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Neuroscience

उत्पादित माउस टिबियल नर्व में न्यूरोफिलमेंट परिवहन की इमेजिंग और विश्लेषण

Published: August 31, 2020 doi: 10.3791/61264
Automatic Translation
1, 1,2, 3,4, 1
1Department of Neuroscience, The Ohio State University, 2Present address: Interdepartmental Neuroscience Graduate Program and Department of Neurobiology, Northwestern University, 3Quantitative Biology Institute, Ohio University, 4Department of Physics and Astronomy, Ohio University

Summary

हम ट्रांसजेनिक चूहों से परिधीय नसों के एकल myelinated axons में न्यूरोफिलमेंट के अक्षीय परिवहन का विश्लेषण करने के लिए फ्लोरेसेंस फोटोएक्टिवेशन विधियों का वर्णन करते हैं जो एक फोटोएक्टिवेट न्यूरोफिलामेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं।

Abstract

न्यूरोफिलामेंट प्रोटीन पॉलिमर ~ 0.35-3.5 मिमी/दिन की औसत गति से अक्षीय परिवहन के धीमे घटक में अक्षों के साथ चलते हैं। हाल ही में जब तक सीटू में इस आंदोलन का अध्ययन केवल रेडियोआइसोटोपिक पल्स-लेबलिंग का उपयोग करके संभव था, जो दिनों के लौकिक संकल्प और मिलीमीटर के स्थानिक संकल्प के साथ पूरी नसों में अक्षीय परिवहन के विश्लेषण की अनुमति देता है। उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ सीटू में न्यूरोफिलामेंट परिवहन का अध्ययन करने के लिए, हमने एक hThy1-paGFP-NFM ट्रांसजेनिक माउस विकसित किया जो न्यूरॉन्स में फोटोएक्टिवेट जीएफपी के साथ टैग किए गए न्यूरोफिलामेंट प्रोटीन एम को व्यक्त करता है। यहां हम इन चूहों पूर्व वीवोसे टिबियल नसों के एकल माइलिनेटेड एक्सॉन में न्यूरोफिलामेंट परिवहन का विश्लेषण करने के लिए फ्लोरेसेंस फोटोएक्टिवेशन पल्स-एस्केप और पल्स-स्प्रेड विधियों का वर्णन करते हैं। आइसोलेटेड तंत्रिका खंडों को माइक्रोस्कोप चरण पर ऑक्सीजनयुक्त खारा के साथ परफ्यूजन द्वारा बनाए रखा जाता है और डिस्क कंफोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी कताई द्वारा चित्रित किया जाता है। वायलेट लाइट का उपयोग एक छोटी अक्षीय खिड़की में फ्लोरेसेंस को सक्रिय करने के लिए किया जाता है। सक्रिय और फ्लैंकिंग क्षेत्रों में फ्लोरेसेंस का विश्लेषण समय के साथ किया जाता है, जो क्रमशः मिनट और माइक्रोन के क्रम पर लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ न्यूरोफिलामेंट परिवहन के अध्ययन की अनुमति देता है। गणितीय मॉडलिंग का उपयोग न्यूरोफिलामेंट परिवहन के गतिज मापदंडों को निकालने के लिए किया जा सकता है जिसमें वेग, दिशात्मक पूर्वाग्रह और परिणामस्वरूप डेटा से रुके हुए व्यवहार शामिल हैं। नाड़ी-भागने और नाड़ी फैलाने के तरीकों को अन्य नसों में न्यूरोफिलामेंट परिवहन की कल्पना करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। अतिरिक्त ट्रांसजेनिक चूहों के विकास के साथ, इन तरीकों का उपयोग एक्सॉन में अन्य साइटोस्केलेल और साइटोसोलिक प्रोटीन के अक्षीय परिवहन को छवि और विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

न्यूरोफिलामेंट्स के अक्षीय परिवहन को पहली बार 1 9 70 के दशक में रेडियोआइसोटोपिक पल्स-लेबलिंग1द्वारा प्रदर्शित किया गया था। इस दृष्टिकोण ने वीवो मेंन्यूरोफिलामेंट परिवहन के बारे में जानकारी का खजाना प्राप्त किया है, लेकिन इसमें अपेक्षाकृत कम स्थानिक और लौकिक संकल्प होता है, आमतौर पर मिलीमीटर और दिनों के क्रम पर सबसे अच्छा2। इसके अलावा, रेडियोआइसोटोपिक पल्स-लेबलिंग एक अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण है जिसके लिए एक ही समय पाठ्यक्रम उत्पन्न करने के लिए कई जानवरों के इंजेक्शन और बलिदान की आवश्यकता होती है। 1 99 0 के दशक में फ्लोरोसेसेंस माइक्रोस्कोपी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन और प्रगति की खोज के साथ, बाद में कैलिफ़ोर्निया या मिनटों के समय पैमाने पर और उप-सूक्ष्म स्थानिक संकल्प के साथ, आंदोलन3के तंत्र में बहुत अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हुए, सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में सीधे न्यूरोफिलामेंट परिवहन की छवि संभव हो गई। इन अध्ययनों से पता चला है कि एक्सॉन में न्यूरोफिलामेंट पॉलिमर माइक्रोट्यूबुल मोटर प्रोटीन द्वारा चालित माइक्रोट्यूबुले पटरियों के साथ एंटीरोग्रेड और प्रतिगामी दोनों दिशाओं में तेजी से और रुक-रुककर आगे बढ़ते हैं। हालांकि, न्यूरोफिलामेंट्स डिफेक्शन-लिमिटेड संरचनाएं हैं जो व्यास में सिर्फ 10 एनएम हैं जो आमतौर पर केवल दसियों नैनोमीटर से अपने पड़ोसियों से अलग होती हैं; इसलिए, पॉलिमर केवल सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में ट्रैक किया जा सकता है जिसमें विरल वितरित न्यूरोफिलामेंट्स होते हैं ताकि चलती पॉलिमर को उनके पड़ोसियों से हल किया जा सके4. इस प्रकार, वर्तमान में एक्सॉन में एकल न्यूरोफिलामेंट को ट्रैक करना संभव नहीं है जिसमें प्रचुर मात्रा में न्यूरोफिलामेंट पॉलिमर होते हैं, जैसे कि माइलिनेटेड एक्सॉन।

फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूरोफिलामेंट से भरपूर एक्सोन में न्यूरोफिलामेंट के अक्षीय परिवहन का विश्लेषण करने के लिए, हम फ्लोरेसेंस फोटोएक्टिवेशन पल्स-एस्केप विधि का उपयोग करते हैं जिसे हमने सुसंस्कृत तंत्रिका कोशिकाओं4,,5में न्यूरोफिलामेंट के दीर्घकालिक ठहराव व्यवहार का अध्ययन करने के लिए विकसित किया। एक फोटोएक्टिवेबल फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलामेंट फ्यूजन प्रोटीन के साथ टैग किए गए न्यूरोफिलामेंट्स को एक्सॉन के एक छोटे खंड में सक्रिय किया जाता है, और फिर सक्रिय क्षेत्र से उन फिलामेंट्स के प्रस्थान की दर समय के साथ फ्लोरेसेंस क्षय को मापने के द्वारा निर्धारित की जाती है। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह न्यूरोफिलामेंट परिवहन का जनसंख्या स्तर का विश्लेषण है जिसे व्यक्तिगत न्यूरोफाइलमेंट पॉलिमर के आंदोलन को ट्रैक करने की आवश्यकता के बिना मिनटों या घंटों के समय-पैमाने पर लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमने इस विधि का उपयोग माइलिनिंग संस्कृतियों में न्यूरोफिलामेंट परिवहन के काइनेटिक्स का विश्लेषण करने के लिए किया है6.

हाल ही में, हमने मानव न्यूरॉन-विशिष्ट Thy1 प्रमोटर7के नियंत्रण में न्यूरॉन्स में एक पगएफपी-टैग न्यूरोफिलामेंट प्रोटीन एम (paGFP-NFM) के निम्न स्तर को व्यक्त करने वाले एक hThy1-paGFP-NFM ट्रांसजेनिक माउस के विकास का वर्णन किया। यह माउस फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सीटू में न्यूरोफिलमेंट परिवहन के विश्लेषण की अनुमति देता है। इस लेख में, हम दो दृष्टिकोणों का उपयोग करके इन चूहों से टिबियल नसों के माइलिनेटेड एक्सॉन में न्यूरोफिलमेंट परिवहन का विश्लेषण करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों का वर्णन करते हैं। इन दृष्टिकोणों में से पहला ऊपर वर्णित नाड़ी-एस्केप विधि है। यह विधि न्यूरोफिलामेंट्स के रुके हुए व्यवहार के बारे में जानकारी उत्पन्न कर सकती है, लेकिन उस दिशा में अंधा है जिसमें तंतुओं सक्रिय क्षेत्र को विदा करते हैं, और इसलिए शुद्ध दिशात्मकता और परिवहन वेग8के माप की अनुमति नहीं देता है। इन दृष्टिकोणों में से दूसरा एक नई नाड़ी-प्रसार विधि है जिसमें हम न केवल सक्रिय क्षेत्र से फ्लोरेसेंस के नुकसान का विश्लेषण करते हैं, बल्कि दो फ्लैंकिंग खिड़कियों में फ्लोरेसेंस में क्षणिक वृद्धि भी करते हैं जिसके माध्यम से फ्लोरोसेंट फिलामेंट्स आगे बढ़ते हैं क्योंकि वे एंथोग्रेड और प्रतिगामी दोनों दिशाओं में सक्रिय क्षेत्र को विदा करते हैं। दोनों दृष्टिकोणों में, माप खिड़कियों में फ्लोरेसेंस में परिवर्तन के गणितीय विश्लेषण और मॉडलिंग का उपयोग करके औसत वेग, शुद्ध दिशात्मकता और रुके हुए व्यवहार जैसे न्यूरोफिलमेंट परिवहन के मापदंडों को प्राप्त किया जा सकता है। चित्रा 3 इन दो दृष्टिकोणों को दिखाता है।

यह प्रोटोकॉल पगप्लोसुरेंस की तंत्रिका, सक्रियण और इमेजिंग के विच्छेदन और तैयारी को दर्शाता है, और इमेजजे9के फिजी वितरण पैकेज का उपयोग करके अधिग्रहीत छवियों से न्यूरोफिलामेंट परिवहन का मात्राकरण करता है। हम टिबियल तंत्रिका का उपयोग करते हैं क्योंकि यह लंबा (कई सेमी) है और शाखा नहीं करता है; हालांकि, सैद्धांतिक रूप से paGFP-NFM व्यक्त करने वाली कोई भी तंत्रिका इस तकनीक के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त है यदि इसे अक्षतंख को नुकसान पहुंचाए बिना विच्छेदित और डी-म्यान किया जा सकता है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) ने मंजूरी दे दी है ।

1. तंत्रिका नमकीन समाधान की तैयारी

  1. ब्रेयर के खारा10:98 एमसीएम एनएसीएल, 1 एमएमएम केसीएल, 2 एमएमएम केएच2पीओ4,1 एमएम एमजीएसओ4,1.5 एमएम सीसीएल2,5.6% डी-ग्लूकोज, 23.8 एमएम एनएएचसीओ3 डबल डिफाल्टर पानी में बनाएं।
  2. बुलबुला 95% ऑक्सीजन/5% कार्बन डाइऑक्साइड (कार्बोजन) खारा समाधान के माध्यम से कम से कम 30 मिनट के लिए उपयोग करने से पहले। बचे हुए खारे को एक सप्ताह के भीतर पुन: प्रयुक्त किया जा सकता है; हालांकि, प्रत्येक उपयोग से पहले इसे फिर से किया जाना चाहिए।
  3. एक 60 मिली सी सीरिंज में ऑक्सीजनयुक्त नमकीन डालो और यह सुनिश्चित करें कि सिरिंज में न्यूनतम हवा शेष है।

2. तंत्रिका परफ्यूजन चैंबर की प्रारंभिक असेंबली

  1. सिरिंज और टयूबिंग को कनेक्ट करें जैसा कि चित्रा 1Aमें दिखाया गया है, बहिर्वाह ट्यूब को अपशिष्ट फ्लास्क में रखना।
  2. बाहरी गैसकेट को परफ्यूजन चैंबर आवास में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रवाह प्रवेश और आउटलेट पोस्ट गैसकेट में छेद के साथ गठबंधन कर रहे हैं।
  3. एक #1.5 परिपत्र कवरलिप (40 मिमी व्यास) पर आंतरिक गैसकेट (सिलिकॉन, 100 माइक्रोन मोटी) रखें, एक तंग सील सुनिश्चित करने के लिए गैसकेट में किसी भी झुर्रियों को ध्यान से चौरसाई करें। बाद में विधानसभा की सुविधा के लिए, एक कागज तौलिया या काम का सामना करना पड़ गैसकेट के साथ पोंछ पर कवरस्लिप और गैसकेट जगह है ।

3. विच्छेदन और माउस टिबियल तंत्रिका की तैयारी

  1. कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना या किसी अन्य संस्थागत रूप से अनुमोदित विधि द्वारा पशु का बलिदान करें। एक टाइमर शुरू करें जब जानवर आंदोलन/श्वास समाप्त हो जाता है, क्योंकि प्रयोग केवल बलिदान7के 3 घंटे के भीतर किए जाने चाहिए ।
  2. फर को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और एक इलेक्ट्रिक रेजर का उपयोग करके जानवर के पैरों और वापस से जितना संभव हो उतना हटा दें।
  3. बड़ी विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, रीढ़ के बीच के पास त्वचा में एक पृष्ठीय चीरा बनाने के लिए और जानवर के वेंट्रल पहलू के आसपास कटौती जारी है। इस कट से शुरू करें, धीरे-धीरे इसे मांसपेशियों से दूर खींचकर और प्रावरणी को काटकर पैरों से त्वचा को प्रतिबिंबित करें।
  4. एक विच्छेदन ट्रे पर एक रीढ़ की स्थिति में जानवर रखें और सभी चार पंजे पिन करें। वैकल्पिक रूप से आगे आंदोलन को कम करने के लिए पूंछ पिन।
  5. माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके, सियाटिक तंत्रिका को बेनकाब करने के लिए पूंछ और घुटने के बीच जांघ की मांसपेशियों में एक चीरा बनाएं। सुनिश्चित करें कि तंत्रिका, जो मांसपेशियों के माध्यम से दिखाई दे रही है, कटौती न हो।
  6. मांसपेशियों को हटाने के लिए चीरा को पृष्ठीय और वेंट्रेल बढ़ाएं। इसी तरह, नुकसानदायक तंत्रिका से बचने के लिए कटौती उथले और कम रखते हुए, बछड़े की मांसपेशियों को हटा दें।
  7. मांसपेशियों को तब तक हटा दें जब तक कि टिबियल तंत्रिका पूरी तरह से उस बिंदु से उजागर हो जाती है जहां यह सियाटिक तंत्रिका (घुटने पर) से एड़ी(चित्रा 2 ए)तक शाखाओं में आती है।
    नोट: टिबियल तंत्रिका के विच्छेदन सहित और निम्नलिखित सभी चरणों में, तंत्रिका में PAGFP के संभावित आकस्मिक सक्रियण को कम करने के लिए परिवेश प्रकाश के अनावश्यक संपर्क से बचें।
  8. रीढ़ की हड्डी के समीपस्थ अंत में टिबियल तंत्रिका को संदंश की एक जोड़ी के साथ पकड़ें और माइक्रोडिसेक्शन कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके तंत्रिका को काट लें। तंत्रिका पर तनाव न डालें, इसे मांसपेशियों से दूर उठाएं, किसी भी अनुलग्नक को काटें।
  9. टिबियल तंत्रिका के रीढ़-डिस्टल अंत को काटें और कमरे के तापमान ऑक्सीजनयुक्त खारे के एक छोटे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। प्रक्रिया में इस बिंदु से, तंत्रिका के समीपस्थ और डिस्टल सिरों का ट्रैक रखने के लिए हमेशा निश्चित रहें।
    नोट: ऐसा करने का एक तरीका तंत्रिका के डिस्टल एंड को एक कोण कट के साथ चिह्नित करना है जैसे कि टेपर दिखाई दे रहा है।
  10. तंत्रिका के समीपस्थ छोर से शुरू, धीरे से उजागर अक्षतंप को बहुत ठीक-इत्तला देने वाले संदंश की एक जोड़ी के साथ समाप्त होता है।
  11. संदंश की एक दूसरी जोड़ी के साथ, तंत्रिका म्यान को समीपस्थ समझें, और धीरे-धीरे तंत्रिका के डिस्टल एंड की ओर खींचें। तंत्रिका म्यान न्यूनतम प्रतिरोध के साथ अक्षतंखों के साथ स्लाइड करेगा। सुनिश्चित करें कि इस प्रक्रिया के दौरान तंत्रिका पर कोई अनुचित तनाव लागू न हो।

4. अंतिम तंत्रिका परफ्यूजन चैंबर विधानसभा

  1. तंत्रिका के समीपस्थ अंत को लोभी, इसे नमकीन से हटा दें और धीरे-धीरे इसे आंतरिक गैसकेट के आयताकार उद्घाटन के भीतर परफ्यूजन कक्ष के कवरस्लिप पर रखें, तंत्रिका पर कोमल तनाव बनाए रखें क्योंकि आप इसे नीचे रखते हैं ताकि यह सीधे पड़े।
  2. तंत्रिका का सामना करना पड़ रहा नाली पक्ष के साथ तंत्रिका पर माइक्रोएक्विड स्लाइड रखें, और तंत्रिका के समानांतर प्रवाह की दिशा। कवरस्लिप और माइक्रोक्वडक्ट असेंबली को फ्लिप करें, और इसे बाहरी गैसकेट के लिए ऐपोस किए गए माइक्रोकक्क्विड स्लाइड के साथ पर्फ्यूजन चैंबर आवास के भीतर रखें। तंत्रिका और आसपास के आंतरिक गैसकेट को अब कवरस्लिप और माइक्रोक्वडक्ट स्लाइड के बीच सैंडविच किया जाएगा, जो गैसकेट द्वारा अलग किए जाते हैं, कवरस्लिप का सामना करना पड़ रहा है(चित्रा 1B)।
  3. पर्फ्यूजन चैंबर को मेटल हाउसिंग में रखकर और लॉकिंग रिंग घुमाकर सुरक्षित करें। सुनिश्चित करें कि प्लास्टिक आवास पूरी तरह से सभी धातु क्लिप के तहत है और खारा रिसाव को रोकने के लिए अच्छी तरह से कस। ओवरटाइटिंग माइक्रोक्वाडक्ट स्लाइड या कवरस्लिप को क्रैक कर सकता है। कक्ष को पलटें ताकि कवरलिप नीचे का सामना कर रहा हो।
  4. धीरे-धीरे पर्फ्यूजन कक्ष को भरने के लिए खारा सिरिंज प्लंजर दबाना। इनलेट और आउटलेट ट्यूबिंग, आउटलेट फ्लास्क और सिरिंज सेटअप और इमेजिंग के दौरान हर समय चैंबर के ऊपर ही ऊंचा रखें । यह साइफन से बचाता है, जो बुलबुले पेश कर सकता है या कक्ष में नकारात्मक दबाव के कारण ध्यान अस्थिरता पैदा कर सकता है।
  5. पर्फ्यूजन असेंबली को एक उल्टे माइक्रोस्कोप चरण में स्थानांतरित करें और खारा सिरिंज को सिरिंज पंप में माउंट करें। 0.25 एमएल/मिनट की प्रवाह दर के लिए एक उचित गति से मोटर शुरू करें। फिर कनेक्ट करें और इन-लाइन सॉल्यूशन हीटर सेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर चालू करें।
  6. उद्देश्य हीटर कनेक्ट करें और 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें, उद्देश्य पर तेल लागू करें, और परफ्यूजन कक्ष को स्टेज माउंट में डालें।
  7. चैंबर हीटर पैड पर तेल लगाएं और परफ्यूजन चैंबर में अटैच करें। कनेक्ट करें और चैंबर हीटर चालू करें; 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट करें।
    नोट: तापमान में परिवर्तन के कारण समाधान की अधिकता के कारण परफ्यूजन कक्ष में बुलबुले बन सकते हैं। यदि बुलबुले बनते हैं, तो संक्षेप में समाधान प्रवाह दर को 5-10x तक बढ़ाएं जब तक बुलबुले कक्ष को साफ नहीं करते।
  8. पर्फ्यूजन चैंबर को स्टेज एडाप्टर में लॉक करें और ऑब्जेक्टिव ऑयल को चैंबर के नीचे कवरस्लिप के संपर्क में लाएं।
    नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले एएसआई स्टेज एडाप्टर के साथ बायोपटेक चैंबर एक उल्टे माइक्रोस्कोप विन्यास के लिए डिज़ाइन किया गया है।

5. फ्लोरेसेंस सक्रियण और छवि अधिग्रहण

  1. ब्राइटफील्ड रोशनी का उपयोग करके, कवरस्लिप सतह(चित्रा 2B)के निकटतम तंत्रिका की निचली सतह पर अक्षों की परत पर ध्यान केंद्रित करें। Myelinated axons (आमतौर पर वयस्क चूहों में व्यास में 1 - 6 माइक्रोन) एक myelin म्यान की उपस्थिति से पहचाना जा सकता है, जो इसके विपरीत वृद्धि के बिना ब्राइटफील्ड ट्रांसमिटेड प्रकाश रोशनी के तहत दिखाई देता है। श्मिट-लैंटरमैन फांके और रैनवियर के नोड्स भी आसानी से स्पष्ट हैं । अनमायलीनेड एक्सॉन अधिक पतले होते हैं (आमतौर पर & 1 माइक्रोन व्यास) और आम तौर पर बंडलों (रेमक बंडलों) में मौजूद होते हैं, जहां वे आम तौर पर एक दूसरे से हल होने के लिए बहुत बारीकी से उत्तेजित होते हैं।
  2. यदि माइक्रोस्कोप पर उपलब्ध है, तो टाइमलैप्स इमेजिंग के दौरान ध्यान बनाए रखने के लिए ऑटो-फोकस सिस्टम को सक्रिय करें।
  3. एक ब्राइटफील्ड संदर्भ छवि प्राप्त करें। छवियों के संबंध में तंत्रिका (रीढ़ की हड्डी के समीपस्थ और डिस्टल सिरों) के अभिविन्यास को रिकॉर्ड करें।
  4. प्री-ब्लीच ऑटोफ्लोरेसेंस रिकॉर्ड करने के लिए 488 एनएम लेजर और पगएफपी (जैसे, 525/50 एनएम) के लिए उपयुक्त उत्सर्जन फ़िल्टर का उपयोग करके एक कॉन्फोकल छवि प्राप्त करें। बेहोश संकेत का पता लगाने के लिए तदनुसार समायोजित जोखिम समय के साथ, फोटोब्लैचिंग को कम करने के लिए लेजर शक्ति कम रखें। एक उदाहरण के रूप में, प्रतिनिधि डेटा 5% लेजर पावर और 4 एस एक्सपोजर पर प्राप्त किए गए थे। भविष्य के सभी प्रयोगों में उपयोग के लिए अधिग्रहण सेटिंग्स रिकॉर्ड करें।
    नोट: फोटोएक्टिवेशन के बाद, आदर्श इमेजिंग सेटिंग्स 20 छवियों के दौरान मूल सिग्नल के 25% से कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात और जीटी;8 और फोटोब्लैकिंग का उत्पादन करेंगी। एक्सोन को वाइडफील्ड एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा भी इमेज किया जा सकता है जैसा कि हमने मूल रूप से7किया था, लेकिन कॉन्फोक्लिटी की कमी के कारण छवि की गुणवत्ता कम होगी।
  5. लगभग 5x सामान्य इमेजिंग शक्ति के लिए लेजर शक्ति सेट करें और 3-4 मिनट के जोखिम समय के साथ एक छवि प्राप्त करें। हालांकि आवश्यक नहीं है, इस कदम को पृष्ठभूमि संकेत को कम करने और इस प्रकार फोटोएक्टिवेटेड फ्लोरेसेंस के सिग्नल-टू-शोर को अधिकतम करने के लिए ऑटोफ्लोरेसेंस और अवांछित फ्लोरेसेंस के अन्य स्रोतों को ब्लीच करने की सिफारिश की जाती है।
  6. इस ब्लीचिंग चरण के बाद प्री-एक्टिवेशन ऑटोफ्लोरेसेंस रिकॉर्ड करने के लिए चरण 5.4 में उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स के साथ एक छवि प्राप्त करें।
  7. ब्राइटफील्ड छवि पर, वांछित सक्रियण खिड़की के आकार के बराबर लंबाई के साथ अक्षतंयों के समानांतर एक लाइन खींचें। इस खिड़की की लंबाई प्रयोगात्मक लक्ष्य और मापदंडों के आधार पर भिन्न होगी, लेकिन विशिष्ट लंबाई पल्स-एस्केप प्रतिमान के लिए 5 माइक्रोन और पल्स-स्प्रेड प्रतिमान के लिए 40 माइक्रोन हैं।
  8. एक गाइड के रूप में इस लाइन का उपयोग करना, अक्षों के लिए लंबवत देखने के क्षेत्र में ब्याज (आरओआई) के आयताकार क्षेत्र को आकर्षित करें। इस क्षेत्र में सभी अक्षों को फोटोएक्टिवेट करने के लिए शामिल करना चाहिए ।
  9. 405 एनएम रोशनी के साथ फोटोएक्टिवेशन के लिए इष्टतम सेटिंग्स निर्धारित करें।
    नोट: केवल पहले प्रयोगात्मक सक्रियण से पहले इस चरण और उप-चरणों को करें। एक प्रयोग के दौरान, एक ही फोटोएक्टिवेशन सेटिंग्स का उपयोग किया जाना चाहिए।
    1. 405 एनएम लेजर लाइन, कम लेजर पावर (जैसे, 5%), और पिक्सेल निवास समय (जैसे, 40 माइक्रोन) और एक पल्स का उपयोग करके ब्याज के क्षेत्र को बार-बार सक्रिय करें, प्रत्येक सक्रियण के बाद सक्रिय जीएफपी फ्लोरेसेंस की छवि प्राप्त करें। जब तक फ्लोरेसेंस नहीं बढ़ता है, तब तक दोहराएं, और फिर प्रत्येक छवि के लिए रुचि के क्षेत्र में फ्लोरेसेंस की मात्रा निर्धारित करें।
    2. पल्स नंबर बनाम औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता की साजिश करें। दालों की संख्या का चयन करें जिसके बाद फ्लोरेसेंस अब सक्रियण के लिए दालों की इष्टतम संख्या के रूप में नहीं बढ़ता है।
  10. 405 एनएम प्रकाश के साथ पैटर्न उत्तेजन द्वारा चरण 5.8 में तैयार किए गए पगएफपी फ्लोरेसेंस को सक्रिय करें। सुनिश्चित करें कि एक छवि से पहले और बस सक्रियण के बाद अधिग्रहीत किया जाता है।
    नोट: आदर्श paGFP सक्रियण आरओआई के भीतर निहित तेज सीमाओं के साथ फ्लोरेसेंस के एक स्पष्ट रूप से परिभाषित क्षेत्र का उत्पादन करेगा।
  11. सक्रियण खत्म होते ही 1 मिनट का टाइमर शुरू करें। 1 मिनट के अंत में, एक टाइमलैप्स श्रृंखला का अधिग्रहण शुरू करें।
    नोट: 1 मिनट की देरी फ्लोरेसेंस में वृद्धि के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है जो PAGFP11के फोटोएक्टिवेशन के बाद मनाया जाता है । नाड़ी-प्रसार विधि के लिए, 30 सेकंड टाइमलैप्स अंतराल के साथ 5-10 मिनट की अधिग्रहण अवधि वेग और दिशात्मकता को मापने के लिए केंद्रीय और फ्लैंकिंग खिड़कियों में प्रारंभिक ढलानों के माप के लिए पर्याप्त है। पल्स-एस्केप विधि के लिए, 5 या 10 मिनट के समय के साथ 30-150 मिनट की अधिग्रहण अवधि फिलामेंट्स के दीर्घकालिक ठहराव व्यवहार के विश्लेषण की अनुमति देती है
  12. अधिग्रहीत सभी छवियों को सहेजें, साथ ही फ्लोरेसेंस सक्रियण के लिए उपयोग किए जाने वाले आरओआई।
  13. तंत्रिका के एक नए क्षेत्र में जाएं और चरण 5.1-5.11 दोहराएं। यदि नया क्षेत्र एक ही अक्षतंतु के साथ है, तो अन्य सक्रिय क्षेत्र से बाहर चले गए फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलामेंट्स का पता लगाने से बचने के लिए पहले सक्रिय क्षेत्र से कम से कम 500 माइक्रोन होना चाहिए। अंतिम टाइमलैप्स का अधिग्रहण 3 घंटे की खिड़की के अंत से पहले खत्म होना चाहिए।
    नोट: यह संभव है कि तैयारी 3 घंटे से अधिक समय तक व्यवहार्य हो सकती है, लेकिन हमने इसकी पुष्टि नहीं की है। कुशल विच्छेदन और तैयारी के साथ, पांच और आठ 10 मिनट के टाइमलैप्स छवि सेट के बीच इस 3 घंटे की खिड़की के भीतर अधिग्रहीत किया जा सकता है ।
  14. अंतिम टाइमलैप्स छवि श्रृंखला के अधिग्रहण के बाद, खारा के प्रवाह को रोकें, समाधान और कक्ष हीटर को डिस्कनेक्ट करें, और माइक्रोस्कोप चरण से परफ्यूजन उपकरण को हटा दें।

6. फ्लैटफील्ड और डार्कफील्ड छवि अधिग्रहण

  1. फ्लोरोसिन का घोल डबल डिस्टिल्ड पानी के 05 एमएल में 250 मिलीग्राम फ्लोरोसिन पाउडर डालकर करें। मिश्रण जब तक कोई दिखाई कण नहीं हैं और किसी भी अविक्षि: सामग्री तलछट करने के लिए एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में 30 सेकंड के लिए समाधान स्पिन। इस समाधान को प्रकाश जोखिम से संरक्षित होने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. एक स्लाइड में फ्लोरोसिन समाधान के 8 माइक्रोन जोड़ें और #1.5 कवरलिप लागू करें। अतिरिक्त तरल दाग, नेल पॉलिश के साथ सील, और सूखने की अनुमति दें।
    नोट: इस उच्च एकाग्रता पर, फ्लोरोसीन डाई का मजबूत अवशोषण समाधान के भीतर रोशन बीम को बुझाता है, जो कवरस्लिप की सतह पर फ्लोरेसेंस का एक पतला विमान पैदा करता है जो तेजी से विसारक विनिमय12के कारण फोटोब्लैचिंग के लिए एक समान और प्रतिरोधी दोनों है।
  3. फ्लोरोसेइन स्लाइड कवरस्लिप-साइड को उल्टे माइक्रोस्कोप चरण पर नीचे रखें और कवरस्लिप की सतह पर फ्लोरेसेंस के पतले विमान पर ध्यान केंद्रित करें। स्लाइड के चारों ओर ले जाएँ देखने के एक क्षेत्र है कि हवा बुलबुले (काले धब्बे) या बड़े फ्लोरोसीन कणों (उज्ज्वल धब्बे) शामिल नहीं है खोजने के लिए।
  4. 0.2 माइक्रोन अंतराल पर 6 माइक्रोन फैले एक जेड-स्टैक प्राप्त करें जैसे कि मध्य छवि मूल फोकस विमान है। एक छोटे से जोखिम समय का उपयोग करें (जैसे, 40 एमएस) क्योंकि फ्लोरेसेंस बहुत उज्ज्वल होगा। यह जेड-स्टैक अधिग्रहण देखने के क्षेत्र में अधिकतम फ्लोरेसेंस पर कब्जा करने के लिए आवश्यक है क्योंकि कवरस्लिप शायद ही कभी पूरी तरह से क्षैतिज होता है और फ्लोरोसीन फ्लोरेसेंस का विमान बहुत संकीर्ण होता है। देखने के कुल 25 क्षेत्रों के लिए इस दोहराएं, खेतों के बीच किसी भी दिशा में कम से 20 μm द्वारा मंच चलती है ।
  5. कैमरे के शटर सहित सभी प्रकाश पथ शटर बंद करें, और लेजर पावर और एक्सपोजर समय को शून्य पर सेट करें। इन सेटिंग्स के साथ 100 छवियों का ढेर प्राप्त करें। इन छवियों को डार्कफील्ड छवि उत्पन्न करने के लिए औसत किया जाएगा, जिसका उपयोग डार्क करंट और कैमरा चिप पर पूर्वाग्रह ऑफसेट के लिए सही करने के लिए किया जाएगा।
    नोट: स्ट्रीमिंग अधिग्रहण इन छवियों को कैप्चर करने का एक आदर्श तरीका है।

7. ब्लीच सुधार के लिए ग्लाइटोलिटिकली बाधित नसों इमेजिंग

  1. चरण 1 में एक खारा समाधान बनाएं और ऑक्सीजन करें; हालांकि डी-ग्लूकोज के लिए स्थानापन्न 2-डिऑक्सी-डी-ग्लूकोज और ग्लाइकोलिस13को बाधित करने के लिए 0.5 एमएम सोडियम आइसोडोसेटेट जोड़ें । हम इसे "निरोधात्मक नमकीन" के रूप में संदर्भित करते हैं।
  2. चरण 5.11 में सेट 10-30 मिनट के टाइमलैप्स छवि के साथ, निरोधात्मक नमकीन का उपयोग करके चरण 2-5 दोहराएं। न्यूरोफिलामेंट परिवहन का पूर्ण अवरोध सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग से पहले निरोधात्मक नमकीन के आवेदन के 40-50 मिनट बाद अनुमति दें।
    नोट: ग्लाइकोलिटिक अवरोध अंततः अक्षों को मार डालेगा, इसलिए अवरोध के बाद समय की एक संकीर्ण खिड़की है जिसमें डेटा प्राप्त करना है, आमतौर पर लगभग 30 मिनट। मेटाबोलिक अवरोध के स्तर का एक संकेतक अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया का फ्लेविन ऑटोफ्लोरेसेंस है, जिसे लंबे एक्सपोजर के कारण टाइमलैप्स श्रृंखला में पाया जा सकता है जिसका उपयोग हम पगप्लोरस14को छवि देने के लिए करते हैं। आमतौर पर, निरोधात्मक नमकीन के साथ उपचार के दौरान माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि होगी। यदि माइटोकॉन्ड्रिया गोल या टुकड़ा करना शुरू कर देता है, तो इमेजिंग बंद कर देता है।

8. इमेजजे का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण

  1. फ्लैटफील्ड और डार्कफील्ड करेक्शन
    1. डार्कफील्ड इमेज स्टैक खोलें और इमेज क्लिक करके छवियों को औसत करें । ढेर । डार्कफील्ड छवि उत्पन्न करने के लिए ड्रॉप-डाउन darkfield मेनू में जेड परियोजना और औसत तीव्रता का चयन करना।
    2. फ्लोरोसिन फ्लैटफील्ड छवि ढेर खोलें और छवि पर क्लिक करके प्रत्येक (कुल 25) का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण बनाएं। ढेर । जेड परियोजना और ड्रॉप-डाउन मेनू में अधिकतम तीव्रता का चयन।
    3. इमेज पर क्लिक करके परिणामी 25 अधिकतम प्रक्षेपण छवियों को एक स्टैक में मिलाएं । ढेर । स्टैक के लिए छवियां। इमेज पर क्लिक करके इस स्टैक का औसत तीव्रता प्रक्षेपण बनाएं । ढेर । Z परियोजना और फ्लैटफील्ड छविउत्पन्न करने के लिए ड्रॉपडाउन मेनू से औसत तीव्रता का चयन।
    4. प्रक्रिया पर क्लिक करके फ्लैटफील्ड छवि से डार्कफील्ड छवि घटाना । छवि कैलकुलेटर,ऑपरेशन के रूप में घटाना का चयन। सुनिश्चित करें कि 32-बिट (फ्लोट) परिणाम विकल्प की जांच की जाती है। परिणाम सही फ्लैटफील्ड छविहै।
    5. पहले क्लिक करके सही फ्लैटफील्ड छवि की औसत पिक्सेल तीव्रता को मापें विश्लेषण । माप सेट करें और मीन ग्रे वैल्यू बॉक्स की जांच करें, और फिर 'एम' कुंजी दबाएं।
    6. प्रक्रिया पर क्लिक करके अपनी औसत तीव्रता से सही फ्लैटफील्ड छवि को विभाजित करें । गणित । 7.1.5 चरण में प्राप्त औसत ग्रे मूल्य को विभाजित करें और दर्ज करें। यह विलोम लाभ छवि का उत्पादन होगा।
    7. टाइमलैप्स इमेज स्टैक के साथ प्री-एक्टिवेशन और पोस्ट-एक्टिवेशन इमेज खोलें। इमेज पर क्लिक करके छवियों को एक ही स्टैक में मिलाएं । ढेर । उपकरण । संक्षिप्त,और ड्रॉपडाउन मेनू से कालक्रम क्रम में छवियों का चयन करें। सुनिश्चित करें कि 4D छवि विकल्प के रूप में ओपन का चयन नहीं किया गया है। परिणामस्वरूप स्टैक पूरी छवि सेटहै।
    8. पूर्ण छवि सेटपर चरण 8.1.4 दोहराएं, और फिर प्रक्रिया पर क्लिक करके उलटा लाभ छवि द्वारा परिणाम को विभाजित करें। छवि कैलकुलेटर और ऑपरेशन के रूप में विभाजित का चयन। यह सही पूर्ण छवि सेटका उत्पादन करेगा, जिसमें प्रत्येक छवि को रोशनी के क्षेत्र में और डिटेक्टर पर एकरूपता न होने के लिए सही किया गया है।
  2. इमेज स्टैक अलाइनमेंट
    1. स्टेज या सैंपल बहाव के कारण टाइमलैप्स श्रृंखला में छवि विमानों के गलत संरेखण के लिए सही करने के लिए, प्लगइन्स पर क्लिक करके निश्चित क्षेत्र प्लगइन(पूरक फ़ाइल 1)द्वारा संरेखण स्थापित करें। प्लगइन स्थापित करें,प्लगइन फ़ाइल वाले फ़ोल्डर पर नेविगेट करें, और प्लगइन का चयन करें। प्लगइन स्थापित करने के बाद इमेजजे को पुनः आरंभ करें।
      नोट: यह प्लगइन "कम से कम वर्गों को congealing" सिद्धांत15के आधार पर छवियों को संरेखित करता है।
    2. सही पूर्ण छवि सेट पर एक आरओआई ड्रा करें जो कई अक्षों तक फैला है और प्रत्येक एक्सॉन के भीतर सक्रिय फ्लोरेसेंस की समीपस्थ और डिस्टल सीमाओं से परे नहीं है। इस क्षेत्र की ज्यामिति महत्वहीन है, हालांकि उन क्षेत्रों को छोड़कर जिनमें संरचनाएं आकार या आकार बदलती हैं, संरेखण में सुधार करेंगे।
    3. प्लगइन्स पर क्लिक करके अलाइनमेंट प्लगइन चलाएं । निश्चित क्षेत्र द्वारा संरेखण। प्लगइन फ्रेम के बीच विस्थापन पर एक डिफ़ॉल्ट 2-पिक्सेल अधिकतम रखता है, हालांकि यदि नमूने का महत्वपूर्ण बहाव होता है तो इसे प्रारंभिक पॉप-अप विंडो में समायोजित किया जा सकता है। छवि स्टैक के आकार के आधार पर संरेखण में कई मिनट लग सकते हैं।
    4. संरेखण की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए गठबंधन स्टैक का निरीक्षण करें। कुछ फ्रेम को मैन्युअल रूप से संरेखित करने की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि स्वचालित संरेखण फ्रेम के बीच फ्लोरेसेंस में बड़े उतार-चढ़ाव के लिए अच्छी तरह से काम नहीं कर सकता है। यह एक फ्रेम है जो छवि क्लिक करके स्थानांतरित किया जाना चाहिए देखने के दौरान पूरा किया जा सकता है । ट्रांसफॉर्म । अनुवादकरें । निम्नलिखित पॉप-अप पर क्लिक करें कि क्या पूरे स्टैक का अनुवाद किया जाना चाहिए। अनुवाद में केवल पूर्णांक पिक्सेल मानों का उपयोग करें और यह सुनिश्चित करें कि ड्रॉपडाउन इंटरपोलेशन मेनू किसी केलिए सेट नहीं है, क्योंकि आंशिक पिक्सेल बदलाव या इंटरपोलेशन पिक्सेल तीव्रता के पुनर्संरहार के कारण डेटा को बदल देगा।
    5. गठबंधन पूर्ण छवि सेटके रूप में इसे सहेजें ।
  3. फ्लोरेसेंस तीव्रता का मापन
    1. सक्रिय क्षेत्र के एक किनारे के साथ पहली बांह के साथ सेट गठबंधन पूर्ण छवि के पहले फ्रेम पर कोण उपकरण का उपयोग करके एक आरओआई ड्रा करें, अक्षों के लंबवत, और दूसरी आर्म वर्टिकल। कोण को मापने के लिए 'एम' कुंजी दबाएं, जो देखने के क्षेत्र में अक्षतंखों के अभिविन्यास का वर्णन करता है।
    2. छवियों का पैमाना निर्धारित करें ताकि विश्लेषण पर क्लिक करके आयामों को माइक्रोन में मापा जा सके । स्केल सेट करें और उचित मूल्यों में प्रवेश करें।
    3. विश्लेषण पर क्लिक करके आरओआई प्रबंधक खोलें । उपकरण । आरओआई मैनेजर। पल्स-एस्केप प्रतिमान के लिए, 8.3.7 कदम करने के लिए छोड़ दें। नाड़ी-प्रसार के लिए, 8.3.4 कदम जारी रखें।
    4. किसी भी आयाम का एक वर्ग आरओआई ड्रा करें, और फिर संपादित करें । चयन । निर्दिष्ट करें। सुनिश्चित करें कि स्केल्ड इकाइयों के विकल्प की जांच की जाती है, और फिर आरओआई को 15μm की चौड़ाई और छवि की ऊंचाई के बराबर या उससे अधिक ऊंचाई पर सेट करें।
    5. एडिट पर क्लिक करके चरण 8.3.1 में मापा कोण द्वारा आरओआई घुमाएं । चयन । इसे अक्षतंप के लिए लंबवत बनाने के लिए घुमाएं, और सक्रिय क्षेत्र के समीपस्थ किनारे के साथ एक तरफ आरओआई रखें। इस आरओआई को जोड़ें, जिसे हम 'टी' कुंजी दबाकर प्रबंधक को समीपस्थ गाइड आरओआई के रूप में संदर्भित करेंगे।
    6. सक्रिय क्षेत्र के डिस्टल किनारे के साथ संरेखित करने के लिए आरओआई खींचें और 'टी' कुंजी दबाकर फिर से आरओआई प्रबंधक में जोड़ें। हम इसे डिस्टल गाइड आरओआई के रूप में संदर्भित करेंगे। फ्लैंकिंग मेजरमेंट आरओआई को आकर्षित करने के लिए बाद में समीपस्थ और डिस्टल गाइड आरओआई का उपयोग किया जाएगा।
    7. ऊपर चरण 5.11 में अधिग्रहीत टाइमलैप्स इमेज सीक्वेंस का उपयोग करके, मात्राकरण के लिए अक्षों का चयन करें। यह छवि अनुक्रम इस उद्देश्य के लिए उपयोगी है क्योंकि यह एक्सोन के कमजोर ऑटोफ्लोरेसेंस को कैप्चर करता है, सक्रिय क्षेत्र के बाहर उनकी आकृति विज्ञान का खुलासा करता है।
      नोट: निम्नलिखित मानदंडों को पूरा नहीं करने वाले एक्सॉन को विश्लेषण से बाहर रखा गया है:
      1. एक्सॉन सभी माप खिड़कियों की पूरी लंबाई के साथ ध्यान में होना चाहिए।
      2. एक्सॉन सक्रियण क्षेत्र के समीपस्थ और डिस्टल सिरों के लंबवत के 5 डिग्री के भीतर होना चाहिए।
      3. एक्सॉन में सक्रियण क्षेत्र के समीपस्थ और डिस्टल सिरों के 5μm के भीतर कोई इनविटेशन नहीं होना चाहिए।
      4. एक्सॉन को बाहर करें जो इमेजिंग के दौरान दिखने वाले आकार को बदलते हैं।
      5. अक्षों को बाहर निकालें जो अक्षों को बाहर करते हैं जो सक्रियण के बाद की छवि(चित्रा 2 सी, नीचे)में एक असतत सक्रिय क्षेत्र की अनुपस्थिति के सबूत के रूप में अस्वस्थ दिखाई देते हैं, क्योंकि यह सक्रिय फ्लोरेसेंस के प्रसार प्रसार का संकेत है, जो तब होता है जब अक्षांश मर जाता है।
    8. अक्षों के भीतर ऑटोफ्लोरोसेंट संरचनाओं के लिए चरण 5.5 से लंबे समय तक एक्सपोजर ब्लीचिंग छवि का निरीक्षण करें। यह फ्लोरेसेंस माइटोकॉन्ड्रिया16के भीतर फ्लेव्स के कारण है । एक्सॉन को विश्लेषण से बाहर करें यदि ये माइटोकॉन्ड्रिया गोल या खंडित(चित्रा 2डी, नीचे)दिखाई देते हैं, जैसा कि विस्तारित, रैखिकसंरचनाओं (चित्रा 2D,शीर्ष) के विपरीत होता है, क्योंकि यह मेटाबोलिक गिरावट का संकेत है।
    9. ऊपर बनाए गए समीपस्थ और डिस्टल गाइड आरओआई का उपयोग करके, प्रति एक्सॉन तीन माप ROIs का विश्लेषण किया जा रहा है: एक केंद्रीय खिड़की जिसमें 40 माइक्रोन सक्रिय क्षेत्र के भीतर अक्षतंप शामिल है, और दो फ्लैंकिंग विंडो 15 माइक्रोन आरओआई और सक्रियण क्षेत्र की सीमा पर एक्सॉन के व्यास से विवश ऊंचाई से विवश है। आरओआई प्रबंधक के लिए सभी तीन क्षेत्रों को जोड़ें। ग्लाइकोलिटिक रूप से बाधित एक्सॉन के लिए, एक ही क्षेत्र को आकर्षित करें जो सक्रिय क्षेत्र के बीच में 5 माइक्रोन से अधिक चौड़ा नहीं है और यह अक्षतंतु के बाहर विस्तार नहीं करता है। नाड़ी से बचने के प्रतिमान के लिए, सक्रिय क्षेत्र केवल 5 माइक्रोन चौड़ा है, इसलिए पूरी खिड़की का उपयोग किया जाना चाहिए।
    10. सभी अक्षों के लिए चरण 8.3.9 दोहराएं जो चरण 8.3.7 और 8.3.8 के मानदंडों को पूरा करते हैं।
    11. विश्लेषण पर क्लिक करके औसत पिक्सेल तीव्रता के लिए सक्रिय माप सेट करें । माप सेट करें और मीन ग्रे वैल्यू विकल्प का चयन करें। सुनिश्चित करें कि कोई अन्य माप विकल्प की जांच कर रहे हैं।
    12. विंडो का चयन करके और 'सीटीआरएल' + 'ए' दबाकर आरओआई प्रबंधक विंडो में सभी आरओआई का चयन करें। आरओआई प्रबंधक खिड़की में, अधिक क्लिक करें । फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने के लिए बहु उपाय। आगे के विश्लेषण के लिए परिणाम विंडो से स्प्रेडशीट तक डेटा कॉपी करें।
    13. विश्लेषण पर क्लिक करके क्षेत्र क्षेत्र में सक्रिय माप सेट करें । माप सेट करें और क्षेत्र विकल्प का चयन करें। सुनिश्चित करें कि कोई अन्य माप विकल्प की जांच कर रहे हैं।
    14. दोहराएं चरण 8.3.12। क्षेत्र के लिए परिणामों की एक पंक्ति को कॉपी करना केवल आवश्यक है, क्योंकि क्षेत्र समय के साथ भिन्न नहीं होता है।

9. फोटोब्लेच करेक्शन

  1. ग्लाइकोलिटिकली बाधित एक्सॉन के लिए डेटा स्प्रेडशीट में, किसी दिए गए आरओआई के लिए फ्रेम 3 (पहला टाइमलैप्स फ्रेम) से शुरू होने वाले प्रत्येक फ्रेम के मतलब फ्लोरेसेंस से फ्रेम 1 (प्री-एक्टिवेशन फ्रेम) के मतलब फ्लोरेसेंस को घटाएं। परिणाम पृष्ठभूमि-घटाया मतलब हैं।
  2. डेटा को फ्रेम नंबरों के साथ एक स्कैटरप्लॉट के रूप में अब्सिसा के रूप में प्लॉट करें। Aeएई-बीएक्सके रूप में समीकरण के साथ प्रत्येक आरओआई (अधिकांश स्प्रेडशीट कार्यक्रमों में यह फ़ंक्शन होता है) से डेटा के लिए एक घातीय ट्रेंडलाइन फिट करें। यह समीकरण फोटोब्लैचिंग फ़ंक्शनएफ टी = एफ0 *ई-tɣ के बराबर है जहां एफ0 टाइमलैप्स के पहले फ्रेम में फ्लोरेसेंस है, ɣ घातीय ब्लीचिंग दर है, टी समय है, और ई प्राकृतिक लॉगरिथम आधार है।
  3. ग्लाइकोलिटिकली बाधित नसों से सभी एक्सॉन के सभी आरओआई के लिए कदम 9.1.1-9.1.2 दोहराएं। फोटोब्लैचिंग दर के सबसे सटीक अनुमान के लिए, कम से कम 5 अलग-अलग नसों से कुल में कम से कम 15 अक्षों का उपयोग करें। फोटोब्लैचिंग के लिए प्रायोगिक डेटा को सही करने के लिए सभी बाधित अक्षों से घातीय ब्लीचिंग दरों (ɣ) के औसत का उपयोग करें। प्रत्येक प्रयोग या अध्ययन के लिए एक नया ब्लीचिंग अंशांकन किया जाना चाहिए, क्योंकि फोटोब्लैचिंग छवि अधिग्रहण सेटिंग्स और लेजर शक्ति पर निर्भर है, जो समय के साथ बदल सकते हैं।
  4. सामान्य नमकीन (यानी ग्लाइकोलिटिकली रूप से बाधित नहीं) के साथ इमेज किए गए एक्सॉन के सभी क्षेत्रों के लिए चरण 9.1.1 दोहराएं।
  5. प्रत्येक डेटा बिंदु कोई-tɣद्वारा विभाजित करें, टी के लिए समय का उपयोग करके और औसत ɣ चरण 9.1.3 में पाया जाता है। ये फोटोब्लेच-सही साधनहैं।
  6. प्रत्येक समय उस क्षेत्र में कुल फ्लोरेसेंस खोजने के लिए ब्याज के उस क्षेत्र के लिए क्षेत्र द्वारा प्रत्येक डेटा बिंदु गुणा करें।

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Representative Results

चित्रा 3 नाड़ी-भागने और नाड़ी फैलाने वाले प्रयोगों से प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है। हमने कई अध्ययन प्रकाशित किए हैं जो पल्स-एस्केप विधि और उन आंकड़ों के विश्लेषण के लिए हमारे तरीकों का उपयोग करके प्राप्त आंकड़ों का वर्णन करते हैं5,,6,,7,8,,17।, नीचे, हम दिखाते हैं कि पल्स-स्प्रेड डेटा न्यूरोफिलामेंट परिवहन की दिशात्मकता और वेग के बारे में जानकारी कैसे दे सकता है, जिसकी हमने पहले रिपोर्ट नहीं की है।

अक्षतंवास में न्यूरोफिलामेंट परिवहन रुक-रुक कर और द्विदिशात्मक है। इस परिवहन को एंटेरोग्रेड और प्रतिगामी दिशाओं में किसी भी समय चलने वाले फिलामेंट्स के अंश से वर्णित किया जा सकता Equation 41 Equation 40 है, और क्रमशः, और एंटेरोग्रेड और प्रतिगामी दिशाओं में उनके वेग, द्वारा Equation 39 और निरूपित। Equation 38 यदि हम एक्सॉन की प्रति यूनिट लंबाई में न्यूरोफिलामेंट पॉलिमर की कुल मात्रा लेते हैं, तो किसी दिए गए क्षेत्र के Equation 37 माध्यम से एंटीरोग्रेड और प्रतिगामी दिशाओं में प्रवाह दिए जाते हैं।

Equation 36

और

Equation 35,

क्रमशः, और कुल प्रवाह Equation 34 द्वारा दिया जाता है

Equation 33,

जहां Equation 70 इकाइयों μm-1है , Equation 32 इकाइयों है Equation 31 और Equation 34 इकाइयों है Equation 30 . चूंकि अक्षतंतरी के साथ किसी दिए गए स्थान पर प्रवाह न्यूरोफाइलमेंट बहुलक की मात्रा है जो उस स्थान को समय की एक इकाई में ले जाता है, यह औसत वेग से संबंधित Equation 29 Equation 28 है। इस प्रकार, हम लिख सकते हैं

Equation 27.

नाड़ी-प्रसार प्रयोग में प्रवाह सक्रिय क्षेत्र से फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलामेंट्स के प्रस्थान की दर से निर्धारित किया जा सकता है, जिसे हम केंद्रीय खिड़की के रूप में संदर्भित करते हैं। प्रति सेकंड इस केंद्रीय खिड़की से फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलामेंट पॉलिमर का कुल Equation 26 नुकसान फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलामेंट पॉलिमर के एंटीरोग्रेड और प्रतिगामी दिशाओं में जाने के कारण होने वाले नुकसान का योग है, यानी

Equation 25

केंद्रीय खिड़की में फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलामेंट बहुलक की प्रारंभिक सामग्री के लिए सामान्यीकृत, Equation 24 यानी, जहां केंद्रीय खिड़की की Equation 23 लंबाई है, नुकसान की यह दर फिर हो जाती है

Equation 22

सेंट्रल Equation 21 विंडो में फ्लोरेसेंस में कमी की ढलान कहां है, जो शुरू में Equation 20 8द्वारा दिए गए समय अवधि के लिए रैखिक है । एक 40 माइक्रोन केंद्रीय खिड़की के लिए, यह सिर्फ दसियों सेकंड के बराबर है। हालांकि, इस बड़े खिड़कियों के लिए, घातीय क्षय चरण में संक्रमण क्रमिक है और ढलान प्रभावी रूप से कई मिनट या अधिक8के लिए रैखिक है।

शुरुआती समय में, फ्लैंकिंग खिड़कियां केंद्रीय खिड़की से बाहर निकलने वाले सभी न्यूरोफिलामेंट्स को कैप्चर करती हैं क्योंकि इन फिलामेंट्स के पास फ्लैंकिंग खिड़कियों से गुजरने और उन्हें दूसरी तरफ से बाहर निकलने के लिए पर्याप्त समय नहीं है। इस मामले में, फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलामेंट पॉलिमर की मात्रा जो केंद्रीय खिड़की को प्रति सेकंड और प्रतिव्यापी रूप से छोड़ती है, यानी फ्लक्स Equation 19 Equation 18 और, न्यूरोफिलामेंट सामग्री में वृद्धि Equation 17 और Equation 16 फ्लैंकिंग खिड़कियों में दी जाती है। केंद्रीय खिड़की में फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलामेंट पॉलिमर की प्रारंभिक सामग्री के लिए सामान्यीकृत, फ्लैंकिंग खिड़कियों में वृद्धि की दरें बन जाती हैं

Equation 15

Equation 14

जहां Equation 13 और Equation 12 क्रमशः समीपस्थ और डिस्टल फ्लैंकिंग खिड़कियों में फ्लोरेसेंस में वृद्धि की ढलान हैं।

इस प्रकार, हम फ्लैंकिंग खिड़कियों में ढलानों के संदर्भ में औसत वेग व्यक्त कर सकते हैं, यानी

Equation 11      (Eq. 1)

और इन ढलानों के अनुपात के संदर्भ में एंटीरोग्रेड और प्रतिगामी चलती न्यूरोफिलामेंट्स की संख्या का अनुपात, यानी

Equation 10     (Eq. 2)

कहां Equation 9 और Equation 8 दरों जिस पर न्यूरोफिलामेंट्स एंटीरोग्रेडली से प्रतिगामी चलती है और इसके विपरीत8रिवर्स निरूपित . के मूल्यों Equation 7 और Equation 6 सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में व्यक्तिगत न्यूरोफिलामेंट्स के आंदोलन को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, जैसा कि पहले17रिपोर्ट किया गया था । महत्वपूर्ण बात, Eq में वेग के लिए अभिव्यक्ति 1 केवल सक्रियण के बाद कम समय पर लागू होता है जिसके दौरान फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलामेंट्स फ्लैंकिंग विंडो में प्रवेश करते हैं लेकिन छोड़ते नहीं हैं। इस कम समय की खिड़की की अवधि फ्लैंकिंग खिड़कियों की लंबाई और न्यूरोफिलामेंट आंदोलन की गतिज पर निर्भर करेगी। अब पार्श्व खिड़कियां, सिद्धांत रूप में, अब समय खिड़की । सैद्धांतिक रूप से, कोई भी परीक्षण कर सकता है कि इस कसौटी की पुष्टि करके पूरा किया जाता है

Equation 5     (Eq. 3)

Eq. 1 में वेग के लिए अभिव्यक्ति के विपरीत, जो फ्लैंकिंग खिड़कियों में ढलानों के बीच अंतर से दिया जाता है, Eq में दिशात्मकता के लिए अभिव्यक्ति 2 खिड़की के आकार को फ्लैंक करने के लिए मजबूत है क्योंकि यह फ्लैंकिंग खिड़कियों में ढलानों के अनुपात से दिया जाता है।

चित्रा 3 एक C57Bl/6J पृष्ठभूमि पर हमारे hThy1 paGFP-NFM लाइन से एक 8 सप्ताह पुराने पुरुष माउस के टिरियल तंत्रिका में myelinated axons पर पल्स-एस्केप और पल्स प्रसार प्रयोगों से प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है, क्रमशः 5 और ४० μm के खिड़की के आकार का उपयोग कर । कम से कम 2 सप्ताह की उम्र के चूहों, दोनों पुरुष और महिला, इन प्रयोगात्मक प्रतिमान के लिए इस्तेमाल किया गया है। अध्ययन में परीक्षण किया जा रहा है के आधार पर शोधकर्ता द्वारा उचित आयु और सेक्स का निर्धारण किया जाना चाहिए। समय के साथ, यह देखा जा सकता है कि सक्रिय क्षेत्रों के किनारे एंटीरोग्रेड और प्रतिगामी दोनों दिशाओं में न्यूरोफिलामेंट्स के प्रस्थान के कारण धुंधला होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप केंद्रीय खिड़की से फ्लोरेसेंस की हानि होती है।

नाड़ी-भागने की विधि(चित्रा 3ए, सी, ई)के लिए, सक्रिय क्षेत्र में फ्लोरेसेंस क्षय गतिज दीर्घकालिक और अल्पकालिक ठहराव व्यवहार8, 18,18के बारे में जानकारी प्राप्त कर सकते हैं। इन प्रयोगों के लिए, सक्रिय क्षेत्र छोटा हो सकता है (हम आम तौर पर 5 माइक्रोन का उपयोग करते हैं; चित्रा 3Aमें पीला बॉक्स देखें)। पल्स-स्प्रेड विधि(चित्रा 3बी, डी, एफ)के लिए, हम फ्लोरोसेंट न्यूरोफाइलमेंट्स का एक बड़ा पूल प्रदान करने के लिए एक लंबे समय तक सक्रिय क्षेत्र (यहां 40 माइक्रोन; चित्रा 3 बीमें पीला बॉक्स देखें) का उपयोग करते हैं। यह उस समय को लंबा करता है जिस पर फ्लैंकिंग क्षेत्रों में फ्लोरेसेंस वृद्धि रैखिक बनी हुई है (ऊपर देखें)। इन खिड़कियों की लंबाई बढ़ाकर फ्लैंकिंग खिड़कियों में इस फ्लोरेसेंस वृद्धि के रैखिक डोमेन को भी बढ़ाया जा सकता है, हालांकि यह देखने के क्षेत्र के आकार से सीमित है। हमने चित्रा 3 डीमें दिखाए गए डेटा के लिए लाल और हरे रंग में दिखाए गए 15 माइक्रोन फ्लैंकिंग खिड़कियों का उपयोग किया।

चित्रा 3ई, 3F क्रमशः चित्रा 3सी, 3 डी में दिखाए गए माप खिड़कियों के लिए कुल फ्लोरेसेंस तीव्रता(यानी, पिक्सेल तीव्रता का योग) की मात्रा दिखाता है। नाड़ी-भागने की विधि के लिए क्षय बिफेसिक है, एक प्रारंभिक घातीय क्षय के साथ जो ऑन-ट्रैक न्यूरोफिलामेंट्स के प्रस्थान का प्रतिनिधित्व करता है। यह एक दूसरे धीमी घातीय क्षय के लिए लगभग 10-20 मिनट में संक्रमण है जो ऑफ-ट्रैक फिलामेंट्स8के जुड़ाव और प्रस्थान का प्रतिनिधित्व करता है। पल्स-स्प्रेड विधि की तुलना के लिए,,हम चित्रा 3Eमें केवल 12 मिनट का समय पाठ्यक्रम दिखाते हैं, लेकिन आमतौर पर विश्लेषण के समय पाठ्यक्रम को दीर्घकालिक रुके हुए काइनेटिक्स5,6, 18 पर कब्जा करने के लिए लंबे समय तक (आमतौर पर 30-120 मिनट) की आवश्यकता होती है।,618 नाड़ी फैलाने की रणनीति के लिए, आंदोलन के वेग और दिशात्मकता की गणना केवल फ्लैंकिंग खिड़कियों में ढलानों पर निर्भर करती है। यहां उपयोग की जाने वाली खिड़की की लंबाई के लिए, रैखिक चरण लगभग 5 मिनट तक फैला हुआ है। रैखिकता की इस समय खिड़की की अवधि का मूल्यांकन ढलान को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले समय को संवर्द्धित रूप से छोटा करके किया जाना चाहिए, और उस बिंदु का निर्धारण करना चाहिए जिस पर ढलान अब बढ़ता नहीं है। यदि दृश्य के कैमरा क्षेत्र परमिट देता है तो खिड़की की लंबाई में वृद्धि करके इस अवधि को बढ़ाया जा सकता है, हालांकि किसी दिए गए प्रयोग में सभी अक्षों के लिए खिड़की की लंबाई स्थिर रखी जानी चाहिए। एक उदाहरण के रूप में, हमने चित्रा 3Fमें पल्स-स्प्रेड डेटा के लिए ढलानों को मापने के लिए पहले 5 मिनट के डेटा का उपयोग किया है। ७२ A.U./min,-५९४ A.U./मिनट, और १११ A.U./min के समीपस्थ, केंद्रीय और डिस्टल खिड़कियों के लिए क्रमशः (A.U. = मनमाने ढंग से इकाइयों) की ढलानों में यह परिणाम है । इन मूल्यों को सामान्य करने के लिए, वे केंद्रीय खिड़की के प्रारंभिक फ्लोरेसेंस से विभाजित हैं, जिसके परिणामस्वरूप ०.१०८% एफ 0/मिनट,-०.९६२% एफ0/मिनटऔर ०.१७३% एफ0/मिनटकी दरें हैं । 3 लागू करने से हम पाते हैं कि संरक्षण मापदंड पूरा नहीं हो रहा है, यह दर्शाता है कि हम सभी फ्लैंकफ्लैंक में फ्लूरेस्केंस पर कब्जा नहीं कर रहे हैं ।0 यह हमारे EMCCD कैमरा (82 μm x 82 μm) के दृश्य के क्षेत्र के कारण एक तकनीकी सीमा है। SCMOS चिप्स, जो देखने के बहुत बड़े क्षेत्रों हो सकता है के साथ कैमरे, बड़ा पार्श्व खिड़की के आकार के उपयोग की अनुमति सकता है । हालांकि, हम इस संभावना को बाहर नहीं कर सकते कि केंद्रीय और फ्लैंकिंग ढलानों के बीच यह विसंगति भी कम से कम भाग में, फोटोब्लेचिंग (चर्चा देखें) की सीमा को कम करके कम आंकने के लिए, जो फ्लैंकिंग खिड़कियों में सकारात्मक ढलानों को कम आंकने और केंद्रीय खिड़की में नकारात्मक ढलान का अनुमान लगाने का प्रभाव होगा।

फ्लैंकिंग खिड़कियों (%F0/मिनट)और Eq. 2 के ऊपर की दरों से, और 17 के मूल्यों का उपयोग Equation 4 Equation 3 17करके, हम अनुपात = 2.12 की गणना करते Equation 2 हैं। यह इंगित करता है कि 68% फिलामेंट्स एंटेरोग्रेड और 32% प्रतिगामी चल रहे थे। एक ही दरों और Eq. 1 ऊपर का उपयोग करना, हम औसत शुद्ध जनसंख्या वेग Equation 1 = 40 * (0.00173-0.00108) = ०.०२६ μm/min, या ०.०३७ मिमी/दिन की गणना । इसी तरह की उम्र के चूहों में रेडियोआइसोटोपिक पल्स-लेबलिंग अध्ययनों ने दो सेंटीमीटर 19, 20 की दूरी पर ०.१२ मिमी/दिन तक धीमा, सियाटिक तंत्रिका के सबसे समीपस्थ भागों में लगभग०.६ मिमी/दिन,के न्यूरोफिलामेंट जनसंख्या वेग की सूचना दीहै। हमारे पल्स-स्प्रेड डेटा टिबियल तंत्रिका में इकट्ठा किया गया था, मोटे तौर पर इन उपायों के लिए एक और 2-3 सेंटीमीटर डिस्टल । ऊपर उल्लिखित कारणों से, हम मानते हैं कि 0037 मिमी/दिन का अनुमान वास्तविक वेग को कम आंकना है। हालांकि, रेडियोआइसोटोपिक पल्स-लेबलिंग द्वारा टिबियल तंत्रिका में मनाए गए स्थानिक धीमा को एक्सपेरिमेंट करना यह अनुमान अनुचित नहीं है, खासकर जब हम मानते हैं कि यह एक बहुत ही अलग स्थानिक और लौकिक पैमाने पर एक बहुत ही अलग पद्धति का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।

आबादी के बीच महत्वपूर्ण मतभेदों का पता लगाने के लिए नाड़ी-प्रसार विधि की क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए, हमने सामान्य और अवरोधक दोनों लवकुश के साथ नसों से मापा जाने वाला समीपस्थ और डिस्टल फ्लैंकिंग विंडो ढलानों की तुलना की। ग्लाइकोलिसिस का अवरोध न्यूरोफिलामेंट्स के आंदोलन को रोकता है, जैसा कि हमने पहले5,,6,,7बताया है। हम बाद में प्रयोगों के लिए नमूना आकार के चयन पर चर्चा करेंगे, लेकिन यहां हमने अवरोध के दौरान प्रति तंत्रिका एक अधिग्रहण क्षेत्र की सीमा के कारण सामान्य नमकीन में एक तंत्रिका और दो निरोधात्मक खारा में इस्तेमाल किया। चित्रा 4A सक्रिय क्षेत्र से बाहर परिवहन में स्पष्ट कमी का प्रदर्शन करते हुए ग्लाइकोलिटिकली बाधित तंत्रिका से एक उदाहरण टाइमलैप्स दिखाता है। दरअसल, हम काफी कम डिस्टल और समीपस्थ ढलानों(चित्रा 4B,पी = 0.00000639 और 0.0121, क्रमशः, है Tukey जोड़ी तुलना ANOVA के बाद) अवरोधक खारा बनाम सामान्य खारा के साथ perfused के साथ इलाज नसों में लगता है । हम भी इन दो शर्तों के बीच जनसंख्या वेग में एक महत्वपूर्ण कमी पातेहै (चित्रा 4C,पी = ०.०२३२, असमान विचरण के साथ टी परीक्षण, पी = ०.०१९० के साथ समान विचरण के लिए एफ परीक्षण के बाद) ।

Figure 1
चित्रा 1: परफ्यूजन चैंबर। (A)परफ्यूजन चैंबर हाउसिंग और बाहरी गैसकेट की असेंबली को खारा सिरिंज और अपशिष्ट फ्लास्क से जुड़े ट्यूबिंग के साथ दिखाता है। (ख)आरेख चैंबर की विधानसभा को ही दिखाता है । आंतरिक गैसकेट #1.5 कवरस्लिप के शीर्ष पर फ्लैट रखा गया है। तंत्रिका को आंतरिक गैसकेट के आयताकार उद्घाटन द्वारा बनाए गए कुएं में कवरस्लिप पर रखा जाता है। माइक्रोक्वेड स्लाइड को #1.5 कवरस्लिप और माइक्रोक्वाडक्ट स्लाइड के बीच तंत्रिका सैंडविच करने के लिए तंत्रिका पर रखा गया है। अंत में, सैंडविच(ए)में दिखाया विधानसभा के बाहरी गैसकेट के शीर्ष पर बढ़ते से पहले फ़्लिप किया जाता है और एक लॉकिंग रिंग (नहीं दिखाया गया) के साथ सुरक्षित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: टिबियल तंत्रिका तैयारी। (क)माउस के पैर के भीतर टिबियल तंत्रिका के स्थान को दिखाने वाली छवि, जिसमें ग्लूटस सतही, बाइसेप्स फेमोरिस, सेिएंडिनोसस, पॉपलाइटस, टिबिलिस कौडालिस और फ्लेक्सर डिजोरम लांगस मांसपेशियों को हटा दिया गया है । टिबियल तंत्रिका को घुटने पर उत्पन्न होने वाली सियाटिक तंत्रिका की तीन प्रमुख शाखाओं में से एक के रूप में देखा जा सकता है। (ख)इकट्ठे कक्ष में क्रॉस-सेक्शन में तंत्रिका की योजनाबद्ध, कवरस्लिप के नीचे तेल विसर्जन उद्देश्य दिखा । सबसे अच्छी ऑप्टिकल गुणवत्ता को कवरस्लिप की सतह पर अक्षों की परत को सक्रिय और इमेजिंग द्वारा प्राप्त किया जाता है; प्रकाश बिखरने के कारण तंत्रिका में छवि की गुणवत्ता में गहरी गिरावट आती है। (ग)सक्रियण के तुरंत बाद एक स्वस्थ अक्षतंपन (ऊपर) और एक अस्वस्थ अक्षतंश (नीचे) के उदाहरण। धराशायी येलो लाइन सक्रिय क्षेत्र को चिह्नित करता है। सक्रिय फ्लोरेसेंस में स्वस्थ एक्सॉन में तेज सीमाएं होती हैं जबकि अस्वस्थ एक्सॉन में सक्रिय फ्लोरेसेंस सक्रिय क्षेत्र से तेजी से बाहर निकलता है, जो सेकंड के भीतर अक्षतंप को भरता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। (घ)एक स्वस्थ अक्षतंतरी (ऊपर) और एक अस्वस्थ अक्षतंश (नीचे) में माइटोकॉन्ड्रियल उपस्थिति के उदाहरण। माइटोकॉन्ड्रिया फ्लैविन ऑटोफ्लोरेसेंस16के कारण दिखाई देते हैं । वे स्वस्थ अक्षों में रैखिक (ठोस एरोहेड) दिखाई देते हैं। अस्वस्थ अक्षों में, माइटोकॉन्ड्रिया पहले पंचाट (खुले तीर) बन जाते हैं और फिर बाद में समय के साथ बेहोश हो जाते हैं, जो अक्षतंतु स्वास्थ्य का संकेतक प्रदान करते हैं। स्वस्थ अक्षों में धराशायी खुला तीररेखा रैखिक से पंचक में संक्रमण के लिए एक माइटोकॉन्ड्रियन की ओर इशारा करता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: नाड़ी-भागने और नाड़ी फैलाने वाले प्रयोग। पूर्व सक्रियण का उदाहरण, पोस्ट-एक्टिवेशन और 8 सप्ताह पुराने माउस के टिबियल तंत्रिका में myelinated axons की टाइमलैप्स छवियों(क)एक पल्स-एस्केप प्रयोग और(बी)एक पल्स-स्प्रेड प्रयोग। प्री-एक्टिवेशन इमेज शीर्ष पैनल है, जिसमें पोस्ट-एक्टिवेशन छवियां हैं।  समय टिकटों सक्रियण के बाद बीता समय दिखा। पीले बक्से सक्रिय क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन सक्रियणों को 40 माइक्रोस पिक्सेल निवास समय और 5% लेजर पावर के साथ 5 स्कैन का उपयोग करके किया गया था। स्केल बार = 10 माइक्रोन। (ग)नाड़ी-भागने के प्रयोग में तीन अक्षों के लिए माप आरओआई (पीला) । (घ)नाड़ी फैलाने वाले प्रयोग में तीन अक्षों के लिए समीपस्थ (लाल), केंद्रीय (पीला) और डिस्टल (हरा) माप आरओआई । प्रत्येक अक्षतंख के लिए माप आरओआई ठोस लाल (समीपस्थ), ठोस पीले (केंद्रीय खिड़की) और ठोस हरे (डिस्टल विंडो) में दिखाए जाते हैं। (ई) औसत फ्लोरेसेंस बनाम समय का प्लॉट, सी डैश लाइन में 3 अक्षों का औसत डेटा के लिए एकt घातीय-τtकार्य फिट है, जैसा कि पहले7वर्णित है।E एफ) केंद्रीय, डिस्टल और समीपस्थ आरओआई बनाम समय में फ्लोरेसेंस के भूखंड, डी में तीन अक्षों सहित 14 अक्षों का औसत। ढलान की गणना ट्रेंडलाइन फिट से डेटा के पहले 5 मिनट तक की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: न्यूरोफिलामेंट परिवहन पर मेटाबोलिक अवरोधकों का प्रभाव। (क)ग्लाइकोलिस को बाधित करने और सेलुलर एटीपी को समाप्त करने के लिए 5.6% (w/v) 2-डिऑक्सी-ग्लूकोज और 0.5 एमएम सोडियम आयोडोसेटेट के साथ पूर्व में इलाज किए गए तंत्रिका के टाइमलैप्स छवियों का उदाहरण। ध्यान दें कि सक्रिय क्षेत्रों की डिस्टल और समीपस्थ सीमाएं तेज रहती हैं, जो न्यूरोफिलामेंट परिवहन के अवरोध का संकेत देती हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन।(ख)डिस्टल (डी) और समीपस्थ (पी) में ढलानों का मात्राकरण खिड़कियां (क्रमशः एंटेरोग्रेड और प्रतिगामी), केंद्रीय खिड़की (% एफ 0/मिनट) में प्रारंभिक फ्लोरेसेंस के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया, एक तंत्रिका(14अक्षों) से मानक खारा का उपयोग करके और दो नसों (8 अक्षों) से खारा के साथ पूर्व नियोजित (ग)न्यूरोफिलमेंट जनसंख्या वेग की गणना फ्लैंकिंग खिड़कियों में ढलानों से की जाती है, जो अवरोधक उपचार के बाद वेग में काफी कमी दिखाता है। - पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.005; **- पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.01; * - पी एंड एलटी; 0.05। डेटा अवरोधकों की उपस्थिति में न्यूरोफिलामेंट परिवहन की महत्वपूर्ण हानि दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

नाड़ी-भागने और नाड़ी-प्रसार प्रयोगों के विश्लेषण में देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि प्रसंस्करण के बाद, मुख्य रूप से फ्लैट-फील्ड सुधार, छवि संरेखण और ब्लीच सुधार के दौरान त्रुटि की शुरुआत के लिए महत्वपूर्ण क्षमता है। रोशनी में गैर-एकरूपता के लिए फ्लैट-फील्ड सुधार आवश्यक है, जिसके परिणामस्वरूप केंद्र से परिधि तक देखने के क्षेत्र में तीव्रता में गिरावट आती है। गैर-एकरूपता की सीमा तरंगदैर्ध्य-निर्भर है और इस प्रकार, हमेशा उस तरंगदैर्ध्य पर किया जाना चाहिए जिसका उपयोग प्रायोगिक डेटा प्राप्त करने के लिए किया जाना है। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि फ्लैट-फील्ड छवि में गैर-एकरूपता सही मायने में छवियों में गैर-एकरूपता का प्रतिनिधि है जिसे ठीक किया जाए। पल्स-स्प्रेड प्रयोग विशेष रूप से अनुचित फ्लैट-फील्ड सुधार से त्रुटि के लिए असुरक्षित हैं क्योंकि माप ROIs छवि की परिधि की ओर विस्तार करता है जहां तीव्रता गिरावट सबसे बड़ी है।

इष्टतम paGFP सक्रियण सेटिंग्स सक्रियण विधि और लेजर मापदंडों द्वारा भिन्न होंगे, और पहले इमेजिंग सत्र से पहले अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। बहुत कम सक्रियता सक्रिय फ्लोरेसेंस के लिए कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात में परिणाम होगा, जबकि बहुत अधिक सक्रिय फ्लोरेसेंस की ब्लीचिंग में परिणाम होगा क्योंकि गैर-सक्रिय और सक्रिय paGFP दोनों बैंगनी प्रकाश से उत्साहित हो सकते हैं। छवि में रुचि के क्षेत्र को चुनिंदा रूप से रोशन करने के लिए, हम एक एंडोर एफरप्पा लेजर गैल्वो स्कैनर का उपयोग करते हैं, जो तेज सीमाओं के साथ फ्लोरेसेंस का स्पष्ट रूप से परिभाषित क्षेत्र उत्पन्न करता है, जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है। हमें एंडोर मोज़ेक डिजिटल डायाफ्राम का उपयोग करके सफलता भी मिली है, जो एक डिजिटल माइक्रोमिरर डिवाइस है, जिसमें एक पारा आर्क लैंप रोशनी स्रोत7के रूप में है। अन्य विकल्प व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। पगएफपी के साथ काम करते समय एक चुनौती फ्लोरेसेंस तीव्रता में देरी से वृद्धि होती है जो फोटोएक्टिवेशन चरण के बाद 1 मिनट के भीतर होती है। यह वृद्धि इसलिए होती है क्योंकि बैंगनी प्रकाश के साथ रोशनी सक्रिय पगएफपी अणुओं के अनुपात को "अंधेरे स्थिति" में प्रवेश करने का कारण बनती है जिसमें से वे दसियों सेकंड11के समय पाठ्यक्रम पर वापस आराम कर सकते हैं। हमारे अनुभव में, वृद्धि आमतौर पर वाइडफील्ड उत्तेजना के साथ 5% से कम होती है, लेकिन लेजर उत्तेजना के साथ 20% से अधिक हो सकती है, जिससे सक्रिय फ्लोरेसेंस का एक महत्वपूर्ण अनुमान हो सकता है। हम फोटोएक्टिवेशन के 1 मिनट बाद पगएफपी फ्लोरेसेंस की दूसरी "पोस्ट-एक्टिवेशन" छवि प्राप्त करके इसके लिए खाते हैं, और फिर बाद के टाइमलैप्स के लिए संदर्भ बिंदु के रूप में इस छवि का उपयोग करते हैं। हालांकि, यह पहचानना महत्वपूर्ण है कि यह प्रारंभिक फ्लोरेसेंस और प्रारंभिक समय में क्षय गतिज का निर्धारण करने में त्रुटि का एक और संभावित स्रोत पेश करता है।

छवि ढेर के संरेखण के लिए अतिरिक्त ध्यान दिया जाना चाहिए। मिसलाइनमेंट का प्रमुख स्रोत टाइमलैप्स छवि अधिग्रहण के दौरान नमूने का बहाव या अन्य आंदोलन है। इसे उचित मोटाई के आंतरिक गैसकेट का उपयोग करके कम किया जा सकता है और इमेजिंग से पहले तैयारी को "व्यवस्थित" करने की अनुमति दी जा सकती है। हालांकि, इस तरह की किसी भी देरी से छवि अधिग्रहण के लिए उपलब्ध समय कम हो जाएगा क्योंकि तैयारी में व्यवहार्यता की सीमित खिड़की है। यह भी महत्वपूर्ण है कि छवि ताना या उप पिक्सेल बदलाव शुरू संरेखण एल्गोरिदम से बचने के लिए, के रूप में इन प्रक्रियाओं छवि में पिक्सेल तीव्रता resample होगा । नाड़ी-प्रसार प्रयोग विशेष रूप से अनुचित संरेखण से उत्पन्न त्रुटियों के प्रति असुरक्षित हैं क्योंकि सक्रिय फ्लोरेसेंस के क्षेत्र की सीमाएं अपेक्षाकृत तेज हैं, और इस क्षेत्र में फ्लोरेसेंस फ्लैंकिंग अनएक्टिवेटेड क्षेत्रों की तुलना में काफी अधिक है । यहां तक कि स्टैक में छवि विमानों का एक मामूली गलत संरेखण डिस्टल और समीपस्थ माप खिड़कियों में फ्लोरेसेंस मूल्यों में बड़ी छलांग में परिणाम कर सकता है। इस प्रकार, यह जरूरी है कि छवि सेट ठीक से गठबंधन कर रहे है और विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले ध्यान से निरीक्षण किया ।

फोटोब्लीचिंग के लिए सुधार यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि समय के साथ फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की मात्रा में परिवर्तन को सही ढंग से प्रतिबिंबित करें। इस तरह के सुधार केंद्रीय और फ्लैंकिंग खिड़कियों में पूर्ण फ्लोरेसेंस तीव्रता का आकलन करने में त्रुटि का एक महत्वपूर्ण स्रोत हो सकते हैं। चूंकि फोटोब्लेचिंग काइनेटिक्स रोशनी की तीव्रता और फ्लोरोफोर के पर्यावरण पर निर्भर करता है, वास्तविक फोटोब्लैचिंग दरें सत्रों और अक्षतंश से अक्षतंश के बीच भिन्न हो सकती हैं। इस प्रकार, कई अक्षों को मापने और परिणामी डेटा को औसत करने के लिए आवश्यक है, जो स्वयं कुछ त्रुटि का परिचय देता है। ऊपर वर्णित दृष्टिकोण ग्लायकोटिक अवरोधकों के साथ तंत्रिका का इलाज करना और फिर ब्याज के क्षेत्र में फ्लोरेसेंस को सक्रिय करना और समय के साथ फ्लोरेसेंस तीव्रता के नुकसान को ट्रैक करना है। ग्लाइकोलिटिक अवरोधक एटीपी को समाप्त करते हैं और इस प्रकार न्यूरोफिलामेंट परिवहन को रोकते हैं ताकि फ्लोरेसेंस का नुकसान पूरी तरह से फोटोब्लैचिंग के कारण हो और सक्रिय क्षेत्र से बाहर न्यूरोफिलामेंट्स की आवाजाही न हो। इसके बाद इस तरह से निर्धारित औसत ब्लीचिंग काइनेटिक्स का इस्तेमाल प्रायोगिक आंकड़ों को सही करने के लिए किया जाता है । चूंकि प्रत्येक इमेजिंग सत्र में एक अलग ब्लीचिंग अंशांकन करना व्यावहारिक नहीं है, इसलिए कई हफ्तों में फैले कई सत्रों में एक अंशांकन लागू किया जाना चाहिए। इस दृष्टिकोण का एक नुकसान यह है कि यह दिन-प्रतिदिन लेजर शक्ति/रोशनी तीव्रता में भिन्नता के लिए खाता नहीं है, जिसकी निगरानी की जानी चाहिए । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, जिसे हम "आंतरिक ब्लीचिंग सुधार" के रूप में संदर्भित करते हैं, एक ही टाइमलैप्स फिल्मों में सक्रिय क्षेत्र के केंद्र में फ्लोरेसेंस को निर्धारित करके फोटोब्लैकिंग का अनुमान लगाना है जो परिवहन मापन के लिए उपयोग किए जाते हैं। यदि यह माप क्षेत्र केंद्रीय रूप से स्थित है और सक्रिय क्षेत्र की लंबाई से बहुत कम है, और फिर कम समय में किसी भी फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलामेंट्स जो माप क्षेत्र से बाहर जाते हैं, फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलामेंट्स द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा जो इसमें चलते हैं। हालांकि, समय के साथ एक्सॉन के गैर-फ्लोरोसेंट क्षेत्रों को फ्लैंक करने से मापन क्षेत्र में जाने वाले गैर-फ्लोरोसेंट न्यूरोफिलमेंट्स की संभावना बढ़ जाती है, जिससे ब्लीचिंग के कारण फ्लोरेसेंस के नुकसान का अधिक अनुमान लगाया जाता है। इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि यह है कि एक ही क्षेत्र के भीतर विरंजन विशेषताओं के लिए सही है, लेकिन एक नुकसान यह है कि समय खिड़की की अवधि अनुभवजन्य निर्धारित किया जाना चाहिए और परिवहन की दर के साथ ही सक्रिय क्षेत्र की लंबाई पर निर्भर करेगा । यह सब कहा गया है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमारी विधि का उपयोग कर न्यूरोफिलामेंट परिवहन की दिशात्मकता का अनुमान ब्लीचिंग त्रुटियों के लिए मजबूत है (जैसा कि यह खिड़की के आकार के लिए है) क्योंकि यह फ्लैंकिंग खिड़कियों में ढलानों के अनुपात द्वारा दिया जाता है और कोई भी ब्लीचिंग सुधार उस गणना में अंककर्ता और भाजक दोनों पर लागू गुणक है।

फ्लोरोसेंट सिस्टम में निहित शोर और ऊपर वर्णित छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग चरणों के दौरान अतिरिक्त त्रुटि की क्षमता के कारण, पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति के लिए बड़े नमूना आकार का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। हालांकि प्रयोग से पहले जनसंख्या साधनों, विचलन और प्रभाव आकारों को सही ढंग से निर्धारित करना संभव नहीं है, लेकिन हम कोहेन विधि21 का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो मध्यम प्रभाव आकार और 0.05 का अल्फा मानते हैं। एक कोहेन डीमें यह परिणाम है, जो दोनों आबादी के पूल्ड मानक विचलन से विभाजित साधनों में अंतर है, ०.५, जो समूह प्रति कम से १०५ नमूनों को प्राप्त करने का सुझाव देता है । एक बार जब यह सीमा बन जाती है, तो कोई भी वास्तविक जनसंख्या उपायों के प्रकाश में सांख्यिकीय शक्ति का पुनर्मूल्यांकन करने के लिए एक पोस्ट हॉक पावर विश्लेषण कर सकता है । इष्टतम प्रायोगिक परिस्थितियों में, प्रति एक्टिवेशन 1-7 विश्लेषणीय एक्सॉन (9-20 कुल एक्सॉन में से) और प्रति तंत्रिका 10 मिनट के टाइमलैप्स प्रति एक्टिवेशन के अधिग्रहण को मानते हुए 5-8 सक्रियण से प्राप्त करना संभव होना चाहिए।

माइटोकॉन्ड्रिया या वेसिकल्स के लिए लक्षित फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग परिधीय ex vivoनसों,23,24,में झिल्ली के अक्षीय परिवहन का अध्ययन करने के लिए भी किया गयाहै। इसके अलावा, Schiavo प्रयोगशाला ने फ्लोरोसेंटली टैग टिटनेस टॉक्सिन टुकड़ों का उपयोग करके वीवो में एक्सोन में प्रतिगामी रूप से चलती झिल्ली वाले कणों के एक्सोनल परिवहन को छवि देने के लिए दृष्टिकोण विकसित किया है, जिसे मांसपेशियों में इंजेक्ट किया जा सकता है और मोटर तंत्रिका टर्मिनल26द्वारा लिया जाता है। हालांकि, चूंकि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा इन एक्सॉन में झिल्लीदार ऑर्गेनेल्स को हल किया जा सकता है, इसलिए टाइमलैप्स या काइम्बोग्राफ विश्लेषण का उपयोग करके सीधे उनके आंदोलन के वेग और आवृत्ति का विश्लेषण करना संभव है। यहां वर्णित नाड़ी-भागने और नाड़ी फैलाने के तरीकों को इन अक्षों में न्यूरोफिलामेंट परिवहन के काइनेटिक्स का विश्लेषण करने के विशिष्ट लक्ष्य के साथ विकसित किया गया था, जिसमें एकल न्यूरोफिलामेंट्स को हल नहीं किया जा सकता है। इसके लिए मिनटों या दसियों मिनट की अवधि में जनसंख्या स्तर के विश्लेषण की आवश्यकता होती है । हम इस उद्देश्य के लिए एक ट्रांसजेनिक माउस का उपयोग करते हैं, लेकिन वायरल ट्रांसडक्शन या गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन जैसे तरीकों का उपयोग करके फोटोएक्टिवेट प्रोटीन को व्यक्त करना भी संभव होना चाहिए। जबकि ध्यान न्यूरोफिलामेंट परिवहन रहा है, पल्स-एस्केप और पल्स-स्प्रेड विधियों को अन्य साइटोस्केलेल और साइटोसोलिक प्रोटीन के आंदोलन का अध्ययन करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है जो अक्षीय परिवहन के धीमे घटकों में अक्षों के साथ ले जाया जाता है। हम अपने विश्लेषणों को myelinated axons तक सीमित रखते हैं क्योंकि उनका आकार और मायलिन म्यान हमें अपने पड़ोसियों से उन्हें हल करने की अनुमति देता है। रेमक बंडलों में क्लस्टर की प्रवृत्ति और उनकी छोटी क्षमता के कारण अउदार अक्षों को हल नहीं किया जा सकता है। हम टिबियल नसों के उपयोग का वर्णन पूर्व वीवो लेकिन तरीके अन्य परिधीय नसों पर भी लागू होने चाहिए जो पर्याप्त रूप से लंबे (>5 मिमी) और अनशांचित हैं। सिद्धांत रूप में, इन तरीकों को वीवो में इमेज न्यूरोफिलामेंट परिवहन में अनुकूलित करना भी संभव होना चाहिए (उदाहरण के लिए, शल्य चिकित्सा से एक बेहोश माउस में एक तंत्रिका को उजागर करके और फिर माउस को माइक्रोस्कोप चरण पर रखकर)।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक ों को अनुदेश और सहायता के लिए पाउला Monsma धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और टिबियल तंत्रिका विच्छेदन और डॉ अत्सुको उचिदा, च्लोए डुगर और सना चहांदे के साथ माउस पशुपालन के साथ सहायता के लिए सहायता के लिए । इस काम को सहयोगी नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट IOS1656784 से एबी तक के हिस्से में समर्थन मिला । और IOS1656765 पीजे के लिए, और स्वास्थ्य अनुदान R01 NS038526, P30 NS104177 और S10 OD010383 को A.B. N.P.B. को ओहियो राज्य विश्वविद्यालय के अध्यक्ष के पोस्टडॉक्टर स्कॉलर्स प्रोग्राम से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm Bioptechs 1907-1422-100 inner gasket
2-deoxy-D-glucose Sigma D6134
30mm Round Gasket w/ Holes Bioptechs 1907-08-750 outer gasket
35 x 10mm dish Thermo Fisher 153066 dissection dishes
40mm round coverslips Bioptechs 40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip BD 309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system Andor outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride Fisher C79
Coverslips Fisher 12-541-B for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution Sigma G8769
Dissecting pins Fine Science Tools 26001-70
Dissection forceps Fine Science Tools 11251-30 fine tipped forceps
Dissection microscope Zeiss 47 50 03
Dissection pan with wax Ginsberg Scientific 568859
Dissection scissors Fine Science Tools 14061-09 initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber Bioptechs 060319-2-03
Fluorescein sodium Fluka 46960
Inline solution heater Warner Instruments SH27-B
Laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20 initial dissection forceps
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Microaqueduct slide Bioptechs 130119-5
Microscope slides Fisher 12-544-3 for fluorescein slide
Microscope stage insert Applied Scientific Instrumentation I-3017
Objective heater system Okolab Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A Nikon discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective Nikon MRD01901
Potassium chloride Fisher P217
Potassium phosphate Sigma-Aldrich P0662
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium iodoacetate Sigma-Aldrich I2512
Syringe pump Sage Instruments Model 355
Tubing adapter - female Small Parts Inc. 1005109
Tubing adapter - male Small Parts Inc. 1005012
Tygon tubing Bioptechs 1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15018-10 fine scissors

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 162 अक्षीय परिवहन न्यूरोफिलमेंट फोटोएक्टिवेशन पल्स-स्प्रेड पल्स-एस्केप तंत्रिका कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी
उत्पादित माउस टिबियल नर्व में न्यूरोफिलमेंट परिवहन की इमेजिंग और विश्लेषण
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Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., … More

Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve. J. Vis. Exp. (162), e61264, doi:10.3791/61264 (2020).

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