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Diseño de microparplots y preparación de muestras de plantas y suelos para 15 análisisde nitrógeno

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61191
Automatic Translation
1, 1
1Department of Soil, Water and Climate, University of Minnesota

Summary

Se describe un diseño de microplot para la investigación de trazador de 15N para dar cabida a múltiples eventos de muestreo de plantas y suelos en temporada. Se presentan procedimientos de recolección y procesamiento de muestras de suelos y plantas, incluidos los protocolos de molienda y pesaje, para análisis de 15N.

Abstract

Muchos estudios de fertilizantes nitrogenados evalúan el efecto general de un tratamiento en mediciones de fin de temporada, como el rendimiento del grano o las pérdidas acumuladas de N. Un enfoque de isótopo estable es necesario para seguir y cuantificar el destino de la N derivada de fertilizantes (FDN) a través del sistema de cultivo del suelo. El propósito de este artículo es describir un diseño de investigación de pequeñas parcelas utilizando microtramas enriquecidas de 15N no confinadas para múltiples eventos de muestreo de suelos y plantas durante dos temporadas de cultivo y proporcionar protocolos de recolección, manipulación y procesamiento de muestras para un análisis total de 15N. Los métodos se demostraron utilizando un estudio replicado desde el centro-sur de Minnesota plantado en maíz (Zea mays L.). Cada tratamiento consistió en seis hileras de maíz (76 cm de 15,2 m de largo con una microplot (2,4 m por 3,8 m) incrustada en un extremo. La urea de grado fertilizante se aplicó a 135 kg de no ha-1 en la plantación, mientras que la microtrama recibió urea enriquecida a 5 átomos % 15N. Las muestras de suelo y plantas se tomaron varias veces a lo largo de la temporada de crecimiento, teniendo cuidado de minimizar la contaminación cruzada mediante el uso de herramientas separadas y separando físicamente las muestras no enriquecidas y enriquecidas durante todos los procedimientos. Las muestras de suelo y plantas se secaron, molieron para pasar a través de una pantalla de 2 mm, y luego se molieron a una consistencia similar a la harina utilizando un molino de tarro de rodillos. Los estudios de trazador requieren planificación adicional, tiempo de procesamiento de muestras y mano de obra manual, e incurren en costos más altos para materiales enriquecidos de 15N y análisis de muestras que los estudios N tradicionales. Sin embargo, utilizando el enfoque de balance de masas, los estudios de trazador con múltiples eventos de muestreo en temporada permiten al investigador estimar la distribución de FDN a través del sistema de cultivos de suelo y estimar el FDN no contabilizado del sistema.

Introduction

El uso de nitrógeno fertilizante (N) es esencial en la agricultura para satisfacer las demandas de alimentos, fibra, piensos y combustibles de una creciente población mundial, pero las pérdidas de N de los campos agrícolas pueden afectar negativamente la calidad ambiental. Debido a que N sufre muchas transformaciones en el sistema de cultivo de suelo, una mejor comprensión del ciclo N, la utilización de los cultivos y el destino general del fertilizante N son necesarios para mejorar las prácticas de gestión que promueven la eficiencia del uso de N y minimizan las pérdidas ambientales. Los estudios tradicionales de fertilizantes N se centran principalmente en el efecto de un tratamiento en las mediciones de fin de temporada, como el rendimiento de los cultivos, la absorción de N cultivos en relación con la tasa N aplicada (eficiencia aparente del uso de fertilizantes) y el suelo residual N. Si bien estos estudios cuantifican los insumos, salidas y eficiencias del sistema general N, no pueden identificar ni cuantificar N en el sistema de cultivos del suelo derivado de fuentes de fertilizantes o del suelo. Se debe utilizar un enfoque diferente utilizando isótopos estables para rastrear y cuantificar el destino de la N derivada de fertilizantes (FDN) en el sistema de cultivos del suelo.

El nitrógeno tiene dos isótopos estables, 14N y 15N, que se producen en la naturaleza a una proporción relativamente constante de 272:1 para 14N/15N1 (concentración de 0,366 átomos % 15N o 3600 ppm 15N2,3). La adición de fertilizante enriquecido de 15N aumenta el contenido total de 15N del sistema del suelo. Como 15N enriquecido fertilizante se mezcla con suelo no enriquecido N, el cambio medido de 14N /15N relación permite a los investigadores trazar FDN en el perfil del suelo y en el cultivo3,,4. Un balance de masa se puede calcular midiendo la cantidad total de 15N de trazador en el sistema y cada una de sus partes2. Debido a que los fertilizantes enriquecidos de 15N son significativamente más caros que los fertilizantes convencionales, las microtramas enriquecidas de 15N a menudo se incrustan dentro de las parcelas de tratamiento. El propósito de este documento de métodos es describir un diseño de investigación de pequeña parcela utilizando microtramas para múltiples eventos de muestreo de suelos y plantas en temporada para maíz (Zea mays L.) y presentar protocolos para la preparación de muestras de plantas y suelos para el análisis total de 15N. Estos resultados se pueden utilizar para estimar la eficiencia del uso de fertilizantes N y crear un presupuesto N parcial que tenga en cuenta el FDN en el suelo a granel y el cultivo.

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Protocol

1. Descripción del sitio de campo

NOTA: Al realizar ensayos de campo de trazador de 15N, los sitios seleccionados deben minimizar la variación debido al suelo, la topografía y las características físicas5. La contaminación cruzada puede producirse después del movimiento lateral del suelo debido a la pendiente, el viento o la translocación del agua, o la labranza, mientras que la distribución vertical del suelo N puede verse afectada por el flujo de agua del subsuelo y el drenaje de baldosas6.

  1. Describa el sitio de campo experimental que incluye la gestión pasada (por ejemplo, cultivos anteriores y la labranza), la latitud y longitud, las propiedades físicas y químicas del suelo (por ejemplo, análisis textural del suelo, condiciones iniciales de fertilidad, pH y densidad a granel del suelo).
  2. Registre las coordenadas GPS para el sitio de investigación y las esquinas de campo.
  3. Describa el manejo de la temporada de crecimiento, incluyendo el manejo de plagas y enfermedades (uso de herbicidas, insecticidas o fungicidas), el manejo de la fertilidad del suelo (incluyendo la tasa, la fuente, la colocación y el momento de la aplicación), la labranza, los eventos y cantidades de riego, y la gestión de residuos.
  4. A medida que el crecimiento de los cultivos y las transformaciones N mediadas por el microbio se ven afectadas por la humedad del suelo, la temperatura del suelo y la temperatura del aire, la información climática récord, incluidas las altas y bajas temperaturas diarias, la precipitación diaria y la humedad y las temperaturas del suelo a varias profundidades que reflejan las profundidades del muestreo del suelo.

2. Diseño de parcela

  1. Plantar seis hileras de maíz (86.000 plantas ha-1) en un espacio de 76 cm con una dimensión final de parcela de 15,2 m por 4,6 m.
    1. Establecer áreas fronterizas a 1,5 m de cada extremo de la dimensión longitudinal (0-1,5 m, 13,7-15,2 m) y un área fronteriza adicional de 1,5 m de largo (9,8-11,3 m) adyacente a las áreas de muestreo y cosecha(Figura 1).
    2. Designe las filas 2 y 3 como el área de muestreo de plantas y suelos en temporada (1,5-9,8 m) y las filas 4 y 5 como área de cosecha (1,5-9,8 m) para el rendimiento del grano de maíz.
    3. Establecer un área de microparma (11,3-13,7 m) con dimensiones de 2,4 m por 3,8 m centradas en la dimensión de anchura. Recoger las 15muestras de plantas y suelos enriquecidos con N de esta área, dejando 0,38 m de borde sin muestrear en las dimensiones de longitud y anchura para minimizar los efectos de borde (Figura 2).
  2. Delinear la gráfica de tratamiento y las esquinas de micrográficos con banderas de diferentes colores.

3. Precauciones de muestras de suelos y plantas

  1. Utilice equipos y áreas de procesamiento dedicados para materiales no enriquecidos y enriquecidos. La contaminación de materiales no enriquecidos (fertilizante, suelo o planta) por materiales enriquecidos y viceversa puede afectar drásticamente los resultados.
  2. Recoger y procesar muestras de suelo y plantas enriquecidas con 15N en orden de enriquecimiento esperado de 15N más bajo a más alto para minimizar la contaminación cruzada. Asegúrese de que las superficies de trabajo, los guantes, los utensilios y la maquinaria se limpien a fondo entre cada muestra para minimizar la contaminación cruzada del arrastre de muestras.
  3. Minimice el tráfico de pies en microtramas para evitar la contaminación de áreas de muestreo no protegidas. Use cubiertas protectoras para zapatos al acceder a microparmas y retírelas al salir del área de microparma.

4. 15N de preparación y aplicación de fertilizantes enriquecidos

  1. Siguiendo las directrices establecidas por la referencia 2 para los estudios de eficiencia de uso de fertilizantes 15N (F15NUE), diluir 10 átomos % 15N de urea enriquecida a 5 átomos % 15N de urea enriquecida y disolver en 2 L de agua desionizada para garantizar un enriquecimiento uniforme de fertilizantes de urea.
    NOTA: La concentración requerida de 15N de fertilizante enriquecido depende de los objetivos del estudio agronómico. Si la concentración de fertilizante enriquecido de 15N supera los requisitos del investigador, la concentración de fertilizantes en stock puede diluirse con fertilizantes convencionales similares utilizando la siguiente fórmula3.
    X2 á [(C1/C2) - 1] x X1
    X2 es la masa del fertilizante no enriquecido convencional, X1 es la masa del fertilizante trazador, C1 es la concentración isotópica [expresada como atom % exceso (atom % de enriquecimiento medido menos la concentración de fondo natural supuestamente 0,3663 átomo %)] del fertilizante trazador original, y C2 es la concentración isotópica de la mezcla final. Por ejemplo, dados 100 g de 10 átomos de urea enriquecida, se necesitarían 92,7 g de fertilizante convencional no enriquecido para una concentración isotópica final del 5 % de átomos;
    X2 á[(10-0.3663)/5] - 1o á 100.
  2. Analice la solución para la concentración de 15N para verificar el enriquecimiento. Los autores utilizaron los servicios analíticos proporcionados por UC Davis Stable Isotope Facility.
    NOTA: Las reacciones del régimen suelo-planta-microbio a las adiciones de fertilizantes pueden verse afectadas por la forma física de fertilizante. Dependiendo de los objetivos del estudio, la solución de urea puede aplicarse como líquido o deshidratarse para reformar los cristales. Los cristales se pueden compactar en un pastel utilizando una prensa Carver a 10.000 psi, seguido de triturar el pastel y cribar las partículas al tamaño deseado3.
  3. Aplique uniformemente las soluciones de urea enriquecidas de 15N a las microparmas utilizando un pulverizador de moción CO2 calibrado (Figura 3A). Si se utilizan múltiples tasas de N o niveles de enriquecimiento, considere el uso de pulverizadores deCO2 designados para cada nivel de enriquecimiento o utilice un solo pulverizador y aplique soluciones desde el enriquecimiento más bajo al más alto para minimizar la contaminación cruzada del tratamiento.
  4. Incorporar fertilizantes que contengan urea con labranza ligera, rastrillos manuales o al menos 0,6 cm de riego dentro de 24 horas de aplicación para minimizar el potencial de pérdida de volatilización.
  5. Durante la segunda temporada de crecimiento no se aplica fertilizante de urea enriquecido de 15N adicional a la microtrama. Aplicar urea norichada convencional a todo el tratamiento para evitar una respuesta diferencial en el crecimiento del maíz debido al nitrógeno.

5. Procesamiento de muestras de campo: biomasa de maíz sobre el suelo

  1. En cada etapa de muestreo, recoja una muestra compuesta de planta de maíz de seis partes superiores del área de muestreo (15N sin enriquecer) y una muestra compuesta de planta de maíz de seis partes en el suelo de la microplot enriquecida de 15N. Al menos dos plantas deben separar cada planta muestreada para evitar alterar significativamente la dinámica de crecimiento de la planta. Los autores recogieron muestras de plantas en las etapas11 de desarrollo fisiológico de maíz V8 y R1 y en la madurez fisiológica (Figura 2).
  2. Siguiendo los principios descritos en los pasos 3.1 y 3.2, cortar la biomasa de tierra V8 y R1 (5 cm por 5 cm); una astilladora de residuos de patio es una opción satisfactoria. Colocar la biomasa picada en papel etiquetado o bolsas de papel y secar en un horno de aire forzado a 60 oC hasta obtener una masa constante. Registre el peso seco de la biomasa (Figura 3B).
  3. Divida las plantas de maíz fisiológicamente maduras en estufas (todos los tejidos vegetativos, incluidas las hojas, cáscaras y tallos), granos y fracciones de mazorcas. Cortar y secar en un horno de aire forzado a 60 oC hasta que se masa constante. Registre el peso seco de la biomasa.
  4. Dentro de la microparma, cortar todos los tallos de maíz en la superficie del suelo, atar en un haz, etiquetar de acuerdo con la gráfica, y retirar del campo (Figura 3C). Ajuste las banderas de las esquinas de microtrama para que estén casi al ras de la superficie del suelo para minimizar el riesgo de eliminación por la combinación durante la cosecha o la cosecha posterior a labranza.
  5. Cosecha el grano del área de cosecha e informa del rendimiento al 15,5% de contenido de humedad12. Cosecha las áreas de investigación restantes con una parcela combinada.
  6. Rastrillo de biomasa no contenida fuera del área de microtrama. Cortar y volver a aplicar la biomasa sobre el suelo a la parcela correcta (Figura 3D).
  7. Incorporar residuos en la superficie del suelo con labranza teniendo cuidado de minimizar el transporte de residuos de suelo y maíz dentro o fuera del área de microplot. Sustituya las banderas de esquina de microtrama eliminadas debido a la labranza.
  8. Plantar maíz de segundo año en las mismas filas que el maíz de primer año.
  9. Recoger la biomasa de maíz del segundo año sobre el suelo sólo en la madurez fisiológica y procesar como muestras de maíz de primer año como se describe en el paso 5.3. Recoger muestras de microtrabajos del centro del área de microtrama (1,52 m por 0,76 m) para evitar cualquier posible dilución de señal después de labranza (Figura 2). Cosecha el grano del área de cosecha e informa del rendimiento con un 15,5% de contenido de humedad.
  10. Siguiendo los principios de los pasos 3.1 y 3.2, mezcle y muele a fondo 100 a 200 g de material vegetal seco para pasar a través de un tamiz de 2 mm. Mezcle bien el material molido y almacene una submuestra en un sobre de moneda etiquetado para su posterior procesamiento.
    NOTA: Un molino Thomas Wiley es una opción satisfactoria para la molienda de tejido vegetal, mientras que un molino de laboratorio Perten 3610 es una opción satisfactoria para moler granos.
    ADVERTENCIA: Las personas que muele muestras de plantas deben usar protección para los oídos y estar protegidas contra la inhalación de polvo mediante el uso de un respirador facial de filtrado de partículas N95 aprobado por el Instituto Nacional de Seguridad y Salud ocupacional.

6. Procesamiento de muestras de campo: suelo

  1. Recoger muestras de suelo del primer año 8 días después de la aplicación de fertilizantes enriquecidos de 15N, V8, R1 y post-cosecha antes de labranza. Recoger muestras de suelo de segundo año en pre-planta y post-cosecha. Debido a las limitaciones de muestreo logístico, los autores recogieron muestras de suelo en temporada a 0 a 15, 15 a 30,, y 30 a 60 cm de profundidad, muestras de suelo post-cosecha a 0- a 15-, 15- a 30-, 30- a 60-, y 60- a 90-cm de profundidad, y muestras de suelo preplanta de segundo año a 0- a 30-, 30- a 60-, 60- a 120- cm de profundidad.
    NOTA: Si una sonda de suelo no puede recoger un núcleo del suelo a la profundidad deseada más profunda como un solo núcleo, recoja núcleos de profundidad más profundos de los mismos pozos que las profundidades superiores descartando los 1 cm superiores del suelo para evitar la contaminación del suelo que cae de las profundidades superiores.
    1. Recoja una muestra de suelo compuesto de cuatro núcleos (1,8 cm de diámetro) del área de muestreo no silvestre en V8 y R1 utilizando una sonda de mano. Recoger un núcleo en la hilera de maíz y tres núcleos entre las hileras de maíz.
    2. Recoger una muestra de suelo compuesto de dos núcleos (5 cm de diámetro) del área de muestreo no silvestre en la pre-planta y post-cosecha utilizando una sonda hidráulica.
    3. Recoja una muestra de suelo compuesto de 15 núcleos (1,8 cm de diámetro) del área de microplot 8 días después de la aplicación de fertilizante enriquecido de 15N, V8 y R1 con una sonda de mano. Recoger de tres a cuatro núcleos en la hilera de maíz y de 11 a 12 núcleos entre las hileras de maíz.
      NOTA: Los suelos son extremadamente heterogéneos. El mayor número de núcleos recogidos de la microtrama enriquecida proporciona una mejor estimación del verdadero enriquecimiento de 15N del suelo N13.
    4. Recoger una muestra de suelo compuesto de tres núcleos (5 cm de diámetro) del área de microplot en pre-planta y post-cosecha utilizando una sonda hidráulica.
    5. Homogeneice cada muestra de suelo compuesto en un cubo y colóquela en una bolsa de papel preetiquetado.
  2. Secar las muestras de suelo a 35 oC en un horno de aire forzado hasta obtener una masa constante. Moler cada muestra para pasar a través de un tamiz de 2 mm. Una amoladora de suelo mecánica es satisfactoria si se puede limpiar a fondo entre cada muestra.
    NOTA: Las muestras de suelo pueden secarse al aire esparciendo muestras en bandejas en una capa delgada. Las bandejas deben estar en un área libre de contaminación por fuentes externas N. Las muestras no enriquecidas y enriquecidas deben separarse físicamente para evitar la contaminación cruzada.
    ADVERTENCIA: Las personas que muele muestras de suelo deben usar protección para los oídos y estar protegidas contra la inhalación de polvo mediante el uso de un respirador facial de filtrado de partículas N95 aprobado por el Instituto Nacional de Seguridad y Salud ocupacional.

7. Procesamiento de muestras de laboratorio: moler muestras de suelo y plantas

  1. Muestras de plantas molidas secas (2 mm) durante la noche en un horno a 60oC.
  2. Siguiendo los principios descritos en el paso 3, moler muestras de plantas secas o material de suelo a una consistencia fina, similar a la harina. Un molino de tarro de rodillos es una opción satisfactoria.
    NOTA: El molino de tarros de los autores es un sistema de cinta transportadora personalizado que puede procesar 54 tarros de rodillos a la vez.
    1. Llene cada tarro de rodillos (tarro de vidrio de borosilicato de 250 ml con una tapa atornillada) con 10 a 20 g de planta molida o muestra de suelo y siete varillas de acero inoxidable (8,5 cm de largo, 0,7 cm de diámetro).
    2. Enrolle los tarros de rodillos a 0,4 x g durante 6-24 h o hasta que las muestras tengan una consistencia fina, similar a la harina.
    3. Transfiera el material finamente molido a un vial limpio y etiquetado de centelleo de 20 ml.
    4. Entre cada muestra, lave los tarros, las varillas de acero inoxidable y las tapas con agua y jabón para eliminar cualquier residuo.
      1. Sumergir los tarros y tapas de rodillos en un baño de ácido HCl 5% (preparado a partir de 36-38% de stock concentrado) durante la noche14.
        ADVERTENCIA: El ácido clorhídrico es corrosivo. Puede causar quemaduras graves en la piel, daños en los ojos y es perjudicial si se inhala. Use siempre ropa protectora, guantes y protección para los ojos y la cara. Enjuague bien el tejido contactado con agua. Utilice siempre un recipiente secundario al transportar ácidos. Siempre agregue ácido al agua ya que esta reacción es exotérmica. Neutralice inmediatamente los derrames de ácido con bicarbonato de sodio.
        NOTA: Un baño grande de ácido se puede preparar como 100 L de 5% HCl en un recipiente de plástico de 208 L. Prepare varios volúmenes más pequeños en una campana de humo y luego transfiera las soluciones al contenedor de plástico. Reemplace la solución cada tres meses.
      2. Tarros y tapas de rodillos de triple enjuague con agua desionizada y secado al aire.
      3. Sumergir varillas de acero inoxidable en un baño NaOH de 0,05 M (preparado disolviendo 2 g de NaOH en 1 L de agua desionizada) durante la noche14. Prepare un nuevo baño 0.05 M NaOH cada día.
        ADVERTENCIA: El hidróxido de sodio puede causar quemaduras graves en la piel y daños en los ojos. Use siempre ropa protectora y protección para los ojos. Retire inmediatamente la ropa contaminada y enjuague la piel o los ojos con agua durante varios minutos.
      4. Enjuague las varillas con agua caliente del grifo durante 5 minutos. Decantar y triplemente enjuagar las varillas con agua desionizada. Deje que las varillas se sequen al aire en una bandeja forrada con toalla de papel.

8. Pesar muestras de plantas de tierra y suelo para análisis N y 15N totales

  1. Analizar algunas muestras representativas de plantas y suelos para el contenido total de N (por ejemplo, análisis de combustión15). Calcule la masa de la muestra que proporciona contenido N adecuado para el análisis de 15N de acuerdo con las especificaciones del analizador.
    NOTA: Los autores utilizaron los servicios analíticos proporcionados por UC Davis Stable Isotope Facility. Los pesos enriquecidos de la muestra se optimizaron para 20 g de N con un máximo de 100 g de N.
  2. Organice muestras similares de menor a mayor enriquecimiento esperado de 15N. Duplica cada octava a duodécima muestra en cada ejecución para comprobar la precisión de la muestra. Incluya al menos una muestra de comprobación por ejecución16.
  3. Etiquetar una placa limpia de 96 pocillos y una tapa equipada con anillos de evaporación individuales. Corte una tarjeta de índice limpia para que quepa justo dentro de la tapa para evitar el movimiento de la muestra entre los pozos durante el transporte.
  4. Usar guantes de nitrilo, limpiar la microescala, superficies de trabajo, espátula y fórceps con toallitas de laboratorio y etanol. Coloque los utensilios limpios en un Kimwipe en el banco del laboratorio.
    NOTA: Las muestras no enriquecidas y enriquecidas deben procesarse utilizando básculas y utensilios separados para evitar la contaminación cruzada.
  5. Utilice fórceps para colocar una cápsula de estaño preformada de 5 mm x 9 mm sobre una superficie de trabajo limpia, como un bloque de acero inoxidable con 5 mm x 8 mm de pozo. Toque suavemente la cápsula en el pozo para reformar la forma cilíndrica y aplanar la parte inferior de la cápsula si es necesario.
    NOTA: Debido a que las masas de muestra serán muy pequeñas, el riesgo de contaminación de la muestra es alto. Nunca toque las cápsulas con guantes. Deseche la cápsula si toca cualquier superficie que no sea los fórceps, limpie la superficie de trabajo, la báscula de pesaje o la placa de 96 pocillos.
  6. Utilice fórceps para encender suavemente los 1 mm superiores de la cápsula para facilitar la manipulación. Para evitar daños en la báscula al tara el peso de la cápsula, sitúe y suelte la cápsula de 1 a 2 mm por encima de la bandeja de pesaje de microescala. Tare la cápsula. Utilice fórceps para devolver la cápsula a la superficie de trabajo limpia.
  7. Utilice una espátula para agregar cuidadosamente la masa requerida de material de muestra finamente molido a la cápsula. Evite derramar material de muestra en la superficie exterior de la cápsula o en las superficies de trabajo.
  8. Usando fórceps, engarzar lentamente el tercio superior de la cápsula y doblar para sellar. Usando fórceps, continúe doblando y comprimiendo la cápsula en una forma esférica teniendo cuidado de no perforar o rasgar la lata.
    NOTA: Las muestras con bajo contenido de N pueden requerir volúmenes de muestra que excedan la capacidad de la cápsula de 5x9 mm. En estos casos se pueden utilizar cápsulas más grandes (por ejemplo, 9 mm x 10 mm).
  9. Utilice fórceps para dejar caer la cápsula envuelta varias veces desde una altura de 1 cm sobre una superficie o espejo limpio y oscuro para comprobar si hay fugas. Si no aparece polvo, pese la muestra con la misma técnica que se describe en el paso 8.6. Registre el peso de la muestra. Coloque la cápsula en una placa de 96 pozos y registre la colocación del pozo.
    1. Si aparece polvo en la superficie oscura, registre el peso de la muestra. Envuelva la muestra en una segunda cápsula de estaño, vuelva a comprobar si hay fugas y colóquela en una placa limpia de 96 pozos.
      NOTA: Si la cápsula envuelta es demasiado grande para caber en una placa de 96 pozos, utilice una placa de 24 o 48 pozos.
  10. Entre muestras, limpie cada uno de los utensilios y superficies con toallitas de etanol y laboratorio prestando especial atención a los bordes de la espátula y los fórceps.
  11. Fije la tapa a la placa de 96 pozos con cinta adhesiva y guárdela en un desecador.

9. Cálculos

  1. Calcular la masa de N (kg-ha-1) contenida en las muestras de plantas o suelo utilizando las siguientes ecuaciones.

  2. Calcular la fracción N de fertilizante(Nf), el fertilizante derivado N (FDN) y el suelo derivado N (SDN) para muestras de plantas ysuelos 17.

    donde A es el atom % 15N enriquecimiento.

  4. Calcular fertilizante 15N utilizar eficiencia17.

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Representative Results

Los resultados presentados en este artículo provienen de un sitio de campo establecido en 2015 en el Centro de Divulgación e Investigación del Sur de la Universidad de Minnesota ubicado cerca de Waseca, MN. El sitio fue administrado como una rotación de maíz-soja[Glycine max (L.) Merr] antes de 2015, pero fue manejado como una rotación de maíz y maíz durante las temporadas de cultivo de 2015 y 2016. El suelo era un loam arcilloso Nicollet (fino-loamy, mezclado, superactivo, mesico Aquic Hapludolls)-Marga de arcilla Dester (fino-loamy, mezclado, superactivo, mesico Typic Endoaquolls) complejo. La fertilidad del suelo se gestionó de acuerdo con las directrices de la universidad, excepto N18. Varios tratamientos de fertilizantes N se organizaron en un diseño de bloque completo aleatorio con cuatro replicaciones, pero sólo se presenta en este documento la tasa de 135 kg deN-ha -1 aplicada como urea en la plantación. La densidad a granel del suelo se midió en el centro de 0 a 15 capas de profundidad de 15 a 30, 30 a 60, 60 a 90 y 60 a 120 cm de profundidad de dos muestras profundas de 5 cm por replicación utilizando el método de núcleo intacto19. La densidad masiva se promedió dentro de la profundidad en todas las replicaciones y se supone que es constante en todo el campo. La configuración de la parcela y las muestras de plantas y suelos se recogieron y procesaron como se describe en la sección de protocolo.

Total (FDN + SDN) biomasa sobre el terreno N aumentó con cada evento de muestreo sucesivo durante la primera temporada de crecimiento (Figura 4). La concentración de N derivada de fertilizantes fue mayor a principios de la temporada de crecimiento, representando 44 a 4% (media - error estándar) de la biomasa total sobre el suelo N en V8 y disminuyó con cada período de muestreo sucesivo (Figura 4A). Sin embargo, SDN fue consistentemente la mayor fracción de biomasa molida N que ilustra la importancia del suministro de suelo N para un crecimiento óptimo del maíz. En la madurez fisiológica en el primer año, 27 x 1% de la biomasa Mal en el suelo N provenía de FDN con proporciones similares en fracciones de grano, estufa y mazorca(Figura 4B). A la madurez fisiológica en el segundo año, sólo se recuperó 2 x 0,1% de la FDN del primer año en la biomasa sobre el terreno, con 1,6 x 0,2 kg de FDN-1 de primer año exportado en el grano(Figura 4A).

El presupuesto FDN de cultivo de suelo es útil para cuantificar el ciclo FDN dentro del sistema a lo largo del tiempo. Dentro de 8 d de la aplicación de fertilizantes, la mayoría de FDN estaba en los 15 cm superiores del perfil del suelo, como se esperaba (Figura 5). Sin embargo, 22,2 x 4,4 kg de N ha-1 ya se había trasladado a las profundidades más profundas, mientras que el 4 al 10% de la FDN no estaba contabilizado. El FDN no contabilizado es probablemente impulsado principalmente por mecanismos de pérdida N incluyendo lixiviación, desnitrificación y volatilización que mueven FDN por debajo de las profundidades de muestreo del suelo o eliminan el FDN del sistema por completo. En V8 y R1, el FDN no contabilizado aumentó a 60,4 a 4,7 kg de N ha-1 en promedio, mientras que el suelo N (0-15 cm) fue de 31,6 a 6,8 kg de N ha-1 en promedio. El rápido crecimiento del maíz y la alta demanda de N de V8 a R1 dieron lugar a un aumento de 19,0 a 4,4 kg de FDN ha-1 en la biomasa vegetal sobre el suelo que refleja la reducción de 17,7 x 5,2 kg de FDN ha-1 de las profundidades del suelo de 15 a 60 cm. Las condiciones de temperatura y humedad del suelo entre estas etapas de desarrollo del maíz tienden a favorecer el crecimiento microbiano, lo que resulta en una rápida rotación de residuos orgánicos y una reutilización de N mineralizada. Estos resultados sugieren que las raíces de maíz extrajeron FDN inorgánico de las profundidades de 15 a 60 cm, mientras que el FDN en la profundidad de 0 a 15 cm se recicló principalmente entre la materia orgánica del suelo y las fracciones microbianas. Es necesario un análisis isotópico adicional de las piscinas N inorgánicas y orgánicas del suelo para validar esta hipótesis y proporcionar un mayor detalle y una visión de la dinámica ciclista FDN10. En la década de poscosecha 1, el 59 % del FDN original no se había contabilizado, mientras que 18,1 a 3,9 kg de FDN ha-1 estaba en los 30 cm superiores del suelo(Figura 5) y 22,1 a 2,3 kg FDN ha-1 se exportó en el grano (Figura 4B). La eficiencia de uso del fertilizante 15N fue del 24%(Ecuación 7)y se encuentra en el extremo inferior de las medidas F15NUE comúnmente notificadas (25-45%) otros estudios20. Aunque el equipo se limpió a fondo entre cada muestra, las medidas más bajas F15NUE del estudio podrían ser un artefacto de dilución de muestras enriquecidas mediante el procesamiento de muestras enriquecidas en orden de menor a mayor enriquecimiento esperado. La cantidad de FDN en la parte superior de 30 cm se duplicó (36,0 x 5,2 kg FDN ha-1) desde el año post-cosecha 1 hasta el año preplanta 2 debido a la descomposición parcial de residuos desde el otoño anterior, pero por la década de cosecha 2 sólo 17,3 x 3,3 kg FDN ha-1 todavía se encontró dentro del sistema de maíz del suelo(Figura 5). Este estudio indica que al final del primer y segundo año, sólo el 41 y el 29%, respectivamente, del FDN del primer año se contabilizaron dentro del sistema suelo-maíz (incluido el FDN exportado en el grano), mientras que el resto se perdió en el medio ambiente o se lixivió por debajo de la profundidad de muestreo del suelo de 90 cm.

Se pueden obtener resultados espurias cuando las muestras están contaminadas cruzadamente afectando a los cálculos de Nf,FDN y SDN. Por ejemplo, supongamos que una muestra de planta enriquecida de 15N con un enriquecimiento real de 3.000 átomos % 15N está contaminada con material no enriquecido que diluya la concentración de 15N a 2.500 átomos % 15N. Además, supongamos que laplanta N total es de 100 kg de N ha-1, el enriquecimiento del átomo % 15N del fertilizante fue de 5.000, y el enriquecimiento del átomo % 15N de la muestra de planta no enriquecida fue de 0,366. La muestra de planta enriquecida de 15N Nf se reduciría de 0,568 (real) a 0,461 (muestra contaminada) subestimando el VERDADERO FDN en 10,7 kg de N ha-1. Las sobreestimaciones de FDN pueden ocurrir cuando las muestras con un enriquecimiento de 15N bajo están contaminadas con 15N adicionales. Por lo tanto, se debe tener mucho cuidado en todos los pasos de la recolección y el procesamiento de muestras para minimizar la contaminación de la muestra, pero sobre todo cuando se reducen las masas de muestra (por ejemplo, procedimientos de molienda y pesaje).

Figure 1
Figura 1: Diseño de trazado para la gráfica de tratamiento y microparcela. La figura ilustra las dimensiones y las ubicaciones relativas de las áreas fronterizas, el área de muestreo no protegida, el área de cosecha y el área de microplot dentro de la parcela de tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Diagrama de muestreo de plantas y suelos de microplot. La figura ilustra las posiciones relativas de muestreo de plantas y suelos en cada etapa de muestreo que evita alterar los patrones de absorción de maíz N de las plantas de maíz muestreadas posteriormente. Los eventos de muestreo ocurrieron 8 días después de la aplicación de fertilizantes enriquecidos de 15N, en las etapas de desarrollo fisiológico de maíz V8 y R1, en la madurez fisiológica en el año de aplicación de fertilizantes enriquecidos de 15N (PMY1) y al año siguiente (PMY2), y antes de plantar el segundo año (PPY2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Representación cronológica del manejo de microparmas. (A) Disolver 15N de urea enriquecida en 2 L de agua desionizada y rociar sobre la microplot durante la siembra. (B) Recoger y picar una muestra compuesta de planta de maíz de seis partes en el suelo del área de muestreo (15N sin enriquecer) y una muestra compuesta de planta de maíz de seis partes en el suelo de la microtrama enriquecida de 15N en los tiempos de muestreo predeterminados. (C) Después de la recolección de muestras en la madurez fisiológica, retire toda la biomasa sobre el terreno restante del interior de la microtrama. (D) Post-cosecha, rastrillo de biomasa de maíz sobre el suelo de la zona de microplot. Astillar y volver a aplicar la biomasa de maíz de microtrama sobre el área de la microplot. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Ejemplo de biomasa M sobre el terreno dividida en fracciones N (FDN) derivadas de fertilizantes y N (SDN) derivadas del suelo. La biomasa total sobre el suelo N se separó en sus fuentes individuales de FDN (color sólido) y SDN (color hash) en (A) y (B). Las barras de error representan el error estándar de la media. (A) La biomasa sobre el terreno N se midió en las etapas de desarrollo fisiológico del maíz V8 y R1 y en la madurez fisiológica en el año de aplicación de fertilizantes de 15N (PMY1) y el año siguiente a la aplicación de fertilizantes 15N (PMY2). El valor por encima de cada columna representa el porcentaje del N total que era FDN. (B) La biomasa sobre el suelo N medida a PMY1 y PMY2 se muestra en sus partes individuales de mazorca (sólo año 1), estufa (tallo y hojas; incluye mazorca para PMY2), y grano para FDN y SDN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Ejemplo del presupuesto derivado del N (FDN) del fertilizante de suelo y maíz. La masa de FDN recuperada en biomasa de maíz sobre el suelo(Abvgd)y a varias profundidades de muestreo del suelo se informa para seis eventos de muestreo durante dos temporadas de crecimiento. Los eventos de muestreo ocurrieron 8 días después de la aplicación de fertilizantes enriquecidos 15N(PA),en las etapas de desarrollo fisiológico de maíz V8 y R1, en la madurez fisiológica en el año de aplicación de fertilizantes enriquecidos de 15N (PMY1) y al año siguiente (PMY2), y antes de plantar el segundo año (PPY2). La diferencia entre la tasa de fertilizantes aplicados (135 kg N ha-1) y la masa de FDN recuperada en las porciones de suelo-maíz es la no contabilizada para la fracción FDN. La masa total de FDN para PPY2 y PMY2 fue de 113 kg FDN ha-1 porque 22 kg FDN ha-1 se exportó fuera del sistema suelo-maíz como grano de primer año. Las barras de error representan el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La investigación estable de isótopos es una herramienta útil para rastrear y cuantificar FDN a través del sistema de cultivos de suelo. Sin embargo, hay tres supuestos principales asociados con los estudios de trazador N que si se violan pueden invalidar las conclusiones extraídas del uso de esta metodología. Son 1) el trazador se distribuye uniformemente por todo el sistema, 2) los procesos bajo el estudio se producen a las mismas tasas, y 3) N dejando el pool enriquecido 15N no devuelve3. Debido a que este estudio está interesado en la distribución del FDN total en todo el sistema de cultivos de suelo, los supuestos 2 y 3 son de mínima preocupación21.

El alto costo de 15N de material enriquecido generalmente limita el tamaño de 15N estudios de trazador. Por lo tanto, antes de iniciar un estudio de N tracer, el investigador debe planificar cuidadosamente los objetivos del proyecto de investigación teniendo en cuenta: el número de eventos de muestreo, la duración del estudio (días a años), la tasa de aplicación de fertilizantes N y la concentración de enriquecimiento de 15N necesaria para medir las diferencias de abundancia natural (0,366 %) después de 15N de dilución de fertilizantes enriquecidos por suelo a granel2. Los niveles de enriquecimiento de 15N de uso común y las tasas de aplicación se notifican para diferentes tipos de investigación agronómica en la referencia 2. Después de determinar los objetivos del estudio, la microplot debe ser lo suficientemente grande para acomodar el muestreo del suelo y la planta y evitar los efectos del borde. El diseño de parcela descrito en este protocolo utiliza una parcela no confinada que requiere que las áreas fronterizas no muestreadas se emple sean empleadas6. La concentración de 15N en las zonas fronterizas se diluye por el flujo de masa a través del límite de microparplot y la absorción de N desde fuera de la microparma por raíces laterales de maíz que crecen en las filas 1 y 6. Las parcelas confinadas, en las que las barreras físicas se introducen en el suelo, no requieren zonas fronterizas, pero requieren trabajo adicional durante el establecimiento de microparplots y pueden limitar las operaciones rutinarias sobre el terreno6. Las referencias 3, 6, 22-25 proporcionan orientación adicional sobre la selección de tamaños de microparcedoras, anchuras de borde y cuando las parcelas confinadas o no confinadas pueden ser más apropiadas.

El esquema de muestreo de plantas y suelos de este estudio está diseñado para permitir múltiples eventos de muestreo durante dos temporadas de crecimiento consecutivas. A principios de temporada se toman muestras de plantas y suelos cerca de los bordes exteriores de la microtrama. Cada evento de muestreo sucesivo se acerca al centro de la microtrama para evitar el muestreo de áreas muestreadas previamente. Al menos dos plantas de maíz separan cada planta muestreada para minimizar los cambios en el desarrollo fisiológico del maíz. Un desafío con la técnica de muestreo del suelo de este estudio es que el método de muestreo del núcleo del suelo puede no interceptar con precisión la distribución heterogénea de 15N en el perfil del suelo3. La variabilidad espacial del total del suelo N es alta con un coeficiente estimado de variación del 15%3. La excavación completa de microtrama mejoraría la precisión de la cuantificación de 15N, pero requiere el procesamiento de volúmenes significativos de suelo y limita el muestreo a un solo evento3 que no está en línea con los objetivos de este estudio. Subdividir la microtrama en unidades de muestreo más pequeñas permite múltiples eventos de excavación, pero puede aumentar el tamaño de microparcedora requerido para garantizar que las unidades no muestreadas no se vean afectadas por las modificaciones en el dosel del cultivo y la dinámica del agua del suelo. A pesar de la posible reducción de la precisión, muchos estudios utilizan la técnica del núcleo del suelo para microparmas de 1 m29,22,26,27,28. La precisión de la muestra puede aumentar aumentando el número de núcleos de suelo recogidos y compuestos por microtrama utilizando la siguiente fórmula13:

n á (Z2)(CV2)/(d2)

donde n es el número de núcleos de suelo, Z es el variate normal estandarizado para el nivel alfa correspondiente (1.96 para 0.05 y 1.65 para 0.10), CV es el coeficiente de variación, y d es el margen de error en la media de la gráfica (como un decimal). Sobre la base de esta fórmula, los autores esperan que 15 núcleos por microtrama calculen el total de N a 7,6% en el 95% de las parcelas (n a 15; Z 1,96; CV - 15%; d a 0,076). La referencia 25 utilizó un número similar de núcleos, pero subdividió la microtrama en 32 unidades de muestreo que recogen muestras de plantas y suelos de cuatro unidades en cada evento de muestreo.

Otros han demostrado que los datos de micrográficos se pueden extrapolar a toda la gráfica29. Sin embargo, para que esta suposición sea válida, la gráfica de tratamiento y la microtrama deben gestionarse de forma similar. Si es posible, el fertilizante N debe aplicarse en las mismas formas químicas y físicas (por ejemplo, urea disuelta en agua), ya que estas propiedades afectan a la dinámica entre fertilizantes y suelos, incluidos los mecanismos de pérdida de N, la inmovilización y la disponibilidad de microbios y plantas del suelo3.

El método de molienda de frascos de rodillos descrito en este protocolo es capaz de pulverizar grandes volúmenes de muestras de plantas y suelos, ideal para garantizar una muestra representativa y homogeneizada. Sin embargo, la técnica requiere un trabajo manual significativo y tiempo para cargar, descargar, enrollar y limpiar los tarros de rodillos. El procesamiento de muestras está limitado por el número disponible de frascos de rodillos, la capacidad de la unidad de cinta transportadora y el tamaño del baño ácido. Los viales de molienda comercial pueden ser una alternativa a los frascos de rodillos, pero pueden limitar el volumen de muestras de plantas y suelos procesadas. Se pueden construir viales de molienda de un solo uso fabricados en laboratorio que potencialmente sirvan como recipiente de molienda y de almacenamiento de muestras. La consideración principal de cualquiera de estos métodos de molienda es minimizar la contaminación cruzada entre las muestras.

Por último, debido a que el material de fertilizante enriquecido con 15N es caro, 15N de biomasa sobre el suelo enriquecida y muestras de suelo pueden conservarse y homogeneizarse para su uso en estudios futuros. Estos productos pueden ser especialmente útiles al investigar la descomposición de residuos, potencial de mineralización u otros procesos de ciclo de nutrientes21.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen el apoyo del Minnesota Corn Research & Promotion Council, la Hueg-Harrison Fellowship y la Minnesota's Discovery, Research and InnoVation Economy (MnDRIVE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 mL scintillation vial ANY; Fisher Scientific is one example 0334172C
250 mL borosilicate glass bottle QORPAK 264047
48-well plate EA Consumables E2063
96-well plate EA Consumables E2079
Cloth parts bag (30x50 cm) ANY NA For corn ears
CO2 Backpack Sprayer ANY; Bellspray Inc is one example Model T
Coin envelop (6.4x10.8 cm) ANY; ULINE is one example S-6285 For 2-mm ground plant samples
Corn chipper ANY; DR Chipper Shredder is one example SKU:CS23030BMN0 For chipping corn biomass
Corn seed ANY NA Hybrid appropriate to the region
Disposable shoe cover ANY; Boardwalk is one example BWK00031L
Ethanol 200 Proof ANY; Decon Laboratories Inc. is one example 2701TP
Fabric bags with drawstring (90x60 cm) ANY NA For plant sample collection
Fertilizer Urea (46-0-0) ANY NA ~0.366 atom % 15N
Hand rake ANY; Fastenal Company is one example 5098-63-107
Hand sickle ANY; Home Depot is one example NJP150 For plant sample collection
Hand-held soil probe ANY; AMS is one example 401.01
Hydraulic soil probe ANY; Giddings is one example GSPS
Hydrochloric acid, 12N Ricca Chemical R37800001A
Jar mill ANY; Cole-Parmer is one example SI-04172-50
Laboratory Mill Perten 3610 For grinding grain
Microbalance accurate to four decimal places ANY; Mettler Toledo is one example XPR2
N95 Particulate Filtering Facepiece Respirator ANY, ULINE is one example S-9632
Neoprene or butyl rubber gloves ANY NA For working in HCl acid bath
Paper hardware bags (13.3x8.7x27.8 cm) ANY; ULINE is one example S-8530 For soil samples and corn grain
Plant grinder ANY; Thomas Wiley Model 4 Mill is one example 1188Y47-TS For grinding chipped corn biomass to 2-mm particles
Plastic tags ULINE S-5544Y-PW For labeling fabric bags and microplot stalk bundles
Sodium hydroxide pellets, ACS Spectrum Chemical SPCM-S1295-07
Soil grinder ANY; AGVISE stainless steel grinder with motor is one example NA For grinding soil to pass through a 2-mm sieve
Tin capsule 5x9 mm Costech Analytical Technologies Inc. 041061
Tin capsule 9x10 mm Costech Analytical Technologies Inc. 041073
Urea (46-0-0) MilliporeSigma 490970 10 atom % 15N

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References

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Diseño de microparplots y preparación de muestras de plantas y suelos para <sup>15 análisis</sup>de nitrógeno
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Spackman, J. A., Fernandez, F. G. Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis. J. Vis. Exp. (159), e61191, doi:10.3791/61191 (2020).

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