Summary
우리는 광액성 신경필라멘트 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형질성 광섬유 마우스에서 말초 신경의 단일 골수축축에서 신경필라멘트의 축산수송을 분석하는 방법을 설명합니다.
Abstract
Neurofilament 단백질 폴리머는 일평균 ~ 0.35-3.5 mmmm의 속도로 축산 수송의 느린 성분에서 축축을 따라 움직입니다. 최근까지 이 운동의 연구는 방사성 이소토피맥 라벨링을 사용하여 가능했으며, 이는 며칠간의 시간적 해상도와 밀리미터의 공간 해상도로 전체 신경에서 축산 수송을 분석할 수 있게 해주였습니다. 더 높은 시간적 및 공간 해상도로 신경 필라멘트 수송을 연구하기 위해, 우리는 뉴런에서 광액표 GFP로 태그 신경 필라멘트 단백질 M을 표현하는 hThy1-paGFP-NFM 형질 성 마우스를 개발했습니다. 여기서우리는 이러한 마우스 ex vivo로부터의 한 골수염 축삭에서 신경필라멘트 수송을 분석하기 위해 형광활성화 펄스 탈출 및 펄스 확산 방법을 설명한다. 고립 된 신경 세그먼트는 산소식염수와 관류에 의해 현미경 단계에서 유지되고 디스크 공초점 형광 현미경 을 회전하여 이미지화됩니다. 보라색 빛은 짧은 축축절 창에서 형광을 활성화하는 데 사용됩니다. 활성화 및 측면 영역의 형광은 시간이 지남에 따라 분석되어 분 및 미크론 순서에 대한 시간적 및 공간 해상도로 신경 필라멘트 수송 연구를 허용합니다. 수학 모델링은 결과 데이터에서 속도, 방향 편향 및 일시 중지 동작을 포함하여 neurofilament 전송의 운동 매개 변수를 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 펄스 탈출 및 펄스 확산 방법은 또한 그밖 신경에 있는 신경 필라멘트 수송을 시각화하기 위하여 적응될 수 있습니다. 추가 형질 전환 마우스의 발달로, 이 방법은 또한 착상에 있는 그밖 사이토스켈레탈 및 세포경 단백질의 축축한 수송을 심상 하고 분석하기 위하여 이용될 수 있었습니다.
Introduction
신경필라멘트의 축축 전달은 1970년대에 방사성 이소성 맥박 라벨링1에의해 처음 입증되었다. 이 접근법은 생체 내에서 신경 필라멘트 수송에대한 풍부한 정보를 산출했지만, 일반적으로 밀리미터와 일의 순서에 상대적으로 낮은 공간 및 시간적 해상도를 갖는다2. 더욱이, 방사성 동위원소 펄스 라벨링은 단일 시간 과정을 생성하기 위해 여러 동물의 주사와 희생을 요구하는 간접적인 접근법이다. 1990년대에 형광성 단백질의 발견과 형광 현미경 검사법의 발전으로, 이후 초 또는 분 의 시간 척도및 서브 마이크로미터 공간 해상도로 배양 된 뉴런에서 직접 신경 필라멘트 수송을 이미지화하여 운동3의메커니즘에 훨씬 더 큰 통찰력을 제공하게되었습니다. 이러한 연구는 축축산에 신경 필라멘트 폴리머가 미세 투튜룰 모터 단백질에 의해 추진 된 마이크로 투룰 트랙을 따라 영양 및 역행 방향 모두에서 신속하고 간헐적으로 이동한다는 것을 밝혔습니다. 그러나, 신경필라멘트는 수십 나노미터에 의해 그들의 이웃에서 떨어져 일반적으로 간격을 둔 직경에 다만 10 nm의 회절 제한 구조물입니다; 따라서, 중합체는 이동 폴리머가이웃4로부터해결될 수 있도록 드물게 분산된 신경필라멘트를 포함하는 배양된 뉴런에서만 추적될 수 있다. 따라서, 골수염축산축산과 같은 풍부한 신경필라멘트 폴리머를 함유한 축축에서 단일 신경필라멘트를 추적할 수 없다.
형광 현미경을 이용한 신경필라멘트-풍부한 축산에서 신경필라멘트의 축축수송을 분석하기 위해, 배양된신경세포4,,5에서신경필라멘트의 장기 일시 중지 동작을 연구하기 위해 개발한 형광활성화 펄스-이스케이프 방법을 사용하고 있다. 광액활성 형광 성 신경필라멘트 융합 단백질로 태그된 신경필라멘트는 축종의 짧은 세그먼트에서 활성화되고, 활성화된 부위로부터의 필라멘트의 이탈 속도는 시간이 지남에 따라 형광 부패를 측정하여 정량화된다. 이 접근법의 장점은 개별 신경필라멘트 폴리머의 움직임을 추적할 필요 없이 시간 척도에 적용될 수 있는 신경필라멘트 수송의 인구 수준 분석이라는 것입니다. 예를 들어, 우리는 골수 배양6에서신경 필라멘트 수송의 운동을 분석하기 위해이 방법을 사용했다.
최근에는 인간 뉴런 특이적 Thy1 프로모터7의통제 하에 뉴런에서 paGFP 태그된 신경필라멘트 단백질 M(paGFP-NFM)의 낮은 수준을 표현하는 hThy1-paGFP-NFM 형질전환 마우스의 개발을 설명했다. 이 마우스는 형광 현미경 검사를 사용하여 시상에서 신경 필라멘트 수송의 분석을 허용합니다. 이 문서에서는, 우리는 2개의 접근을 사용하여 이 마우스에서 양철 신경의 골수화한 축소에 있는 신경필라멘트 수송을 분석하기 위한 실험적인 접근을 기술합니다. 이러한 접근법의 첫 번째는 위에서 설명한 펄스 이스케이프 방법입니다. 이 방법은 신경필라멘트의 일시 중지 동작에 대한 정보를 생성할 수 있지만 필라멘트가 활성화된 영역을 출발하는 방향으로 눈이 멀어 순 방향성 및 수송 속도8의측정을 허용하지 않는다. 이러한 접근법의 두 번째는 활성화된 영역에서형광손실뿐만 아니라 형광필라멘트가 전방 및 역행 방향으로 활성화된 영역을 떠날 때 이동하는 두 개의 측면 창에서 형광의 일시적인 증가를 분석하는 새로운 펄스 확산 방법입니다. 두 가지 접근법 모두에서 평균 속도, 순 방향성 및 일시 중지 동작과 같은 신경 필라멘트 수송의 매개 변수는 측정 창에서 형광변화의 변화에 대한 수학적 분석 및 모델링을 사용하여 얻을 수 있습니다. 그림 3은 이 두 가지 방법을 보여 줍니다.
이 프로토콜은 ImageJ9의FIJI 분포 패키지를 사용하여 획득 된 이미지에서 paGFP 형광의 신경 의 해부 및 제조, 활성화 및 이미징, 및 신경 필라멘트 수송의 정량화를 보여줍니다. 우리는 긴 (몇 cm)이며 분기하지 않기 때문에 경골 신경을 사용합니다. 그러나, 원칙적으로 paGFP-NFM을 표현하는 신경은 축축을 손상시키지 않고 해부되고 탈피될 수 있는 경우에 이 기술로 사용하기에 적합합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법은 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 신경 식염수 용액의 준비
- 브루어의 식염수100mL만들기 : 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4,1 mM MgSO4,1.5 mM CaCl2,5.6 % D-포도당, 23.8 mM NaHCO3 을 이중 증류수로 만듭니다.
- 사용 전 30분 이상 식염수 용액을 통해 95%의 산소/5%의 이산화탄소(carbogen)를 거품을 낸다. 남은 식염수는 1주일 이내에 재사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 각 사용 하기 전에 재산소 해야 합니다.
- 산소식 식염수에 60mL 주사기에 붓고 주사기에 최소한의 공기가 남아 있는지 확인합니다.
2. 신경 관류 챔버의 초기 조립
- 그림 1A에표시된 대로 주사기와 튜브를 연결하여 유출 튜브를 폐기물 플라스크에 넣습니다.
- 외부 개스킷을 관류 챔버 하우징에 배치하여 유동 입구와 콘센트 기둥이 개스킷의 구멍과 정렬되도록 합니다.
- 내부 개스킷(실리콘, 두께 100μm)을 #1.5 원형 커버슬립(직경 40mm)에 놓고 개스킷의 주름을 조심스럽게 매끄럽게 하여 단단한 밀봉을 보장합니다. 나중에 조립을 용이하게하려면 개스킷이 위를 향하도록 커버슬립과 개스킷을 종이 타월이나 작업 닦아 놓습니다.
3. 마우스 경골 신경의 해부 및 준비
- 이산화탄소 흡입 또는 다른 제도적으로 승인된 방법으로 동물을 희생하십시오. 실험은 희생7의3 시간 이내에 수행되어야하기 때문에 동물이 운동 / 호흡을 중단 할 때 타이머를 시작합니다.
- 모피를 70% 에탄올로 스프레이하고 전기 면도기로 동물의 다리와 등에서 가능한 한 많이 제거합니다.
- 큰 해부 가위를 사용하여 척추 의 중간 근처 피부에 등색 절개를하고 동물의 복부 측면 주위에 절단을 계속합니다. 이 컷부터 근육에서 부드럽게 당기고 근막을 절단하여 다리에서 피부를 천천히 반사합니다.
- 해부 트레이에 동물을 척추 위치에 놓고 네 발을 모두 고정합니다. 선택적으로 꼬리를 고정하여 움직임을 더 줄입니다.
- 미세 절 가위를 사용 하 여, 꼬리와 무릎 사이 중간 허벅지 근육에 절개를 하 고 좌 골 신경을 노출. 근육을 통해 볼 수있는 신경이 절단되지 않았는지 확인하십시오.
- 절개를 등대와 통풍구로 확장하여 근육을 제거합니다. 마찬가지로, 종아리의 근육을 제거, 신경 손상을 피하기 위해 얕고 짧은 상처를 유지.
- 신경이 완전히 발 뒤꿈치(그림 2A)에상골 신경 (무릎에서)에서 분기 지점에서 노출 될 때까지 근육을 제거합니다.
참고: 경골 신경의 해부를 포함 하 고 다음 하는 모든 단계에서, 신경에 paGFP의 가능한 부수적인 활성화를 최소화 하기 위해 주변 빛에 불필요 한 노출을 방지. - 척추 근위쪽 끝에 있는 양철 신경을 한 쌍의 집게로 잡고 미세 절 가위를 사용하여 신경을 잘라냅니다. 신경에 긴장을 두지 않도록주의하고, 근육에서 들어 올려 첨부 파일을 절단하십시오.
- 경골 신경의 척추 말단을 자르고 실온 산소식식염수의 작은 페트리 접시로 옮습니다. 절차에서이 시점에서, 항상 신경의 근위 및 말단 끝을 추적 하는 것이 확실 하다.
참고: 이 작업을 수행하는 한 가지 방법은 테이퍼가 보이도록 각진 절단으로 신경의 말단 끝을 표시하는 것입니다. - 신경의 근접 끝에서 시작하여 노출된 축축을 매우 미세한 집게로 부드럽게 잡습니다.
- 두 번째 집게를 사용하면 신경 칼집을 근교로 잡고 천천히 신경의 말단쪽으로 당깁니다. 신경 칼집은 최소한의 저항으로 축을 따라 미끄러집니다. 이 과정에서 신경에 과도한 긴장이 적용되지 않도록 하십시오.
4. 최종 신경 관류 챔버 조립
- 신경의 근위 쪽 끝을 잡고, 식염수에서 제거하고 천천히 내부 개스킷의 직사각형 개구부 내 관혈 챔버의 커버 슬립에 내려 놓고, 당신이 똑바로 누워 있도록 신경에 부드러운 긴장을 유지.
- 신경을 향한 홈이 있는 측면과 신경에 평행하게 흐르는 흐름방향으로 마이크로커덕트 슬라이드를 신경 위에 놓습니다. 커버슬립 및 마이크로커덕트 어셈블리를 뒤집어 서큐레이션 챔버 하우징 내에 배치하는 마이크로커덕슬라이드를 외부 개스킷에 배치합니다. 신경과 주변 내부 개스킷은 이제 개스킷에 의해 분리되는 커버슬립과 마이크로커덕트 슬라이드 사이에 끼워져 커버슬립(도1B)을향하고 있다.
- 금속 하우징에 배치하고 잠금 링을 회전하여 관류 챔버를 확보하십시오. 플라스틱 하우징이 모든 금속 클립 아래에 완전히 있는지 확인하고 식염수 누출을 방지하기 위해 잘 조여십시오. 과조는 미세 로크 슬라이드 또는 커버 슬립을 해독 할 수 있습니다. 커버슬립이 아래로 향하고 있도록 챔버를 뒤집습니다.
- 식염수 주사기 플런저를 천천히 우울하여 관류 챔버를 채웁니다. 설치 및 이미징 중에 입구와 콘센트 튜브, 콘센트 플라스크 및 주사기를 항상 챔버 자체 위로 올려 놓습니다. 이것은 거품을 소개하거나 챔버에 있는 부정적인 압력 때문에 초점 불안정을 일으키는 원인이 될 수 있는 사이펀을 방지합니다.
- 관류 어셈블리를 반전 된 현미경 단계로 옮기고 식염수 주사기를 주사기 펌프에 장착합니다. 0.25 mL/min의 유량에 적합한 속도로 모터를 시작합니다. 그런 다음 37°C로 설정된 인라인 용액 히터를 연결하고 켭니다.
- 객관적인 히터를 연결하고 37°C로 설정하고, 목표에 오일을 적용하고, 계열 탈산에 관류 챔버를 삽입한다.
- 챔버 히터 패드에 오일을 바르고 관류 챔버에 부착하십시오. 연결 및 챔버 히터를 켭니다. 37 °C로 설정합니다.
참고: 온도의 변화로 인해 용액의 가스유출로 인해 관혈챔버에서 기포가 형성될 수 있다. 거품이 형성되면 거품이 챔버를 지울 때까지 용액 유량을 5-10배 증가시면 잠시 증가합니다. - 관류 챔버를 무대 어댑터에 잠그고 목표 오일을 챔버 밑면의 커버슬립과 접촉합니다.
참고: 여기에 사용되는 ASI 단계 어댑터가 있는 Bioptechs 챔버는 반전된 현미경 구성을 위해 설계되었습니다.
5. 형광 활성화 및 이미지 수집
- 밝은 필드 조명을 사용하여, 커버 슬립 표면에 가장 가까운 신경의 하단 표면에 축축의 층에 초점(도 2B). 골수화 축축(일반적으로 성인 마우스의 직경 1 -6 μm)은 명암 칼집의 존재에 의해 식별될 수 있으며, 이는 대조 향상 없이 밝은 필드 전달 광 조명 아래에서 볼 수 있다. 슈미트 란터만갈라의 갈라진 갈라진 부분과 랜비어의 노드도 쉽게 드러나고 있습니다. 미켈라인축축은 더 가느다란(일반적으로 & 1 μm 직경)이며 일반적으로 번들(Remak 번들)에 존재하며, 일반적으로 서로 해결하기에는 너무 가깝게 양치되어 있습니다.
- 현미경에서 사용할 수 있는 경우, 타임랩스 이미징의 과정을 통해 초점을 유지하기 위해 자동 초점 시스템을 활성화.
- 밝은 필드 참조 이미지를 획득합니다. 이미지와 관련하여 신경의 방향(척추 근위및 단부 끝)을 기록합니다.
- 488nm 레이저와 paGFP(예: 525/50 nm)에 적합한 방출 필터를 사용하여 공초점 이미지를 획득하여 표백제 전 자동 불발성을 기록합니다. 레이저 전력을 낮게 유지하여 광표백을 최소화하고, 노출 시간이 그에 따라 조정되어 희미한 신호를 감지합니다. 예를 들어, 대표적인 데이터는 5% 레이저 전력과 4s 노출로 획득되었습니다. 향후 모든 실험에서 사용할 획득 설정을 기록합니다.
참고: 포토활성화 후 이상적인 이미징 설정은 20개의 이미지 동안 원래 신호의 25% 미만의 신호 대 잡음 비율 > 8 및 광표백을 생성합니다. 축축은 또한 우리가 원래 했던 것처럼 와이드 필드 epifluorescence 현미경 검사법에 의해 심상될 수 있습니다7,그러나 화질은 공초점의 부족 때문에 열등할 것입니다. - 레이저 전력을 약 5배의 일반 이미징 전력으로 설정하고 노출 시간으로 3-4분의 노출 시간으로 이미지를 획득합니다. 필수적지는 않지만, 이 단계는 배경 신호를 줄이고 광활성화 형광의 신호 대 노이즈를 최대화하기 위해 자동 형광 및 원치 않는 형광의 다른 소스를 표백하는 것이 좋습니다.
- 이 표백 단계 후 사전 활성화 자동 형광을 기록하기 위해 5.4 단계에서 사용되는 설정으로 이미지를 획득합니다.
- 브라이트필드 이미지에서 원하는 활성화 창 크기와 동일한 길이의 축축에 평행선을 그립니다. 이 창의 길이는 실험 목표 및 매개 변수에 따라 다르지만, 일반적인 길이는 펄스 이스케이프 패러다임에 대한 5 μm, 펄스 확산 패러다임의 경우 40 μm입니다.
- 이 선을 가이드로 사용하여 축축에 수직으로 시야를 가로질러 직사각형 관심 영역(ROI)을 그립니다. 영역은 광활성화할 모든 축축을 포함해야 합니다.
- 405 nm 조명으로 포토활성화를 위한 최적의 설정을 결정합니다.
참고: 첫 번째 실험 활성화 전에 이 단계와 하위 단계만 수행합니다. 실험 을 진행하는 동안 동일한 포토활성화 설정을 사용해야 합니다.- 405 nm 레이저 라인, 저레이저 전력(예를 들어, 5%), 픽셀 거주 시간(예: 40 μs) 및 1펄스를 사용하여 관심 영역을 반복적으로 활성화하여 각 활성화 후 활성화된 GFP 형광의 이미지를 획득한다. 형광이 더 이상 증가하지 않는 때까지 반복한 다음 각 이미지에 대한 관심 영역에서 형광을 정량화합니다.
- 펄스 수 대 평균 형광 강도를 플롯합니다. 활성화를 위한 최적의 펄스 수로 형광이 더 이상 증가하지 않는 펄스 수를 선택합니다.
- 405nm 광으로 패턴 난관에 의해 5.8단계에서 그려진 영역을 paGFP 형광을 활성화한다. 활성화 직전에 바로 다음에 이미지를 획득해야 합니다.
참고: 이상적인 paGFP 활성화는 ROI 내에 포함된 선명한 경계가 있는 명확하게 정의된 형광 영역을 생성합니다. - 활성화가 완료되면 1분 타이머를 시작합니다. 1분 후, 타임랩스 시리즈를 시작하세요.
참고: paGFP11의광활성화 에 따라 관찰되는 형광의 증가를 허용하기 위해 1분 지연이 필요하다. 펄스 확산 방법의 경우, 30초 타임랩스 간격을 가진 5-10분 획득 기간은 속도와 방향성을 측정하기 위해 중앙 및 측면 창의 초기 경사를 측정하기에 충분합니다. 펄스 이스케이프 방법의 경우, 5분 또는 10분 의 타임랩스 간격으로 30-150분의 획득 기간을 통해 필라멘트의 장기 일시 중지 동작에 대한 분석을 허용합니다. - 획득한 모든 이미지와 형광 활성화에 사용되는 ROI를 저장합니다.
- 신경의 새로운 영역으로 이동하고 단계를 반복 5.1-5.11. 새로운 영역이 동일한 축축을 따라 있는 경우, 다른 활성화 된 지역에서 이동형 신경 필라멘트의 검출을 피하기 위해 이전에 활성화 된 영역에서 적어도 500 μm이어야한다. 최종 타임랩스 의 획득은 3시간 기간이 끝나기 전에 완료되어야 합니다.
참고: 3시간 이상 준비가 가능할 수 있지만, 이를 확인하지 는 않았습니다. 숙련된 해부와 준비를 통해 이 3시간 기간 내에 5~8개의 10분 타임랩스 이미지 세트를 획득할 수 있습니다. - 최종 타임랩스 이미지 시리즈를 획득한 후, 식염수의 흐름을 멈추고 용액및 챔버 히터를 분리하고 현미경 단계에서 관류 장치를 제거한다.
6. 플랫 필드 및 암필드 이미지 수집
- 250 mg의 형광 분말을 0.5mL의 이중 증류수에 추가하여 형광액을 만듭니다. 눈에 보이는 입자가 없을 때까지 섞고 탁상 원심분리기에서 30초 동안 용액을 회전하여 용해되지 않은 물질을 침전시합니다. 이 용액은 광 노출로부터 보호되는 경우 4 °C에서 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.
- 8 μL의 형광용액을 슬라이드에 넣고 #1.5 커버슬립을 적용합니다. 여분의 액체를 블롯하고 매니큐어로 밀봉하고 건조시키십시오.
참고: 이 고농도에서, 형광염염의 강한 흡수는 용액 내에서 조명 빔을 소화하여, 급속한 확산교환(12)으로인해 균일하고 광표백에 강한 커버슬립 의 표면에 형광의 얇은 평면을 생성한다. - 형광 슬라이드 커버슬립 측을 반전 된 현미경 단계에 놓고 커버 슬립의 표면에 형광의 얇은 평면에 초점을 조정합니다. 슬라이드 를 이동하여 기포 (어두운 반점) 또는 큰 형광 입자 (밝은 반점)가 없는 시야를 찾습니다.
- 0.2 μm 간격으로 6 μm에 달하는 z 스택을 획득하여 중간 이미지가 원래 초점 평면입니다. 형광이 매우 밝기 때문에 짧은 노출 시간 (예를 들어, 40 ms)을 사용합니다. 이 z 스택 획득은 커버 슬립이 거의 완벽하게 수평되지 않으며 형광의 평면이 매우 좁기 때문에 시야를 가로 질러 최대 형광을 포착하는 데 필요합니다. 총 25개의 시야 필드에 대해 반복하여 스테이지를 필드 사이의 모든 방향으로 최소 20 μm로 이동합니다.
- 카메라 셔터를 포함한 모든 라이트 패스 셔터를 닫고 레이저 출력과 노출 시간을 0으로 설정합니다. 이러한 설정으로 100개의 이미지 스택을 획득합니다. 이러한 이미지는 어두운 전류와 카메라 칩의 바이어스 오프셋을 보정하는 데 사용되는 암필드 이미지를 생성하는 데 평균됩니다.
참고: 스트리밍 수집은 이러한 이미지를 캡처하는 이상적인 방법입니다.
7. 표백제 교정을 위한 글리코리티 억제 신경을 이미징
- 1단계에서와 같이 식염수 용액을 만들고 산소화하십시오. 그러나 D-포도당을 위한 2-deoxy-D-포도당을 대체하고당화분해(13)를억제하기 위해 0.5mM 나트륨 요도아세테이트를 첨가한다. 우리는 이것을 "억제식염"이라고 부릅니다.
- 10-30분 타임랩스 이미지가 5.11 단계로 설정된 억제식염을 사용하여 2-5단계를 반복합니다. 신경 필라멘트 수송의 완전한 억제를 보장하기 위해 이미징 전에 억제 식염수의 적용 후 40-50 분을 허용합니다.
참고: 글리코리스틱 억제는 결국 축축을 죽여서 일반적으로 약 30분 동안 데이터를 획득하는 억제 후 시간의 좁은 창이 있습니다. 대사 억제의 수준을 나타내는 지표는 축삭 미토콘드리아의 플라빈 자동 형광이며, 이는 우리가 paGFP형광(14)을이미지화하는 데 사용하는 긴 노출로 인해 타임랩스 시리즈에서 검출될 수 있다. 전형적으로, 미토콘드리아 자가형광은 억제식염수로 치료하는 동안 증가할 것이다. 미토콘드리아가 반올림하거나 단편화되기 시작하면 이미징을 중단하십시오.
8. ImageJ를 이용한 이미지 처리 및 분석
- 플랫필드 및 암필드 보정
- 이미지를 클릭하여 암필드 이미지 스택을 열고 이미지를 평균 | 스택 | Z 프로젝트 및 드롭다운 메뉴에서 평균 강도를 선택하여 암필드 이미지를 생성합니다.
- 형광 평면장 이미지 스택을 열고 이미지를 클릭하여 각(총 25개)의 최대 강도 투영을 만듭니다 | 스택 | Z 프로젝트 및 드롭다운 메뉴에서 최대 강도를 선택합니다.
- 결과 25개의 최대 투영 이미지를 하나의 스택에 결합하여 이미지를 클릭 | 스택 | 스택할 이미지입니다. 이미지를 클릭하여 이 스택의 평균 강도 투영을 만듭니다 | 스택 | Z 프로젝트 및 드롭다운 메뉴에서 평균 강도를 선택하여 플랫필드 이미지를 생성합니다.
- 프로세스를 클릭하여 평평한 필드 이미지에서 암필드 이미지를 빼내다 | 이미지 계산기,작업으로 빼기를 선택합니다. 32비트(플로트) 결과 옵션을 선택합니다. 결과는 수정된 플랫필드 이미지입니다.
- 먼저 클릭하여 수정된 플랫필드 이미지의 평균 픽셀 강도를 측정 | 측정값을 설정하고 평균 회색 값 상자를 확인한 다음 'm' 키를 누른 다음 누를 수 있습니다.
- 프로세스를 클릭하여 수정된 플랫필드 이미지를 평균 강도로 나눕니다 | 수학 | 7.1.5 단계에서 얻은 평균 회색 값을 나누고 입력합니다. 이렇게 하면 역이득 이미지가 생성됩니다.
- 타임랩스 이미지 스택과 함께 사전 활성화 및 사후 활성화 이미지를 엽니다. 이미지를 클릭하여 이미지를 단일 스택으로 결합 | 스택 | 도구 | 드롭다운메뉴에서 이미지를 연대순으로 선택합니다. 4D 이미지로 열기 옵션이 선택되지 않았는지 확인합니다. 결과 스택은 전체 이미지 집합입니다.
- 전체 이미지 세트에서8.1.4 단계를 반복한 다음 프로세스를 클릭하여 역게인 이미지로 결과를 나눕니다 | 이미지 계산기 및 분할을 작업으로 선택합니다. 이렇게 하면 각 이미지가 조명 분야와 검출기에서 균일하지 않은 것에 대해 수정된 수정된 전체 이미지 집합이생성됩니다.
- 이미지 스택 정렬
- 스테이지 또는 샘플 드리프트로 인해 타임랩스 시리즈의 이미지 평면 의 정렬 불량을 수정하려면 플러그인을 클릭하여 고정 지역플러그인(보충 파일 1)으로 정렬을 설치 | 플러그인을 설치,플러그인 파일을 포함하는 폴더로 탐색하고 플러그인을 선택합니다. 플러그인을 설치 한 후 ImageJ를 다시 시작합니다.
참고 :이 플러그인은 "최소 사각형 congealing"원칙15에따라 이미지를 정렬합니다. - 여러 축축에 걸쳐 각 축축 내의 활성화된 형광의 근위 및 단면 경계를 넘어 확장되지 않는 보정된 전체 이미지 세트에 ROI를 그립니다. 영역의 형상은 중요하지 않습니다.
- 플러그인을 클릭하여 정렬 플러그인을 실행 | 고정 된 영역에 의해 정렬. 플러그인은 프레임 사이의 변위에 기본 2 픽셀 최대값을 배치하지만 샘플의 상당한 드리프트가있는 경우 초기 팝업 창에서 조정할 수 있습니다. 선형은 이미지 스택의 크기에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 정렬된 스택을 시각적으로 검사하여 정렬 품질을 평가합니다. 자동화된 정렬이 프레임 간의 형광의 큰 변동에 대해 잘 작동하지 않을 수 있기 때문에 일부 프레임을 수동으로 정렬해야 할 수 있습니다. 이미지를 클릭하여 이동해야 하는 프레임을 보면서 이 작업을 수행할 수 있습니다| 변환 | 번역. 전체 스택을 번역해야 하는지 여부를 묻는 다음 팝업에서 아니요를 클릭합니다. 번역에서 정수 픽셀 값만 사용하고 픽셀 강도의 리샘플링으로 인해 일부 픽셀 이동 또는 보간이 데이터를 변경하므로 드롭다운 보간 메뉴가 없음으로설정되어 있는지 확인합니다.
- 정렬된 전체 이미지 집합으로 저장합니다.
- 스테이지 또는 샘플 드리프트로 인해 타임랩스 시리즈의 이미지 평면 의 정렬 불량을 수정하려면 플러그인을 클릭하여 고정 지역플러그인(보충 파일 1)으로 정렬을 설치 | 플러그인을 설치,플러그인 파일을 포함하는 폴더로 탐색하고 플러그인을 선택합니다. 플러그인을 설치 한 후 ImageJ를 다시 시작합니다.
- 형광 강도 의 측정
- 활성화 된 영역의 한 가장자리를 따라 첫 번째 팔로 정렬 된 전체 이미지 세트의 첫 번째 프레임에 각도 도구를 사용하여 ROI를 그립니다, 축삭에 수직, 두 번째 팔 수직. 'm' 키를 눌러 시야의 축축의 방향을 설명하는 각도를 측정합니다.
- 분석/축소를 클릭하여 치수를 미크론으로 측정할 수 있도록 이미지의 배율을 설정 | 배율을 설정하고 적절한 값을 입력합니다.
- 분석 을 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다 | 도구 | ROI 매니저. 펄스 탈출 패러다임의 경우 8.3.7 단계로 건너뜁니다. 펄스 확산의 경우 8.3.4 단계를 계속합니다.
- 차원의 사각형 ROI를 그린 다음 편집을 클릭 | 선택 | 를 지정합니다. 배율 조정된 단위 옵션을 확인한 다음 ROI를 15μm 너비와 이미지 높이와 같거나 큰 높이로 설정합니다.
- 편집을 클릭하여 8.3.1 단계에서 측정된 각도로 ROI를 회전 | 선택 | 회전하여 축삭에 수직으로 만들고 활성화 된 영역의 근접 가장자리를 따라 ROI를 한쪽으로 놓습니다. 이 ROI를 추가하면 't' 키를 눌러 관리자에게 근위 가이드 ROI라고 합니다.
- ROI를 드래그하여 활성화된 영역의 단면 모서리에 맞춰 't' 키를 눌러 ROI 관리자에 다시 추가합니다. 우리는 이것을 단상 가이드 ROI라고 부를 것입니다. 근위 및 단부 가이드 ROI는 측면 측정 ROI를 그리는 데 나중에 사용됩니다.
- 위의 5.11 단계에서 획득한 타임랩스 이미지 시퀀스를 사용하여 정량화를 위해 축축을 선택합니다. 이 이미지 시퀀스는 축축의 약한 자동 불발성을 캡처하여 활성화 된 영역 외부에서 자신의 형태를 드러내기 때문에이 목적을 위해 유용합니다.
참고: 다음 기준을 충족하지 않는 축축수는 분석에서 제외됩니다.- 축축은 모든 측정 창의 전체 길이를 따라 초점을 맞추어야 합니다.
- 축축은 활성화 영역의 근해 및 단부 끝에 수직으로 5° 이내여야 합니다.
- 축축은 활성화 영역의 근위 및 단부 끝의 5μm 이내에 질이 없어야합니다.
- 이미징 과정에서 모양을 눈에 띄게 변경하는 축삭을 제외합니다.
- 이는 축착이 죽을 때 발생하는 활성형 형광의 확산 분산을 나타내기 때문에 사후 활성화이미지(도 2C,아래)에서 이산 활성화 영역의 부재에 의해 입증된 바와 같이 건강에 해로운 것처럼 보이는 축축을 제외한다.
- 축선 내의 자동 형광 구조물에 대해 5.5 단계에서 장노출 표백 이미지를 관찰하십시오. 이 형광은 미토콘드리아16내의 플라빈으로 인한 것이다. 이러한 미토콘드리아가 둥글거나 단편화된 경우 분석에서 축축을배제(도 2D,하단), 확장, 선형 구조(도2D,위), 이대사 감소의 표시로.
- 위에 생성된 근해 및 단층 가이드 ROI를 사용하여 분석되는 축축당 3개의 측정 ROI를 그립니다: 40 μm 활성화 영역 내의 축축을 포괄하는 중앙 창, 그리고 측면 창 15 μm ROI에 의해 구속된 너비가 있는 두 개의 측면 창과 활성화 영역의 축축의 직경에 의해 구속된 높이. ROI 관리자에 세 영역을 모두 추가합니다. 글리코리티억제축의 경우, 활성 영역의 중간에 5 μm 이하의 폭이 없고 축축외부로 확장되지 않는 단일 영역을 그립니다. 펄스 이스케이프 패러다임의 경우 활성화된 영역은 폭이 5μm에 불과하므로 전체 창을 사용해야 합니다.
- 8.3.7 단계 및 8.3.8 단계의 기준을 충족하는 모든 축에 대해 8.3.9 단계를 반복하십시오.
- 분석 을 클릭하여 활성 측정을 평균 픽셀 강도로 설정 | 측정값을 설정하고 평균 회색 값 옵션을 선택합니다. 다른 측정 옵션을 선택하지 않도록 합니다.
- 창을 선택하고 'Ctrl' + 'a'를 눌러 ROI 관리자 창의 모든 ROI를 선택합니다. ROI 관리자 창에서 더 많은 것을 클릭 | 형광 강도를 측정하기 위한 다중 측정값. 추가 분석을 위해 결과 창에서 스프레드시트에 데이터를 복사합니다.
- 분석 을 클릭하여 지역 영역으로 활성 측정 설정 | 측정값을 설정하고 영역 옵션을 선택합니다. 다른 측정 옵션을 선택하지 않도록 합니다.
- 반복 단계 8.3.12. 영역이 시간에 따라 달라지지 않으므로 해당 영역에 대한 결과의 행 을 복사하기만 하면 됩니다.
9. 포토블리치 수정
- 글리코리티 억제축을 위한 데이터 스프레드시트에서, 주어진 ROI에 대해 프레임 3(첫 번째 타임랩스 프레임)에서 시작하는 각 프레임의 평균 형광으로부터 프레임 1(사전 활성화 프레임)의 평균 형광을 빼는다. 결과는 배경 빼기 수단입니다.
- 데이터를 프레임 번호가 abscissa로 사용하여 분산플롯으로 플롯합니다. Ae-bx의 형태로 방정식과 각 ROI (대부분의 스프레드 시트 프로그램이이 기능을 가지고)의 데이터에 지수 추세선을맞춥니다. 이 방정식은F0이 타임랩스의 첫 번째 프레임에서 형광인 광표백 함수 Ft = F0 *e-tɣ, ɣ 지수 표백 속도, t는 시간이며, e는 천연 로가릿베이스이다.
- 반복 단계 9.1.1-9.1.2 글리코리티 억제 신경에서 모든 축종의 모든 ROI에 대 한. 광표백 속도의 가장 정확한 추정을 위해, 적어도 5 개의 분리된 신경에서 총 15개의 축축을 사용하십시오. 모든 억제축축에서 기하급수적 표백속도(ɣ)의 평균을 사용하여 광표백을 위한 실험 데이터를 수정한다. photo표백은 이미지 획득 설정과 시간이 지남에 따라 변경될 수 있는 레이저 전원에 따라 달라지므로 각 실험 이나 연구에 대해 새로운 표백 보정을 수행해야 합니다.
- 정상 식염수로 이미지된 축축의 모든 영역에 대해 9.1.1을 반복합니다(즉, 글리코리티로 억제되지 않음).
- 각 데이터 포인트를전자-tɣ나누어 t에 대한 시간과 9.1.3 단계에서 발견되는 평균 ɣ 사용합니다. 이들은 포토블리치 수정 수단입니다.
- 관심 영역의 각 데이터 점을 곱하여 각 영역에서 각 영역의 총 형광을 찾을 수 있습니다.
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Representative Results
그림 3은 펄스 이스케이프 및 펄스 확산 실험의 대표적인 이미지를 보여줍니다. ,우리는 펄스 탈출 방법과 그 데이터5,,6,,7,8,17의분석을위한 우리의 방법을 사용하여 얻은 데이터를 설명하는 여러 연구를 발표했다.8 아래에서 펄스 확산 데이터가 이전에 보고하지 않은 neurofilament 전송의 방향성 및 속도에 대한 정보를 얻을 수있는 방법을 보여줍니다.
축절의 신경 필라멘트 수송은 간헐적이고 양방향입니다. 이 수송은 선행 및 역행 방향에서 주어진 시간에 이동하는 필라멘트의 분수에 의해 설명 될 
수있다, 각각, 그리고 선행 및 역행 방향에서 자신의 속도, 에 의해 표시 
및 
. 축삭의 단위 길이당 신경필라멘트 폴리머의 총 양을 
섭취하면, 주어진 부위를 통해 전방 및 역행 방향의 유동을
및
,
각각, 총 플럭스는 
,
단위 μm-1이있는경우 
단위가 있으며 
단위가 
있습니다. 축삭을 따라 지정된 위치에서 플럭스는 시간의 단위로 그 위치를 지나 이동하는 신경필라멘트 폴리머의 양이기 때문에, 이를 통해 평균 속도와 관련이 
있다. 따라서, 우리는 쓸 수 있습니다
.
펄스 확산 실험에서 플럭스는 우리가 중앙 창으로 지칭하는 활성화된 지역에서 형광 신경필라멘트의 이탈 속도로부터 결정될 수 있다. 초당 이 중앙 창에서 형광 신경필라멘트 폴리머의 총 
손실은 형광 신경필라멘트 폴리머로 인한 손실의 합계로 인해 전방 및 역행 방향으로 떠나는 것입니다.
중앙 창에서 형광 신경필라멘트 폴리머의 초기 함량으로 정규화, 
즉, 
중앙 창의 길이는 어디에, 이 손실 속도는 그러면 된다
중앙 창에서 형광감소의 경사는 8로 주어진 기간 동안 처음에 
8선형이다. 40 μm 중앙 창의 경우 이는 수십 초에 불과합니다. 그러나, 윈도우의 경우 이 큰, 기하급수적 붕괴 단계로의 전환은 점진적이며 경사는 몇 분 이상8에대해 효과적으로 선형된다.
초기에 측면 창은 이 필라멘트가 측면 창을 통과하여 다른 쪽에서 빠져나갈 충분한 시간이 없기 때문에 중앙 창을 나가는 모든 신경 필라멘트를 캡처합니다. 이 경우, 중앙 창을 초당 영양및 역행하게 떠나는 형광 신경필라멘트 폴리머의 양은, 즉 플럭스와, 
신경필라멘트 
함량의 증가와 측면 창에 의해 
주어진다. 중앙 창에서 형광 신경필라멘트 폴리머의 초기 함량으로 정규화되고, 측면 창의 증가율은
근위및 탈실 측면 창에서 형광이 증가하는 경사면은 각각 이다.
따라서 측면 창의 경사면에서 평균 속도를 표현할 수 있습니다.
(Eq. 1)
및 이러한 슬로프의 비율의 관점에서 이동 신경 필라멘트의 안과 및 역행의 수의 비율, 즉.
(Eq. 2)
어디 
및 
신경 필라멘트가 격렬하게 이동하고 그 반대의 경우도 마찬가지8에anterogradely에서 역방향되는 비율을 나타냅니다. 상기 값은 
배양된 뉴런에서 개별 신경필라멘트의 움직임을 측정하여 결정될 수 있으며, 이전에 보고된 바와 같이17. 중요한 것은, Eq.1의 속도에 대한 발현은 형광 신경필라멘트가 측면 창으로 들어가지만 떠나지 않는 활성화 후 짧은 시간에만 적용됩니다. 이 짧은 시간 창의 기간은 측면 창의 길이와 신경 필라멘트 운동의 운동에 따라 달라집니다. 측면 창이 길어지며 원칙적으로 시간 창이 길어집니다. 이론적으로, 하나는이 기준이 확인하여 충족되는 것을 테스트 할 수 있습니다
(Eq. 3)
측면 창의 경사의 차이에 의해 주어진 Eq. 1의 속도 표현과는 달리, Eq.2의 방향성에 대한 표현은 측면 창 의 비율에 의해 주어지기 때문에 측면 창 크기에 견고하다.
도 3는 C57Bl/6J 배경의 hThy1 paGFP-NFM 라인에서 8주 된 수컷 마우스의 티비알 신경에서 골수화 축축에 대한 맥박 탈출 및 펄스 확산 실험의 대표적인 결과를 각각 5 및 40 μm의 창 크기를 사용하여 보여줍니다. 적어도 2 주의 생쥐, 남성과 여성 모두, 이러한 실험 적인 패러다임에 대 한 사용 되었습니다. 적절한 연령과 성별은 연구에서 테스트되는 것에 따라 연구원에 의해 결정되어야합니다. 시간이 지남에 따라, 활성화 된 영역의 가장자리는 전방 및 역행 방향 모두에서 신경 필라멘트의 이탈로 인해 흐리게, 중앙 창에서 형광의 손실의 결과로 볼 수 있습니다.
펄스 이스케이프방법(도 3A, C, E)의경우, 활성화된 영역에서형광 부패 역학은 장기 및 단기 일시 중지 동작8,,18에대한 정보를 얻을 수 있다. 이러한 실험의 경우 활성화된 영역이 짧을 수 있습니다(일반적으로 5μm를 사용하며 그림 3A에서노란색 상자를 참조하십시오). 펄스 확산방법(도 3B, D, F)의경우, 형광 신경필라멘트의 더 큰 풀을 제공하기 위해 더 긴 활성화 영역(40 μm, 도 3B의노란색 상자 참조)을 사용합니다. 이렇게 하면 측면 영역의 형광 증가가 선형으로 유지되는 시간이 길어집니다(위 참조). 측면 창의 이 형광 증가의 선형 도메인은 이러한 창의 길이를 증가시킴으로써 증가할 수 있지만, 이는 시야의 크기에 의해 제한됩니다. 그림 3D에표시된 데이터에 대해 빨간색과 녹색으로 표시된 15 μm 측면 창을 사용했습니다.
도 3E,3F는 도 3C,3D에 각각 도시된 측정 창에 대한 총 형광 강도(즉, 픽셀 Figure 3강도의 합)의 정량화를 나타낸다. 펄스 이스케이프 방법의 경우 부패는 양성이며, 초기 지수 붕괴는 궤도 신경 필라멘트의 이탈을 나타냅니다. 이는 오프트랙 필라멘트8의동원과 이탈을 나타내는 두 번째 느린 지수 붕괴로 약 10-20분 간 전환됩니다. 펄스 확산 방법과 비교하기 위해 도 3E에서12분 의 시간 코스만 표시하지만, 일반적으로 분석의 시간 과정은 장기 일시 중지 운동5,,6,,18을캡처하는 데 더 길어야 한다(일반적으로 30-120분). 펄스 확산 전략의 경우 이동속도와 방향성의 계산은 측면 창의 경사면에만 의존합니다. 여기에 사용된 창 길이의 경우 선형 위상은 약 5분 동안 연장됩니다. 선형의 이 시간 창의 기간은 경사를 측정하는 데 사용되는 시간을 점진적으로 단축하고 경사가 더 이상 증가하지 않는 지점을 결정하여 평가되어야 합니다. 이 기간은 카메라 시야가 허용하는 경우 창 길이를 늘려서 늘릴 수 있지만 지정된 실험에서 모든 축에 대해 창 길이를 일정하게 유지해야 합니다. 예를 들어, 우리는 그림 3F에서펄스 확산 데이터에 대한 경사를 측정하기 위해 데이터의 처음 5 분을 사용했다. 이로 인해 A.U./min 72개, -594 A.U./min, 근교, 중앙 및 단면 창의 경우 111AU./min(A.U. = 임의 단위)의 경사면이 생성됩니다. 이러한 값을 정상화하기 위해 중앙 창의 초기 형광으로 나누어 0.108 %F0/min, -0.962 % F0/min 및 0.173 % F0/min. Eq를 적용하면 보존 기준이 충족되지 않는다는 것을 알 수 있습니다. 이것은 우리의 EMCCD 카메라 (82 μm x 82 μm)의 시야로 인해 기술적 한계입니다. 훨씬 더 큰 시야를 가질 수 있는 sCMOS 칩이 있는 카메라는 더 큰 측면 창 크기를 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리는 중앙과 측면 경사 사이의 이러한 불일치가 적어도 부분적으로, 측면 창의 긍정적 인 경사를 과소 평가하고 중앙 창의 음극을 과대 평가하는 효과가있을 것이다 광표백의 범위 (토론 참조)의 정도를 과소 평가할 수 있다는 가능성을 배제 할 수 없다.
위 쪽의 점(%F 0/min)과 Eq.2의0 
속도에서, 및 
17의값을 사용하여, 우리는 비율 = 
2.12를 계산합니다. 이것은 필라멘트의 68%가 영양을 움직이고 32% 역행했다는 것을 나타냅니다. 위의 동일한 요금 및 Eq.1을 사용하여 평균 순 인구 속도 
= 40 *(0.00173-0.00108) = 0.026 μm/min 또는 0.037 mm/day를 계산합니다. 유사한 연령의 마우스에 있는 방사성 동위원소 맥박 라벨링 연구는 2센티미터19,20의거리에 걸쳐 0.12 mm/day로 둔화되는 sciatic 신경의 가장 근접한 부분에서 대략 0.6 mm/day의 신경필라멘트 인구 속도를보고했습니다. 우리의 펄스 확산 데이터는 경골 신경에서 수집되었습니다, 대략 다른 2-3 센티미터 이러한 조치에 해반. 위에서 언급 한 이유로, 우리는 0.037 mm/일의 추정이 진정한 속도의 과소 평가라고 생각합니다. 그러나, 방사성이소피토피소 펄스 라벨링에 의해 관찰된 공간 둔화를 추정하는 것은 이 추정치가 불합리하지 않으며, 특히 매우 다른 공간 및 측두적인 규모에 대해 매우 다른 방법론을 사용하여 결정되었다고 생각할 때.
집단 간의 상당한 차이를 감지하는 펄스 확산 방법의 능력을 입증하기 위해 정상 및 억제제 식염수로 퍼진 신경에서 측정된 근위 및 탈경 측면 창 경사를 비교했습니다. 글리코리시스의 억제는 신경필라멘트의 움직임을 차단합니다, 우리는 이전에 보고한 바와 같이5,,6,,7. 우리는 나중에 실험을 위한 견본 크기의 선택을 토론할 것입니다, 그러나 여기에서 우리는 억제 도중 신경 당 1개의 취득 필드의 한계 때문에, 정상 식염수에 있는 1개의 신경 및 2를 억제식염에 이용했습니다. 도 4A는 글리코리티 억제 신경으로부터의 예시 타임랩스를 나타내며, 활성화된 영역으로부터의 수송의 명백한 감소를 나타낸다. 실제로, 우리는 상당히 낮은 탈구 및 근위 경사면을 찾을(그림 4B,p = 0.00000639 및 0.0121, 각각, 투키의 쌍별 비교 다음 ANOVA) 신경에 대 억제식염으로 처리 된 그 정상 식염수와 함께 perfused. 우리는 또한 이 두 조건 사이의 인구 속도의 현저한 감소를 찾습니다(그림 4C,p = 0.0232, t-테스트는 p = 0.0190과 동일한 분산에 대한 F 테스트에 따라).
그림 1: 관혈 챔버. (A)식염수 주사기 및 폐기물 플라스크에 연결된 튜브가 있는 관류 챔버 하우징 및 외부 개스킷의 조립을 보여주는 다이어그램. (B)챔버 자체의 어셈블리를 보여주는 다이어그램. 내부 개스킷은 #1.5 커버슬립 위에 평평하게 놓여 있습니다. 신경은 내부 개스킷의 직사각형 개구부에 의해 생성된 우물의 커버슬립에 놓입니다. 마이크로 커덕슬라이드는 #1.5 커버슬립과 마이크로커덕트 슬라이드 사이의 신경을 끼우기 위해 신경 위에 배치된다. 마지막으로, 샌드위치는(A)에표시된 어셈블리의 외부 개스킷 위에 장착하기 전에 뒤집혀 잠금 링(표시되지 않음)으로 고정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 경골 신경 준비. (A)글루테우스 피상증, 이두근, 세미텐디노스우스, 포플라이트, 티비알리스 코달리스 및 굴곡 디지토리스 긴 근육이 제거된 마우스의 다리 내에서 양골 신경의 위치를 보여주는 이미지가 제거되었다. 양철 신경은 무릎에 발생하는 상시 신경의 세 가지 주요 가지 중 하나로 볼 수 있습니다. (B)조립된 챔버의 단면에서 신경의 회로도, 커버슬립 아래에 오일 침지 목표를 표시한다. 최고의 광학 품질은 커버슬립의 표면에 압정된 축축물의 층을 활성화하고 이미징함으로써 얻어진다. 이미지 품질은 빛 산란으로 인해 신경 속으로 더 깊이 떨어집니다. (C)활성화 직후 건강한 축축(위)과 건강에 해로운 축소(아래)의 예. 파선된 노란색 선은 활성화된 영역을 표시합니다. 활성화된 형광은 건강한 축전에서 날카로운 경계를 가지는 반면, 건강에 해로운 축전에서 활성화된 형광은 활성 영역에서 급속히 확산되어 몇 초 내에 축소를 채웁니다. 스케일 바 = 10 μm. (D)건강한 축사(위)와 건강에 해로운 축(아래)에서 미토콘드리아 외관의 예. 미토콘드리아는 플라빈 자동불발성(16)으로인해 볼 수 있다. 그들은 건강한 축록소에서 선형 (솔리드 화살표 헤드)으로 나타납니다. 건강에 해로운 축에서 미토콘드리아는 먼저 천점 (열린 화살촉)이된 다음 시간이 지남에 따라 희미해져 축소 건강의 지표를 제공합니다. 건강한 축소의 파선 오픈 화살촉은 선형에서 천점으로 전환되는 미토콘드리온으로 가리킵니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 펄스 이스케이프 및 펄스 확산 실험. (A)펄스-이스케이프 실험 및(B)펄스 확산 실험에서 8주 된 마우스의 티비알 신경에서 골수축의 사전 활성화, 사후 활성화 및 타임랩스 이미지의 예. 사전 활성화 이미지는 아래 활성화 후 이미지와 함께 맨 위 패널입니다. 타임스탬프는 활성화 후 경과된 시간을 표시합니다. 노란색 상자는 활성화된 영역을 나타냅니다. 이러한 활성화는 40 μs 픽셀 거주 시간과 5 % 레이저 전력으로 5 스캔을 사용하여 수행되었습니다. 스케일 바 = 10 μm. (C)펄스 탈출 실험에서 3개의 축록에 대한 측정 ROI(노란색). (D)맥박 확산 실험에서 3개의 축축에 대한 근접성(빨강), 중앙(노랑) 및 탈단(녹색) 측정 ROI. 각 축록에 대한 측정 ROI는 솔리드 레드(근접), 솔리드 옐로우(중앙 창) 및 솔리드 그린(말단 창)으로 표시됩니다. (E)C.대시 라인에서 3축의 평균형광의 평균은 이전에 설명된 바와 같이Ft =Ae-θt,이전에 설명된 바와 같이, 평균 형광및 시간, 3축의 평균은 데이터에 적합한 지수 함수이다. F) 중앙, 단산 및 근위 ROI 대 시간, D의 3개의 축록을 포함하여 14개의 축록스의 평균에서 형광의 플롯. 경사는 처음 5분 동안 의 데이터로 적합한 추세선에서 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대사 억제제가 신경필라멘트 수송에 미치는 영향. (A)글리코리시스를 억제하고 세포 ATP를 고갈시키기 위해 5.6%(w/v) 2-데옥시-포도당 및 0.5 mM 나트륨 요이오도아세테이트로 전처리된 신경의 타임랩스 이미지의 예. 활성화 된 영역의 단부 및 근위 경계는 신경 필라멘트 수송의 억제를 나타내는 날카로운 남아있다. 스케일 바 = 10 μm.(B)경사면의 정량화는 실재(D)와 근위(P) 측면 창(각각 선행 및 역행)에서 의 정량화, 중앙 창에서 초기 형광의 백분율로 표현(%F0/min),하나의 신경(14 축) 에서 표준 식염수및 두 신경(8축)에서 혈당을 억제한다. (C)측면 창의 경사면에서 경사면에서 계산된 신경필라멘트 인구 속도는 억제제 치료 후 속도의 현저한 감소를 나타낸다. - p & 0.005; ** - p & 0.01; * - p & 0.05. 데이터는 억제제의 존재에 신경 필라멘트 수송의 중요한 손상을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
주로 평평한 필드 보정, 이미지 정렬 및 표백제 교정 중에 후처리 중에 오류가 발생할 가능성이 크므로 펄스 이스케이프 및 펄스 확산 실험의 분석에 주의를 기울여야 합니다. 평지 보정은 조명의 비 균일성을 보정하는 데 필요하며, 이로 인해 중심에서 주변까지 시야 를 가로질러 강도가 떨어집니다. 비균일성의 정도는 파장에 의존하므로, 항상 실험 데이터를 획득하는 데 사용되는 파장에서 수행되어야 한다. 플랫 필드 이미지의 비 균일성이 보정할 이미지의 비 균일성을 진정으로 대표하도록 하는 것이 중요합니다. 펄스 확산 실험은 측정 ROI가 강도 하락이 가장 큰 이미지 의 주변쪽으로 확장되기 때문에 부적절한 평면 필드 보정에서 오류에 특히 취약합니다.
최적의 paGFP 활성화 설정은 활성화 방법 및 레이저 매개 변수에 따라 다르며 첫 번째 이미징 세션 전에 경험적으로 결정되어야 합니다. 너무 적은 활성화는 활성화 된 형광에 대한 낮은 신호 대 잡음 비율을 초래할 것이다, 반면 너무 많이 활성화 된 형광의 표백을 초래할 것이다 활성화 된 paGFP 모두 보라색 빛에 의해 흥분 될 수 있기 때문에. 이미지에 대한 관심 영역을 선택적으로 조명하기 위해 대표 결과에 표시된 것처럼 선명한 경계가 있는 명확하게 정의된 형광 영역을 생성하는 Andor FRAPPA 레이저 갈보 스캐너를 사용합니다. 우리는 또한 디지털 마이크로 미러 장치인 안도르 모자이크 디지털 다이어프램을 사용하여 성공을 거두었으며, 수은 아크 램프를 조명 소스7로사용했습니다. 다른 옵션은 상업적으로 사용할 수 있습니다. paGFP로 작업할 때 도전은 포토활성화 단계 후 1분 이내에 발생하는 형광 강도의 지연된 증가입니다. 이러한 증가는 보라색 빛으로 조명이 활성화된 paGFP 분자의 비율을 일으켜 수십 초11의시간 코스에서 다시 휴식을 취할 수 있는 "어두운 상태"를 입력하기 때문에 발생합니다. 우리의 경험에서, 증가는 일반적으로 5% 미만넓은 필드 흥분하지만 레이저 여기와 함께 20 %를 초과 할 수 있습니다, 이는 활성화 형광의 중요한 과소 평가로 이어질 수 있습니다. 포토활성화 후 1분 후 paGFP 형광의 두 번째 "사후 활성화" 이미지를 획득한 다음 이 이미지를 후속 타임랩스의 기준점으로 사용하여 이를 설명합니다. 그러나, 이것은 초기 에 초기 형광 및 부패 운동학을 결정하는 오류의 또 다른 잠재적인 근원을 소개한다는 것을 인식하는 것이 중요합니다.
이미지 스택의 정렬에 추가주의를 기울여야 합니다. 정렬 불량의 주요 원인은 타임랩스 이미지 수집 중에 시편의 드리프트 또는 기타 이동입니다. 이것은 적당한 두께의 내부 개스킷을 사용하고 화상 진찰 의 앞에 "정착"하는 준비를 허용하여 최소화될 수 있습니다. 그러나 이러한 지연은 준비에 실행 가능성이 제한된 기간이 있기 때문에 이미지 수집에 사용할 수 있는 시간을 줄입니다. 이러한 프로시저가 이미지의 픽셀 강도를 다시 샘플링하기 때문에 이미지를 왜곡하거나 하위 픽셀 시프트를 도입하는 정렬 알고리즘을 방지하는 것도 중요합니다. 펄스 확산 실험은 활성화된 형광 영역의 경계가 상대적으로 날카롭기 때문에 부적절한 정렬에서 발생하는 오류에 특히 취약하며, 이 영역의 형광은 측면 비활성화 된 영역보다 현저히 높다. 스택에 있는 이미지 평면의 약간의 정렬조차도 말단 및 근위 측정 창에서 형광 값에 큰 점프를 초래할 수 있습니다. 따라서 분석을 진행하기 전에 이미지 집합을 올바르게 정렬하고 신중하게 검사해야 합니다.
광표백에 대한 보정은 시간이 지남에 따라 형광 강도의 변화가 형광 단백질의 양 변화를 정확하게 반영하도록 하는 데 필요합니다. 이러한 수정은 중앙 및 측면 창에서 절대 형광 강도를 추정하는 데 중요한 오류 의 원인이 될 수 있습니다. 광표백 운동학은 조명의 강도와 불소소의 환경에 따라 달라지므로 실제 광표백 속도는 세션과 축축에서 축창까지 다를 수 있습니다. 따라서 여러 축축을 측정하고 결과 데이터를 평균화해야 하며, 이는 그 자체로 약간의 오류가 발생합니다. 위에서 설명한 접근법은 혈당 억제제로 신경을 치료한 다음 관심 영역에서 형광을 활성화하고 시간이 지남에 따라 형광 강도의 손실을 추적하는 것이다. 글리코리스틱 억제제는 ATP를 고갈시키고 따라서 형광의 손실이 전적으로 광표백으로 인해 활성화 된 부위에서 신경 필라멘트의 움직임이 아닌 신경 필라멘트 수송을 억제합니다. 이러한 방식으로 결정된 평균 표백 운동제는 실험 데이터를 수정하는 데 사용됩니다. 각 이미징 세션에서 별도의 표백 보정을 수행하는 것이 실용적이지 않기 때문에 몇 주 동안 확산되는 여러 세션에 단일 교정을 적용해야 합니다. 이 방법의 단점은 레이저 전력 /조명 강도의 변화를 매일 고려하지 않는다는 것입니다. 우리가 "본질적인 표백 보정"이라고 부르는 대안접근법은, 수송 측정에 사용되는 동일한 타임랩스 영화에서 활성화 된 영역의 중심에 있는 형광을 정량화하여 광표백을 추정하는 것입니다. 이 측정 영역이 중앙에 위치하고 활성화 된 영역의 길이보다 훨씬 짧은 경우, 그리고 짧은 시간에 측정 영역에서 이동하는 형광 신경 필라멘트는 그 것으로 이동하는 형광 신경 필라멘트로 대체됩니다. 그러나, 시간이 지남에 따라 축축물의 비형광 영역을 측면으로 이동에서 측정 영역으로 이동 비 형광 신경 필라멘트의 확률이 증가, 표백으로 인한 형광의 손실의 과대 평가로 이어지는. 이러한 접근법의 장점은 동일한 분야 내의 표백 특성에 대해 보정하지만, 시간 창의 지속 시간을 경험적으로 결정해야 하며 활성화 된 영역의 길이뿐만 아니라 수송 속도에 따라 달라지는 단점이 있습니다. 이 모든 것을 말한 바와 같이, 우리의 방법을 사용하여 신경필라멘트 수송의 방향성의 추정은 표백 오류 (측면 창 크기에 대한 것과 같이) 그것은 측면 창의 경사의 비율에 의해 주어지기 때문에 모든 표백 보정은 계산에서 분자및 분모모두에 적용되는 승수이기라는 점에 유의해야합니다.
형광 시스템에 내재된 노이즈와 상술한 이미지 후처리 단계에서 추가 오차가 발생할 수 있으므로 충분한 통계적 전력을 위해 큰 샘플 크기를 사용하는 것이 중요합니다. 실험 전에 인구 수단, 편차 및 효과 크기를 정확하게 결정할 수는 없지만 중간 효과 크기와 0.05의 알파를 가정하는 Cohen메서드(21)를 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 코헨의 d결과,이는 그룹 당 적어도 105 개의 샘플을 획득하는 것을 건의하는 0.5의 두 집단의 풀로 풀린 표준 편차로 나눈 수단의 차이입니다. 이 임계값에 도달하면 실제 인구 측정에 비추어 통계력을 재평가하기 위해 사후 전원 분석을 수행할 수 있습니다. 최적의 실험 조건하에서, 활성화당 1-7개의 분석 가능한 축축(총 축록새 9-20개 중)과 활성화당 10분 타임랩스를 획득한다고 가정할 때 신경당 5-8활성화를 얻을 수 있어야 한다.
미토콘드리아 또는 소포를 대상으로 형광 융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 마우스는 또한 말초 신경 에서 메브란성 세포기관의 축삭 수송을 연구하는 데 사용되어 왔다 ex vivo22,,23,,24,,25. 또한, 스키아보 연구소는 형광 태그테상풍 독소 조각을 사용하여 생체 내 축산에서 비틀거림을 이동하는 축축아 수송을 이미지화하는 접근법을 개발하여 근육에 주입할 수 있고 모터 신경단자(26)에의해 채택된다. 그러나, 음골 세포기관은 형광 현미경 검사법에 의해 이 축삭에서 해결될 수 있기 때문에, 타임랩스 또는 kymograph 분석을 사용하여 그들의 운동의 속도 그리고 주파수를 직접 분석할 수 있다. 여기에 설명된 펄스 탈출 및 펄스 확산 방법은 단일 신경필라멘트를 해결할 수 없는 이 축축에서 신경필라멘트 수송의 운동학을 분석하는 특정 목표를 가지고 개발되었습니다. 이를 위해서는 몇 분 또는 수십 분 동안 인구 수준 분석이 필요합니다. 우리는 이러한 목적을 위해 형질전환 마우스를 사용하지만, 바이러스 성 전염 또는 자궁 전기 기화와 같은 방법을 사용하여 광액 활성 단백질을 표현할 수도 있어야합니다. 초점은 신경 필라멘트 수송 인 동안, 펄스 탈출 및 펄스 확산 방법은 축산 수송의 느린 구성 요소에 축하를 따라 수송되는 그밖 사이토스켈레탈 및 세포경 단백질의 운동을 연구하기 위하여 또한 적응될 수 있습니다. 우리는 그들의 크기와 myelin 칼집이 우리가 그들의 이웃에서 그들을 해결할 수 있기 때문에 myelinated 축축에 우리의 분석을 제한. 작은 구경과 Remak 번들에 클러스터되는 경향으로 인해 미켈라인 축축을 해결할 수 없습니다. 우리는 티비알 신경 ex vivo의 사용을 설명하지만 방법은 충분히 길고 (>5 mm) 및 분기되지 않은 다른 말초 신경에도 적용되어야합니다. 원칙적으로, 생체 내에서 neurofilament 수송을 이미지하기 위해 이러한 방법을 적응할 수 있어야합니다 (예를 들어, 수술로 진정 된 마우스에 신경을 노출한 다음 현미경 단계에 마우스를 배치함으로써).
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 공초점 현미경 검사법과 정경 신경 해부와 박사 아츠코 우치다, 클로이 듀거와 사나 차한데 마우스 축산에 대한 도움을 폴라 몬스마에 감사드립니다. 이 작품은 A.B에 공동 국가 과학 재단 보조금 IOS1656784에 의해 부분적으로 지원되었다. 그리고 IOS1656765 에 P.J., 및 건강 보조금 R01 NS038526, P30 NS104177 및 S10 OD010383 에 A.B. N.P.B. 오하이오 주립 대학 총장의 박사 후 학자 프로그램에서 펠로우십에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe - Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil - type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter - female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter - male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
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