Summary
Fotoaktive nörofilament proteinini ifade eden transgenik farelerden periferik sinirlerin tek miyelinli aksonları içinde nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemlerini tanımlıyoruz.
Abstract
Nörofilament protein polimerleri aksonal taşımanın yavaş bileşeninde aksonlar boyunca ~0.35-3.5 mm/gün ortalama hızlarda hareket eder. Yakın zamana kadar yerinde bu hareketin çalışma sadece radyoizotopik darbe etiketleme kullanarak mümkün oldu, hangi gün bir zamansal çözünürlük ve milimetre bir mekansal çözünürlük ile tüm sinirlerde aksonal taşıma analizi sağlar. Yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlük ile yerinde nörofilament taşıma çalışma için, nörofilament protein M nöroniklerde fotoaktivabl GFP ile etiketlenmiş ifade eden bir hThy1-paGFP-NFM transgenik fare geliştirdi. Burada floresan fotoaktivasyon darbe kaçış ve nabız-spread yöntemleri bu fareler ex vivotibial sinirlerin tek miyelinli akson nörofilament taşıma analiz etmek için açıklar. İzole sinir segmentleri oksijenli salin ile perfüzyon ile mikroskop aşamasında korunur ve dönen disk konfokal floresan mikroskop mikroskopile görüntülenir. Mor ışık kısa bir aksonal pencerede floresan etkinleştirmek için kullanılır. Aktive ve yan bölgelerdefloresan zaman içinde analiz edilir, dakika ve mikron sırasına göre zamansal ve mekansal çözünürlük ile nörofilament taşıma çalışma izin, sırasıyla. Matematiksel modelleme hız, yön önyargı ve ortaya çıkan verilerden duraklama davranışı da dahil olmak üzere nörofilament taşıma kinetik parametreleri ayıklamak için kullanılabilir. Nabız kaçış ve nabız yayma yöntemleri de diğer sinirlerde nörofilament taşıma görselleştirmek için adapte edilebilir. Ek transgenik farelerin geliştirilmesi ile, bu yöntemler de görüntü ve akson diğer sitoskelet ve sitosolik proteinlerin aksonal taşıma analiz etmek için kullanılabilir.
Introduction
Nörofilamentlerin aksonal nakli ilk kez 1970'lerde radyoizotopik nabız etiketleme1ile gösterilmiştir. Bu yaklaşım in vivonörofilament taşıma hakkında bilgi zenginliği vermiştir , ama nispeten düşük uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahiptir, genellikle milimetre ve gün sırasına göre en iyi2. Ayrıca, radyoizotopik darbe etiketleme enjeksiyon ve tek bir zaman ders oluşturmak için birden fazla hayvan kurban gerektiren dolaylı bir yaklaşımdır. 1990'larda floresan proteinlerin keşfi ve floresan mikroskopi deki gelişmelerle, daha sonra nörofilament naklini doğrudan kültürlü nöronlarda saniye veya dakika lık bir zaman ölçeğinde ve mikrometre altı uzamsal çözünürlükte görüntülemek mümkün hale geldi ve hareketmekanizmasınaçok daha fazla fikir kazandırdı 3 . Bu çalışmalar, aksonların nörofilament polimerlerinin mikrotübül motor proteinleri tarafından itilen mikrotübül parçaları boyunca hem anterograd hem de retrograd yönlerde hızlı ve aralıklı olarak hareket ettiğini ortaya koymuştur. Ancak, nörofilamentler genellikle nanometre sadece onlarca tarafından komşularından ayrı aralıklı olan çapı sadece 10 nm kırınım sınırlı yapılardır; bu nedenle, polimerler sadece hareket eden polimerler komşularından çözülebilir böylece seyrek dağıtılmış nörofilamentler içeren kültürlü nöronlar izlenebilir4. Bu nedenle, miyelinatlı aksongibi bol nörofilament polimerler içeren aksonlarda tek nörofilamentleri takip etmek günümüzde mümkün değildir.
Floresan mikroskopisi kullanarak nörofilament açısından zengin aksonların nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için, kültürlü sinir hücrelerindeki nörofilamentlerin uzun süreli duraklama davranışını incelemek için geliştirdiğimiz floresan fotoaktivasyon darbe kaçış yöntemini kullanıyoruz4,5. Fotoaktibl floresan nörofilament füzyon proteini ile etiketlenen nörofilamentler akson kısa bir segmentte aktive edilir, ve daha sonra aktive bölgeden bu filamentlerin ayrılma oranı zaman içinde floresan çürüme ölçülerek ölçülür. Bu yaklaşımın avantajı, tek tek nörofilament polimerlerin hareketini izlemek için gerek kalmadan dakika veya saat bir zaman ölçeğinde uygulanabilir nörofilament taşıma bir nüfus düzeyinde analizi olmasıdır. Örneğin, miyelinating kültürlerde nörofilament transport kinetik analiz etmek için bu yöntemi kullandık6.
Son zamanlarda, insan nöron spesifik Thy1 organizatörü kontrolü altında nöronlarda bir paGFP etiketli nörofilament protein M (paGFP-NFM) düşük seviyelerde ifade bir hThy1-paGFP-NFM transgenik fare gelişimini anlattı7. Bu fare floresan mikroskopisi kullanarak yerinde nörofilament taşıma analizine izin verir. Bu makalede, bu farelerden gelen tibial sinirlerin miyelinli aksonları nörofilament naklini analiz etmek için deneysel yaklaşımları iki yaklaşım la açıklıyoruz. Bu yaklaşımlardan ilki yukarıda açıklanan darbe kaçış yöntemidir. Bu yöntem nörofilamentlerin duraklama davranışı hakkında bilgi üretebilir, ancak filamentlerin aktive edilen bölgeden ayrıldığı yöne kördür ve bu nedenle net yön ve taşıma hızının ölçülmesine izin vermez8. Bu yaklaşımların ikincisi, sadece aktive bölgeden gelen floresan kaybını değil, aynı zamanda floresan filamentlerin aktive edilen bölgeden hem anterograd hem de retrograd yönlerde hareket ettikleri iki yan penceredeki floresan geçici artışı da analiz ettiğimiz yeni bir nabız yayma yöntemidir. Her iki yaklaşımda da ortalama hız, net yönlülük ve duraklama davranışı gibi nörofilament taşıma parametreleri matematiksel analiz ve ölçüm pencerelerinde floresan değişikliklerin modelalınması ile elde edilebilir. Şekil 3 bu iki yaklaşımı göstermektedir.
Bu protokol, imageJ9'unFIJI dağıtım paketini kullanarak elde edilen görüntülerden sinirin diseksiyonunu ve hazırlanmasını, paGFP floresansının aktivasyonu ve görüntülenmesi ve nörofilament taşınmasının niceliğini göstermektedir. Kaval siniri uzun (birkaç cm) olduğu ve dallanmadığı için kullanıyoruz; ancak, ilke olarak paGFP-NFM ifade eden herhangi bir sinir aksonlar zarar vermeden diseksiyon ve de-sheathed olabilir eğer bu teknik ile kullanmak için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Sinir saline çözeltisinin hazırlanması
- Breuer'in tuzlu10 10mL'sini yapın : 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,5 mM CaCl2, %5.6 D-glukoz, 23.8 mM NaHCO3 çift distile suda.
- Kabarcık 95% oksijen / 5% karbondioksit (carbogen) kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca tuzlu çözelti ile. Artık tuzlu bir hafta içinde yeniden kullanılabilir; ancak, her kullanımdan önce reoxygenated olmalıdır.
- Oksijenli tuzlu eti 60 mL'lik şırınganın içine dökün ve şırıngada minimum hava kaldığından emin olun.
2. Sinir perfüzyon odasının ilk montajı
- Şırıngayı ve tüpü Şekil 1A'dagösterildiği gibi bağlayın ve çıkış tüpünü bir atık şişesine yerleştirin.
- Dış contayı perfüzyon odası gövdesine yerleştirin, akış giriş ve çıkış direklerinin contadaki deliklerle hizalanmasını sağlar.
- İç contayı (silikon, 100 μm kalınlığında) #1,5 dairesel bir kapak fişinin üzerine (40 mm çapında) koyarak contadaki kırışıklıkları dikkatlice düzelterek sıkı bir conta sağlayın. Daha sonra montaj kolaylaştırmak için, bir kağıt havlu veya görev mendil üzerinde conta yukarı bakacak şekilde kapak ve conta yerleştirin.
3. Diseksiyon ve fare tibial sinir hazırlanması
- Karbondioksit teneffüs veya başka bir kurumsal onaylı yöntem ile hayvan Kurban. Hayvan hareket / nefes durur zaman bir zamanlayıcı başlatın, deneyler sadece kurban 3 saat içinde yapılmalıdır7.
- % 70 etanol ile kürk sprey ve bir elektrikli jilet kullanarak hayvanın bacakları ndan mümkün olduğunca çıkarmak ve geri.
- Büyük diseksiyon makas bir çift kullanarak, omurganın ortasına yakın deride bir dorsal kesi yapmak ve hayvanın ventral yönü etrafında kesim devam. Bu kesimbaş, yavaş yavaş yavaşça kas uzak çekerek ve fasya keserek bacaklardan deri yansıtın.
- Bir diseksiyon tepsisi üzerinde bir supine pozisyonda hayvan yerleştirin ve dört pençeleri pin. İsteğe bağlı olarak daha fazla hareketi azaltmak için kuyruk pin.
- Mikrodiseksiyon makas kullanarak, siyatik sinir ortaya çıkarmak için kuyruk ve diz arasında orta uyluk kasları bir kesi yapmak. Kas yoluyla görülebilen sinirin kesilmediğinden emin olun.
- Kas kaldırmak için kesi dorsally ve ventrally genişletin. Benzer şekilde, buzağı kasları kaldırmak, sinir zarar önlemek için kesikler sığ ve kısa tutmak.
- Tibial sinir tamamen siyatik sinir dalları noktadan kadar kasları çıkarın (dizde) topuk(Şekil 2A).
NOT: Tibial sinirin diseksiyonu da dahil olmak üzere ve aşağıdaki tüm adımlarda, sinirpaGFP olası tesadüfi aktivasyonu en aza indirmek için ortam ışığına gereksiz maruz kalmaktan kaçının. - Bir çift forceps ile omurga-proksimal ucunda tibial sinir kavramak ve mikrodiseksiyon makas bir çift kullanarak sinir kesti. Sinir üzerinde gerginlik koymak değil dikkat, kas uzak kaldırın, herhangi bir ekleri kesme.
- Tibial sinirin omurga-distal ucunu kesin ve oda sıcaklığında oksijenli salin küçük bir Petri kabına transfer. Prosedürde bu noktadan itibaren, her zaman sinirproksimal ve distal biter takip etmek emin olun.
NOT: Bunu yapmanın bir yolu, konik görünür gibi açılı bir kesim ile sinirdistal ucunu işaretlemektir. - Sinirproksimal ucundan başlayarak, yavaşça çok ince uçlu büşre bir çift ile maruz akson biter kavramak.
- Forceps ikinci bir çift ile, proksimally sinir kılıfı kavramak, ve yavaş yavaş sinir distal sonuna doğru çekin. Sinir kılıfı en az direnç ile akson boyunca slayt olacaktır. Bu işlem sırasında sinire gereksiz gerginlik uygulanmadığından emin olun.
4. Son sinir perfüzyon odası montajı
- Sinirin proksimal ucunu kavrayarak, tuzlu dan çıkarın ve yavaş yavaş iç conta dikdörtgen açılış içinde perfüzyon odasının coverslip üzerine yatıyordu, düz yatıyor böylece sinir üzerinde hafif gerginlik koruyarak.
- Mikroakemer slaytı sinirin üzerinde, sinirlere bakan oluklu tarafı ve sinire paralel akış yönü ile yerleştirin. Kapak ve mikroakemer tertibatını ters çevirin ve dış contaya yerleştirilen mikroakemer kaydırağı ile perfüzyon odası gövdesine yerleştirin. Sinir ve çevreleyen iç conta şimdi coverslip ve conta ile ayrılır mikroakemer slayt arasında sıkışmış olacak, coverslip yukarı bakacak şekilde(Şekil 1B).
- Perfüzyon haznesini metal gövdeye yerleştirerek ve kilitleme halkasını döndürerek sabitleyin. Plastik gövdenin tüm metal klipslerin tamamen altında olduğundan emin olun ve tuzlu su sızıntısını önlemek için iyice sıkın. Aşırı sıkma mikroakemer slayt veya coverslip çatlamak olabilir. Odayı ters çevirin ki kapak kayması aşağı bakacak şekilde.
- Perfüzyon odasını doldurmak için tuzlu şırınga pistonuna yavaşça bastırın. Kurulum ve görüntüleme sırasında giriş ve çıkış borusu, çıkış şişesi ve şırıngayı her zaman odanın üzerinde tutun. Bu, kabarcıklar tanıtmak veya odasında negatif basınç nedeniyle odak istikrarsızlık neden sifon önler.
- Perfüzyon tertibatını ters bir mikroskop aşamasına aktarın ve tuzlu şırıngayı şırınga pompasına monte edin. 0,25 mL/dk akış hızı için motoru uygun bir hızda çalıştırın. Ardından 37 °C'ye ayarlanmış sıralı solüsyon ısıtıcıyı bağlayın ve açın.
- Nesnel ısıtıcıyı bağlayın ve 37 °C'ye ayarlayın, hedefe yağ uygulayın ve perfüzyon odasını sahne montajına takın.
- Oda ısıtıcı pedyağı uygulayın ve perfüzyon odasına takın. Oda ısıtıcısını bağlayın ve açın; 37 °C olarak ayarlanır.
NOT: Sıcaklıktaki değişiklikler çözeltinin gaz dan sıcağa bağlı olarak perfüzyon odasında kabarcıkların oluşmasına neden olabilir. Kabarcıklar oluşursa, kabarcıklar oda temizleyin kadar kısaca 5-10x tarafından çözelti akış hızını artırmak. - Perfüzyon odasını sahne adaptörüne kilitleyin ve nesnel yağı odanın alt tarafındaki kapak kaymasıyla temas ettirin.
NOT: Burada kullanılan ASI stage adaptörü ile Bioptechs odası ters mikroskop yapılandırması için tasarlanmıştır.
5. Floresan aktivasyonu ve görüntü edinimi
- Parlak alan aydınlatması kullanarak, kapak yüzeyine en yakın sinirin alt yüzeyindeki akson tabakasına odaklanın(Şekil 2B). Miyeline aksonlar (genellikle yetişkin farelerde çapı 1 -6 μm) kontrast geliştirme olmadan brightfield iletilmiş ışık aydınlatması altında görülebilir bir miyelin kılıf varlığı ile tespit edilebilir. Schmidt-Lanterman yarıkları ve Ranvier düğümleri de kolayca belirgindir. Miyelinated aksonlar daha incedir (genellikle <1 μm çapında) ve genellikle demetler halinde (Remak demetleri) bulunurlar ve genellikle birbirlerinden çözülemeyecek kadar yakın dırlar.
- Mikroskopta varsa, zaman atlamalı görüntüleme boyunca odaklanmayı sürdürmek için otomatik odaklama sistemini etkinleştirin.
- Brightfield referans görüntüsü elde edin. Sinirin yönünü (omurga-proksimal ve distal uçlar) görüntülerle ilgili olarak kaydedin.
- Çamaşır suyu öncesi otofloresansı kaydetmek için 488 nm lazer ve paGFP 'ya (örn. 525/50 nm) uygun bir emisyon filtresi kullanarak bir konfokal görüntü edinin. Fotobeyaztasyonen aza indirmek için lazer gücünü düşük tutun, pozlama süresi soluk sinyali algılamak için buna göre ayarlanır. Örnek olarak, temsili veriler %5 lazer gücü ve 4 s pozlama ile elde edildi. Gelecekteki tüm denemelerde kullanılmak üzere edinme ayarlarını kaydedin.
NOT: Fotoaktivasyondan sonra ideal görüntüleme ayarları bir sinyal-gürültü oranı > 8 ve 20 görüntü boyunca orijinal sinyalin %25'inden daha azını fotobeyaztlama sağlayacaktır. Aksonlar da biz başlangıçta7yaptığı gibi geniş alan epifloresan mikroskopisi ile görüntülenebilir , ama görüntü kalitesi konfokalitif eksikliği nedeniyle düşük olacaktır. - Lazer gücünü yaklaşık 5 kat normal görüntüleme gücüne ayarlayın ve 3-4 dakikalık pozlama süresine sahip bir görüntü elde edin. Gerekli olmasa da, bu adım arka plan sinyalini azaltmak ve böylece fotoaktik floresan sinyal-gürültü maksimize etmek için otofloresan ve istenmeyen floresan diğer kaynakları ağartmak için tavsiye edilir.
- Bu ağartma adımından sonra etkinleştirme öncesi otomatik floresans kaydetmek için adım 5.4'te kullanılan ayarlarla bir görüntü edinin.
- Brightfield görüntüsünde, aksonlarla paralel, istenilen etkinleştirme penceresi boyutuna eşit uzunlukta bir çizgi çizin. Bu pencerenin uzunluğu deneysel hedefe ve parametrelere bağlı olarak değişir, ancak tipik uzunlukları darbe kaçış paradigması için 5 μm ve darbe yayılımı için 40 m'dir.
- Bu satırı kılavuz olarak kullanarak, aksonları dik görüş alanına dikdörtgen bir ilgi alanı (ROI) çizin. Bölge fotoaktif olması için tüm aksonları kapsamalıdır.
- 405 nm aydınlatma ile fotoaktivasyon için en uygun ayarları belirleyin.
NOT: Yalnızca bu adımı ve ilk deneysel etkinleştirmeden önce alt adımları gerçekleştirin. Deneme boyunca aynı fotoaktivasyon ayarları kullanılmalıdır.- 405 nm lazer hattı, düşük lazer gücü (örn. %5) ve piksel çalışma süresi (örn. 40 μs) ve bir darbe kullanarak tekrar tekrar ilgi çekici bir bölgeyi etkinleştirin ve her aktivasyondan sonra aktif GFP floresanının görüntüsünü elde edin. Floresan artmadan tekrarlayın ve her görüntü için ilgi çekici bir bölgede floresan miktarını ölçün.
- Ortalama floresan yoğunluklarını nabız sayısına karşı çizin. Aktivasyon için en uygun darbe sayısı olarak floresan artık artar sonra darbelerin sayısını seçin.
- 405 nm ışık ile desenli uyarma ile adım 5.8 çizilen bölge paGFP floresan etkinleştirin. Etkinleştirmeden hemen önce ve etkinleştirmeden hemen sonra görüntü nün elde edilmesini sağlayın.
NOT: İdeal paGFP aktivasyonu, YGI'de yer alan keskin sınırlara sahip, açıkça tanımlanmış bir floresan bölgesi üretecektir. - Etkinleştirme sona ererken 1 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın. 1 dakikasonunda, bir timelapse serisi nin edinimi başlar.
NOT: PaGFP11fotoaktivasyonu sonrasında gözlenen floresan artışı için 1 dakikalık gecikme gereklidir. Nabız yayma yöntemi için, 30 saniyelik zaman atlamalı aralıklarla 5-10 dakikalık bir kazanım periyodu, hız ve yönlülüğü ölçmek için merkezi ve yan pencerelerdeki ilk yamaçların ölçümü için yeterlidir. Darbe kaçış yöntemi için, 5 veya 10 dakikalık zaman atlamalı aralıklarla 30-150 dakikalık bir kazanım süresi filamentlerin uzun süreli duraklama davranışının analizine izin verir - Floresan aktivasyonu için kullanılan Yatırım Getirisi'nin yanı sıra elde edilen tüm görüntüleri kaydedin.
- Siniryeni bir bölgeye taşıyın ve adımları 5.1-5.11 tekrarlayın. Yeni bölge aynı akson boyunca ise, diğer aktif bölgeden hareket eden floresan nörofilamentlerin tespitini önlemek için daha önce aktive edilen bölgeden en az 500 μm olmalıdır. Son zaman atlamalı edinme 3 saatlik pencerenin bitiminden önce bitirmelidir.
NOT: Hazırlık 3 saatten daha uzun süre uygulanabilir olabilir, ancak biz teyit değil. Yeterli diseksiyon ve hazırlık ile, beş ila sekiz arasında 10 dakikalık timelapse görüntü setleri bu 3 saatlik pencere içinde elde edilebilir. - Son timelapse görüntü serisi elde edilip, tuzlu su akışını durdurun, çözelti ve oda ısıtıcıları kesmek ve mikroskop aşamasından perfüzyon cihazı çıkarın.
6. Düz alan ve darkfield görüntü edinimi
- 0,5 mL çift distile suya 250 mg floresan tozu ekleyerek floresan çözeltisi yapın. Görünür parçacıklar olmayana kadar karıştırın ve çözünmemiş herhangi bir malzemeyi tortulamak için bir masa üstü santrifüjde 30 saniye boyunca çözeltiyi döndürün. Bu çözelti, ışığa maruz kalma durumunda 4 °C'de birkaç ay saklanabilir.
- Bir slayta 8 μL floresan çözeltisi ekleyin ve #1,5 kapak kaydırın. Fazla sıvıyı temizleyin, oje ile kapatın ve kurumasını bekleyin.
NOT: Bu yüksek konsantrasyonda, floresan boyanın güçlü emilimi çözelti içindeki aydınlatıcı Kirişi söndürür ve kapak yüzeyinde hem düzgün hem de hızlı difüzör değişimi nedeniyle fotobeyaznmeye karşı dayanıklı ince bir floresan düzlemi üretir12. - Floresan slayt kapağını ters mikroskop aşamasına aşağı doğru yerleştirin ve kapağın yüzeyindeki ince floresan düzlemine odaklanın. Hava kabarcıkları (koyu noktalar) veya büyük floresan parçacıkları (parlak noktalar) içermeyen bir görüş alanı bulmak için slaytetrafında hareket ettirin.
- Orta daki görüntünün orijinal odak düzlemi olması için 0,2 μm aralıklarla 6 μm'lik bir z yığını edinin. Floresan çok parlak olacağından kısa pozlama süresi (örn. 40 ms) kullanın. Bu z-stack edinimi, kapak kayma nadiren mükemmel yatay ve floresan floresan düzlemi çok dar olduğu gibi görüş alanı boyunca maksimal floresan yakalamak için gereklidir. Bunu toplam 25 görüş alanı için tekrarlayın ve sahneyi alanlar arasında herhangi bir yönde en az 20 m hareket ettirin.
- Kamera deklanşörü de dahil olmak üzere tüm ışık yolu panjurlarını kapatın ve lazer gücünü ve pozlama süresini sıfıra ayarlayın. Bu ayarlarla 100 resim yığını edinin. Bu görüntüler karanlık akım ve kamera çipi üzerinde önyargı ofset düzeltmek için kullanılacak darkfield görüntü oluşturmak için ortalama olacaktır.
NOT: Akış edinimi bu görüntüleri yakalamak için ideal bir yoldur.
7. Görüntüleme glikolitik çamaşır suyu düzeltme için sinirlerin inhibe
- Adım 1'deki gibi tuzlu çözelti yapmak ve oksijenvermek; ancak D-glukoz yerine 2-deoksi-D-glukoz ve glikoliz inhibe etmek için 0.5 mM sodyum iyodoasetat ekleyin13. Biz buna "inhibitör tuzlu" olarak adlandırıyoruz.
- 10-30 dakikalık timelapse görüntü adım 5.11 ayarlanmış, inhibitör tuzlu kullanarak adımları 2-5 tekrarlayın. Nörofilament taşımatam inhibisyonu sağlamak için görüntüleme den önce inhibitör tuzlu uygulamadan sonra 40-50 dakika bekleyin.
NOT: Glikolitik inhibisyon sonunda aksonları öldürecek, böylece inhibisyondan sonra dar bir zaman penceresi vardır ve bu da genellikle yaklaşık 30 dakika veri elde etmek için. Metabolik inhibisyon düzeyinin bir göstergesi aksonal mitokondri flavin otofloresans, biz paGFP floresan1 görüntü için kullandığımız uzun pozlama nedeniyle timelapse serisi tespit edilebilir14. Tipik olarak, mitokondriyal otofloresans inhibitör tuzlu ile tedavi sırasında artacaktır. Mitokondri toparlamaya veya parçalanmaya başlarsa, görüntülemeyi durdurun.
8. ImageJ kullanarak görüntü işleme ve analiz
- Düz alan ve darkfield düzeltme
- Darkfield görüntü yığınını açın ve Resim'i tıklatarak görüntüleri ortalamanız | Yığınlar | Z Project ve darkfield görüntüsünü oluşturmak için açılır menüde Ortalama Yoğunluk seçilir.
- Floresan flatfield görüntü yığınlarını açın ve Resim ' e tıklayarak her birinin (toplam 25) maksimum yoğunluklu projeksiyonu oluşturun | Yığınlar | Z Project ve açılan menüde Max Intensity'yi seçme.
- Resim | Yığınlar | Yığıngörüntüler. Resim ' e tıklayarak bu yığının ortalama yoğunluk projeksiyonu oluşturun | Yığınlar | Z Projesi ve düz alan görüntüsünüoluşturmak için açılan menüden Ortalama Yoğunluk seçilir.
- İşlem 'e tıklayarak darkfield görüntüsünü düz alan görüntüsünden çıkarma | Görüntü Hesap Makinesi, işlem olarak Çıkarma'yı seçer. 32 bit (float) sonuç seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Sonuç düzeltilmiş flatfield görüntüdür.
- Düzeltilmiş düz alan görüntüsünün ortalama piksel yoğunluğunu ilk olarak Analiz et | Ölçümleri ayarlayın ve Ortalama gri değer kutusunu işaretleyin ve ardından 'm' tuşuna basın.
- Düzeltilmiş düz alan görüntüsünü İşlem'e tıklayarak ortalama yoğunluğuna göre böl | Matematik | 7.1.5 adımda elde edilen ortalama gri değeri böl ve gir. Bu ters kazanç görüntü üretecektir.
- Devre arası görüntü yığınıyla birlikte etkinleştirme öncesi ve aktivasyon sonrası görüntüleri açın. Resim | Yığınlar | Araçlar | Açılanmenülerden görüntüleri kronolojik sırada tamamla ve seçin. 4B görüntü olarak Aç seçeneğinin seçilmediğinden emin olun. Ortaya çıkan yığın tam görüntü kümesidir.
- Tam görüntü kümesinde8.1.4 adımını tekrarlayın ve ardından İşlem 'e tıklayarak sonucu ters kazanç görüntüsüne bölün | Görüntü Hesap Makinesi ve işlem olarak Böl'ü seçin. Bu düzeltilmiş tam görüntü kümesiüretecek , hangi her görüntü aydınlatma alanında ve dedektör üzerinde olmayan tekdüzelik için düzeltilmiştir.
- Görüntü yığını hizalama
- Sahne veya örnek kayması nedeniyle zaman atlama serisindeki görüntü düzlemlerinin yanlış hizalanmasını düzeltmek için, Eklentileri tıklatarak Hizalama'yı sabit bölge eklentisine(Ek Dosya 1)yükleyin | PlugIn'i yükleyin,eklenti dosyasını içeren klasöre gezinme ve eklentiyi seçin. Eklentiyi yükledikten sonra ImageJ'i yeniden başlatın.
NOT: Bu eklenti görüntüleri "en az kareler congealing" ilkesine göre hizalar15. - Birkaç aksonu kapsayan ve aksonların her birinde aktif floresan proksimal ve distal sınırları ötesine geçmez düzeltilmiş tam görüntü seti üzerinde bir YG çizin. Bölgenin geometrisi önemsizdir, ancak yapıların şekil veya boyut değiştirdiği alanlar hariç olmak üzere hizalamayı geliştirecektir.
- Eklentileri tıklatarak hizalama eklentisini çalıştırın | Sabit bölgeye göre hizalama. Eklenti, kareler arasındaki yer değiştirmeye varsayılan 2 piksellik maksimum yerleştirir, ancak örnekte önemli bir sürüklenme varsa bu durum ilk açılır pencerede ayarlanabilir. Hizalama, görüntü yığınının boyutuna bağlı olarak birkaç dakika sürebilir.
- Hizalamanın kalitesini değerlendirmek için hizalanmış yığını görsel olarak inceleyin. Otomatik hizalama, çerçeveler arasındaki floresan büyük dalgalanmalar için iyi çalışmayabilir gibi, daha sonra bazı çerçeveler, el ile hizalanması gerekebilir. Bu, Resim | Dönüştür | Çevir. Yığının tamamının çevrilip çevrilmemesi gerektiğini soran aşağıdaki açılır pencerede Hayır'ı tıklatın. Çeviride yalnızca tümsado piksel değerlerini kullanın ve kesirli piksel kaydırma veya enterpolasyon piksel yoğunluklarının yeniden alabilmesi nedeniyle verileri değiştireceği için açılır menüenterasyon menüsünün Noneolarak ayarlandığından emin olun.
- Hizalanmış tam görüntü kümesi olarak bunu kaydedin.
- Sahne veya örnek kayması nedeniyle zaman atlama serisindeki görüntü düzlemlerinin yanlış hizalanmasını düzeltmek için, Eklentileri tıklatarak Hizalama'yı sabit bölge eklentisine(Ek Dosya 1)yükleyin | PlugIn'i yükleyin,eklenti dosyasını içeren klasöre gezinme ve eklentiyi seçin. Eklentiyi yükledikten sonra ImageJ'i yeniden başlatın.
- Floresan yoğunluklarının ölçümü
- Hizalanmış tam görüntü kümesinin ilk karesinde, aktive bölgenin bir kenarı boyunca, aksonlarla dik ve ikinci kol dikey olan açı aracını kullanarak bir Yatırım Getirisi çizin. Açıyı ölçmek için 'm' tuşuna basın, bu da aksonun görüş alanındaki yönünü açıklar.
- Analiz et | Ölçek'i ayarlayın Scale ve uygun değerleri girin.
- Çözümle'yi tıklatarak Yatırım Getirisi yöneticisini açın | Araçlar | YRK Yöneticisi. Nabız kaçış paradigması için adım 8.3.7'ye geçin. Nabız yayılımı için, adım 8.3.4 devam edin.
- Herhangi bir boyuttan bir kare yy'ı çizin ve sonra Edit'i tıklatın | Seçim | Belirtin. Ölçeklenmiş birimler seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun ve yG'yi 15 μm genişliğe ve görüntünün yüksekliğine eşit veya daha yüksek bir yüksekliğe ayarlayın.
- Düzenleme ' yi tıklatarak YG'yi adım 8.3.1' de ölçülen açıya göre döndürün | Seçim | Aksonlarla dik hale getirmek için döndürün ve yG'yi aktive bölgenin proksimal kenarı boyunca bir tarafıyla yerleştirin. Proksimal kılavuz Yatırım Getirisi olarak adlandırılacağız bu Yatırım Getirisi'ni 't' tuşuna basarak yöneticiye ekleyin.
- YG'yi etkinleştirilen bölgenin distal kenarıyla hizalamak için sürükleyin ve 't' tuşuna basarak yG yöneticisine tekrar ekleyin. Biz distal kılavuzu RoI olarak bu bakın. Proksimal ve distal kılavuz ROI'lar daha sonra yan ölçüm ROI'larını çizmek için kullanılacaktır.
- Yukarıdaki adım 5.11'de edinilen timelapse görüntü sırasını kullanarak nicelleştirme için aksonu seçin. Bu görüntü dizisi, aksonların zayıf otofloresanlarını yakalayıp aktif bölgenin dışındaki morfolojilerini ortaya çıkardığı için bu amaç için yararlıdır.
NOT: Aşağıdaki ölçütlere uymayan aksonlar analizden çıkarılır:- Aksonlar tüm ölçüm pencerelerinin tüm uzunluğu boyunca odaklanmış olmalıdır.
- Aksonlar aktivasyon bölgesinin proksimal ve distal uçlarına dik 5° içinde olmalıdır.
- Aksonlar aktivasyon bölgesinin proksimal ve distal uçlarının 5μm içinde hiçbir invaginations olmalıdır.
- Görüntüleme sırasında gözle görülür şekilde şekil değiştiren aksonu hariç takın.
- Aktivasyon sonrası görüntüde ayrı bir aktive bölgenin yokluğunda kanıtlandığı gibi sağlıksız görünen aksonu hariç tutarak(Şekil 2C, altta), bu akson öldüğünde meydana gelen aktif floresan'ın diffüzif dağılımının göstergesidir.
- Aksoniçindeki otofloresan yapılar için adım 5.5'ten uzun pozlama beyazlatma görüntüsünü gözlemleyin. Bu floresan mitokondri içinde flavins kaynaklanmaktadır16. Bu mitokondriler, metabolik gerilemenin bir göstergesi olduğu için, uzatılmış, doğrusal yapıların(Şekil 2D, üst) aksine yuvarlak veya parçalanmış(Şekil 2D, alt) görünüyorsa aksonu analizden dışlayın.
- Yukarıda oluşturulan proksimal ve distal kılavuz ROI'ları kullanarak, analiz edilen akson başına üç ölçüm ROI'sı çizin: 40 μm aktif bölge içindeki akson'u kapsayan merkezi bir pencere ve yan pencere 15 μm ROI'lar ile sınırlandırılmış genişliğe sahip iki yan pencere ve aktivasyon bölgesinin sınırındaki akson çapı ile sınırlanan yükseklik. Üç bölgeyi de YG yöneticisine ekleyin. Glikolik inhibe aksonlar için, aktive bölgenin ortasında en fazla 5 μm genişliğinde ve akson dışında uzanan tek bir bölge çizin. Darbe kaçış paradigması için, aktif bölge sadece 5 μm genişliğindedir, bu nedenle tüm pencere kullanılmalıdır.
- Adım 8.3.7 ve 8.3.8 kriterlerini karşılayan tüm aksonlar için 8.3.9 adımını tekrarlayın.
- Etkin ölçümleri Analiz et ' e tıklayarak ortalama piksel yoğunluğuna ayarlayın | Ölçümleri ayarlayın ve Ortalama gri değer seçeneğini seçin. Başka ölçüm seçeneğinin kontrol olmadığından emin olun.
- Pencereyi seçerek ve 'Ctrl' + 'a' tuşuna basarak YG Yöneticisi penceresindeki tüm ROI'ları seçin. YG Yöneticisi penceresinde, Daha fazla | Floresan yoğunluklarını ölçmek için Çoklu Ölçü. Daha fazla analiz için sonuçlar penceresinden verileri elektronik tabloya kopyalayın.
- Etkin ölçümleri Analiz et' i tıklatarak bölge alanına ayarlama | Ölçümleri ayarlayın ve Alan seçeneğini seçin. Başka ölçüm seçeneğinin kontrol olmadığından emin olun.
- Adımı 8.3.12'yi tekrarlayın. Alan zamana göre değişmediği için, alan için sonuçların yalnızca bir satırını kopyalamak gerekir.
9. Photobleach düzeltme
- Glikoletik olarak inhibe edilen aksonlara ait veri tablosunda, belirli bir Yatırım Getirisi için çerçeve 3'ten (ilk zaman atlamalı çerçeve) başlayarak her çerçevenin ortalama floresanından kare 1'in (aktivasyon öncesi çerçeve) ortalama floresanını çıkarın. Sonuçlar arka plan-çıkarılan anlamına gelir.
- Verileri, çerçeve numaraları yla abscissa olarak bir dağılım çizimi olarak çizin. Ae-bxşeklinde bir denklem ile her YG (en elektronik tablo programları bu işleve sahip) verilere bir üstel eğilim çizgisi sığdırMak . Bu denklem fotobleaching fonksiyonu Ft = F0 * e-tin f0 zaman atlamasının ilk karesinde floresan olduğu eşdeğerdir, üstel ağartma hızı, t zaman ve e doğal logaritma tabanıdır.
- Glikolikinik inhibe sinirlertüm akson tüm ROI için tekrar adımları 9.1.1-9.1.2. Fotobeyaztma oranının en doğru tahmini için, en az 5 ayrı sinirden en az 15 akson kullanın. Fotobeyaztma için deneysel verileri düzeltmek için tüm inhibe aksonların üstel beyazlatma oranlarının ortalamasını (10) kullanın. Fotobeyaztasyon görüntü edinme ayarlarına ve zaman içinde değişebilen lazer gücüne bağlı olduğundan, her deney veya çalışma için yeni bir beyazlatma kalibrasyonu yapılmalıdır.
- Normal salin ile görüntülenen aksonun tüm bölgeleri için 9.1.1 adımını tekrarlayın (yani glikoletik olarak inhibe edilmez).
- Her veri noktasını e-tt'yebölün, t için zaman ve 9.1.3 adımda bulunan ortalama bir süreyi kullanarak. Bunlar fotobleach düzeltilmiş anlamına gelir.
- Her zaman o bölgedeki toplam floresan bulmak için ilgi alanı için her veri noktası ile çarpın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3, darbe kaçışı ve darbe yayılımı deneylerinden temsili görüntüler gösterir. Biz darbe-kaçış yöntemi ve buverilerinanalizi için yöntemlerimiz5,6,,7,8,17kullanılarak elde edilen verileri açıklayan çeşitli çalışmalar yayınladık. Aşağıda, nabız yayılımı verilerinin daha önce bildirmediğimiz nörofilament taşımacılığının yön ve hızı hakkında nasıl bilgi verebileceğini gösteriyoruz.
Aksonda nörofilament taşınması aralıklı ve çift yönlüdür. Bu taşıma, anterograd ve retrograd yönlerde herhangi bir zamanda hareket eden filamentlerin fraksiyonu ile tanımlanabilir 
ve 
sırasıyla, ve anterograd ve retrograd yönlerde ki hızları, tarafından belirtilir 
ve 
. Aksonun birim uzunluğu başına toplam nörofilament polimer miktarını 
alırsak, belirli bir bölgede anterograd ve retrograd yönlerdeki akslar
Ve
,
sırasıyla ve toplam akı 
tarafından verilir
,
birimleri 
μm-1, 
birimleri vardır ve birimleri 
vardır. Akson boyunca belirli bir yerde akı zaman bir birim içinde o yerde geçmiş hareket eden nörofilament polimer miktarı olduğundan, üzerinden ortalama hız ile ilgilidir 
. Böylece, yazabilirsiniz
.
Bir darbe yayılımı deneyinde akı, merkezi pencere olarak adlandırdığımız floresan nörofilamentlerin aktif bölgeden ayrılma oranından belirlenebilir. Saniyede bu merkezi pencereden floresan nörofilament polimerin toplam kaybı 
anterograd ve retrograd yönlerde ayrılan floresan nörofilament polimerlerin kayıplarının toplamıdır.
Merkezi pencerede floresan nörofilament polimer in ilk içeriğine normalleştirilmiş, 
yani, 
merkezi pencerenin uzunluğu nerede, bu kayıp oranı daha sonra olur
nerede merkezi pencerede floresan azalma eğimi, başlangıçta 
8tarafından verilen bir süre için doğrusal . 40 μm merkezi pencere için, bu sadece on saniye eşittir. Ancak, bu kadar büyük pencereler için, üstel bozma aşamasına geçiş aşamalı ve eğim etkili birkaç dakika veya daha fazladoğrusal 8.
İlk zamanlarda, yan camlar merkezi pencereden çıkan tüm nörofilamentleri yakalar, çünkü bu filamentler yan pencerelerden geçip diğer taraftan çıkmak için yeterli zamana sahip değildir. Bu durumda, merkezi pencereanterogradely ve retrogradly saniyede terk floresan nörofilament polimer miktarları, yani akılar 
ve 
, nörofilament içeriğinde artış 
ve yan 
pencerelerde verilir. Merkezi pencerede floresan nörofilament polimerin ilk içeriğine normalleştirilen, yan pencerelerdeki artış oranları
nerede 
ve 
proksimal ve distal yan pencerelerde floresan artış yamaçlarında, sırasıyla.
Böylece, yan camlar, yani eğimleri açısından ortalama hızı ifade edebilirsiniz.
(Eq. 1)
ve anterograd ve retrograd hareketli nörofilamentlerin sayısının bu eğimlerin oranı açısından oranı, yani.
(Eq. 2)
nörofilamentlerin anterogradly'den geriye doğru hareket edene ve tersi8'egeri dönüş oranlarını gösterir. Değerleri 
ve 
kültürlü nöronlarda bireysel nörofilamentlerin hareketini ölçerek belirlenebilir, daha önce bildirildiği gibi17. Daha da önemlisi, Eq. 1'deki hız ifadesi, floresan nörofilamentlerin yan pencereye girdiği ancak ayrılmadığı aktivasyondan sonra kısa sürede uygulanır. Bu kısa zaman penceresinin süresi, yan pencerelerin uzunluğuna ve nörofilament hareketinin kinetik durumuna bağlıdır. Uzun yan pencereler, prensipte, uzun zaman penceresi. Teorik olarak, bu kriterin
(Eq. 3)
Eq. 1'deki hız ifadesinin aksine, yan camlar arasındaki eğimler arasındaki farktan dolayı verilen, Eq. 2'deki yönlülük ifadesi, yan camdaki yamaçların oranı ile verildiği için pencere boyutunu kuşatmaya kadar sağlamdır.
Şekil 3, sırasıyla 5 ve 40 μm'lik pencere boyutları kullanarak, C57Bl/6J arka plan daki hThy1 paGFP-NFM hattımızdan 8 haftalık erkek faremizin tibial sinirindeki miyelinli aksonlar üzerinde nabız-kaçış ve darbe yayılımı deneylerinin temsili sonuçlarını göstermektedir. Bu deneysel paradigmalar için hem erkek hem de dişi olmak üzere en az 2 haftalık fareler kullanılmaktadır. Uygun yaş ve cinsiyet, çalışmada test edilen ebağlı olarak araştırmacı tarafından belirlenmelidir. Zamanla, aktive bölgelerin kenarlarının hem anterograd hem de retrograd yönlerde nörofilamentlerin ayrılması sonucu bulanıklık yaptığı ve merkezi pencereden floresan kaybına yol açabildiği görülebilir.
Darbe kaçış yöntemi için(Şekil 3A, C, E), aktive bölgede floresan çürüme kinetik uzun vadeli ve kısa vadeli duraklama davranışı hakkında bilgi verebilir8,18. Bu deneyler için, etkinleştirilen bölge kısa olabilir (genellikle 5 μm kullanırız; Şekil 3A'dakisarı kutuya bakınız). Darbe yayılımı yöntemi için(Şekil 3B, D, F),floresan nörofilamentlerden daha büyük bir havuz sağlamak için daha uzun aktif bir bölge (burada 40 μm; Şekil 3B'dekisarı kutuya bakınız) kullanırız. Bu, kanat bölgelerindefloresan artışın doğrusal kaldığı süreyi uzatır (yukarıya bakın). Bu floresan artış lineer etki alanı da bu pencerelerin uzunluğu artırArak artırılabilir, ancak bu görüş alanının boyutu ile sınırlıdır. Şekil 3D'de gösterilen veriler için kırmızı ve yeşil renkte gösterilen 15 μm'lik yan pencereler kullandık.
Şekil 3E,3F, Şekil 3C,3D'de gösterilen ölçüm pencereleri için toplam floresan yoğunluklarının (yani piksel yoğunluklarının toplamının) niceliğini gösterir. Darbe kaçış yöntemi için çürüme bifhasik, on-track nörofilamentlerin ayrılmasını temsil eden bir ilk üstel çürüme ile. Bu geçişler yaklaşık 10-20 dakika ikinci bir yavaş üstel çürüme için seferberlik ve off-trackfilamentler8 kalkış temsil eder. Darbe yayma yöntemi ile karşılaştırma için, Şekil 3Esadece 12 dakikalık bir zaman ders göstermek , ama genellikle analiz zaman ders uzun olması gerekir (genellikle 30-120 dakika) uzun vadeli duraklatma kinetik yakalamak için5,6,18. Darbe yayılımı stratejisi için, hareketin hız ve yönlülüğünün hesaplamaları sadece yan camların eğimlerine bağlıdır. Burada kullanılan pencere uzunlukları için doğrusal faz yaklaşık 5 dakika uzar. Bu zaman penceresinin süresi, eğimi ölçmek için kullanılan süreyi kademeli olarak kısaltarak ve eğimin artık artmama noktasını belirleyerek değerlendirilmelidir. Bu süre, kamera görüş alanı izin verirse pencere uzunlukları artırılarak artırılabilir, ancak pencere uzunlukları belirli bir deneydeki tüm aksonlar için sabit tutulmalıdır. Örnek olarak, Şekil 3F'dekidarbe yayılımı verilerinin eğimlerini ölçmek için ilk 5 dakikalık verileri kullandık. Bu, sırasıyla proksimal, merkezi ve distal pencereler için 72 A.U./min, -594 A.U./dk ve 111 A.U./dak'ın eğimleri ile sonuçlanır (A.U. = keyfi birimler). Bu değerleri normalleştirmek için, merkezi pencerenin ilk floresansına göre bölünürler ve %0.108 F0/dk, -0.962 %F0/dk ve 0.173 %F0/dk. Eq. 3 uygulama oranlarıyla sonuçlanır. Bu, EMCCD kameramızın (82 μm x 82 μm) görüş alanı nedeniyle teknik bir sınırlamadır. Çok daha büyük görüş alanlarına sahip olabilecek sCMOS yongaları olan kameralar, daha büyük yan pencere boyutlarının kullanılmasına izin verebilir. Ancak, merkezi ve yan yamaçlar arasındaki bu tutarsızlığın, en azından kısmen, yan pencerelerdeki olumlu eğimleri küçümseme ve merkezi penceredeki negatif eğimi abartma etkisi yaratabilecek fotobeyazlama nın kapsamını küçümsemeolasılığı göz ardı edemeyiz.
Yukarıdaki (F0/dk) ve Eq. 2'deki yan pencerelerdeki oranlar ile 17 değerleri kullanarak 
= 
17 
2.12 oranını hesaplıyoruz. Bu, filamentlerin %68'inin anterograd, %32'sinin retrograd olduğunu gösterir. Yukarıdaki aynı oranlar ve Eq. 1 kullanarak ortalama net nüfus hızını 
= 40*(0,00173-0,00108) = 0,026 μm/dk veya 0,037 mm/gün olarak hesaplıyoruz. Benzer yaştaki farelerde radyoizotopik nabız etiketleme çalışmaları siyatik sinirin en proksimal kısımlarında yaklaşık 0.6 mm/gün nörofilament popülasyon hızı bildirmiş, ikisantimetre,lik bir mesafe içinde 0.12 mm/gün'e kadar yavaşlar.20 Nabız yayılımı verilerimiz tibial sinirde toplandı, kabaca bu ölçümlere 2-3 santimetre distal. Yukarıda belirtilen nedenlerle, 0,037 mm/gün tahmininin gerçek hızın hafife alındığına inanıyoruz. Ancak, tibial sinir içine radyoizotopik nabız etiketleme tarafından gözlenen mekansal yavaşlama tahmin bu tahmin mantıksız değil, özellikle biz çok farklı bir mekansal ve zamansal ölçekte çok farklı bir metodoloji kullanılarak tespit edildiğini göz önüne alındığında.
Popülasyonlar arasındaki önemli farklılıkları tespit etmek için nabız yayma yönteminin yeteneğini göstermek için, hem normal hem de inhibitör serumile perfüzyonlu sinirlerden ölçülen proksimal ve distal yan pencere eğimlerini karşılaştırdık. Glikoliz inhibisyonu nörofilamentlerin hareketini engeller, daha önce bildirdiğimiz gibi5,6,7. Daha sonra deneyler için örnek boyutların seçimi tartışacağız, ancak burada inhibisyon sırasında sinir başına bir kazanım alanının sınırlandırılması nedeniyle, normal tuzlu bir sinir ve inhibitör tuzlu iki sinir kullanılır. Şekil 4A glikolitik inhibe sinir bir örnek timelapse gösterir, aktive bölgenin dışına taşıma belirgin bir azalma gösteren. Gerçekten de, inhibitör salin ile tedavi edilen sinirlerde, normal tuzlu su ile perfüzyona karşı inhibitör salin ile tedavi edilen sinirlerde (Şekil 4B, p = 0.00000639 ve 0.0121, sırasıyla, Tukey's pairwise karşılaştırma) anlamlı derecede düşük distal ve proksimal yamaçları bulabilirsiniz. Ayrıca bu iki koşul arasındaki popülasyon hızında önemli bir azalma görüyoruz(Şekil 4C, p = 0.0232, eşit olmayan varyanslarla t-testi, p = 0.0190 ile eşit varyans için F testini takip ederek).
Şekil 1: Perfüzyon odası. (A) Perfüzyon odası gövdesi ve dış contanın montajını gösteren ve tuzlu şırınga ve atık şişesine bağlı boruları gösteren diyagram. (B) Odanın montajını gösteren diyagram. İç conta #1.5 kapak üzerinde düz döşenir. Sinir iç conta dikdörtgen açılış tarafından oluşturulan kuyuda coverslip yerleştirilir. Mikroakemer slayt #1.5 coverslip ve microaqueduct slayt arasındaki sinir sandviç sinir üzerine yerleştirilir. Son olarak, sandviç (A)gösterilen montaj dış conta üstüne monte edilmeden önce döndürülür ve bir kilitleme halkası ile sabitlenir (gösterilmez). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tibial sinir hazırlığı. (A) Bir fare nin bacak içinde tibial sinirin yerini gösteren görüntü, hangi gluteus superficialis, pazı femoris, semitendinosus, popliteus, tibialis caudalis ve fleksör digitorum longus kasları kaldırıldı. Tibial sinir diz de doğan siyatik sinirin üç ana dallarından biri olarak görülebilir. (B) Birleştirilmiş odada ki kesitteki sinirşeması, örtü nün altındaki yağ daldırma hedefini gösterir. En iyi optik kalite, kapak yüzeyine apposed akson tabakasının aktive edilmesi ve görüntülenmesi ile elde edilir; Görüntü kalitesi ışık saçılımı nedeniyle sinir içine daha derin azalır. (C) Aktivasyondan hemen sonra sağlıklı bir akson (üst) ve sağlıksız bir akson (altta) örnekleri. Kesikli sarı çizgi etkinleştirilen bölgeyi işaretler. Aktif floresan sağlıklı akson keskin sınırları vardır, sağlıksız akson ise aktive floresan hızla aktive bölgeden yayılır, saniye içinde akson doldurma. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D) Sağlıklı bir akson (üst) ve sağlıksız bir akson (alt) mitokondriyal görünüm örnekleri. Mitokondri flavin otofloresans nedeniyle görülebilir16. Sağlıklı aksonlarda doğrusal (katı ok başları) görünürler. Sağlıksız aksonlar, mitokondri ilk punctate olur (açık ok başları) ve daha sonra zaman içinde sönük, akson sağlık bir göstergesi sağlayan. Sağlıklı aksondaki kesik açık ok ucu, doğrusaldan delmeye geçiş mitokondriye işaret ediyor. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nabız kaçış ve nabız yayılımı deneyleri. 8 haftalık bir farenin tibial sinirinde miyelinated aksonun ön aktivasyon, aktivasyon sonrası ve timelapse görüntüleri örneği(A) bir darbe kaçış deneyi ve(B) darbe yayılımı deneyi. Aktivasyon öncesi görüntü, aşağıdaki aktivasyon sonrası görüntülerin yer alan üst panelidir. Zaman damgaları etkinleştirmeden sonra geçen süreyi gösterir. Sarı kutular aktive edilen bölgeyi temsil ediyor. Bu aktivasyonlar 40 μs piksel çalışma süresi ve %5 lazer gücüne sahip 5 tarama kullanılarak gerçekleştirildi. Ölçek çubukları = 10 μm. (C) Bir darbe kaçış deneyinde üç akson için ölçüm ROI'ları (sarı). (D) Bir darbe yayılımı deneyinde üç akson için proksimal (kırmızı), merkezi (sarı) ve distal (yeşil) ölçüm ROI'ları. Her akson için ölçüm ROI'ları düz kırmızı (proksimal), düz sarı (merkezi pencere) ve düz yeşil (distal pencere) olarak gösterilir. (E) Ortalama floresan karşı zaman arsa, C. Kesikli hattında 3 akson ortalama veri uygun bir üstel fonksiyondur, form Ft = Ae-τt, daha önce açıklandığı gibi7. F) Merkezi, distal ve proksimal ROI'larda zamana göre floresan, D'deki üç akson da dahil olmak üzere ortalama 14 akson. Eğim, ilk 5 dakikaveriye uygun eğilim çizgilerinden hesaplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Metabolik inhibitörlerin nörofilament taşınması üzerine etkisi. (A) Glikoliz inhibe etmek ve hücresel ATP tüketmek için% 5.6 (w / v) 2-deoksi-glikoz ve 0.5 mM sodyum iyodoasetat ile pretreated bir sinir timelapse görüntüleri örneği. Aktive bölgelerin distal ve proksimal sınırları keskin kalır unutmayın, nörofilament taşıma bir inhibisyon göstergesi. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Distal (D) ve proksimal (P) yan pencerelerdeki yamaçların (sırasıyla anterograd ve retrograd), merkezi penceredeki ilk floresan yüzdesi olarak ifade edilen (F0/dk), standart salin kullanan bir sinirden (14 akson) ve glikolitik inhibitöriçeren tuzlu suile önceden işlenmiş iki sinirden (8 akson) ölçülmesi. (C) Yan camlarda yamaçlardan hesaplanan nörofilament popülasyon hızları, inhibitör tedavisi sonrasında hızda önemli bir azalma gösterir. - p < 0,005; ** - p < 0,01; * - p < 0.05. Veriler inhibitörlerin varlığında nörofilament taşımacılığında önemli bir bozulma olduğunu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakım-kaçış ve nabız yayılımı deneylerinin analizinde dikkatli olunmalıdır, çünkü özellikle düz alan düzeltmesi, görüntü hizalama ve çamaşır suyu düzeltmesi sırasında, işlem sonrası hatanın ortaya çıkması için önemli bir potansiyel vardır. Düz alan düzeltmesi, aydınlanmadaki tekdüzelik için düzeltmegereklidir, bu da merkezden çevreye görüş alanı boyunca yoğunlukta bir düşüşe neden olur. Tekdüzeliğin kapsamı dalga boyuna bağlıdır ve bu nedenle, her zaman deneysel verilerin elde edilmesinde kullanılacak dalga boyunda yapılmalıdır. Düz alan görüntüsündeki tekdüzeliğin düzeltilecek görüntülerdeki tekdüzelik dışılığı gerçekten temsil etmesini sağlamak önemlidir. Nabız yayılımı deneyleri, ölçüm ROI'ları yoğunluğun en büyük olduğu görüntünün çevresine doğru uzandığından, yanlış düz alan düzeltmesi sonucu hataya karşı özellikle savunmasızdır.
Optimal paGFP aktivasyon ayarları aktivasyon yöntemine ve lazer parametrelerine göre değişir ve ilk görüntüleme seansından önce ampirik olarak belirlenmelidir. Çok az aktivasyon aktif floresan için düşük sinyal-gürültü oranı neden olur, çok fazla aktif floresan beyazlatma neden olur, çünkü hem aktive olmayan ve aktif paGFP menekşe ışık tarafından heyecanlı olabilir. Görüntüye ilgi olan bir bölgeyi seçici olarak aydınlatmak için, TemsilSonuçları'nda gösterildiği gibi, keskin sınırlarla açıkça tanımlanmış bir floresan bölgesi oluşturan Andor FRAPPA lazer galvo tarayıcısı kullanıyoruz. Biz de bir Andor Mozaik Dijital Diyafram kullanarak başarı elde ettik, hangi bir dijital mikroayna cihaz, aydınlatma kaynağı olarak cıva ark lambası ile7. Diğer seçenekler ticari olarak mevcuttur. paGFP ile çalışırken bir sorun fotoaktivasyon adımından sonra 1 dakika içinde olur floresan yoğunluğu gecikmeli artış. Bu artış, menekşe ışığı ile aydınlatma, aktive paGFP moleküllerinin bir kısmının, on saniye11'likbir zaman diliminde geri dinlenebilecekleri bir "karanlık duruma" girmesine neden olması nedeniyle oluşur. Bizim deneyim, artış genellikle az% 5 geniş alan uyarma ile ama lazer uyarma ile% 20 aşabilir, hangi aktif floresan önemli bir küçümseme yol açabilir. Bunu, fotoaktivasyondan 1 dakika sonra paGFP floresanının ikinci bir "aktivasyon sonrası" görüntüsünü alarak ve bu görüntüyü sonraki zaman atlamalı için referans noktası olarak kullanarak hesaplıyoruz. Ancak, bu ilk floresan ve çürüme kinetik erken zamanlarda belirlenmesinde hata başka bir potansiyel kaynağı tanıtmak olduğunu kabul etmek önemlidir.
Görüntü yığınlarının hizalanmasına dikkat edilmelidir. Yanlış hizalamanın temel kaynağı, zaman atlamalı görüntü edinimi sırasında numunenin sürüklenme veya diğer hareketidir. Bu uygun kalınlıkta iç contalar kullanılarak ve görüntüleme öncesi "yerleşmek" için hazırlık izin vererek en aza indirilebilir. Ancak, bu tür bir gecikme, hazırlık canlılık sınırlı bir pencere olduğundan görüntü edinimi için kullanılabilir süreyi azaltacaktır. Bu yordamlar görüntüdeki piksel yoğunluklarını yeniden örnekleyeceği için görüntüyü büken veya alt piksel kaydırmaları sağlayan hizalama algoritmalarından kaçınmak da önemlidir. Nabız yayılımı deneyleri, aktif floresan bölgesinin sınırları nispeten keskin olduğundan ve bu bölgedeki floresan yan akıtan olmayan bölgelerden önemli ölçüde daha yüksek olduğundan, yanlış hizalamadan kaynaklanan hatalara karşı özellikle savunmasızdır. Yığındaki görüntü düzlemlerinin hafif bir yanlış hizalanması bile distal ve proksimal ölçüm pencerelerinde floresan değerlerinde büyük sıçramalara neden olabilir. Bu nedenle, görüntü kümelerinin düzgün bir şekilde hizalanmış olması ve analize devam etmeden önce dikkatle incelenmesi zorunludur.
Fotobeyaztma için düzeltme, zaman içinde floresan yoğunluğundaki değişikliklerin floresan protein miktarındaki değişiklikleri doğru bir şekilde yansıttığından emin olmak için gereklidir. Bu tür düzeltmeler, merkezi ve yan pencerelerdeki mutlak floresan yoğunluklarını tahmin etmede önemli bir hata kaynağı olabilir. Fotobeyaztkinetiği aydınlatma nın yoğunluğuna ve florofor un çevresine bağlı olduğu için, gerçek fotobeyazrlama hızları seanslar arasında ve aksondan aksona kadar değişebilir. Bu nedenle, birden çok akson ölçmek ve kendisi bazı hata tanıttı elde edilen verileri ortalama gereklidir. Yukarıda açıklanan yaklaşım glikolitik inhibitörleri ile sinir tedavi etmek ve daha sonra ilgi bir bölgede floresan etkinleştirmek ve zaman içinde floresan yoğunluğu kaybını izlemektir. Glikolitik inhibitörler ATP'yi tüketir ler ve böylece nörofilament naklini engellerler, böylece floresan kaybı tamamen fotobeyazrlamadan kaynaklanır ve nörofilamentlerin aktive bölgeden dışarı çıkmasına bağlı değildir. Bu şekilde belirlenen ortalama ağartma kinetiği daha sonra deneysel verileri düzeltmek için kullanılır. Her görüntüleme oturumunda ayrı bir ağartma kalibrasyonu yapmak pratik olmadığından, haftalarboyunca yayılan birden fazla seansa tek bir kalibrasyon uygulanmalıdır. Bu yaklaşımın bir dezavantajı, lazer güç /aydınlatma yoğunluğundaki değişimleri günden güne hesaba katmamasıdır ve bu nedenle izlenmesi gerekir. "İçsel beyazlatma düzeltmesi" olarak adlandırdığımız alternatif bir yaklaşım, taşıma ölçümleri için kullanılan aynı zaman atlamalı filmlerde aktif bölgenin merkezindeki floresanmiktarını ölçerek fotobeyazlasyon tahmin etmektir. Eğer bu ölçüm bölgesi merkezi olarak yer alıyorsa ve aktif bölgenin uzunluğundan çok daha kısaysa ve kısa sürede ölçüm bölgesinden çıkan floresan nörofilamentler yerini floresan nörofilamentlerle dolduracaktır. Ancak zamanla aksonun floresan olmayan bölgelerinin kuşatmasından ölçüm bölgesine hareket eden floresan olmayan nörofilamentlerin olma olasılığı artar ve beyazlatma nedeniyle floresan kaybının aşırı tahmin edilmesine yol açan bir artış meydana gelir. Bu yaklaşımın bir avantajı da aynı alandaki beyazlatma özelliklerini düzeltmesi, ancak dezavantajı, zaman penceresinin süresinin ampirik olarak belirlenmesi ve taşıma hızına ve aktif olan bölgenin uzunluğuna bağlı olmasıdır. Tüm bunlar söylenmiş olarak, bizim yöntemimizi kullanarak nörofilament taşımacılığının yönlülüğünün tahmininin beyazlatma hatalarına (pencere boyutu yanması için olduğu gibi) sağlam olduğu unutulmamalıdır, çünkü yan camdaki yamaçların oranı ile verilir ve herhangi bir ağartma düzeltmesi bu hesaplamada hem sayıcı hem de paydaya uygulanan bir çarpantır.
Floresan sisteminin doğasında bulunan gürültü ve yukarıda açıklanan görüntü sonrası işlem adımları sırasında eklenen ek hata potansiyeli nedeniyle, yeterli istatistiksel güç için büyük örnek boyutları kullanmak önemlidir. Denemeden önce popülasyon araçlarını, sapmaları ve etki boyutlarını doğru bir şekilde belirlemek mümkün olmasa da, orta etki boyutu ve 0,05 alfa varsayarak Cohen yöntemi21'i kullanmanızı öneririz. Bu, her iki dpopülasyonun havuzlu standart sapmasıyla bölünen ortalama farkı olan 0,5'lik bir Cohen'in d'si ile sonuçlanır ve bu da grup başına en az 105 örnek alınmasını önerir. Bu eşiğe ulaşıldıktan sonra, gerçek nüfus önlemleri ışığında istatistiksel gücü yeniden değerlendirmek için bir post hoc güç analizi yapılabilir. Optimal deneysel koşullar altında, aktivasyon başına 1-7 analiz edilebilir akson (9-20 toplam akson) ve aktivasyon başına 10 dakikalık zaman atlamalı edinimi varsayarak sinir başına 5-8 aktivasyon elde etmek mümkün olmalıdır.
Mitokondri veya vezikülleri hedefleyen floresan füzyon proteinlerini ifade eden transgenik fareler de periferik sinirlerex vivo22,,23,24,25membranöz organellerin aksonal naklini incelemek için kullanılmıştır. Buna ek olarak, Schiavo laboratuvarı kas içine enjekte edilebilir ve motor sinir terminalleri tarafından alınır floresan etiketli tetanoz toksin parçaları kullanarak vivo aksonlar retrogradly hareketli membranöz organelleraksonal taşıma görüntü yaklaşımlar geliştirdi26. Ancak bu aksonlarda membranöz organeller floresan mikroskopi ile çözülebildiği için, zaman atlamalı veya mimograf analizi ile doğrudan hareketlerinin hızını ve sıklığını analiz etmek mümkündür. Burada açıklanan nabız-kaçış ve nabız yayma yöntemleri, tek nörofilamentlerin çözülemediği bu aksonlara nörofilament naklinin kinetiklerini analiz etmek amacıyla geliştirilmiştir. Bu dakika veya onlarca dakika bir süre içinde bir nüfus düzeyi analizi gerektirir. Bu amaçla transgenik bir fare kullanıyoruz, ancak viral transdüksiyon veya rahim elektroporasyonu gibi yöntemler kullanarak fotoaktibl proteini ifade etmek de mümkün olmalıdır. Odak nörofilament taşıma iken, darbe kaçış ve nabız-spread yöntemleri de aksonal taşıma yavaş bileşenleri aksons boyunca taşınan diğer sitoskeletve sitosolik proteinlerin hareketini incelemek için adapte edilebilir. Analizlerimizi miyelinlenmiş aksonlarla sınırlandırıyoruz çünkü boyutları ve miyelin kılıfı onları komşularından çözmemizi sağlıyor. Miyeline edilmemiş aksonların küçük kalibreleri ve Remak demetleri halinde kümelenme eğilimleri nedeniyle çözümlenemez. Biz tibial sinirler ex vivo kullanımını tarif ama yöntemler de yeterince uzun (>5 mm) ve dalsız diğer periferik sinirler için geçerli olmalıdır. Prensip olarak, bu yöntemleri vivo'da nörofilament taşımaya uyarlamak da mümkün olmalıdır (örneğin, bir siniri ameliyatla uyuşturulmuş bir fareye maruz bırakarak ve fareyi mikroskop aşamasına yerleştirerek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar öğretim ve konfokal mikroskopi ve tibial sinir diseksiyonu ve Dr Atsuko Uchida, Chloe Duger ve Sana Chahande fare yetiştiriciliği ile yardım için yardım için Paula Monsma teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen A.B.'ye ios1656784 osb'nin ortak Ulusal Bilim Vakfı Hibeleri tarafından desteklenmiştir. ve IOS1656765 P.J., ve Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 NS038526, P30 NS104177 ve S10 OD010383 A.B. N.P.B. Ohio State Üniversitesi Rektörü'nün Doktora Sonrası Akademisyenler Programı'ndan bir burs tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe - Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil - type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter - female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter - male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
