade fisiológica do primeiro ano, 27 ± 1% da biomassa acima do solo N foi de FDN com proporções semelhantes em frações de grãos, stover e cob(Figura 4B). Na maturação fisiológica no segundo ano, apenas 2 ± 0,1% da FDN do primeiro ano foi recuperada na biomassa acima do solo com 1,6 ± 0,2 kg de FDN ha-1 exportado no grão(Figura 4A).
O orçamento da FDN da cultura do solo é útil para quantificar o ciclismo FDN dentro do sistema ao longo do tempo. Dentro de 8 d de aplicação de fertilizantes, a maioria da FDN estava no topo 15 cm do perfil do solo, como esperado(Figura 5). No entanto, 22,2 ± 4,4 kg N ha-1 já haviam se movido para as profundezas mais profundas, enquanto 4 ± 10% da FDN estavam desaparecidas. O FDN não contabilizado é provavelmente impulsionado principalmente por mecanismos de perda de N, incluindo lixiviação, denitrificação e volatilização que movem fDN abaixo das profundidades de amostragem do solo ou removem o FDN do sistema inteiramente. Na V8 e R1, o FDN não contabilizado aumentou para 60,4 ± 4,7 kg N ha-1 em média, enquanto o solo N (0-15 cm) foi de 31,6 ± 6,8 kg N ha-1 em média. O rápido crescimento do milho e a alta demanda N de V8 para R1 resultaram em um aumento de 19,0 ± 4,4 kg FDN ha-1 em biomassa vegetal acima do solo espelhando a redução de 17,7 ± 5,2 kg FDN ha-1 das profundidades do solo de 15 a 60 cm. As condições de temperatura e umidade do solo entre esses estágios de desenvolvimento de milho tendem a favorecer o crescimento microbiano, resultando em rápida rotatividade de resíduos orgânicos e reutilização de N mineralizada. Esses resultados sugerem que as raízes do milho extraíram FDN inorgânico das profundidades de 15 a 60 cm, enquanto a FDN na profundidade de 0 a 15 cm foi principalmente ciclou entre matéria orgânica do solo e frações microbianas. Análises isotópicas adicionais das piscinas N inorgânicas e orgânicas do solo são necessárias para validar essa hipótese e fornecer maior detalhe e insight sobre a dinâmica do ciclismo FDN10. No ano pós-colheita 1, 59 ± 2% da FDN original não foi contabilizada, enquanto 18,1 ± 3,9 kg FDN ha-1 estava nos 30 cm superiores do solo(Figura 5) e 22,1 ± 2,3 kg FDN ha-1 foi exportado no grão (Figura 4B). Fertilizante 15N eficiência de uso foi de 24% (Equação 7) e está na extremidade baixa das medidas comumente relatadas F15NUE (25-45%) relatado por outros estudos20. Embora os equipamentos tenham sido completamente limpos entre cada amostra, as medidas mais baixas da F15NUE do estudo poderiam ser um artefato de diluição de amostra enriquecida, processando amostras enriquecidas em ordem de enriquecimento mais baixo a mais esperado. A quantidade de FDN no topo de 30 cm dobrou (36,0 ± 5,2 kg FDN ha-1) do ano pós-colheita 1 para o ano pré-planta 2 devido à quebra parcial de resíduos desde a queda anterior, mas no ano pós-colheita 2 apenas 17,3 ± 3,3 kg FDN ha-1 ainda foi encontrado dentro do sistema solo-milho (Figura 5). Este estudo indica que, ao final do primeiro e segundo anos, apenas 41 e 29%, respectivamente, da FDN do primeiro ano foram contabilizados dentro do sistema solo-milho (incluindo fdn exportado no grão) enquanto o restante foi perdido para o meio ambiente ou lixiviado abaixo da profundidade amostral do solo de 90 cm.
Resultados espúrios podem ser obtidos quando as amostras estão contaminadas cruzadamente, afetando cálculos de Nf,FDN e SDN. Por exemplo, suponha que uma amostra vegetal enriquecida de 15N com um enriquecimento real de 3.000 átomos % 15N esteja contaminada com material não enriquecido diluindo a concentração de 15N para 2.500 átomos % 15N. Além disso, suponha que aPlanta Total N seja de 100 kg N ha-1, o enriquecimento átomo de 15N do fertilizante foi de 5.000, e o enriquecimento átomo % 15N da amostra vegetal não enriquecida foi de 0,366. A amostra vegetal enriquecida de 15NN N seria reduzida de 0,568 (real) para 0,461 (amostra contaminada) subestimando a verdadeira FDN em 10,7 kg N ha-1. Superestimações de FDN podem ocorrer quando amostras com baixo enriquecimento de 15N estão contaminadas com adicional de 15N. Assim, deve-se tomar cuidado extremo em todas as etapas da coleta e processamento da amostra para minimizar a contaminação da amostra, mas principalmente quando as massas amostrais são reduzidas (por exemplo, procedimentos de moagem e pesagem).
Figura 1: Projeto de enredo para o enredo de tratamento e microtrama. A figura ilustra as dimensões e colocações relativas das áreas fronteiriças, área de amostragem não polida, área de colheita e área de microtrama dentro do lote de tratamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diagrama de amostragem de plantas e solos. A figura ilustra as posições relativas de amostragem de plantas e solos em cada estágio amostral que evita alterar os padrões de absorção de milho N de plantas de milho amostradas posteriormente. Os eventos amostrais ocorreram 8 dias após a aplicação de fertilizantes enriquecidos em 15N, nas etapas de desenvolvimento fisiológico de milho V8 e R1, na maturação fisiológica no ano de 15N aplicação de fertilizante enriquecido (PMY1) e no ano seguinte(PMY2),e antes do plantio do segundo ano(PPY2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação cronológica do gerenciamento de microtramas. (A) Dissolver 15N de ureia enriquecida em 2 L de água desionizada e pulverizar no microplodo no plantio. (B) Coletar e cortar uma amostra composta de planta de milho de seis acima do solo de dentro da área de amostragem (15N não polida) e uma amostra composta de planta de milho de seis acima do solo a partir do microplot enriquecido de 15N nos tempos de amostragem pré-determinados. (C) Após a coleta de amostras na maturidade fisiológica, remova toda a biomassa remanescente acima do solo de dentro do microplodo. (D) Pós-colheita, ancinho não enriquecido acima da biomassa de milho do microplot. Chip e reaplicar o milho microplot acima do solo biomassa para a área de microtrama. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplo de biomassa acima do solo N particionada em frações n derivadas de fertilizantes N (FDN) e solo derivado n (SDN). A biomassa total acima do solo N foi separada em suas fontes individuais de FDN (cor sólida) e SDN (cor hashed) em (A) e (B). As barras de erro representam o erro padrão da média. (A) A biomassa acima do solo N foi medida nas etapas de desenvolvimento fisiológico do milho V8 e R1 e na maturidade fisiológica no ano de aplicação de fertilizantes 15N(PMY1) e no ano seguinte à aplicação de fertilizantes 15N(PMY2). O valor acima de cada coluna representa a porcentagem do total de N que foi FDN. (B) A biomassa acima do solo N medida em PMY1 e PMY2 é mostrada em suas partes individuais de espiga (apenas Ano 1), stover (talo e folhas; inclui espiga para PMY2) e grãos para FDN e SDN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exemplo do orçamento derivado do fertilizante de solo-milho N (FDN). A massa de FDN recuperada em biomassa de milho acima do solo(Abvgd)e em várias profundidades de amostragem do solo é relatada para seis eventos de amostragem ao longo de duas estações de cultivo. Os eventos amostrais ocorreram 8 dias após a aplicação de fertilizantes enriquecidos de 15N(PA),nas etapas de desenvolvimento fisiológico de milho V8 e R1, na maturidade fisiológica no ano de 15N aplicação de fertilizante enriquecido(PMY1) e no ano seguinte(PMY2),e antes do plantio do segundo ano(PPY2). A diferença entre a taxa de fertilizantes aplicados (135 kg N ha-1) e a massa de FDN recuperada nas porções de solo-milho é a fração FDN não contabilizada. A massa total de FDN para PPY2 e PMY2 foi de 113 kg FDN ha-1 porque 22 kg FDN ha-1 foi exportado para fora do sistema solo-milho como grão do primeiro ano. As barras de erro representam o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A pesquisa de isótopos estáveis é uma ferramenta útil para rastrear e quantificar a FDN através do sistema de cultura do solo. No entanto, existem três premissas principais associadas a estudos de rastreadores N que, se violadas, podem invalidar conclusões extraídas do uso dessa metodologia. São 1) o rastreador é uniformemente distribuído em todo o sistema, 2) processos sob o estudo ocorrem nas mesmas taxas, e 3) N deixando a piscina enriquecida de 15N não retorna3. Como este estudo está interessado na distribuição do total da FDN em todo o sistema de culturas do solo, as suposições 2 e 3 são de mínima preocupação21.
O alto custo de material enriquecido de 15N geralmente limita o tamanho de 15estudos rastreadores N. Portanto, antes de iniciar um estudo n tracer, o pesquisador deve planejar cuidadosamente os objetivos do projeto de pesquisa considerando: o número de eventos amostrais, a duração do estudo (dias a anos), a taxa de aplicação de fertilizantes N e a concentração de enriquecimento de 15N necessária para medir diferenças da abundância natural (0,366 átomos %) após 15N diluição de fertilizante enriquecido por solo a granel2. Comumente utilizados 15N níveis de enriquecimento e taxas de aplicação são relatados para diferentes tipos de pesquisa agronômica no Ref. 2. Após a determinação dos objetivos do estudo, o microtrama deve ser suficientemente grande para acomodar a amostragem do solo e das plantas e evitar efeitos de borda. O desenho da trama descrito neste protocolo utiliza uma parcela não confinada exigindo que áreas fronteiriças não amostradas sejam empregadas6. A concentração de 15N em áreas fronteiriças é diluída pelo fluxo de massa através do limite de microtrama e a absorção n de fora do microplot por raízes de milho laterais crescendo nas linhas 1 e 6. Os lotes confinados, onde as barreiras físicas são levadas para o solo, não exigem áreas de fronteira, mas exigem trabalho adicional durante o estabelecimento de microtramas e podem limitar as operações de campo de rotina6. As referências 3, 6, 22-25 fornecem orientações adicionais sobre a seleção de tamanhos de microtramas, larguras de borda e quando parcelas confinadas ou não confinadas podem ser mais apropriadas.
O esquema de amostragem de plantas e solo deste estudo foi projetado para permitir múltiplos eventos amostrais ao longo de duas estações de crescimento consecutivas. Amostras de plantas e solos no início da temporada são colhidas perto das bordas externas do microtrama. Cada evento amostral sucessivo se aproxima do centro do microtrama para evitar amostragem de áreas amostradas anteriormente. Pelo menos duas plantas de milho separam cada planta amostrada para minimizar as mudanças no desenvolvimento fisiológico do milho. Um desafio com a técnica de amostragem do solo deste estudo é que o método de amostragem do núcleo do solo pode não interceptar com precisão a distribuição heterogênea de 15N no perfil do solo3. A variabilidade espacial do total de N do solo é elevada com um coeficiente estimado de variação de 15%3. A escavação completa de microtramas melhoraria a precisão de quantificação de 15N, mas requer o processamento de volumes significativos de solo e limita a amostragem a um único evento3 que não está em consonância com os objetivos deste estudo. Subdividir o microtrato em unidades amostrais menores permite múltiplos eventos de escavação, mas pode aumentar o tamanho necessário de microtrama para garantir que as unidades não amostradas não sejam afetadas por modificações no dossel da cultura e na dinâmica da água do solo. Apesar da potencial redução da precisão, muitos estudos utilizam a técnica do núcleo do solo para microtramas ≥1 m29,22,26,,27,28. A precisão da amostra pode ser aumentada aumentando o número de núcleos de solo coletados e compostos por microtrama usando a seguinte fórmula13:
n = (Z2)(CVCV2)/(d2)
onde n é o número de núcleos de solo, Z é a variação normal padronizada para o nível alfa correspondente (1,96 para 0,05 e 1,65 para 0,10), CV é o coeficiente de variação, e d é a margem de erro na média da parcela (como decimal). Com base nessa fórmula, os autores esperam que 15 núcleos por microtrat estimariam o total de N a ±7,6% em 95% das parcelas (n = 15; Z = 1,96; CV = 15%; d = 0,076). A referência 25 utilizou um número semelhante de núcleos, mas subdividido o microplodo em 32 unidades amostrais coletando amostras de plantas e solos de quatro unidades em cada evento amostral.
Outros mostraram que os dados do microplot podem ser extrapolados para todo o lote29. No entanto, para que essa suposição seja válida, o lote de tratamento e o microplot devem ser gerenciados da mesma forma. Se possível, o fertilizante N deve ser aplicado nas mesmas formas químicas e físicas (por exemplo, a ureia dissolvida na água) pois essas propriedades impactam a dinâmica do solo de fertilizantes, incluindo mecanismos de perda n, imobilização e disponibilidade para micróbios e plantas do solo3.
O método de moagem de potes de rolo descrito neste protocolo é capaz de pulverizar grandes volumes de amostras de plantas e solos, ideais para garantir uma amostra representativa e homogeneizada. No entanto, a técnica requer trabalho manual significativo e tempo para carregar, descarregar, rolar e limpar os potes de rolo. O processamento da amostra é limitado pelo número disponível de potes de rolo, a capacidade da unidade da correia transportadora e o tamanho do banho ácido. Frascos de moagem comercial podem ser uma alternativa aos frascos de rolo, mas podem limitar o volume de amostras de plantas e solo processadas. Podem ser construídos frascos de moagem de uso único feitos em laboratório que potencialmente sirvam como vaso de moagem e armazenamento de amostras. A principal consideração de qualquer um desses métodos de moagem é minimizar a contaminação cruzada entre as amostras.
Finalmente, como o material de fertilizante enriquecido de 15N é caro, 15N enriquecido acima do solo e amostras de solo podem ser retidos e homogeneizados para uso em estudos futuros. Esses produtos podem ser especialmente úteis ao investigar a decomposição de resíduos, o potencial de mineralização ou outros processos de ciclismo de nutrientes21.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio do Minnesota Corn Research & Promotion Council, da Hueg-Harrison Fellowship e da Bolsa de Economia de Descoberta, Pesquisa e InnoVation de Minnesota (MnDRIVE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 mL scintillation vial | ANY; Fisher Scientific is one example | 0334172C | |
| 250 mL borosilicate glass bottle | QORPAK | 264047 | |
| 48-well plate | EA Consumables | E2063 | |
| 96-well plate | EA Consumables | E2079 | |
| Cloth parts bag (30x50 cm) | ANY | NA | For corn ears |
| CO2 Backpack Sprayer | ANY; Bellspray Inc is one example | Model T | |
| Coin envelop (6.4x10.8 cm) | ANY; ULINE is one example | S-6285 | For 2-mm ground plant samples |
| Corn chipper | ANY; DR Chipper Shredder is one example | SKU:CS23030BMN0 | For chipping corn biomass |
| Corn seed | ANY | NA | Hybrid appropriate to the region |
| Disposable shoe cover | ANY; Boardwalk is one example | BWK00031L | |
| Ethanol 200 Proof | ANY; Decon Laboratories Inc. is one example | 2701TP | |
| Fabric bags with drawstring (90x60 cm) | ANY | NA | For plant sample collection |
| Fertilizer Urea (46-0-0) | ANY | NA | ~0.366 atom % 15N |
| Hand rake | ANY; Fastenal Company is one example | 5098-63-107 | |
| Hand sickle | ANY; Home Depot is one example | NJP150 | For plant sample collection |
| Hand-held soil probe | ANY; AMS is one example | 401.01 | |
| Hydraulic soil probe | ANY; Giddings is one example | GSPS | |
| Hydrochloric acid, 12N | Ricca Chemical | R37800001A | |
| Jar mill | ANY; Cole-Parmer is one example | SI-04172-50 | |
| Laboratory Mill | Perten | 3610 | For grinding grain |
| Microbalance accurate to four decimal places | ANY; Mettler Toledo is one example | XPR2 | |
| N95 Particulate Filtering Facepiece Respirator | ANY, ULINE is one example | S-9632 | |
| Neoprene or butyl rubber gloves | ANY | NA | For working in HCl acid bath |
| Paper hardware bags (13.3x8.7x27.8 cm) | ANY; ULINE is one example | S-8530 | For soil samples and corn grain |
| Plant grinder | ANY; Thomas Wiley Model 4 Mill is one example | 1188Y47-TS | For grinding chipped corn biomass to 2-mm particles |
| Plastic tags | ULINE | S-5544Y-PW | For labeling fabric bags and microplot stalk bundles |
| Sodium hydroxide pellets, ACS | Spectrum Chemical | SPCM-S1295-07 | |
| Soil grinder | ANY; AGVISE stainless steel grinder with motor is one example | NA | For grinding soil to pass through a 2-mm sieve |
| Tin capsule 5x9 mm | Costech Analytical Technologies Inc. | 041061 | |
| Tin capsule 9x10 mm | Costech Analytical Technologies Inc. | 041073 | |
| Urea (46-0-0) | MilliporeSigma | 490970 | 10 atom % 15N |
References
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