Summary
15N izleyici araştırması için bir mikroplot tasarımı, mevsiminde birden fazla bitki ve toprak örnekleme olayını barındıracak şekilde tanımlanmıştır. Öğütme ve tartım protokolleri de dahil olmak üzere toprak ve bitki numune toplama ve işleme prosedürleri 15N analiz için konur.
Abstract
Introduction
Gübre azotu (N) kullanımı tarımda artan küresel nüfusun gıda, lif, yem ve yakıt taleplerini karşılamak için gereklidir, ancak tarım salkı larından kaynaklanan N kayıpları çevresel kaliteyi olumsuz etkileyebilir. N toprak-kırpma sisteminde birçok dönüşümler uğrar çünkü, N bisiklet daha iyi anlaşılması, ürün kullanımı, ve gübre N genel kaderi N kullanım verimliliğini teşvik ve çevresel kayıpları en aza indirmek yönetim uygulamalarını geliştirmek için gereklidir. Geleneksel N gübre çalışmaları öncelikle ürün verimi, uygulanan N oranına göre mahsul N alımı (görünür gübre kullanım verimliliği) ve artık toprak N gibi sezon sonu ölçümleri üzerinde bir tedavinin etkisi üzerinde duruluyor. Bu çalışmalar genel sistem N girdileri, çıktıları ve verimlilikleri ölçerken, gübre kaynaklarından veya topraktan elde edilen toprak mahsul sisteminde N'yi tanımlayamazlar ve ölçemezler. Toprak mahsul sisteminde n (FDN) elde edilen gübrenin akıbetini izlemek ve ölçmek için kararlı izotoplar kullanılarak farklı bir yaklaşım kullanılmalıdır.
Azot un doğada 14 N/ 15N için nispeten sabit bir oranda meydana gelen 14N/15N1 (konsantrasyon0,366 atom % 15N veya 3600 ppm 15N2,3)olmak üzere iki kararlı izotopvardır. 15 15N zenginleştirilmiş gübrenin eklenmesi toprak sisteminin toplam 15N içeriğini artırır. 15N zenginleştirilmiş gübre zenginleştirilmemiş toprak N ile karışımları gibi, 14N /15N oranı ölçülen değişiklik araştırmacılar toprak profilinde FDN izlemek ve ürüniçine 3,4sağlar. Bir kütle dengesi, sistemdeki toplam 15N izleyici miktarı ve 2'2nin her biri ölçülerek hesaplanabilir. 15N zenginleştirilmiş gübreler geleneksel gübrelere göre çok daha pahalı olduğundan, 15N zenginleştirilmiş mikroplotlar genellikle arıtma arazileri içinde gömülür. Bu yöntem ödevinin amacı, mısır için birden fazla mevsim içi toprak ve bitki örnekleme etkinlikleri(Zea mays L.) için mikroçizimler iman eden küçük bir arazi araştırma tasarımını tanımlamak ve toplam 15N analizi için bitki ve toprak örneklerinin hazırlanması için protokoller sunmaktır. Bu sonuçlar daha sonra N gübre kullanım verimliliğini tahmin etmek ve toplu toprak ve mahsul fdn için kısmi Bir N bütçe muhasebe oluşturmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Alan site açıklaması
NOT: 15N izleme alanı denemesi yaparken, seçilen siteler toprak, topografya ve fiziksel özellikler nedeniyle değişimi en aza indirmelidir5. Çapraz kontaminasyon eğim, rüzgar veya su translokasyonu veya toprak işlemesi nedeniyle yanal toprak hareketi sonrasında oluşabilir, toprak N dikey dağılımı yeraltı su akışı ve kiremitdrenajıtarafından etkilenebilir 6 .
- Geçmiş yönetimi (örn. önceki ekinler ve toprak işleme), enlem ve boylam, toprak fiziksel ve kimyasal özellikleri (örn. toprak dokusal analizi, ilk doğurganlık koşulları, pH ve toprak kütle yoğunluğu) dahil olmak üzere deneysel saha alanını tanımlayın.
- Araştırma alanı ve saha köşeleri için GPS koordinatlarını kaydedin.
- Haşere ve hastalık yönetimi (herbisit, böcek ilacı veya mantar ilacı kullanımı), toprak doğurganlık yönetimi (oran, kaynak, yerleştirme ve uygulama zamanlaması dahil), toprak işleme, sulama olayları ve miktarları ve kalıntı yönetimi dahil olmak üzere büyüyen sezon yönetimi açıklayın.
- Mahsul büyümesi ve mikrop aracılı N dönüşümleri toprak nemi, toprak sıcaklığı ve hava sıcaklığından etkilendiği için, günlük yüksek ve düşük sıcaklıklar, günlük yağış lar ve toprak nemi ve sıcaklıkları da dahil olmak üzere iklim bilgilerini toprak örnekleme derinliklerini yansıtan çeşitli derinliklerde kaydeder.
2. Arsa tasarımı
- Bitki altı mısır satır (~ 86.000 bitki ha-1) 76 cm aralıklı 15.2 m tarafından 4.6 m son bir arsa boyutu ile.
- Uzunlamasına boyutun her ucundan 1,5 m( 0-1,5 m, 13,7-15,2 m) ve örnekleme ve hasat alanlarına bitişik 1,5 m uzunluğunda (9,8-11,3 m) ek bir sınır alanı kurun(Şekil 1).
- 2 ve 3 sıralarını mevsim içi bitki ve toprak örnekleme alanı (1,5-9,8 m) ve 4 ve 5 sıralarını mısır tanesi verimi için hasat alanı (1,5-9,8 m) olarak belirleyin.
- Genişlik boyutuna odaklanmış 2,4 m ile 3,8 m boyutlarında bir mikroçizim alanı (11.3-13.7 m) kurun. Kenar etkilerini en aza indirmek için uzunluk ve genişlik boyutlarında 0,38 m numunelenmemiş kenarlık bırakarak bu alandaki 15N zenginleştirilmiş bitki ve toprak numunesinin tümünü toplayın(Şekil 2).
- Farklı renkli bayraklar ile tedavi arsa ve microplot köşeleri delineate.
3. Toprak ve bitki numunesi önlemleri
- Zenginleştirilmemiş ve zenginleştirilmiş malzemeler için özel ekipman ve işleme alanları kullanın. Zenginleştirilmiş malzemeler (gübre, toprak veya bitki) tarafından zenginleştirilmiş malzemelerin kirlenmesi ve bunun tersi sonuçları büyük ölçüde etkileyebilir.
- 15N zenginleştirilmiş toprak ve bitki numunelerini, çapraz kontaminasyonu en aza indirmek için beklenen en düşük 15N zenginleştirme sırasına göre toplayın ve işleyin. Numune taşımadan çapraz kontaminasyonu en aza indirmek için çalışma yüzeylerinin, eldivenlerin, mutfak eşyalarının ve makinelerin her numune arasında iyice temizlenmesini sağlayın.
- Zenginleştirilmemiş örnekleme alanlarının kirlenmesini önlemek için mikro arazilerde yaya trafiğini en aza indirin. Mikro çizimlere erişirken koruyucu ayakkabı kaplamaları takın ve mikroçizim alanından çıkarken çıkarın.
4. 15N zenginleştirilmiş gübre hazırlama ve uygulaması
- Gübre 15N kullanım verimliliği (F15NUE) çalışmaları için Ref. 2 tarafından öne sürülen kurallara uyulması, 10 atom % 15N zenginleştirilmiş üre % 5 atom 15N zenginleştirilmiş üre ve üre gübresinin düzgün zenginleştirilmesini sağlamak için 2 L deiyonize su da çözünür.
NOT: 15N zenginleştirilmiş gübrenin gerekli konsantrasyonu tarımsal çalışmanın hedeflerine bağlıdır. Stok 15N zenginleştirilmiş gübre konsantrasyonu araştırmacının gereksinimlerini aşarsa, stok gübre konsantrasyonu aşağıdaki formül3kullanılarak benzer konvansiyonel gübre ile seyreltilebilir.
X2 = [(C1/C2) - 1] × X1
X2 geleneksel zenginleştirilmemiş gübrenin kütlesi, X1 izleyici gübresinin kütlesi, C1 izotopik konsantrasyon [atom % aşırı olarak ifade edilir (ölçülen atom % zenginleştirme eksi doğal arka plan konsantrasyonu olarak kabul edilen 0.3663 atom %)] ve C2 son karışımın izotopik konsantrasyonudur. Örnek olarak, 100 g verilen 100 g % zenginleştirilmiş üre, konvansiyonel zenginleştirilmemiş gübre 92.7 g 5 atom % son izotopik konsantrasyon uğrama için gerekli olacaktır;
X2 = {[(10-0.3663)/5] - 1} × 100. - Zenginleştirme doğrulamak için 15N konsantrasyonu için çözümü analiz edin. Yazarlar UC Davis Kararlı İzotop Tesisi tarafından sağlanan analitik hizmetlerden yararlandı.
NOT: Toprak-bitki-mikrop rejiminin gübre eklemelerine verdiği tepkiler gübrenin fiziksel formundan etkilenebilir. Çalışmanın hedeflerine bağlı olarak, üre çözeltisi bir sıvı olarak uygulanabilir veya reform kristalleri için susuz. Kristaller 10.000 psi bir Carver basın kullanılarak bir pasta içine sıkıştırılmış olabilir, pasta ezme ve istenilenboyutaparçacıkları tarama takip 3 . - 15 N 15zenginleştirilmiş üre çözümlerini kalibre edilmiş bir sırt çantası CO2 püskürtücü(Şekil 3A)kullanarak mikroçizimlere eşit olarak uygulayın. Birden fazla N oranı veya zenginleştirme düzeyi kullanılıyorsa, her zenginleştirme seviyesi için belirlenmiş CO2 püskürtücüler kullanmayı düşünün veya tek bir püskürtücü kullanın ve tedavi çapraz kontaminasyonu en aza indirmek için en düşükten en yüksek zenginleştirmeye kadar çözümler uygulayın.
- Volatilizasyon kaybı potansiyelini en aza indirmek için 24 saat içinde hafif toprak işleme, el tırmıkları veya en az 0,6 cm sulama ile üre içeren gübreler dahil edin.
- İkinci büyüme sezonunda mikroarsa ilave 15N zenginleştirilmiş üre gübresi uygulanmaz. Azot nedeniyle mısır büyümesinde diferansiyel bir yanıt önlemek için tüm tedavi geleneksel zenginleştirilmemiş üre uygulayın.
5. Alan numune işleme: yerüstü mısır biyokütlesi
- Her örnekleme aşamasında, örnekleme alanı içinden altı-aboveground mısır bitki kompozit örnek toplamak(15N zenginleştirilmemiş) ve altı-aboveground mısır bitki kompozit örnek 15N zenginleştirilmiş mikroarsa. En az iki bitki önemli ölçüde bitki büyüme dinamikleri değişen önlemek için her örneklenmiş bitki ayırmak gerekir. Yazarlar V8 ve R1 mısır fizyolojik gelişim aşamalarında bitki örnekleri toplandı11 ve fizyolojik olgunluk(Şekil 2).
- 3.1 ve 3.2 adımlarında açıklanan ilkelere göre V8 ve R1 yerüstü biyokütlesini (≤5 cm ile ≤5 cm); bir bahçe atık parçalayıcı tatmin edici bir seçenektir. Doğranmış biyokütleyi etiketli kumaş veya kağıt torbaya yerleştirin ve 60 °C'de sabit kütleye kadar fırına kurulayın. Biyokütle kuru ağırlığını kaydedin (Şekil 3B).
- Bölüm fizyolojik stover içine mısır bitkileri olgun (yapraklar, kabukları ve sapları dahil olmak üzere tüm bitkisel dokular), tahıl, ve koçan fraksiyonları. 60 °C'de bir fırında sabit kütleye kadar doğrayın ve kurulayın. Biyokütle kuru ağırlığını kaydedin.
- Mikroarsa içinde, toprak yüzeyinde tüm mısır sapları kesilmiş, bir paket içine kravat, arsa göre etiket, ve alanından kaldırmak (Şekil 3C). Hasat veya hasat sonrası toprak işleme sırasında birleştirme ile kaldırma riskini en aza indirmek için neredeyse toprak yüzeyi ile floş olmak için microplot köşe bayrakları ayarlayın.
- Hasat alanından hasat tahıl ve rapor verim 15.5% nem içeriği12. Hasat kalan araştırma alanları bir arsa ile birleştirmek.
- Mikro çizim alanından zenginleşmemiş biyokütle leri tırmıkla. Mikroçizatriyi yerüstü biyokütlesini doğru çizime doğrayın ve yeniden uygulayın (Şekil 3D).
- Toprak ve mısır kalıntısı taşınmasını en aza indirmeye özen görerek toprak yüzeyine kalıntıyı mikroplot alanına veya dışına dahil edin. Toprak işlemesi nedeniyle kaldırılan herhangi bir microplot köşe bayraklarını değiştirin.
- İlk yıl mısır ile aynı sıralara ikinci yıl mısır bitki.
- Adım 5.3 açıklandığı gibi sadece fizyolojik olgunluk ve ilk yıl mısır örnekleri gibi süreç ikinci yıl yerüstü mısır biyokütlesi toplamak. Toprak işlemeden sonra olası sinyal seyreltmelerini önlemek için mikroplot alanının merkezinden (1,52 m ila 0,76 m) mikroçizim örnekleri toplayın(Şekil 2). Hasat alanından tahıl hasat ve rapor verim 15.5% nem içeriği.
- 3.1 ve 3.2 adımlarının prensiplerini izleyerek, 2 mm'lik bir elekten geçmek için 100 ila 200 g kurutulmuş bitki malzemesini iyice karıştırın ve öğütün. Zemin malzemesini iyice karıştırın ve daha fazla işlem için bir alt numuneyi etiketli bir sikke zarfında saklayın.
NOT: Perten Laboratuvar Değirmeni 3610 tahıl öğütme için tatmin edici bir seçenek iken Bir Thomas Wiley değirmen bitki doku taşlama için tatmin edici bir seçenektir.
DİkKAT: Bitki numunelerini öğüten kişiler, Ulusal İş Güvenliği ve Sağlığı Enstitüsü onaylı N95 Partikül Filtreleme Yüz Parçası Respiratörü takarak kulak koruması takmalı ve toz soluduğundan korunmalıdır.
6. Alan numune işleme: toprak
- 15N zenginleştirilmiş gübre uygulaması, V8, R1 ve hasat sonrası toprak işlemeden 8 gün sonra birinci yıl toprak örneklerini toplayın. Hasat öncesi ve hasat sonrası ikinci yıl toprak örneklerini toplayın. Lojistik örnekleme kısıtlamaları nedeniyle, yazarlar mevsim içi toprak örneklerini 0-15-, 15 ila 30- ve 30-60 cm derinliklerde hasat sonrası toprak örnekleri 0-15-, 15-30-30-, ve 60- 60-cm derinliklerde ve ikinci yıl bitki öncesi toprak örnekleri 0- ila 30-, 30- 60-60- 60- 120 cm derinliklerde.
NOT: Bir toprak sondası tek bir çekirdek olarak istenilen derinliğe bir toprak çekirdeği toplayamıyorsa, üst derinliklerden düşen topraktan kirlenmeyi önlemek için toprağın üst 1 cm'sini atan üst derinliklerle aynı sondaj deliklerinden daha derin derinlik çekirdekleri toplayın.- Bir el sondası kullanarak V8 ve R1'deki zenginleştirilmemiş örnekleme alanından dört çekirdekli (1,8 cm çapında) kompozit toprak numunesi alın. Mısır satır ve mısır satırları arasında üç çekirdek bir çekirdek toplamak.
- Hidrolik probu kullanarak, tesis öncesi ve hasat sonrası zenginleştirilmemiş örnekleme alanından iki çekirdekli (5 cm çapında) kompozit toprak numunesi toplayın.
- 15 N zenginleştirilmiş gübre uygulaması, V8 ve R1'den 8 gün sonra mikroplot alanından 15çekirdekli (1,8 cm çapında) kompozit toprak numunesi alın. Mısır satır ve mısır satırları arasında 11-12 çekirdek üç ila dört çekirdek toplamak.
NOT: Topraklar son derece heterojendir. Zenginleştirilmiş mikroplot içinde toplanan çekirdeklerin daha fazla sayıda toprak N13gerçek 15N zenginleştirme daha iyi bir tahmin sağlar. - Hidrolik probu kullanarak, tesis öncesi ve hasat sonrası mikroplot alanından üç çekirdekli (5 cm çapında) kompozit toprak numunesi toplayın.
- Her kompozit toprak örneğini bir kovada homojenize edin ve önceden etiketlenmiş bir kağıt torbaya yerleştirin.
- Kuru toprak numuneleri 35 °C'de, sabit kütleye kadar zorunlu hava fırınında. 2 mm'lik bir elekten geçmek için her numuneyi öğütün. Mekanik bir toprak öğütücü, her numune arasında iyice temizlenebilirse tatmin edicidir.
NOT: Toprak örnekleri ince bir tabaka halinde tepsilere serilerek havayla kurutulabilir. Tepsiler, N kaynakları nın dışında kirlenmeden uzak bir alanda olmalıdır. Zenginleştirilmemiş ve zenginleştirilmiş numuneler çapraz kontaminasyonu önlemek için fiziksel olarak ayrılmalıdır.
DİkKAT: Toprak numunelerini öğüten kişiler, Ulusal İş Güvenliği ve Sağlığı Enstitüsü onaylı N95 Partikül Filtreleme Yüz Parçası Respiratörü takarak kulak koruması takmalı ve toz soluduğundan korunmalıdır.
7. Laboratuvar numune işleme: öğütme toprak ve bitki örnekleri
- Kuru zemin bitkisi numuneleri (2 mm) bir gecede 60 °C'deki bir fırında.
- Adım 3'te açıklanan ilkelere göre, kurutulmuş bitki numunelerini veya toprak malzemesini ince, un benzeri bir kıvamda öğütün. Bir rulo kavanoz değirmen tatmin edici bir seçenektir.
NOT: Yazarların kavanoz değirmeni, aynı anda 54 silindir kavanozu işleyebilen özel olarak üretilebilen bir konveyör bant sistemidir.- Her rulo kavanozu (250 mL borosilikat cam kavanozu vidaüstü kapakla) 10 ila 20 g öğütülmüş bitki veya toprak numunesi ve yedi paslanmaz çelik çubukla (8,5 cm uzunluğunda, 0,7 cm çapında) doldurun.
- Rulo rulo kavanoz 6-24 saat veya numuneler ince, un gibi bir kıvam ayana kadar 0,4 x g.
- İnce zemin malzemesini temiz, etiketli 20 mL sintillasyon şişesine aktarın.
- Her örnek arasında, yıkama rulo kavanoz, paslanmaz çelik çubuklar, ve sabun ve su ile kapaklar herhangi bir kalıntı kaldırmak için.
- Rulo kavanozları ve kapakları %5 HCl asit banyosuna daldırın (%36-38 konsantre stoktan hazırlanan) bir gecede14.
DİkKAT: Hidroklorik asit aşındırıcıdır. Bu ciddi cilt yanıkları neden olabilir, göz hasarı, ve solunduğunda zararlıdır. Her zaman koruyucu giysiler, eldivenler, göz ve yüz koruması giyin. Floş iyice su ile temas lı doku. Asitleri taşırken her zaman ikincil bir kap kullanın. Bu reaksiyon ekzotermik olduğu için her zaman suya asit ekleyin. Hemen kabartma tozu ile asit dökülmeleri nötralize.
NOT: Büyük bir asit banyosu 208 L plastik kapta %5 HCl'de 100 L olarak hazırlanabilir. Bir duman kaputunda birkaç küçük hacimleri hazırlayın ve sonra plastik konteyner çözümleri aktarın. Çözümü her üç ayda bir değiştirin. - Deiyonize su ve hava kuru ile üçlü durulama rulo kavanoz ve kapaklar.
- Paslanmaz çelik çubukları 0,05 M NaOH banyosuna daldırın (1 L deiyonize suda 2 g NaOH eriterek hazırlanır)14 geceleyin. Her gün yeni bir 0.05 M NaOH banyosu hazırlayın.
DİkKAT: Sodyum hidroksit ciddi cilt yanıkları ve göz hasarına neden olabilir. Her zaman koruyucu giysiler ve göz koruması giyin. Kirlenmiş giysileri hemen çıkarın ve cildi veya gözleri birkaç dakika suyla durulayın. - 5 dakika boyunca çalışan sıcak musluk suyu altında çubuklar durulayın. Dekant ve üçlü deiyonize su ile çubuklar durulayın. Çubuklar kağıt havlu kaplı tepside kuru hava sağlar.
- Rulo kavanozları ve kapakları %5 HCl asit banyosuna daldırın (%36-38 konsantre stoktan hazırlanan) bir gecede14.
8. Toplam N ve 15 N analizi için zemin bitkisi ve toprak örneklerini tartMak
- Toplam N içeriği için birkaç temsili bitki ve toprak örneğini analiz edin (örn. yanma analizi15). Analizör özelliklerine göre 15N analizi için yeterli N içeriği sağlayan örnek kütlesini hesaplayın.
NOT: Yazarlar UC Davis Kararlı İzotop Tesisi tarafından sağlanan analitik hizmetlerden yararlandı. Zenginleştirilmiş numune ağırlıkları 20 μg N ve maksimum 100 μg N için optimize edilmiştir. - En düşükten en yüksek beklenen 15N zenginleştirmeye benzer örnekleri düzenleyin. Örnek hassasiyetini kontrol etmek için her çalıştırmada her sekizila on ikinci numuneyi kopyalayın. Çalıştırılanın16başına en az bir çek örneği ekleyin.
- Etiket temiz bir 96-iyi plaka ve bireysel iyi buharlaşma halkaları ile donatılmış kapak. Taşıma sırasında kuyular arasında örnek hareketi önlemek için kapağın içine sığacak şekilde temiz bir indeks kartı kesin.
- Nitril eldiven ler takın, mikro pulları, çalışma yüzeylerini, spatulaları ve kopları laboratuvar mendilleri ve etanolile temizleyin. Laboratuvar bankına kimwipe'in üzerine temizlenmiş aletler yerleştirin.
NOT: Zenginleştirilmemiş ve zenginleştirilmiş numuneler çapraz kontaminasyonu önlemek için ayrı ölçekler ve gereçler kullanılarak işlenmelidir. - 5 mm x 8 mm kuyuya sahip paslanmaz çelik blok gibi temiz bir çalışma yüzeyine önceden oluşturulmuş 5 mm x 9 mm'lik bir kutu kapsül yerleştirmek için forseps kullanın. Silindirik şekli reform ve gerekirse kapsül alt düzleştirmek için yavaşça kuyuya kapsül dokunun.
NOT: Numune kütleleri çok küçük olacağından, numune kontaminasyon riski yüksektir. Kapsüllere asla eldivenle dokunmayın. Bu forceps, temiz çalışma yüzeyi, ölçek tartma tava veya 96-well plaka dışında herhangi bir yüzeye dokunursa kapsül atın. - Manipülasyonu kolaylaştırmak için kapsülün üst 1 mm'sini hafifçe parlamak için forceps kullanın. Kapsülün ağırlığını katran yaparken kireç hasarından kaçınmak için, kapsülü mikro ölçektetin ağırlık tavasının 1 ila 2 mm yukarısına kadar takın ve bırakın. Kapsülü tare. Kapsülü temiz çalışma yüzeyine döndürmek için pratisyen hekimler kullanın.
- Kapsüle gerekli zemin numunesi malzemesinin kütlesini dikkatlice eklemek için bir spatula kullanın. Numune materyalinin kapsülün dış yüzeyine veya çalışma yüzeylerine dökülmesinden kaçının.
- Forceps kullanarak, yavaş yavaş kapsül üst üçte kırışmak ve mühür üzerinde katlayın. Forceps kullanarak, kat ve küresel bir şekil içine kapsül sıkıştırmak için devam delmek veya tin yırtmak için değil dikkat.
NOT: N içeriği düşük numuneler, 5x9 mm kapsülün kapasitesini aşan numune hacimleri gerektirebilir. Bu durumlarda daha büyük kapsüller (örneğin, 9 mm x 10 mm) kullanılabilir. - Kaçakları kontrol etmek için sarılmış kapsülü 1 cm yükseklikten temiz, karanlık bir yüzeye veya aynaya birkaç kez düşürmek için forseps kullanın. Toz görünmüyorsa, 8.6 adımda açıklandığı gibi aynı tekniği kullanarak numuneyi tartın. Örnek ağırlığı kaydedin. Kapsülü 96 kuyuluk bir plakaya yerleştirin ve kuyu yerleşimini kaydedin.
- Karanlık yüzeyde toz beliriyorsa, örnek ağırlığı kaydedin. Örneği ikinci bir kutu kapsülüne sarın, sızıntıları tekrar kontrol edin ve temiz bir 96 kuyuluk tabağa yerleştirin.
NOT: Sarılmış kapsül 96 kuyulu bir plakaya sığmayacak kadar büyükse, 24 veya 48 kuyulu bir plaka kullanın.
- Karanlık yüzeyde toz beliriyorsa, örnek ağırlığı kaydedin. Örneği ikinci bir kutu kapsülüne sarın, sızıntıları tekrar kontrol edin ve temiz bir 96 kuyuluk tabağa yerleştirin.
- Numuneler arasında, spatula ve forceps kenarlarına özel dikkat eden etanol ve laboratuvar mendilleri ile mutfak eşyaları ve yüzeylerin her birini temizleyin.
- Bant kullanarak kapağı 96 kuyudaki tabağa sabitleyin ve kurutucuda saklayın.
9. Hesaplamalar
- Aşağıdaki denklemleri kullanarak bitki veya toprak örneklerinde bulunan N (kg'ha-1)kütlesini hesaplayın.
- Bitki ve toprak örnekleri için N(FDN)elde edilen gübre yi (N f),ve topraktan elde edilen N(SDN)gübreyi hesaplayın17.
a atom % 15N zenginleştirme nerede. -
- Hesaplama gübre 15N kullanım verimliliği17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Toplam (FDN + SDN) yerüstü biyokütle N ilk büyüme sezonunda her ardışık örnekleme olayı ile arttı(Şekil 4). Gübre kaynaklı N konsantrasyonu, v8'deki toplam yer üstü biyokütlesi N'nin %44 ± 4 (ortalama ± standart hata) ile büyüme mevsiminde en yüksek seviyedeydi ve birbirini izleyen her örnekleme periyoduile birlikte azaldı(Şekil 4A). Ancak, SDN sürekli optimum mısır büyümesi için toprak N kaynağının önemini gösteren yer üstü biyokütle N en büyük kısmı oldu. İlk yıl fizyolojik olgunlukta yerüstü biyokütlesi N'nin %27 ± 1'i tahıl, stover ve cob fraksiyonlarında benzer oranlarda FDN'den dir(Şekil 4B). İkinci yıl fizyolojik olgunlukta, birinci yıl FDN'nin sadece %2 ± 0.1'i yerüstü biyokütlesinde 1.6 ± 0.2 kg birinci yıl FDN ha-1 tahıldan ihraç edildi(Şekil 4A)kurtarıldı.
Toprak mahsulFDN bütçe zaman içinde sistem içinde FDN bisiklet ölçmek için yararlıdır. Gübre uygulamasının 8 d'sinde FDN'nin büyük bir kısmı beklendiği gibi toprak profilinin ilk 15 cm'sinde yer aldı (Şekil 5). Ancak, 22.2 ± 4.4 kg N ha-1 daha derin derinliklere taşınırken FDN'nin %4 ± 10'u hesaba katılmamıştır. Hesaba katılmayan FDN, büyük olasılıkla öncelikle leaching, denitrifikasyon ve toprak örnekleme derinliklerinin altına FDN'yi hareket ettiren veya FDN'yi sistemden tamamen çıkaran volatilite gibi N kaybı mekanizmaları tarafından yönlendirilir. V8 ve R1'de, hesaba katılmayan FDN ortalama 60,4 ± 4,7 kg N ha-1'e, toprak N (0-15 cm) ise ortalama 31,6 ± 6,8 kg Nha -1'e yükselmiştir. Mısırın hızlı büyümesi ve V8'den R1'e yüksek N talebi, 17,7 ± 5,2 kg FDN ha-1'i yansıtan yer üstü bitki biyokütlesinde 19,0 ± 4,4 kg FDN ha-1'lik bir artışla sonuçlandı. Bu mısır geliştirme aşamaları arasındaki toprak sıcaklığı ve nem koşulları organik artıkların hızlı ciro ve mineralize N yeniden kullanımı ile sonuçlanan mikrobiyal büyüme lehine eğilimindedir. Bu sonuçlar mısır köklerinin 15 ila 60 cm derinliklerde inorganik FDN'yi çıkardığını, 0-15 cm derinlikteki FDN'nin ise öncelikle toprak organik maddesi ile mikrobiyal fraksiyonlar arasında geçiş olduğunu göstermektedir. Toprak inorganik ve organik N havuzlarıek izotopik analizi bu hipotezi doğrulamak ve FDN bisiklet dinamikleri10içine daha fazla ayrıntı ve anlayış sağlamak için gereklidir. Hasat sonrası yıl 1 olarak, orijinal FDN'nin %59 ± 2'si hesaba katılmamışken, 18.1 ± 3.9 kg FDN ha-1 toprağın ilk 30 cm'sinde(Şekil 5)ve 22.1 ± 2.3 kg FDN ha-1 tahıla ihraç edildi (Şekil 4B). Gübre 15N kullanım verimi % 24(Denklem 7)idi ve yaygın olarak bildirilen F 15 NUE önlemlerinin en düşük ucunda (%25-45)15 diğer çalışmalar tarafından bildirilen20. Her numune arasında ekipman iyice temizlenmesine rağmen, çalışmanın alt F15NUE ölçüleri, zenginleştirilmiş numuneleri beklenen en düşük ila en yüksek zenginleşme sırasına göre işleyerek zenginleştirilmiş numune seyreltme bir artifakı olabilir. İlk 30 cm'deki FDN miktarı iki katına çıkarak (36.0 ± 5.2 kg FDN ha-1) hasat sonrası yıl 1'den bitki öncesi yıl 2'ye kısmi kalıntı dökümü nedeniyle 2 sadece 17.3 ± 3.3 kg FDN ha-1 toprak-mısır sisteminde bulunmuştur (Şekil 5). Bu çalışma, birinci ve ikinci yılın sonunda, birinci yıl FDN'nin sırasıyla %41 ve %29'unun toprak-mısır sistemi içinde (tahılda ihraç edilen FDN dahil) hesaba kıldığını, geri kalanının ise ya çevreye kaybolduğunu ya da 90 cm'lik toprak örnekleme derinliğinin altında aklandığını göstermektedir.
Örnekler Nf,FDN ve SDN hesaplamalarını etkileyen çapraz kontamine olduğunda sahte sonuçlar elde edilebilir. Örneğin, gerçek 3.000 atom % 15N zenginleştirme ile 15N zenginleştirilmiş bitki örneği 15N konsantrasyonu 2.500 atom % 15N seyreltilmiş zenginleştirilmemiş malzeme ile kontamine olduğunu varsayalım. Ayrıca, ToplamPlant N Bitki100 kg N ha-1, gübrenin atom % 15N zenginleştirme 5.000 ve atom % 15N zenginleştirme zenginleştirilmiş olduğunu varsayalım 0.366. 15N zenginleştirilmiş bitki örneği Nf 0,568 (gerçek) 0,461 (kontamine örnek) 10,7 kg N ha-1tarafından gerçek FDN hafife azaltılmış olacaktır. FDN'nin aşırı tahminleri, 15N zenginleştirme düşük numuneler ek 15N ile kontamine olduğunda oluşabilir. Bu nedenle, numune kontaminasyonunu en aza indirmek için numune toplama ve işlemenin tüm adımlarında, özellikle numune kütleleri azaltıldığında (örn. taşlama ve tartma prosedürleri) aşırı özen izlenmelidir.
Şekil 1: Tedavi konusu ve mikro arsa için çizim tasarımı. Şekil boyutları ve sınır alanları, zenginleştirilmemiş örnekleme alanı, hasat alanı ve tedavi arsa içinde microplot alanı göreli yerleşimleri göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikroplot bitki ve toprak örnekleme diyagramı. Şekil, daha sonra örneklenmiş mısır bitkilerinin mısır N alım modellerinin değiştirilmesini önleyen her örnekleme aşamasındaki göreceli bitki ve toprak örnekleme pozisyonlarını göstermektedir. Örnekleme olayları 15N zenginleştirilmiş gübre uygulamasından 8 gün sonra, V8 ve R1 mısır fizyolojik gelişim aşamalarında, fizyolojik olgunlukta 15N zenginleştirilmiş gübre uygulaması(PMY1)ve ertesi yıl(PMY2),ve ikinci yıl(PPY2)dikimden önce meydana geldi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikroçizim yönetiminin kronolojik tasviri. (A) 15N zenginleştirilmiş üreyi 2 L deiyonize su haline getirin ve dikim sırasında mikroarsa üzerine püskürtün. (B) Örnekleme alanı içinden altı-yerüstü mısır bitki kompozit numunesi(15N zenginleştirilmemiş) ve önceden belirlenmiş örnekleme zamanlarında 15N zenginleştirilmiş mikroarsadan altı-yerüstü mısır bitki kompozit numunesi toplayın ve doğrayın. (C) Fizyolojik olgunlukta numune toplamayı takiben, kalan tüm yer üstü biyokütlesini mikroçizimin içinden çıkarın. (D) Hasat sonrası, mikroplot alanından zenginleştirilmemiş yerüstü mısır biyokütlesi tırmık. Çip ve microplot mısır yerüstü biyokütle microplot alana yeniden uygulayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yerüstü biyokütle N örneği, elde edilen gübreye bölünmüş N (FDN) ve topraktan elde edilen N (SDN) fraksiyonları. Toplam yer üstü biyokütle N FDN (düz renk) ve SDN (hashed renk) bireysel kaynakları(A)ve (B)ayrılmıştır. Hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil ediyor. (A) Yerüstü biyokütle N V8 ve R1 mısır fizyolojik gelişim aşamalarında ve fizyolojik olgunluk ta 15N gübre uygulaması(PMY1)ve takip eden yıl 15N gübre uygulama(PMY2)ölçüldü. Her sütunun üzerindeki değer, FDN olan toplam N'nin yüzdesini temsil eder. (B) PMY1 ve PMY2'de ölçülen yer üstü biyokütle N, pmy1 ve SDN için pişkin (sadece 1. yıl), stover (sap ve yapraklar; PMY2 için kokon içerir) ve FDN ve SDN için tahıl ın ayrı kısımlarında gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Toprak-mısır gübresi elde edilen N (FDN) bütçesi örneği. FDN kütlesi yerüstü(Abvgd)mısır biyokütlesi ve çeşitli toprak örnekleme derinliklerinde iki büyüyen mevsim boyunca altı örnekleme olaylar için bildirilmiştir kurtarıldı. Örnekleme olayları 15N zenginleştirilmiş gübre uygulaması(PA)takip eden 8 gün, V8 ve R1 mısır fizyolojik gelişim aşamalarında, fizyolojik olgunluk ta 15N zenginleştirilmiş gübre uygulaması yıl(PMY1) ve ertesi yıl(PMY2),ve ikinci yıl dikim den önce(PPY2). Uygulanan gübre oranı (135 kg N ha-1)ile toprak-mısır kısımlarında geri kazanılmış FDN kütlesi arasındaki fark FDN fraksiyonu için hesaplanmamış olandır. 22 kg FDN ha-1 ilk yıl tahıl olarak toprak-mısır sisteminden ihraç edildiği için PPY2 ve PMY2 için FDN'nin toplam kütlesi 113 kg FDN ha-1 idi. Hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kararlı izotop araştırma toprak-kırpma sistemi üzerinden FDN izleme ve ölçmek için yararlı bir araçtır. Ancak, ihlal edilirse bu metodolojiyi kullanarak çıkarılan sonuçları geçersiz kılabileceği ne kadar önemli üç temel varsayım vardır. Onlar 1) tracer düzgün sistem boyunca dağıtılır, 2) çalışma kapsamında süreçler aynı oranlarda oluşur ve 3) N 15N zenginleştirilmiş havuz bırakarak3dönmez . Bu çalışma toprak-mahsul sistemi boyunca toplam FDN dağılımı ile ilgilendiği için, varsayımlar 2 ve 3 en az endişe21vardır.
15N zenginleştirilmiş malzemenin yüksek maliyeti genellikle 15N izleme çalışmalarının boyutunu sınırlar. Bu nedenle, bir N izleyici çalışması başlatmadan önce, araştırmacı dikkatle göz önünde bulundurularak araştırma projesinin hedefleri planlamak gerekir: örnekleme olayların sayısı, çalışmanın uzunluğu (gün yıl), N gübre uygulama oranı, ve 15N zenginleştirme konsantrasyonu doğal bolluk (0.366 atom) farklılıkları ölçmek için gerekli toplutoprak2 tarafından 15N zenginleştirilmiş gübre seyreltme aşağıdaki . Yaygın olarak kullanılan 15N zenginleştirme düzeyleri ve uygulama oranları Ref. 2'de farklı tarımsal araştırma türleri için rapor edilmektedir. Çalışma hedefleri belirlendikten sonra, mikroplot toprak ve bitki örnekleme karşılamak ve kenar etkileri önlemek için yeterince büyük olmalıdır. Bu protokolde açıklanan çizim tasarımı, örneklenmemiş sınır alanlarının6. Sınır bölgelerinde 15N konsantrasyonu, mikroplot sınırı boyunca kütle akışı ve 1 ve 6 sıralarında büyüyen lateral mısır kökleri tarafından mikroplot dışından N alımı ile seyreltilir. Fiziksel bariyerlerin toprağa sürüldüğü sınırlı araziler, sınır alanları gerektirmez, ancak mikroarsa nın kurulması sırasında ek çalışma gerektirir ve rutin saha operasyonlarını sınırlandırabilir6. 3, 6, 22-25 referansları, mikro çizim boyutlarının, kenarlık genişliklerinin ve sınırlı veya sınırlı olmayan çizimlerin seçilmesi konusunda ek kılavuzlar sağlar.
Bu çalışmanın bitki ve toprak örnekleme şeması, art arda iki büyüme mevsiminde birden fazla örnekleme olayına olanak sağlayacak şekilde tasarlanmıştır. Erken sezon bitki ve toprak örnekleri microplot dış kenarlarına yakın alınır. Birbirini izleyen her örnekleme olayı, daha önce örneklenmiş alanların örneklenemaması için mikro çizimin merkezine daha yakın hareket eder. En az iki mısır bitkileri mısır fizyolojik gelişimindeki değişiklikleri en aza indirmek için her örneklenmiş bitki ayırın. Bu çalışmanın toprak örnekleme tekniği ile bir sorun toprak çekirdek örnekleme yöntemi doğru toprak profili3 15N heterojen dağılımı kesemeyebilir olmasıdır. Toprak toplamı N'nin mekansal değişkenliği %153'lüktahmini bir katsayısı ile yüksektir. Komple mikroplot kazı 15N nicelik doğruluğunu artırmak ama toprak önemli hacimlerde işleme gerektirir ve bu çalışmanın hedefleri doğrultusunda olmayan tek bir olay3 örnekleme sınırlar. Mikro parselin daha küçük örnekleme birimlerine bölünmesi birden fazla kazı olayına izin verir, ancak numune lenmemiş birimlerin mahsul gölgeliği ve toprak su dinamiğindeki değişikliklerden etkilenmemesini sağlamak için gerekli mikroplot boyutunu artırabilir. Doğruluk potansiyel azalma rağmen, birçok çalışma mikroplots ≥1 m29,,22, 26,26,27,28için toprak çekirdek tekniği kullanın. Aşağıdaki formül13kullanılarak mikroplot başına toplanan ve kompozit toprak çekirdeği sayısı artırılarak numune hassasiyeti artırılabilir:
n = (( Z2)(CV2)/(d2)
n toprak çekirdeği sayısı, Z ilgili alfa seviyesi için standart normal variat (0,05 için 1,96 ve 0,10 için 1,65), CV varyasyon katsayısı ve d arsa ortalamasında hata payı (ondalık olarak). Bu formüle dayanarak, yazarlar mikroarsa başına 15 çekirdeğin toplam N ile %95'ini ±p±z %7,6 oranında tahmin etmesini beklerler(n = 15; Z = 1,96; CV = %15; d = 0,076). Referans 25 benzer sayıda çekirdek kullanmış, ancak mikro çizimi her örnekleme olayında dört üniteden bitki ve toprak örnekleri toplayan 32 örnekleme birimine böldü.
Diğerleri mikroplot veri tüm arsa29için tahmin edilebilir göstermiştir. Ancak, bu varsayımın geçerli olabilmesi için, tedavi konusu ve mikro arsabenzer şekilde yönetilmelidir. Mümkünse, gübre N aynı kimyasal ve fiziksel formlarda uygulanmalıdır (örneğin, suda çözünmüş üre) bu özellikleri n kaybı mekanizmaları da dahil olmak üzere gübre-toprak dinamikleri etkisi, immobilizasyon, ve toprak mikropları ve bitkiler için kullanılabilirlik3.
Bu protokolde tanımlanan rulo kavanoz öğütme yöntemi, temsili, homojenize numune sağlamak için ideal olan büyük hacimli bitki ve toprak numunelerini toz haline getirebilme yeteneğine sahiptir. Ancak, teknik önemli el emeği ve zaman yüklemek için gerektirir, boşaltmak, rulo, ve rulo rulo ve rulo rulo. Numune işleme silindir kavanoz mevcut sayısı ile sınırlıdır, konveyör bant ünitesi nin kapasitesi, ve asit banyosu boyutu. Ticari taşlama şişeleri silindir kavanozlara alternatif olabilir, ancak işlenen bitki ve toprak örneklerinin hacmini sınırlayabilir. Laboratuvar yapımı, tek kullanımlık taşlama şişeleri potansiyel olarak hem taşlama hem de numune depolama kabı olarak hizmet verebilir inşa edilebilir. Bu taşlama yöntemlerinden herhangi birinin temel göz önünde bulundurulması, numuneler arasındaki çapraz kontaminasyonu en aza indirmektir.
Son olarak, 15N zenginleştirilmiş gübre malzemesi pahalı olduğundan, 15N zenginleştirilmiş yer üstü biyokütle ve toprak örnekleri korunabilir ve gelecekteki çalışmalarda kullanılmak üzere homojenize edilebilir. Bu ürünler kalıntı ayrışma, mineralizasyon potansiyeli veya diğer besin bisiklet süreçleri21araştırırken özellikle yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Minnesota Mısır Araştırma ve Promosyon Konseyi, Hueg-Harrison Bursu ve Minnesota Discovery, Research and InnoVation Economy (MnDRIVE) Bursu'nun desteğini kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 mL scintillation vial | ANY; Fisher Scientific is one example | 0334172C | |
| 250 mL borosilicate glass bottle | QORPAK | 264047 | |
| 48-well plate | EA Consumables | E2063 | |
| 96-well plate | EA Consumables | E2079 | |
| Cloth parts bag (30x50 cm) | ANY | NA | For corn ears |
| CO2 Backpack Sprayer | ANY; Bellspray Inc is one example | Model T | |
| Coin envelop (6.4x10.8 cm) | ANY; ULINE is one example | S-6285 | For 2-mm ground plant samples |
| Corn chipper | ANY; DR Chipper Shredder is one example | SKU:CS23030BMN0 | For chipping corn biomass |
| Corn seed | ANY | NA | Hybrid appropriate to the region |
| Disposable shoe cover | ANY; Boardwalk is one example | BWK00031L | |
| Ethanol 200 Proof | ANY; Decon Laboratories Inc. is one example | 2701TP | |
| Fabric bags with drawstring (90x60 cm) | ANY | NA | For plant sample collection |
| Fertilizer Urea (46-0-0) | ANY | NA | ~0.366 atom % 15N |
| Hand rake | ANY; Fastenal Company is one example | 5098-63-107 | |
| Hand sickle | ANY; Home Depot is one example | NJP150 | For plant sample collection |
| Hand-held soil probe | ANY; AMS is one example | 401.01 | |
| Hydraulic soil probe | ANY; Giddings is one example | GSPS | |
| Hydrochloric acid, 12N | Ricca Chemical | R37800001A | |
| Jar mill | ANY; Cole-Parmer is one example | SI-04172-50 | |
| Laboratory Mill | Perten | 3610 | For grinding grain |
| Microbalance accurate to four decimal places | ANY; Mettler Toledo is one example | XPR2 | |
| N95 Particulate Filtering Facepiece Respirator | ANY, ULINE is one example | S-9632 | |
| Neoprene or butyl rubber gloves | ANY | NA | For working in HCl acid bath |
| Paper hardware bags (13.3x8.7x27.8 cm) | ANY; ULINE is one example | S-8530 | For soil samples and corn grain |
| Plant grinder | ANY; Thomas Wiley Model 4 Mill is one example | 1188Y47-TS | For grinding chipped corn biomass to 2-mm particles |
| Plastic tags | ULINE | S-5544Y-PW | For labeling fabric bags and microplot stalk bundles |
| Sodium hydroxide pellets, ACS | Spectrum Chemical | SPCM-S1295-07 | |
| Soil grinder | ANY; AGVISE stainless steel grinder with motor is one example | NA | For grinding soil to pass through a 2-mm sieve |
| Tin capsule 5x9 mm | Costech Analytical Technologies Inc. | 041061 | |
| Tin capsule 9x10 mm | Costech Analytical Technologies Inc. | 041073 | |
| Urea (46-0-0) | MilliporeSigma | 490970 | 10 atom % 15N |
References
- Sharp, Z. Principles of Stable Isotope Geochemistry. , 2nd Edition, (2017).
- Van Cleemput, O., Zapata, F., Vanlauwe, B. Guidelines on Nitrogen Management in Agricultural Systems. Guidelines on Nitrogen Management in Agricultural Systems. 29 (29), 19 (2008).
- Hauck, R. D., Meisinger, J. J., Mulvaney, R. L. Practical considerations in the use of nitrogen tracers in agricultural and environmental research. Methods of Soil Analysis: Part 2-Microbiological and Biochemical Properties. , 907-950 (1994).
- Bedard-Haughn, A., Van Groenigen, J. W., Van Kessel, C. Tracing 15N through landscapes: Potential uses and precautions. Journal of Hydrology. 272 (1-4), 175-190 (2003).
- Peterson, R. G. Agricultural Field Experiments: Design and Analysis. , Marcel Dekker, Inc. New York. (1994).
- Follett, R. F. Innovative 15N microplot research techniques to study nitrogen use efficiency under different ecosystems. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 32 (7/8), 951-979 (2001).
- Russelle, M. P., Deibert, E. J., Hauck, R. D., Stevanovic, M., Olson, R. A. Effects of water and nitrogen management on yield and 15N-depleted fertilizer use efficiency of irrigated corn. Soil Science Society of America Journal. 45 (3), 553-558 (1981).
- Schindler, F. V., Knighton, R. E. Fate of Fertilizer Nitrogen Applied to Corn as Estimated by the Isotopic and Difference Methods. Soil Science Society of America Journal. 63, 1734 (1999).
- Stevens, W. B., Hoeft, R. G., Mulvaney, R. L. Fate of Nitrogen-15 in a Long-Term Nitrogen Rate Study. Agronomy Journal. 97 (4), 1037 (2005).
- Recous, S., Fresneau, C., Faurie, G., Mary, B. The fate of labelled 15N urea and ammonium nitrate applied to a winter wheat crop. Plant and Soil. 112 (2), 205-214 (1988).
- Abendroth, L. J., Elmore, R. W., Boyer, M. J., Marlay, S. K. Corn Growth and Development. , (2011).
- Lauer, J. G. Methods for calculating corn yield. , http://corn.agronomy.wisc.edu/AA/pdfs/A033.pdf (2002).
- Gomez, K. A., Gomez, A. A. Statistical Procedures for Agricultural Research. , 2nd Edition, John Wiley and Sons. (1984).
- Khan, S. A., Mulvaney, R. L., Brooks, P. D. Diffusion Methods for Automated Nitrogen-15 Analysis using Acidified Disks. Soil Science Society of America Journal. 62 (2), 406 (1998).
- Horneck, D. A., Miller, R. O. Determination of Total Nitrogen in Plant Tissue. Handbook of Reference Methods for Plant Analysis. , 75-84 (1998).
- UC Davis Stable Isotope Facility. Carbon (13C) and Nitrogen (15N) Analysis of Solids by EA-IRMS. , https://stableisotopefacility.ucdavis.edu/13cand15n.html (2019).
- Stevens, W. B., Hoeft, R. G., Mulvaney, R. L. Fate of Nitrogen-15 in a Long-Term Nitrogen Rate Study: II. Nitrogen Uptake Efficiency. Agronomy Journal. 97 (4), 1046 (2005).
- Kaiser, D. E., Fernandez, F. G., Coulter, J. A. Fertilizing Corn in Minnesota. , University of Minnesota Extension. https://extension.umn.edu/crop-specific-needs/fertilizing-corn-minnesota (2018).
- Blake, G. R., Hartge, K. H.
- Jokela, W. E., Randall, G. W. Fate of Fertilizer Nitrogen as Affected by Time and Rate of Application on Corn. Soil Science Society of America Journal. 61 (6), 1695 (2010).
- Hart, S. C., Stark, J. M., Davidson, E. A., Firestone, M. K. Nitrogen Mineralization, Immobilization, and Nitrification. Methods of Soil Analysis, Part 2. Microbiological and Biochemical Properties. (5), 985-1018 (1994).
- Jokela, W., Randall, G. A nitrogen-15 microplot design for measuring plant and soil recovery of fertilizer nitrogen applied to corn. Agronomy journal (USA). 79 (APRIL), http://agris.fao.org/agris-search/search/display.do?f=1988/US/US88241.xml;US875113688 322-325 (1987).
- Olson, R. V. Fate of tagged nitrogen fertilizer applied to irrigated corn. Soil Science Society of America Journal. 44 (3), 514-517 (1980).
- Follett, R. F., Porter, L. K., Halvorson, A. D. Border Effects on Nitrogen-15 Fertilized Winter Wheat Microplots Grown in the Great Plains. Agronomy Journal. 83 (3), 608-612 (1991).
- Balabane, M., Balesdent, J. Input of fertilizer-derived labelled n to soil organic matter during a growing season of maize in the field. Soil Biology and Biochemistry. 24 (2), 89-96 (1992).
- Recous, S., Machet, J. M., Mary, B. The partitioning of fertilizer-N between soil and crop: Comparison of ammonium and nitrate applications. Plant and Soil. 144 (1), 101-111 (1992).
- Bigeriego, M., Hauck, R. D., Olson, R. A. Uptake, Translocation and Utilization of 15N-Depleted Fertilizer in Irrigated Corn. Soil Science Society of America Journal. 43 (3), 528 (1979).
- Glendining, M. J., Poulton, P. R., Powlson, D. S., Jenkinson, D. S. Fate of15N-labelled fertilizer applied to spring barley grown on soils of contrasting nutrient status. Plant and Soil. 195 (1), 83-98 (1997).
- Khanif, Y. M., Cleemput, O., Baert, L. Field study of the fate of labelled fertilizer nitrate applied to barley and maize in sandy soils. Fertilizer Research. 5 (3), 289-294 (1984).
