Summary
Epigenetiska markörer används för undertypning av vita blodkroppar (WBC) genom kvantifiering av DNA-metyleringsmönster. Detta protokoll presenterar en multiplex droplet polymeras kedjereaktion (mdPCR) metod med hjälp av en termoplastisk elastomer (TPE)-baserade microfluidic enhet för droplet generation möjliggör exakt och multiplex metylering-specifika mål kvantifiering av WBC differential räknas.
Abstract
En multiplexed droplet PCR (mdPCR) arbetsflöde och detaljerade protokoll för att fastställa epigenetiska-baserade vita blodkroppar (WBC) differentialantal beskrivs, tillsammans med en termoplastisk elastomer (TPE) mikrofluidic droplet generation enhet. Epigenetiska markörer används för WBC subtyping som är av viktigt prognostiskt värde vid olika sjukdomar. Detta uppnås genom kvantifiering av DNA-metyleringsmönster av specifika CG-rika regioner i arvsmassan (CpG loci). I detta papper är bisulfitbehandlat DNA från mononukleära celler i perifert blod (PBMCs) inkapslat i droppar med mdPCR-reagenser inklusive primrar och hydrolyslysrörssonder som är specifika för CpG loci som korrelerar med WBC-subpopulationer. Multiplex tillvägagångssätt möjliggör förhör av många CpG lokus utan behov av separata mdPCR reaktioner, möjliggör mer exakt parametrisk bestämning av WBC sub-populationer med hjälp av epigenetiska analys av metylering platser. Denna exakta kvantifiering kan utvidgas till olika tillämpningar och belyser fördelarna för klinisk diagnos och efterföljande prognos.
Introduction
Analys av vita blodkroppar (WBCs) sammansättning är bland de mest efterfrågade laboratorietester i blodsjukdomar diagnostik. Differential leukocyte räkna fungerar som en indikator för ett spektrum av sjukdomar inklusive infektion, inflammation, anemi, och leukemi, och är under utredning som en tidig prognostisk biomarkör för flera andra villkor samt. Guldmyntfot i WBC subtyping innebär immunfärgning och/eller flödescytometri som båda kräver kostsamma, instabilitetsbenägna fluorescerande antikroppar och är ofta mycket beroende av operatörens kompetens vid provberedning. Denna metod är dessutom tillämplig på enbart färska blodprover, så att proverna inte kan frysas för transport eller senare analys.
Epigenetiska markörer har nyligen framträtt som kraftfulla analytiska verktyg för studier av fenotypiska variationer. Därefter har mänskliga leukocyte populationer visat sig ha cell-härstamning DNA metylering mönster som möjliggör den exakta karakterisering av WBC delmängder. Subtypning baserad på epigenetiska markörer ger ett lovande alternativ som inte är beroende av färsk blodprovsinsamling eller dyra antikroppar och kan utnyttjas som en biomarkör för sjukdomsanseringoch mottaglighet 1,2,3,4,5.
Genom-hela studier har utförts för omfattande kartläggning av metylerade specifika CG-rika regioner i arvsmassan (CpG öar) i leukocyte subtyper att identifiera kandidat epigenetiska markörer specifika för leukocyt subtyper. PCR-protokoll har utvecklats på grund av denna orsak till metylerade genregioner, t.ex.+ + + Wiencke et al. har visat nyttan av duplexdropp PCR för epigenetisk subtypning av T-Cells, vilket ger resultat som starkt korrelerar med FLÖDESAKTIVERAD CELLSORTERING (FACS) analys6. Denna kvantitativa genetiska analysmetod bygger på partitionering av mallen nukleinsyra molekyler och PCR reagenser i tusentals diskreta, volymetriskt definierade, sub-nanoliter stora droppar som innehåller noll, en eller flera mål nukleinsyra kopior, med hjälp av vatten-i-olja emulsioner aktiveras av mikrofluidik7,8. PCR-förstärkningen utförs inom varje enskild droppe och ändpunktens fluorescensintensitet för varje droppe mäts, vilket möjliggör absolut kvantifiering av mål som finns i provet. Droplet PCR har fastställts för att vara mer exakt, exakt, och tekniskt enklare än standard qPCR, vilket gör det till en mer gynnsam DNA-metyleringsbaserad metod för klinisk utvärdering av T-Cells. Även om en snabbt framväxande subtyping metod, multiplexed epigenetiska analys att sond för olika metylerade CpG regioner samtidigt saknas. Detta är nödvändigt för rutinmässiga leukocyte differential räknas.
Häri presenteras och anställd för metyleringsspecifik multiplexdroppe PCR (mdPCR) en termoplastisk elastomer (TPE) (TPE). Tekniken har använts för att avgränsa specifika leukocyte subtyper, CD3+ T-Cells och CD4+ CD25+ T-Regs, baserat på cell-härstamning DNA metylering mönster, dvs, epigenetisk variation av CD3Z och FOXP3 CpG regioner, respektive. Ett detaljerat protokoll för DNA-extraktion, bisulfitkonvertering och mdPCR beskrivs i samförstånd med en fabriceringsmetod för en TPE-dropletgenereringsapparat. Representativa resultat av metoden jämförs med de av immunofluorescens färgning belysa nyttan av den föreslagna metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som utfördes i denna studie med mänskliga prover godkändes av NRC: s etiknämnd och gjordes enligt NRC: s politik som styr mänskliga ämnen som följer tillämpliga forskningsriktlinjer och är förenliga med lagarna i Québec, Kanada.
1. Cellpreparering
- Tina de frusna humana perifera blodet mononukleära celler (PBMC) omedelbart genom att placera cryovial i ett vattenbad på 37 °C i 5 min.
- Invertera kryoialen två gånger för att försiktigt resuspend cellerna och med hjälp av en 1 mL pipett överföra cellen suspensionen till en 15 mL koniska röret.
- Tillsätt 10 mL förvuppverat (37 °C) tillväxtmedium kompletterat med 10% fetalt bovinsserum (RPMI-1640 + 10% FBS) till 15 mL-tuben som innehåller PBMC-ämnena.
- Centrifugera cellupphängningen i en svängande hinkcentrifug vid rumstemperatur med en hastighet av 330 x g i 10 min med snabb acceleration och bromsen på hög.
- När snurrandet är över, försiktigt dekantera supernatanten. Resuspend cell pelleten i 3 mL av fosfat-buffrad koksaltlösning (PBS) pH 7.2, som innehåller 2 mM etylendiaminetetraättiksyra (EDTA) genom att knacka på sidan av rören.
- Blanda cellerna genom att invertera röret med locket tätt tillslutet.
- Förbered två 1,5 mL mikrorör och med hjälp av en pipett alikvot 1,5 mL av cellupphängningen i varje rör, varav en används för efterföljande immunofluorescensfärgning och en för DNA-extraktionen.
2. Immunofluorescens färgning och bildframställning protokoll
- Resuspend celler (från 1,7) i 200 μL PBS buffert som innehåller 0,1% natriumazid och 2% FBS och justera den slutliga koncentrationen av cell suspensionen till högst 2 x 107 celler/mL.
- Dela cellupphängningen genom att pipettera 100 μL-volym i två separata 1,5 mL mikrorör.
- Tillsätt 20 μL-volym anti-Hu CD3/CD4 konjugerad med Fluorescein isothiocyanate (FITC) och Phycoerythrin (PE) till ett rör och anti-Hu CD4/CD25 konjugerat med FITC och PE (se Tabell över material) till det andra röret, respektive.
- Tillsätt 1 droppe blå fluorescerande levande cellfläck (se Table of Materials) till varje rör.
- Inkubera i rumstemperatur med hjälp av en rörrotator i 2 h. Skydda mot ljus.
- Centrifugera cellupphängningen vid rumstemperatur vid 330 x g i 10 min med snabb acceleration och bromsen på hög.
- Dekantera supernatanten och försiktigt återanvänd cellpelletsen genom att knacka på tuben. Tillsätt 1 mL PBS, pH 7,2 innehållande 2 mM EDTA. Se till att locket är tätt stängd, blanda cellerna genom att invertera röret 2x.
- Upprepa steg 2.6 och 2.7 för tre gånger.
- Resuspend celler i 20 μL pbs pH 7.2 som innehåller 2 mM EDTA.
- Pipett 10 μL droppe av cellupphängningen på ett borosilikiskt mikroskopsglas och vänta i 2 min på att celler långsamt ska sedimentera till botten av droppen.
- Placera försiktigt ett glasöverdrag slip ovanpå mikroskopet bilden och placera bilden på scenen i en inverterad mikroskop.
- Spela in bilder av cellerna med hjälp av en 10x mål och en EMCCD kamera ansluten till mikroskopet för var och en av fluoroforer för båda cell suspension prover.
- Räkna lysrörsmärkta celler manuellt (se Kompletterande information för rådata).
- Ta förhållandet mellan anti-Hu CD3 och anti-Hu CD4/CD25 märkta-celler till DAPI-färgade celler för att få proportionerna cd3+ T-Cells och CD4+ CD25+ T-Regs till total leukocyte.
3. DNA-extraktion och bisulfitomvandling
- DNA-extraktion
OBS: Extrahera DNA från PBMC som bereds i avsnitt 1 med hjälp av en magnetisk DNA-reningssats (seTable of Materials ) efter förfaranden som tillverkaren tillhandahåller.- I ett 1,5 mL rör suspend celler i 100 μL av PBS och tillsätt 20 μL Proteinase K och 400 μL Lys/Bindning buffert. Blanda genom pipettering upp-ner 10x, utför sedan inkubation i rumstemperatur i 5 min.
- Fånga DNA-pärla komplexet genom att placera röret på en magnetisk rack för 1-2 min, sedan försiktigt bort och kassera supernatanten.
- Avlägsna röret som innehåller DNA-pärlkomplexet från magnetiskt rack och resuspend pärlorna i 600 μL Wash Buffer #1 för att tvätta bort eventuell icke-specifik bindning.
- Placera röret igen på magnetstället och ta försiktigt bort och kassera supernatanten.
- Upprepa steg 3.1.3 och 3.1.4 med 600 μL Wash Buffer #2.
- Lämna röret öppet till lufttorka i 1 min.
- Avlägsna röret från magnetställningen och elera DNA:t genom att dosera 100 μL Elution Buffer och pipettera DNA-/pärlkomplexet uppåt och nedåt 20x.
- Placera röret som innehåller det eluterade DNA:t igen på magnetställningen och inkubera i 1-2 min för att separera de magnetiska pärlorna från det eluterade DNA.
- Överför den eluterade renade DNA-lösningen till ett nytt rent rör.
- Bedöm koncentrationen av det renade DNA-provet genom att mäta absorbansen vid 260 nm med hjälp av en spektrofotometer.
- Bisulfite konvertering
OBS: Utför bisulfitkonverteringen på renat DNA med hjälp av en metyleringssats (se Tabell över material) efter förfaranden som tillverkaren tillhandahåller.- Till 20 μL DNA-prov (200-500 ng) i ett PCR-rör tillsätt 130 μL Omvandlingsreagens. Blanda väl och snurra ner en kort stund.
- Överför PCR-röret till en termisk cykelapparat och utför cykelprotokollet enligt följande: 98 °C i 8 min; 54 °C i 60 min och håll i 4 °C.
- Tillsätt 600 μL av Bindningsbufferten till en jonkromatografi (IC) som placeras i ett uppsamlingsrör.
- Lägg till DNA-provet i IC-kolonnen som innehåller bindningsbufferten och blanda genom att invertera röret flera gånger. Centrifugera i 30 s i full fart. Kassera det insamlade genomflödet.
- Till kolumnen tillsätt nu 100 μL Wash Buffer. Utför centrifugeringen enligt beskrivningen i steg 3.2.4 och kassera genomflödet.
- Tillsätt 200 μl Avsulfonationsbuffert och utför inkubation vid rumstemperatur i 15-20 min. Centrifugera och kassera genomflödet enligt anvisningarna i steg ovan.
- Tillsätt 200 μL Wash Buffer till kolonnen. Centrifugera i full fart i 30 s och kassera genomflödet.
- Upprepa steg 3.2.7.
- Överför kolonnen till ett nytt 1,5 mL uppsamlingsrör och tillsätt 100 μL PCR-grade vatten på kolonnens membran. Centrifugera i full fart i 1 min för att elera DNA:t.
- Bedöm koncentrationen av bisulfitomvconverted DNA-prov genom att mäta absorbansen vid 260 nm med hjälp av en spektrofotometer.
OBS: Använd värdet 40 μg/mL för absorbans vid 260 nm = 1,0. - Förvara DNA vid -20 °C för korttidsförvaring eller vid -70 °C för långtidsförvaring.
4. Tillverkning av anordning för droppgenerering
OBS: En mikrofluidisk anordning som används för droppgenerering (CAD-fil som tillhandahålls i den kompletterande informationen) tillverkades i ett renrum (klass 1 000) miljö i termoplastisk elastomer (se Tabell of Materials) med hjälp av varmprägling som genereras av följande protokoll.
- SU-8 mögel tillverkning
- Förbered en SU-8 mögel på en 6 "kisel wafer med hjälp av standard fotolitografi som beskrivs nedan.
- Rengör en 6 " kisel wafer med hjälp av syre plasma vid 500 W för 10 s.
- Spin-coat SU-8 motstå på kisel wafer vid 900 rpm för 40 s för att uppnå en total filmtjocklek av 100 μm.
- Placera rån på en kokplatta och förbaka i 15 min vid 65 °C, följt av 2 h vid 95 °C.
- Exponera för UV-ljus vid 365 nm (Hg i-line) genom en fotomask med hög definition av transparens med hjälp av en exponeringsdos på 1 000 mJ/cm2.
- Placera rån på en kokplatta och efterbaka i 15 min vid 65 °C, följt av 40 min vid 95 °C.
- Utveckla genom att fördjupa i propylenglykol monometyleter acetat (PGMEA) i 5 min.
- Skölj med PGMEA och isopropanol och torka med en ström av kvävegas.
- Placera rån på en kokplatta och hårdbaka i 2 h vid 135 °C.
- Silanize rån i vakuum desiccator som innehåller en droppe silanizing agent (tricholoro perfluoroktyl silan) placeras på en intilliggande glas mikroskop glida för 2 h.
OBS: Detta görs för att silanerna ska bildas ett monolayer på SU-8-mästarens yta. Tricholoro perfluoroktyl silan ska alltid hanteras i draghuven och hållas borta från vattenkällor.
- Polydimetylsiloxan (PDMS) replika
- Förbered flytande prepolymerer av PDMS (se Tabell över material) vid ett 10:1-förhållande w/w elastomerbas till härdningsmedel i en plastkopp.
- Placera koppen i en planetär centrifugal vakuum mixer att blanda och avgasa PDMS blandningen.
- Häll PDMS blandning på formen placeras i den anpassade metallhållare som förhindrar harts läckage och bota vid 65 °C i 2 h.
- Använd pincett, skala försiktigt bort PDMS mögel från SU-8 mästare.
- Epoxi mögel
OBS: En epoxiform tillverkades från SU-8/silicon master med hjälp av en mellanliggande replikeringsprocess med PDMS.- Förbered epoxihartsen (se Tabell över material) med hjälp av ett 100/83 w/w-förhållande av harts/härdare.
- Avgasa blandningen under minskat tryck med hjälp av en vakuumtorkning ugn i 30 min.
- Häll kådan över PDMS-repliken och bota vid 80 °C i 12 h.
- Ta bort den härdade epoxiformen från PDMS-replikan, placera på en värmeplatta och hårdbaka i 2 h vid 120 °C.
- TPE-enhet
- Extrudera pellets av TPE (se Tabell av material) vid 165 °C i 2,0 mm tjocka och 7"breda ark av flera meter i längd och lagra dem som en rulle för framtida bruk.
- Skär TPE arket från rullen med sax i en 7 "kvadrat.
- Placera TPE-arket mellan epoxiformen och ett icke-mönstrat kiselrån av kisel (se steg 4.1.10 för wafer silaniseringsprocedur).
- Utför varmprägling vid en temperatur på 125 °C, en pålagd kraft på 10 kN, och ett tryck på 10– 2 mbar i 10 min.
- Demold försiktigt i rumstemperatur med hjälp av metanol spray för att separera präglade TPE från kisel wafer och epoxi mögel.
- Skär ytterligare 7 "kvadratiska ark TPE och placera den mellan två icke-mönstrade silanized kisel wafers.
- Utför varmprägling vid en temperatur på 140 °C, en pålagd kraft på 10 kN, och ett tryck på 10–2 mbar i 10 min för att bilda en planaryta för stängning av kanalerna och tätning av enheten.
- Demold försiktigt i rumstemperatur med hjälp av metanol spray för att separera präglade TPE från de två kisel plattor.
- Skär var och en av de präglade TPE ark till enhetens storlek med hjälp av en läkare blad.
- Stansa inkopplingshålen för in- och utloppskanalerna i den strukturerade enheten med hjälp av en 1 mm biopsistansnål med en kolv.
- Omslut kanalerna genom att placera en planar TPE-apparat i direkt kontakt med kanalerna i rumstemperatur.
- Ställ eventuellt i en ugn vid 70 °C i 2 h för att främja enhetsbindning.
- Montera åtkomsthålen med en engångs fluidikslang (I.D. 0,25 mm, O.D. 0,8 mm). Täta lederna med hjälp av en epoxilim för att säkerställa läckagesäker manipulation.
5. Droplet generation och PCR
OBS: Tabell 1 beskriver information om framåt- och omvänt primers tillsammans med de dubbelsläckta hydrolysproterna för C-LESS- CD3Z- och Foxp3-gener, som krävs för multiplexförstärkning av demetylerade genmål.
- Förbered mastermixen enligt beskrivningen i tabell 2.
- Tina alla komponenter i master mix med undantag för enzymblandningen. Blanda mastermixen noggrant genom att pipettera upp-ner och snurra ner en kort stund.
- Tillsätt lämplig volym (1 μL) av bisulfiteconverted DNA (från avsnitt 3.2) till mastermix i ett PCR-rör. Blanda reaktionen genom att pipettera upp-ner och snurra ner en kort stund.
- Anslut engångs fluidikrör (I.D. 0,25 mm, O.D. 1,6 mm) till två precisionsglassprutor (250 μL-volym) med peek-kopplingar.
- Förfyll en precisionsglasspruta med 250 μL bärolja innehållande 5 % fluor-ytaktiva ämnen.
- Förfyll en annan precisionsglasspruta med 50 μL bärolja innan du laddar 100 μL av PCR-mixen för att säkerställa dispensering av hela provvolymen under emulgering.
- Ställ in en droppe mikrofluidisk enhet på en scen av en upprätt ljus mikroskop utrustad med en höghastighetskamera för att observera och registrera droppbildning i realtid.
- Placera de förfyllda sprutorna på den programmerbara sprutpumpen och använd PEEK union med beslag (se Table of Materials), anslut sprutornas slangar till slangarna till droppens mikrofluidiska apparats respektive inloppskanaler.
- Placera slangen från utloppet på droppgeneratorn inuti ett 0,5 mL PCR-rör.
- Justera sprutpumpens flödeshastighet till 2 μL/min och låt droppstorleken stabiliseras innan den uppkomna emulsionen samlas upp.
- Samla upp emulsionen och överför 75 μL till ett 0,2 mL PCR-rör för termisk cykling.
- Se till att oljehalten i PCR-röret nära överensstämmer med volymen i den spridda fasen för att förhindra att dropparna kolas under termisk cykling.
- Placera 0,2 mL PCR-röret i termisk cycler och utför cykelprotokollet enligt följande: förvärmning vid 95 °C i 5 min, därefter 45 cykler vid 95 °C för 15 s och glödgning/förlängning vid 60 °C i 30 s.
- Använd den återstående emulsionen för att fylla ett borosilikerat kapillärrör (100 μm djup) med en rektangulär profil för att bilddroppar ska kunna avbildas och bedöma droppdiametern.
- Placera borosilikatröret fyllt med emulsionen på ett mikroskopslid. Använd ett inverterat mikroskop utrustat med en EMCCD-kamera och 10x-målsättning för att spela in ljusa fältbilder av dropparna.
- Mät droplet diametern med hjälp av en bild analys programvara som beskrivs nedan.
- Ställ in skalan för känt avstånd i mikrometer som motsvarar antalet pixlar i bilden genom att välja knappen 'Analysera' och sedan 'Ställskala '.
- Konvertera bilden till gråskala genom att välja 'Image' -knappen och sedan 'Skriv'. Justera ljusstyrka och kontrast om det behövs. Ställ in ett manuellt tröskelvärde för att avgränsa och fylla cirklarna genom att välja 'Image' -knappen och sedan 'Justera tröskelvärde'.
- Analysera partiklarna genom att välja knappen 'Analysera partiklar' och ställa in cirkuläriteten till 0,75 – 1.
- Erhåll det resulterande området och diametern på de uppmätta dropparna som automatiskt visas i programvaran.
- Beräkna medelvärdet droplet diameter och förutsatt att en sfärisk droppe, uppskatta partitionen volymen, som kommer att användas för att beräkna absolut målkoncentration.
- Se till att dropparna är monodisperse genom att analysera variationskoefficienten (CV) som tas som kvoten mellan standardavvikelserna och medelvärdena (k = 1), för droppdiametern (< 3%).
6. Fluorescensavbildning och bildanalys
- Avbildning av fluorescens
- Efter förstärkning överför du PCR-emulsionen till kapillärröret i borosilikat (50 μm djup) med en rektangulär profil för att kunna ordna droppar till ett tättpackat monolager för avbildning.
- Fixera de fyllda kapillärerna på mikroskopsglaset och täta båda sidor med hjälp av ett UV-akryllim. Applicera en UV-ljuskälla på UV-limmet var noga med att inte belysa emulsionen för att undvika att bleka provet.
- Ladda glasglaset på ett inverterat mikroskop utrustat med en EMCCD-kamera och ett 10x-mål.
- Använda mikroskop bildhantering programvara, välj Förvärva | Live - Snabb att starta realtid kamera förvärv, observera provet, och se till att bredden på kapillären fångas.
- Ställ in den ljusa fältlampan för diaskopisk belysning vid 3,5 V.
- Ställ in led-lysröret med bredspektrum för episkopisk belysning vid 20% intensitet.
- Justera infångningsinställningen för alla våglängder (Bright field, FAM, HEX och Cy5) manuellt genom att välja Kalibrering | Kommandot Optiska konfigurationer i bildhanteringsprogrammet. För varje fluorofor behöver motsvarande fluorescensfilterkub manuellt växlas. En filterkub för den ljusa fältavbildningen måste användas för att behålla samma optiska bana.
- Justera exponeringstiden manuellt före bildförvärv med hjälp av Acquire | Kommandot Kamerainställningar för varje fluorofor som sammanfattas i tabell 3. Ställ in avläsningsläget EM gain 17 MHz på 16-bitars med en förstärkningsmultiplikator på 100 i menyn 'Capture Settings' i programvaran.
- I PROGRAMVARANS LUT-fönster ställer du in LUTs-skalan så att överföringssignalen omfattas inom det inställda intervallet. I detta experiment sattes skalan från 500 upp till 12 000 ungefär.
- Automatisera infångningen med hjälp av ett multipointförvärvsprogram med hjälp av både XY-sökning och flera våglängdsalternativ i den specifika ordningen. Se till att scenen flyttas till den inledande positionen, fånga alla olika våglängder och fortsätt sedan till nästa position.
- Först ställa upp XY scan genom att anpassa XY scan profil i XY scan menyn av programvaran. I 'Custom Multipoint Definition', välj den stora bilddefinitionsrutan och ställ in den på 40,0 x 1,0 mm ungefär (emulsionsfyllningens längd). Använd 1% överlappning.
- Aktivera alternativet 'Använd Fokusyta' och ställ in fokusytakurvan genom att justera fokusplanet vid olika punkter på provet med hjälp av fokusratten på mikroskopet.
- För det andra, setup den flera våglängd scan genom att välja fliken skanning. Lägg till var och en av de optiska konfigurationer som skapats i steg 6.1.7 för varje våglängd.
- Klicka på alternativet för att stänga aktiv slutare under scenförflyttning och under filterbyte för att undvika att bleka provet och köra förvärvet genom att trycka på knappen 'Startköras.. Exportera varje anskaffningsram i tiff-filer och dela upp varje kanal i en separerad fil med hjälp av alternativet Dela flera filer och genom att tillämpa sparade LUTs-inställningar. Använd alternativet punktnamn och kanalnamn för att enkelt skilja varje bildfil åt.
- Bildanalys
- Sortera alla förvärvade bilder av brightfield och fluorescens filter för att ladda upp till en öppen källkod bildanalys programvara.
- Använd bildanalysprogramvara för att skapa en pipeline för att identifiera alla droppar med hjälp av brightfield-bilder och mät sedan intensiteten hos tillhörande lysrörsdroppar.
- Till pipeline, ladda upp brightfield och fluorescens tiff bilder sedan lägga till moduler 'ColorToGray', 'IdentifyPrimaryObjects', 'MeasureObjectIntensity', och 'ExportToSpreadsheet'. Använd brightfield droplet bilder för att identifiera objekt, sedan använda objekt som mask för att mäta intensiteten av fluorescerande bilder.
- Kör pipeline med utvalda tiff-bilder för att extrahera genomsnittlig fluorescensintens av fluorescensdroppbilder. Genomföra experimentet i tre exemplar, med varje uppsättning som består av ~ 5.000 droppar för analys.
- Tillämpa algoritmen 'definetherain' (http://definetherain.org.uk/) för att identifiera de positiva och negativa droppklustren. De positiva bör ligga inom 3 standardavvikelser av medelvärdet. Detta bestämmer tröskelintensiteten hos positiva droppar som ska användas för räkning.
- Återigen använda programvaran bildanalys för att genomföra en ny pipeline där fluorescenströskeln för varje gen mål är inställd enligt definitionen i föregående steg.
- Ladda upp brightfield och fluorescerande bilder till pipeline. Lägg till moduler 'ColorToGray', 'RescaleIntensity', 'Threshold', 'IdentifyPrimaryObjects', 'MeasureObjectSizeShape', 'FilterObjects', och 'ExportToSpreadsheet'. Skapa unika moduler för brightfield-bilder och varje fluorescensfilter för droppar.
- Skala om bildintensitetsskala från 0 till 1 för varje fluorescensbildgrupp. Ställ sedan in tröskelvärdet för att identifiera och räkna objekten över det fastställda tröskelvärdet. Om det behövs, lägg till 'ExpandOrShrinkObjects' modul för att krympa objekt för att underlätta räkning och identifiering av droppar i brightfield.
- Identifiera endast objekt inom vald storlek på 20–30 pixlar och filtrera de räknade objekten så att de bara behåller de objekten med en specifik diameter (dvs. droppar i 75 μm diameter-området) och en rund sfärisk excentricitet på 0,5 och under.
- Exportera resultaten till en tabell som listar det totala antalet droppar från brightfield-bilder, samt droplet-antal av alla fluorescenskanaler som används; nämligen Cy5 för C-LESS-gen, HEX för metylerad CD3Z-gen, och FAM för metylerad FOXP3-gen (se Kompletterande Information för råda experimentella data som erhållits för den presenterade mdPCR-analysen).
- Beräkna förhållandet mellan negativa droppar för varje genmål och tillämpa Poisson-fördelning för att erhålla respektive kopior per droppe (CPD) med hjälp av ekvation 1:
där x representerar antalet droppar som innehåller 0, 1, 2 eller fler molekyler, och λ representerar CPD-värdet. - Beräkna, den absoluta målkoncentrationen genom att ta förhållandet mellan CPD-värdet och den droppvolym som erhålls i steg 5.20 med ekvation 2:
där värdet (1-p) representerar fraktionen av negativa droppar. - Beräkna andelen CD3+ T-Cells och CD4+ CD25+ T-Regs genom att dividera respektive CPD-värden för metylerade CD3Z- och FOXP3-gener med C-LESS – eller totalcell – CPD-värde (se Tilläggsinformation för CPD-beräkningar från rådata).
- Jämför dessa procentvärden med de som erhålls från immunofluorescensavbildning med hjälp av antikroppar för CD3+ T-Cell och CD4+ CD25+ T-Reg-räkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den TPE-baserade mikrofluidiska droppgeneratoranordningen tillverkades med hjälp av det beskrivna protokollet enligt figur 1. En öppenhet mask användes i fotolitografi för att få kisel (Si) master. Mjuk litografi utfördes för att erhålla en omvänd PDMS replika av Si master som sedan användes för att fabricera epoxi mögel. Epoxi föregångare hälldes på PDMS och botas till crosslink och härda. Denna form, som representerar den exakta kopian av Si master var mer motståndskraftig för efterföljande termoformning av termoplaster med hjälp av varm prägling. När epoxiformen erhölls var termoplastisk elastomer präglad. Efter präglingen var TPE demolded, och enheter skars. Ett platt TPE-substrat användes för att försegla anordningen. Hål slogs i det övre locket, och de två substraten var bundna. Slutligen sattes de nödvändiga slangarna för anslutningar från världen till chip in och enheten var klar för användning. Provbilder av fabricerade master mögel, TPE material och präglade enheter visas i figur 2. Monterad anordning med slangar sammanlänkningar drevs med ett par oberoende programmerbara spruta pumpar för att generera emulsioner för mdPCR. Mettylation-specifika mdPCR utfördes med hjälp av bisulfitbehandlat DNA som extraherats från frysta PBMCs. Lämpliga primers och hydrolys sonder för CD3Z, FOXP3 och C-Less gener lades till PCR mix för emulgering. Efter droppgenerering av lämplig storlek (ungefär 72 μm diameter) utsattes emulsionen för ett termiskt cykelprotokoll. Slutligen infördes dropparna i ett glas kapillär med 1 mm bredd och 50 μm höjd för bildbehandling. Detta resulterar i en monolayerfördelning av droppar som är idealiska för fluorescensbildförvärv (Figur 3). Bilder spelades in för var och en av de fyra våglängderna. En bildanalys utfördes sedan för att identifiera alla droppar (figur 4) som uppfyller tröskelvärdet kriterier som fastställts genom 'definetherain' algoritm. Fluorescensintensiteten hos alla droppar i deras respektive fluorofore ritas sedan upp och tröskeln för positiva och negativa droppar fastställdes (Figur 5). Därefter utfördes identifiering och räkning av dessa droppar som låg över den valda tröskeln. CPD-värdena beräknades sedan och andelen CD3+ T-Cell och CD4+ 25+ T-Regs fastställdes baserat på metylerade CD3Z- respektive FOXP3-kopior med avseende på CPD för totalceller, eller C-LESS-gen (figur 6). Procentvärdena jämfördes sedan med de som erhölls genom immunofluorescensavbildning av T-Cell- och T-Reg-populationer med hjälp av lämpliga antikroppar.
| FOXP3 Framåt | GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG | |
| FOXP3 Omvänd | TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA | |
| CD3Z Framåt | GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG | |
| CD3Z Omvänd | CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA | |
| C-MINDRE Framåt | TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA | |
| C-MINDRE Omvänd | TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C | |
| FOXP3 Sond | /56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/ | |
| CDZ3-sond | /56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/ | |
| C-Mindre Sond | /56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/ | |
Tabell 1: Primer och hydrolyssondsdesign.
| Reagens | Lager lösning | Volym för mastermix | Fungerande koncentration |
| Tris-HCl | 1 M | 2 μL | 20 mM |
| KCl | 1 M | 10 μL | 100 mM |
| MgCl2 | 25 mM | 16 μL | 4 mM |
| C-MINDRE Primers | 10 μM | 10 μL | 1 μM var |
| CD3Z-grundor | 10 μM | 10 μL | 1 μM var |
| FOXP3 Grundare | 10 μM | 10 μL | 1 μM var |
| C-MINDRE sond | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| CD3Z-sond | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| FOXP3 sond | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| HotStarTaq DNA-polymeras | 5 Enheter/μL | 8 μL | 0,4 enheter/μL |
| Bisulfitbehandlat DNA-mål | Variabel | Variabel | Variabel |
| Nukleasefritt vatten | Variabel | ||
| Total volym | 100 μL |
Tabell 2: Master mix recept för mdPCR.
| Optisk konfiguration | Exponering | DIA-lampa | Florescent ljus |
| Ljust fält | 50 ms | På | Av |
| Fam | 300 ms | Av | 20% |
| Hex | 300 ms | Av | 20% |
| Cy5 | 400 ms | Av | 20% |
Tabell 3: Inställningar för optisk konfiguration och bildanskaffning.
Bild 1: Snabb prototypframtagning av droppgeneratorn. Schematisk illustration av den process som används för tillverkning av (A) master mögel och (B) TPE-baserade mikrofluidic emulgering enhet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Komponenter som är involverade i tillverkningsprocessen. (A) Silicon master, (B) PDMS replika, (C) epoxi mögel, (D) TPE material extruderas i ark och förpackade i rullar, (E) präglade TPE och (D) monterad anordning. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Fluorescensbildanskaffning av droppar efter termisk cykling. (A) Brightfield bild av dropparna i en kapillär som tillät monolayer bild förvärv. (B) Cy5 filterbild av C-LESS-genmål som representerar totalt cellantal. (C) HEX filterbild av metylerad CD3Z gen mål korrelerade till CD3+ T-Cell antal. (D) FAM filterbild av metylerad FOXP3 gen mål korrelerad till CD4+ CD25+ T-Reg räkna. Skala bar är 100 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Pipeline som används för identifiering av droppar som uppfyller tröskelintensiteten. Bilder organiserades först i lämpliga fluorescensfilter med filnamngivning. Bilderna konverterades sedan till gråskala och relativa intensiteter skalas om baserat på minsta och högsta droplet fluorescens intensiteter. Tröskeln valdes sedan enligt värden som erhållits från 'definetherain'-algoritmen och de objekt – eller droppar – som uppfyller de definierade kriterierna identifierades och kvantifierades. Slutligen filtrerades föremålen efter excentricitet och storlek för att erhålla det raffinerade droppräkningen av sfäriska objekt som uppfyller 75 μm diameterstorlek. De kvantifierade objekten och deras intensiteter exporterades sedan till ett kalkylprogram för nedströmsanalys. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Intensitetssplotter för fluorescensintensitet hos droppar efter mdPCR. (A) C-LESS genförstärkning med Cy5 hydrolys sond som representerar den totala cellen räkna som målregionen saknade cytosinrester och, därför, resistenta mot bisulfit behandling. (B) Metylerad CD3Z genförstärkning med HEX hydrolys sond, vägledande för CD3+ T-Cell population. (C) Metylerad FOXP3 genförstärkning med FAM hydrolys sond, som representerar CD4+ CD25+ T-Reg befolkningen. Alla scatter-plottar utsattes för "definetherain"-algoritm för att fastställa lämplig tröskel varigenom de positiva var inom 3 standardavvikelser för det positiva kluster medelvärdet. Mängden "regn" fastställdes också så att det överstiger 1% av de positiva definierade dropparna. Varje datauppsättning för analys bestod av ~5 000 droppar och körts i tre exemplar (se Kompletterande information för rådata och analys). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: CPD-värden för alla genmål och bestämning av delmängdsprocent för vita blodkroppar. (A) De beräknade CPD-värdena baserat på Poissonfördelningen av det positiva dropptalet som ett förhållande mellan totala droppar. Indata representerar den teoretiska CPD förväntas baserat på 740 ng av bisulfitbehandlade DNA, 75 μm diameter droppar, förutsatt 6.6 pg för 1 genkopia. Indatateoretiska CPD var 0,25 och korrelerade med C-LESS CPD som representerar det totala celltalet. (B) Förhållandet mellan CPD för CD3Z och FOXP3 med avseende på C-LESS användes sedan för att erhålla procenten av CD3+ T-Cells respektive CD4+ CD25+ T-Regs. Dessa nyckeltal som procent av totala leukocyter jämfördes sedan med värden som erhållits genom immunofluorescens imaging. Som visats korrelerar värdena från mdPCR och immunofluorescensanalysen med ingen signifikant skillnad, med standardavvikelsefel från mdPCR mycket mindre uttalad. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande information. Vänligen klicka här för att ladda ner dessa filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterade experimentella protokoll och metoder möjliggör in-house mdPCR med hjälp av en fabricerad TPE droplet generator, en termisk cycler och fluorescens mikroskop. Den tillverkade enheten med hjälp av mjuk TPE till TPE bindning ger hydrofoba ytegenskaper som är enhetliga över alla kanalväggar, så att den slutliga enheten inte kräver någon ytbehandling för efterföljande användning som en droppgenerator. Detta material har rutinmässigt anställda i point-of-care plattformar som kräver kompatibilitet med hög genomströmning tillverkning9,10,11,12,13. Dessutom är det också optiskt klart och uppvisar låg fluorescens bakgrund i det synliga spektrumet som är en attraktiv funktion för framtida integration av ett komplett prov-till-svar arbetsflöde med hjälp av mdPCR. DEN PCR reagens recepten är också provided i en homebrew formaten till tillåta för facile multiplex gen kvantifiering, fördriva tiden också uppehållande stabiliteten alltigenom thermalen cykel protokoll. Som sådan en av fördelarna med de presenterade enheter och protokoll är flexibiliteten i att anpassa enhetens design och reagenser som används för en viss tillämpning, vilket är svårt att uppnå med kommersiella produkter och egenutvecklade formuleringar. Vidare tar det bort nödvändigheten av dyr instrumentering för att utföra experimentet.
Lämpligt termoplastiskt materialval av mikrofluidisk droplet generator är en kritisk parameter som kan kringgå besvärliga ytbehandling att göra enheten hydrofoba för effektiv droppbildning. Dessutom är urvalet av en optimerad mdPCR-buffert också avgörande för att upprätthålla droppstabilitet genom den termiska cykelprocessen – samtidigt som den inte kompromissar med PCR-effektiviteten och hydrolyssondens funktionalitet. Ytterligare modifiering och optimering av mdPCR-bufferten uppmuntras därför att komma fram till mycket specifik och känslig PCR-förstärkning av utvalda genmål, tillsammans med fluorescensbaserad probdetektering. Detta tjänar till att öka signal-brus-förhållanden, minska fallen av "regn" och förenkla experimentell analys och identifiering av positiva dropppopulationer. Felsökning av försöket beror på att man bedömer de kritiska stegen från val av termoplastiskt material till polymeraskoncentration till att anpassa temperaturrampen i det termiska cykelprogrammet för att säkerställa droppstabilitet.
Den nuvarande begränsningen av det beskrivna protokollet är att det fortfarande kräver manuell provöverföring från droppgeneratorn till den termiska växelkuraren och slutligen till en droplet imaging enhet och instrument som ett fluorescensmikroskop. Framtida insatser är dock riktade mot miniatyrisering av mdPCR och integration av dessa steg där droplet generation, PCR och bildbehandling kan utföras på en enda automatiserad plattform.
De erhållna resultaten i figur 6 visar mångsidigheten hos denna mdPCR-metod för att utföra differentiell vit blodkroppskvantifiering. Den föreslagna metoden är mer exakt och reproducerbar än immunofluorescens imaging, som ofta påverkas av användaren manipulation, vilket ger upphov till oönskade mätfel. Detta är också fallet för flödescytometri tekniker som också är beroende av en immun-baserad metod för detektion som är mycket beroende av cellens livskraft, samt flera protokoll steg benägna att användaren fel. Alternativa metoder som kvantitativ PCR (qPCR) i realtid för kvantifieringen påverkas ofta negativt av genmål med lågt kopiertal, en nackdel som åtgärdas genom mdPCR utan att det behövs en dedikerad kalibreringskurva11. Den presenterade mdPCR-metoden presenterar därför en unik molekylär metod för vitt blodcellsdifferentialtal som baseras på metyleringsprofiler av specifika genmål. Kalibreringskurvor för enskilda genmål är inte heller nödvändiga eftersom mdPCR bygger på en absolut kvantifiering av binära positiva och negativa signaler med poissonfördelning för CPD-beräkning.
Den exakta kvantifieringen av icke-metylerade genöar, särskilt av låga kopieringsnummer gener som FOXP3, presenterar en mängd möjligheter för klinisk diagnos. Detta framhävs av kapaciteten hos ett sådant tillvägagångssätt för att identifiera kända metyleringsmönster som korrelerade till sjukdomsuppsigg och progression. mdPCR, som en molekylär strategi med absolut kvantifiering kan användas bortom metylering studier och kan tillämpas på lämpligt bevarade prover, därför ta bort beroendet av färska kliniska prover, och ytterligare utöka dess tillämpningar. Framtida automatisering och miniatyrisering av denna teknik kommer att vara av stort värde för snabb och korrekt klinisk diagnos och efterföljande prognos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga konflikter att deklarera.
Acknowledgments
Författarna erkänner ekonomiskt stöd från National Research Council of Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
- Teitell, M., Richardson, B.
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
- Zouali, M. The Autoimmune Diseases. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
- Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
- Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
- Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).
