סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תא דם לבן (WBC) תת-כמות באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA. פרוטוקול זה מציג שיטת תגובת שרשרת פולימראז טיפות טיפות כפוליות (mdPCR) באמצעות elastomer תרמופלסטי (TPE) מבוסס מיקרופלואידים התקן עבור יצירת droplet המאפשר דיוק ו- multiplex ספציפית מתילציה היעד כימות של ספירות דיפרנציאליות WBC.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מתילציה ספציפית מולטיפלקס טיפות PCR באמצעות התקן מחולל טיפות פולימר לאבחון המטולוגי
במאמר זה
סיכום
תקציר
זרימת עבודה של PCR (mdPCR) של טיפות מרובות ופרוטוקול מפורט לקביעת ספירת תאי דם לבנים מבוססי אפיגנטיקה (WBC) מתוארת, יחד עם התקן ייצור טיפות מיקרופלויד (TPE) תרמופלסטי. סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תת-תחליף WBC שהוא בעל ערך פרוגנוסטי חשוב במחלות שונות. זה מושגת באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA של אזורים ספציפיים עשירים CG בגנום (CpG loci). בנייר זה, ביסובפיט שטופלו DNA מתאי דם היקפיים מונונוקולריים (PBMCs) הוא עטוף טיפות עם reagents mdPCR כולל פריימרים ובדיקות הידרוליזה פלורסנט ספציפי עבור CpG loci כי לתאם עם אוכלוסיות משנה WBC. גישת המולטיפלקס מאפשרת חקירה של CpG loci רבים ללא צורך בתגובות MDPCR נפרדות, המאפשרת קביעה פרמטרית מדויקת יותר של תת-אוכלוסיות WBC באמצעות ניתוח אפיגנטי של אתרי מתילציה. כימות מדויקת זו יכולה להיות מורחבת ליישומים שונים ומדגישה את היתרונות לאבחון קליני ופרוגנוזה עוקבות.
מבוא
ניתוח של הרכב תאי דם לבנים (WBCs) הוא בין בדיקות המעבדה הנפוצות ביותר באבחון המטולוגי. ספירת לוקוציט דיפרנציאלית משמשת כאינדיקטור לספקטרום של מחלות כולל זיהום, דלקת, אנמיה, לוקמיה, והוא נמצא תחת חקירה כסמן ביולוגי פרוגנוסטי מוקדם עבור מספר תנאים אחרים, כמו גם. תקן זהב ב-WBC subtyping כרוך בחיסונים ו/או ציתומיה זרימה ששניהם דורשים נוגדני פלורסנט יקרים, הנוטים לחוסר יציבות, ולעתים קרובות תלויים מאוד במיומנות המפעיל בהכנה לדוגמה. יתר על כן, שיטה זו ישימה לדגימות דם טריות בלבד, כך שלא ניתן להקפיא את הדגימות לצורך משלוח או ניתוח מאוחר יותר.
סמנים אפיגנטיים התגלו לאחרונה ככלים אנליטיים רבי עוצמה לחקר וריאציות פנוטיפיות. לאחר מכן, אוכלוסיות לוקוצי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים שבוצעו במחקר זה מעורבים דגימות אנושיות אושרו על ידי מועצת האתיקה של NRC ונעשה על פי המדיניות של NRC המסדיר נושאים אנושיים המצייתים להנחיות המחקר החלות ותואמת את החוקים ב Québec, קנדה.
1. הכנת תאים
- להפשיר את תאי הדם ההיקפיים הקפואים (PBMCs) באופן מיידי על ידי הצבת cryovial באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- הפוך את cryovial פעמיים כדי להשתמש מחדש בעדינות את התאים ובשימוש 1 מ"ל pipette להעביר את מתלה התא לתוך צינור חרוב 15 מ"ל.
- הוסף 10 מ"ל של חימום מראש (37 °C) גדילה בינוני בתוספת עם 10% סרום פר עוברי (RPMI-1640 + 10% FBS) לצינור 15 מ"ל המכיל את ה-PBMCs.
- צנטריפוגה מתלי התא צנטריפוגה דל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התקן מחולל טיפות microfluidic מבוסס TPE היה מפוברק באמצעות הפרוטוקול המתואר כפי המוצג איור 1. מסיכת שקיפות שימשה בפוטוליתוגרפיה כדי להשיג סיליקון (Si) מאסטר. ליתוגרפיה רכה בוצעה כדי להשיג עותק משוכפל PDMS הפוך של מאסטר Si אשר שימש לאחר מכן כדי לפברק את עובש אפוקסי. מבשר אפוקסי נשפך על PDMS ונרפא כדי crosslink והתקשות. עובש זה, המייצג את העותק המשוכפל המדויק של מאסטר Si היה עמיד יותר עבור תרמופורמציה עוקבות של תרמופלסטיקה באמצעות התגלמות חמה. ברגע שתבנית האפוקסי הושגה, אלסטומר תרמופלסטי היה מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול הניסיוני שהוצג ושיטות לאפשר mdPCR בתוך הבית באמצעות גנרטור טיפות TPE מפוברק, מחזור תרמי, מיקרוסקופ פלואורסציט. המכשיר המפוברק באמצעות TPE רך כדי TPE מליטה מאפשר מאפייני פני השטח הידרופוביים כי הם אחידים על פני כל קירות הערוץ, כך המכשיר הסופי אינו דורש כל טיפול פני השטח לשימוש הבא כמחולל טיפות. חומר זה הועסק באופן שגרתי בפלטפורמות נקודת טיפול המחייבות תאימות עם ייצור תפוקה גבוהה9,10,11,12
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין קונפליקטים להצהיר עליהם.
תודות
המחברים מכירים בתמיכה כספית ממועצת המחקר הלאומית של קנדה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Bio-Rad, מיסיסוגה, ON | TFI0201 | צינור | |
| RAN Biotechnologies, בוורלי, MA | 008-FluoroSurfactant | פלואורו-פעילי שטח | |
| סיליקון קווסט אינטרנשיונל, סנטה קלרה, קליפורניה | |||
| אוקספורד אינסטרומנטס, אבינגדון, בריטניה | מצלמת | ||
| תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | משמש לניתוח | ||
| ניקון, יפן | 10x אובייקטיבי | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| פישר, קנדה | |||
| ויטרוקום, ניו ג'רזי, ארה"ב | 5015 ו-5010 | בורוסיליקט צינור | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| המאמאטסו, יפן | LC-L1V5 | DEL מקור | |
| UV דולומיט | 3200063 | צינורות | |
| דולומיט | 3200302 | צינורות נוזלים חד פעמיים | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | מיקרוסקופ | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schä rding, אוסטריה | |||
| Zymo Research , אירווין, CA | D5030 | ||
| Photron , סן דייגו, CA | |||
| IDT, Coralville , IA | |||
| Gersteltec , Pully , שוויץ | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, קולורדו ספרינגס, CO | |||
| Qiagen , הילדן, גרמניה | |||
| 203603 תמונה J | משמשת להערכת אנכמיה בקוטר | ||
| , מונטריאול, QC | |||
| Excelitas, MA, ארה"ב | מנורת פלורסנט LED רחבת ספקטרום | ||
| MÅ l, שוודיה | אלסטומר תרמופלסטי (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, יפן | משמש לרכישת | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | כתם תא חי פלואורסצנטי כחול (DAPI) | |
| IDEX בריאות & מדע, אוק הארבור, וושינגטון | P-881 | אביזרי | |
| סיגמא-אולדריץ', אוקוויל, ON | 806552 | ||
| דאו קורנינג, מידלנד, MI | |||
| Thinkyארה"ב, קליפורניה, ארה"ב | ARV 310 | ||
| Ihc world, מרילנד, ארה"ב | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, נורת'רידג', קליפורניה | 2607808 | ||
| Cetoni GmbHקורבוסן, גרמניה | |||
| סיגמא-אולדריץ', אוקוויל, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, מיסיסוגה, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, מיסיסוגה, ON | |||
| ניקון, מלוויל, ניו יורק | מיקרוסקופ | ||
| ניקון, יפן | |||
| לוקטיט | AA 352 |
מקורות
- Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
