Summary
Epigenetiske markører anvendes til hvide blodlegemer (WBC) subtyping gennem kvantificering af DNA methylering mønstre. Denne protokol præsenterer en multiplex dråbe polymerase kædereaktion (mdPCR) metode ved hjælp af en termoplastisk elastomer (TPE)-baserede microfluidic enhed til dråbe generation giver mulighed for præcise og multiplex methylation-specifikke mål kvantificering af WBC differentialetal.
Abstract
En multiplexed dråbe PCR (mdPCR) workflow og detaljeret protokol til bestemmelse af epigenetisk-baserede hvide blodlegemer (WBC) differentialetal er beskrevet, sammen med en termoplastisk elastomer (TPE) microfluidic dråbe generation enhed. Epigenetiske markører bruges til WBC subtyping som er af vigtig prognoseværdi i forskellige sygdomme. Dette opnås ved kvantificering af DNA-methyleringsmønstre for specifikke CG-rige regioner i genomet (CpG loci). I dette papir indkapsles bisulfitbehandlet DNA fra perifere blodmonukleare celler (PBPC'er) i dråber med mdPCR-reagenser, herunder primere og hydrolyselyorescerende sonder, der er specifikke for CpG loci, der korrelerer med WBC-delpopulationer. Multiplex-tilgangen gør det muligt at forhøre mange CpG loci uden behov for separate mdPCR-reaktioner, hvilket muliggør en mere præcis parametrisk bestemmelse af WBC-delpopulationer ved hjælp af epigenetisk analyse af methyleringssteder. Denne præcise kvantificering kan udvides til forskellige applikationer og fremhæver fordelene ved klinisk diagnose og efterfølgende prognose.
Introduction
Analyse af hvide blodlegemer (WBCs) sammensætning er blandt de hyppigst efterspurgte laboratorieundersøgelser i hæmatologisk diagnostik. Differential leukocyt tæller tjener som en indikator for et spektrum af sygdomme, herunder infektion, betændelse, anæmi, og leukæmi, og er under efterforskning som en tidlig prognose biomarkør for flere andre betingelser samt. Guld standard i WBC subtyping indebærer immunstaining og / eller flow cytometri, som begge kræver dyre, ustabilitet-tilbøjelige fluorescerende antistoffer og er ofte meget afhængige af operatørens færdigheder i prøve forberedelse. Desuden gælder denne metode kun for friske blodprøver, således at prøverne ikke kan indefryses til forsendelse eller senere analyse.
Epigenetiske markører har for nylig vist sig som kraftfulde analytiske værktøjer til undersøgelse af fænokomypiske variationer. Efterfølgende, humane leukocyt populationer har vist sig at have celle-afstamning DNA methylering mønstre, der giver mulighed for den præcise karakterisering af WBC delmængder. Subtyping baseret på epigenetiske markører giver et lovendealternativ,der ikke afhænger af frisk blodprøvetagning eller dyre antistoffer og kan udnyttes som biomarkør for sygdomsdebutog modtagelighed 1,2,3,4,5.
Genom-dækkende undersøgelser er blevet udført for omfattende kortlægning af methylerede specifikke CG-rige regioner i genomet (CpG øer) i leukocyt undertyper til at identificere kandidat epigenetiske markører specifikke for leukocyt undertyper. PCR-protokoller er blevet udviklet på grund af denne grund til methylerede genregioner, f.eks.+ + + Wiencke et al. har vist nytten af duplex dråbe PCR for epigenetiske subtyping af T-celler, hvilket giver resultater, der er meget korrelerer med flow aktiveret celle sortering (FACS) analyse6. Denne kvantitative genetiske analysemetode er baseret på at opdele skabelonen nukleinsyre molekyler og PCR reagenser i tusindvis af diskrete, volumetrically defineret, sub-nanoliter størrelse dråber, der indeholder nul, en eller flere mål nukleinsyre kopier, ved hjælp af vand-i-olie emulsioner aktiveret af microfluidics7,8. PCR-forstærkningen udføres inden for hver enkelt dråbe, og slutpunktsfluorescensintensiteten for hver dråbe måles, hvilket giver mulighed for absolut kvantificering af de mål, der er til stede i prøven. Droplet PCR er blevet etableret for at være mere præcis, præcis og teknisk enklere end standard qPCR, hvilket gør det til en mere gunstig DNA methylering-baseret metode til klinisk evaluering af T-celler. Selv om en hurtigt spirende subtyping metode, multiplexed epigenetisk analyse til sonde for forskellige methylerede CpG regioner samtidig mangler. Dette er nødvendigt for rutinemæssige leukocyt differentialetal.
Heri præsenteres og anvendes en termoplastisk elastomer (TPE) dråbemikrinikan og anvendes til methyleringsspecifik multiplexdråbe PCR (mdPCR). Teknologien er blevet brugt til at afgrænse specifikke leukocyt undertyper, CD3+ T-celler og CD4+ CD25+ T-Regs, baseret på celle-lineage DNA methylering mønstre, dvs epigenetiske variation af CD3Z og FOXP3 CpG regioner, hhv. En detaljeret protokol for DNA-ekstraktion, bisulfitkonvertering og mdPCR er beskrevet i samarbejde med en fabrikationsmetode for en TPE dråbegenereringsenhed. Repræsentative resultater af metoden sammenlignes med resultaterne af immunfluorescensfarvning, der fremhæver nytten af den foreslåede fremgangsmåde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de forsøg, der blev udført i denne undersøgelse med humane prøver, blev godkendt af NRC's Etiske Råd og blev udført i henhold til NRC's politikker for humane forsøgspersoner, der følger gældende forskningsretningslinjer og er i overensstemmelse med lovgivningen i Québec, Canada.
1. Celleforberedelse
- Tø straks de frosne perifere humane blodmonnukle celler (PBMC' er) op ved at anbringe kryovialen i et vandbad ved 37 °C i 5 min.
- Inverter kryovial to gange for forsigtigt at resuspendere cellerne og ved hjælp af en 1 ml pipette overføre celle suspension i en 15 ml konisk rør.
- Der tilsættes 10 ml forvarmt (37 °C) vækstmedium suppleret med 10 % føtalt kvægserum (RPMI-1640 + 10% FBS) til det 15 mL-rør, der indeholder PBM'erne.
- Centrifuge celle suspension i en svingende spand centrifuge ved stuetemperatur ved en hastighed på 330 x g i 10 min med hurtig acceleration og bremsen på høj.
- Når spin er overstået, forsigtigt dekantere supernatant. Resuspend cell pellet i 3 ml fosfat-buffered saltvand (PBS) pH 7.2, indeholdende 2 mM ethylenediamintetraacetic syre (EDTA) ved at trykke på siden af rørene.
- Bland cellerne ved at vende røret med hætten tæt lukket.
- Der forbered to 1,5 ml mikrorør og ved hjælp af en pipette aliquot 1,5 ml af cellesuspensionen i hvert rør, hvoraf den ene anvendes til efterfølgende immunfluorescensfarvning og en til DNA-ekstraktionen.
2. Immunofluorescensfarvning og billeddannelsesprotokol
- Opslæmrede celler (fra 1,7) i 200 μL PBS-buffer, der indeholder 0,1 % natriumazid og 2 % FBS, og justerer den endelige koncentration af cellesuspensionen til maksimalt 2 x 107 celler/ml.
- Opdel cellesuspensionen ved at pipettere 100 μL volumen i to separate 1,5 ml mikrorør.
- Der tilsættes 20 μL volumen anti-Hu CD3/CD4 konjugeret med Fluorescein isothiocyanat (FITC) og Phycoerythrin (PE) til et rør og anti-Hu CD4/CD25 konjugeret med HENHOLDSVIS FITC og PE (se materialetabel)til det andet rør.
- Der tilsættes 1 dråbe blå fluorescerende levende celleplet (se Materialetabel)til hvert rør.
- Inkuberes ved stuetemperatur ved hjælp af en rørrotator i 2 timer. Beskyt mod lys.
- Centrifuge celleophænget ved stuetemperatur ved 330 x g i 10 min. med hurtig acceleration og bremsen på høj.
- Dekanter supernatanten og opslæm omhyggeligt cellepellet ved at banke på røret. Der tilsættes 1 ml PBS, pH 7.2 indeholdende 2 mM EDTA. Sikre, at hætten er tæt lukket, bland cellerne ved at vende røret 2x.
- Gentag trin 2.6 og 2.7 for tre gange.
- Opslæmmede celler i 20 μL PBS pH 7.2 indeholdende 2 mM EDTA.
- Pipette 10 μL dråbe af celle suspensionen på en borosilikat mikroskop dias og vente i 2 min for celler til langsomt sediment til bunden af dråben.
- Placer forsigtigt et glasdæksel slip oven på mikroskopet dias og placere dias på scenen af en omvendt mikroskop.
- Optag billeder af cellerne ved hjælp af et 10x mål og et EMCCD-kamera, der er forbundet til mikroskopet for hver af fluorophores for begge cellesuspensionsprøver.
- Tal fluorescerende mærkede celler manuelt (se Supplerende oplysninger om rådata).
- Tag forholdet mellem anti-Hu CD3 og anti-Hu CD4/CD25-mærkede celler til DAPI-farvede celler for at opnå proportionerne af CD3+ T-celler og CD4+ CD25+ T-Regs til total leukocyt.
3. OMdannelse af DNA-ekstraktion og bisulfit
- DNA-ekstraktion
BEMÆRK: Uddrag AF DNA fra PBM'er, der er fremstillet i afsnit 1 ved hjælp af et magnetisk DNA-rensesæt (se materialetabel)efter procedurer fra fabrikanten.- I et 1,5 ml rør skal cellerne i 100 μL PBS og der tilsættes 20 μL Proteinase K og 400 μL lysis/bindingsbuffer. Bland ved pipettering op-ned 10x, derefter udføre inkubation ved stuetemperatur i 5 min.
- Opfang DNA-perlekomplekset ved at placere røret på et magnetisk rack i 1-2 min. og fjern og kassér derefter forsigtigt supernatanten.
- Fjern det rør, der indeholder DNA-perlekomplekset, fra magnetisk rack, og opslænket perlerne i 600 μL vaskebuffer #1 at vaske eventuelle ikke-specifikke bindinger væk.
- Anslå røret igen på den magnetiske rist, og fjern og kassér og kassér supernatanten.
- Trin 3.1.3 og 3.1.4 gentages med 600 μL vaskebuffer #2.
- Lad røret stå åbent for lufttørre i 1 min.
- Fjern røret fra den magnetiske rack og eluter DNA ved at dispensere 100 μL Elution Buffer og pipettering DNA / perle kompleks op og ned 20x.
- Placer røret, der indeholder det eluterede DNA igen på den magnetiske rack og inkuberes i 1-2 min at adskille de magnetiske perler fra eluterede DNA.
- Overfør den eluterede rensede DNA-opløsning til et nyt rent rør.
- Koncentrationen af den rensede DNA-prøve vurderes ved måling af absorbansen ved 260 nm ved hjælp af et spektrofotometer.
- Bisulfite konvertering
BEMÆRK: Udfør bisulfitkonverteringen på renset DNA ved hjælp af et methylationssæt (se Materialetabel)efter procedurer fra producenten.- Til 20 μL DNA-prøve (200-500 ng) i et PCR-rør tilsættes 130 μL omdannelsesgenage. Bland godt og drej ned kort.
- OVERfør PCR-røret til en termisk cykelrytter, og cykelprotokollen udføres således: 98 °C i 8 min. 54 °C i 60 min og hold ved 4 °C.
- Der tilsættes 600 μL af bindingsbufferen til en ic-kolonne (ionkromatografi), der er placeret i et opsamlingsrør.
- Der føjes DNA-prøven til IC-kolonnen, der indeholder bindingsbufferen, og blandes ved at vende røret flere gange. Centrifuge for 30 s ved fuld hastighed. Kassér den opsamles gennemstrømning.
- Til kolonnen nu tilføje 100 μL vask buffer. Centrifugering som beskrevet i trin 3.2.4 udførst, og gennemstrømningen kasseres.
- Der tilsættes 200 μl desulfonationsbuffer, og inkubationen udføres ved stuetemperatur i 15-20 min. Centrifuge og kassér gennemstrømningen som beskrevet i ovenstående trin.
- Der tilsættes 200 μL vaskebuffer til kolonnen. Centrifuge ved fuld hastighed i 30 s og kassér flow-through.
- Gentag trin 3.2.7.
- Kolonnen overføres til et nyt 1,5 ml opsamlingsrør, og der tilsættes 100 μL PCR-vand på kolonnens membran. Centrifuge ved fuld hastighed i 1 min for at fremkalde DNA'et.
- Koncentrationen af bisulfit-konverteret DNA-prøve ved måling af absorbansen ved 260 nm ved hjælp af et spektrofotometer.
BEMÆRK: Brug en værdi på 40 μg/ml for absorbans ved 260 nm = 1,0. - OPBEVARES DNA ved -20 °C til korttidsopbevaring eller ved -70 °C til langtidsopbevaring.
4. Fremstilling af udstyr til fremstilling af dråbegenerering
BEMÆRK: En mikrofluidisk anordning, der anvendes til dråbegenerering (CAD-fil i de supplerende oplysninger) blev fremstillet i et rent rum (klasse 1.000) miljø i termoplastisk elastomer (se Tabel over materialer) ved hjælp af varm prægning genereret af følgende protokol.
- SU-8 skimmel fabrikation
- Forbered en SU-8 skimmel på en 6 "silicium wafer ved hjælp af standard fotolitografi som beskrevet nedenfor.
- Rengør en 6 "silicium wafer ved hjælp af ilt plasma ved 500 W for 10 s.
- Spin-coat SU-8 modstå på silicium wafer på 900 rpm for 40 s for at opnå en samlet film tykkelse på 100 μm.
- Waferen på en kogeplade og forbages i 15 minutter ved 65 °C efterfulgt af 2 timer ved 95 °C.
- Eksponeres for UV-lys ved 365 nm (Hg i-line) gennem en high-definition gennemsigtighed fotomaske ved hjælp af en eksponeringsdosis på 1.000 mJ/cm2.
- Waferen på en kogeplade og bages i 15 minutter ved 65 °C efterfulgt af 40 minutter ved 95 °C.
- Udvikles ved nedsænkning i propylenglycol monomethyl ether acetat (PGMEA) i 5 min.
- Skyl med PGMEA og isopropanol og tør med en strøm af nitrogen gas.
- Waferen på en kogeplade og bages hårdt i 2 timer ved 135 °C.
- Silanisere waferen i vakuumeksiccatoren indeholdende en dråbe silaniseringsmiddel (tricholoro perfluorooctylsili), placeret på et tilstødende glasmikroskopglas i 2 timer.
BEMÆRK: Dette gøres for at få silanes til at danne et monolag på overfladen af SU-8 masteren. Tricholoro perfluorooctylsilian skal altid håndteres i røghætten og holdes væk fra vandkilder.
- Polydimethylsiloxan (PDMS) replika
- Forbered flydende præpolymerer af PDMS (se Tabel af materialer) ved et 10:1 forhold w / w af elastomer base til hærdningsmiddel i en plastik kop.
- Placer koppen i en planetarisk centrifugal vakuum mixer til at blande og afgas PDMS blandingen.
- Hæld PDMS blanding på formen placeret i den brugerdefinerede metalholder, der forhindrer harpiks lækage og helbrede ved 65 °C i 2 timer.
- Brug en pincet, forsigtigt skrælle PDMS skimmel fra SU-8 master.
- Epoxy skimmel
BEMÆRK: En epoxyform blev fremstillet af SU-8/siliciummasteren ved hjælp af en mellemliggende replikationsproces med PDMS.- Epoxy harpiks (se Tabel af Materialer)ved hjælp af en 100/83 w / w forholdet mellem harpiks / hærder.
- Afgas blandingen under reduceret tryk ved hjælp af en vakuumtørreovn i 30 min.
- Hæld harpiksen over PDMS replika og hærde ved 80 °C i 12 timer.
- Fjern den hærdede epoxyform fra PDMS replika, sted på en varmeplade og hård bages i 2 timer ved 120 °C.
- TPE-enhed
- Ekstrudere pellets af TPE (se Tabel af Materialer) ved 165 °C i 2,0 mm tyk og 7 "brede plader af flere meter i længden og gemme dem som en rulle til fremtidig brug.
- Skær TPE ark fra rullen ved hjælp af en saks i en 7 "firkant.
- Placer TPE ark mellem epoxy skimmel og en ikke-mønstret silaniseret silicium wafer (se trin 4.1.10 for wafer silanization procedure).
- Varmpræst ved en temperatur på 125 °C udføres, en påført kraft på 10 kN og et tryk på10-2 mbar i 10 min.
- Demold omhyggeligt ved stuetemperatur ved hjælp af methanol spray til at adskille den prægede TPE fra silicium wafer og epoxy skimmel.
- Skær en anden 7 "firkantet ark TPE og placere den mellem to ikke-mønstrede silanized silicium vafler.
- Varmpræsentation udføres ved en temperatur på 140 °C, en påført kraft på 10 kN og et tryk på10-2 mbar i 10 min. for at danne en planaroverflade til lukning af kanalerne og forsegling af anordningen.
- Demold omhyggeligt ved stuetemperatur ved hjælp af methanol spray til at adskille den prægede TPE fra de to silicium vafler.
- Skær hver af de prægede TPE ark til enhedens størrelse ved hjælp af en læge klinge.
- Punch adgangshullerne for indløbs- og udløbskanalerne i den strukturerede enhed ved hjælp af en 1 mm biopsi-hulnål med et stempel.
- Omslut kanalerne ved at placere en planar TPE-enhed i direkte kontakt med kanalerne ved stuetemperatur.
- Eventuelt skal du placere i en ovn ved 70 °C i 2 timer for at fremme enhed limning.
- Sæt adgangshullerne med en engangsvæskeslange (ID 0,25 mm, O.D. 0,8 mm). Luk leddene ved hjælp af en epoxylim for at sikre lækagesikker manipulation.
5. Dråbegenerering og PCR
BEMÆRK: Tabel 1 skitserer oplysninger om de forreste og omvendte primere sammen med de dobbeltslukkede hydrolysesonder for C-LESS-, CD3Z- og Foxp3-gener, som er nødvendige for multiplexforstærkning af demethylerede genmål.
- Forbered mastermixet som beskrevet i tabel 2.
- Tø alle komponenter i master mix undtagen enzymblandingen. Bland master mix grundigt ved pipettering op-ned og drej ned kort.
- Der tilsættes det relevante volumen (1 μL) af bisulfitomvendt DNA (fra punkt 3.2) til masterblanding i et PCR-rør. Bland reaktionen ved at pipettere op og dreje ned kortvarigt.
- Tilslut engangsvæskeslanger (I.D. 0,25 mm, 1,6 mm) til to præcisionsglassprøjter (250 μL volumen) ved hjælp af PEEK-fittings.
- Forfyld en præcisionsglassprøjte med 250 μL bæreolie indeholdende 5 % fluor-overfladeaktivt stof.
- Udfyld endnu en præcisionsglassprøjte med 50 μL bæreolie, før der isættes 100 μL PCR-blandingen for at sikre dispensering af hele prøvevolumenet under emulgering.
- Opsæt en dråbe mikrofluidic enhed på en fase af en opretstående lys mikroskop udstyret med en high-speed kamera til at observere og optage dråbe dannelse i realtid.
- Anlækning af de fyldte sprøjter på den programmerbare sprøjtepumpe og ved hjælp af PEEK-ation med beslag (se Materialetabel),tilslut sprøjternes slange til slangen på de respektive indløbskanaler på dråbens mikrofluidiske anordning.
- Anslæb slangen fra udløbsgeneratoren i et 0,5 ml PCR-rør.
- Juster sprøjtepumpens strømningshastighed til 2 μL/min., og lad dråbestørrelsen stabilisere sig, før den resulterende emulsion opsamler.
- Emulsionen opsamls, og overfør 75 μL til et 0,2 ml PCR-rør til termisk cykling.
- Sørg for, at olieindholdet i PCR-røret nøje svarer til mængden af den spredte fase for at forhindre sammens kuling af dråberne under termisk cykling.
- 0,2 ml PCR-røret anbringes i termiskcykel, og cykelprotokollen udføres således: forvarmning ved 95 °C i 5 min. og derefter 45 denatureringscyklusser ved 95 °C i 15 s og glødning/forlængelse ved 60 °C i 30 s.
- Brug den resterende emulsion til at fylde et borosilikatkapillærrør (100 μm dybde) med en rektangulær profil for at afbilde dråber og vurdere dråbediameteren.
- Anstænkningsrøret, der er fyldt med emulsionen, anbringes på et mikroskopskreds. Brug et omvendt mikroskop udstyret med et EMCCD-kamera og 10x mål til at optage lyse feltbilleder af dråberne.
- Mål dråbediameteren ved hjælp af en billedanalysesoftware som beskrevet nedenfor.
- Indstil skalaen af kendt afstand i mikron, der svarer til antallet af pixel i billedet, ved at vælge knappen 'Analyze' og derefter 'Set Scale'.
- Konverter billedet til gråtoneskala ved at vælge knappen 'Billede' og derefter 'Skriv'. Juster lysstyrke og kontrast, hvis det er nødvendigt. Angiv en manuel tærskel for at afgrænse og udfylde cirklerne ved at vælge knappen 'Billede' og derefter 'Juster tærskel'.
- Analyser partiklerne ved at vælge knappen 'Analyser partikler' og indstille cirkulariteten til 0,75 – 1.
- Få det resulterende område og diameteren af de målte dråber, som automatisk vises i softwaren.
- Beregne den gennemsnitlige dråbe diameter og under forudsætning af en sfærisk dråbe, anslå partition volumen, som vil blive brugt til at beregne absolut målkoncentration.
- Sørg for, at dråberne er monodisperse ved at analysere variationskoefficienten (CV), der tages som forholdet mellem standardafvigelserne og middelværdierne (k = 1), for dråbediameteren (< 3%).
6. Fluorescensbilleddannelse og billedanalyse
- Fluorescens-billeddannelse
- Efter forstærkning overføres PCR-emulsionen til borosilikatkapillærrør (50 μm dybde) med en rektangulær profil for at arrangere dråber i et tætpakket monolayer til billeddannelse.
- Fastgør de fyldte kapillærer på et mikroskop dias og forsegle begge sider ved hjælp af en UV akryl lim. Påfør en UV-lyskilde på UV-klæbemidlet, og pas på ikke at belyse emulsionen for at undgå blegning af prøven.
- Læg glasrutsjebanen på et omvendt mikroskop udstyret med et EMCCD-kamera og et 10x mål.
- Ved hjælp af mikroskopbilledbehandlingssoftware skal du vælge Hent | Live - Hurtig til at starte real-time kamera erhvervelse, observere prøven, og sikre, at bredden af kapillær er fanget.
- Indstil den lyse feltlampe til diaskopisk belysning til 3,5 V.
- Indstil den bredspekterede LED-lysstofrør til episkopisk belysning til 20 % intensitet.
- Juster opsamlingsindstillingen for alle bølgelængder (Lys felt, FAM, HEX og Cy5) manuelt ved at vælge kalibrering | Kommandoen Optiske konfigurationer i billedsoftwaren. For hver fluorophore skal den tilsvarende fluorescensfilterkube skiftes manuelt. Der skal bruges en filterkube til den lyse feltbilleddannelse til at bevare den samme optiske kurve.
- Juster eksponeringstiden manuelt før billedankomst ved hjælp af Hent | Kameraindstillinger for hver fluorophore som opsummeret i tabel 3. Indstil udlæsningstilstanden EM gain 17 MHz ved 16-bit med en forstærkningsmultiplikator på 100 i menuen 'Capture Settings' i softwaren.
- I SOFTWARENS LUT-vindue skal du indstille LUTs-skalaen, så transmissionssignalet er omfattet inden for det indstillede område. I dette eksperiment blev skalaen sat fra 500 op til 12.000 ca.
- Automatiser hentning ved hjælp af et multipunkt-anskaffelsesprogram ved hjælp af både XY-scanning og flere bølgelængdeindstillinger i den specifikke rækkefølge. Sørg for, at scenen går videre til startpositionen, opfang alle de forskellige bølgelængder, og fortsæt derefter til den næste position.
- Først skal du konfigurere XY-scanningen ved at tilpasse XY-scanningsprofilen i XY-scanningsmenuen i softwaren. I 'Custom Multipoint Definition' skal du vælge den store billeddefinitionsboks og indstille den til 40,0 x 1,0 mm ca. (længden af emulsionsfyldningen). Brug 1 % overlapning.
- Aktiver indstillingen 'Brug fokusoverflade' og konfigurer fokusoverfladekurven ved at justere fokusplanet forskellige steder på prøven ved hjælp af fokusknappen på mikroskopet.
- For det andet skal du konfigurere scanningen med flere bølgelængder ved at vælge scanningsfanen. Tilføj hver af de optiske konfigurationer, der er oprettet i trin 6.1.7 for hver bølgelængde.
- Klik på indstillingen for at lukke aktiv lukker under fasebevægelse og under filterændring for at undgå blegning af prøven og kør anskaffelsen ved at trykke påknappenStart kørsel. Eksporter hver anskaffelsesramme til tiff-filer, og opdel hver kanal i en adskilt fil ved hjælp af indstillingen split multiple files og ved at anvende gemte LUTs-indstillinger. Brug punktnavn og kanalnavn til nemt at skelne mellem hver billedfil.
- Billedanalyse
- Sorter alle erhvervede billeder efter brightfield og fluorescens filtre til at uploade til en open source billedanalyse software.
- Brug billedanalysesoftware til at oprette en pipeline for at identificere alle dråber ved hjælp af brightfield-billeder og derefter måle intensiteten af tilknyttede fluorescerende dråber.
- Til pipeline, uploade brightfield og fluorescens tiff billeder derefter tilføje moduler 'ColorToGray', 'IdentifyPrimaryObjects', 'MeasureObjectIntensity', og 'ExportToSpreadsheet'. Brug brightfield-slipværktøjsbilleder til at identificere objekter, og brug derefter objekter som maske til at måle intensiteten af lysstofrør.
- Kør pipeline med udvalgte tiff-billeder for at udtrække den gennemsnitlige fluorescensintensitet af fluorescensdråbebilleder. Udbet forsøget i tre eksemplarer, hvor hvert sæt består af ~5.000 dråber til analyse.
- Anvendalgoritmen ' definetherain' (http://definetherain.org.uk/) til at identificere de positive og negative dråbeklynger. Positiverne skal være inden for 3 standardafvigelser af middelt gennemsnit. Dette bestemmer tærskelintensiteten for de positive dråber, der skal bruges til optælling.
- Brug igen billedanalysesoftwaren til at implementere en ny pipeline, hvor fluorescenstærstlen for hvert genmål er angivet som defineret i det foregående trin.
- Upload brightfield og fluorescerende billeder til rørledningen. Tilføj moduler 'ColorToGray', 'RescaleIntensity', 'Threshold', 'IdentifyPrimaryObjects', 'MeasureObjectSizeShape', 'FilterObjects' og 'ExportToSpreadsheet'. Opret unikke moduler til brightfield billeder og hver fluorescens filter for dråber.
- Skalere billedintensitetsskalaen fra 0 til 1 for hver fluorescensbilledegruppe. Angiv derefter tærsklen for at identificere og tælle objekterne over den fastsatte grænse. Hvis det er nødvendigt, skal du tilføje 'ExpandOrShrinkObjects' modul for at formindske objekter for at lette optælling og identifikation af dråber i brightfield.
- Identificer kun objekter inden for den valgte størrelse på 20-30 pixel, og filtrer de optalte objekter, så de kun bevarer de objekter med en bestemt diameter (dvs. dråber i 75 μm diameterområdet) og en rund sfærisk excentricitet på 0,5 og derunder.
- Eksporter resultaterne til en tabel, der viser det samlede antal dråber fra brightfield-billeder samt dråbetællinger for alle de anvendte fluorescenskanaler. cy5 for C-LESS-gen, HEX for methyleret CD3Z-gen og FAM for methyleret FOXP3-gen (se Supplerende oplysninger om rå eksperimentelle data, der er indhentet for den præsenterede mdPCR-analyse).
- Beregn forholdet mellem negative dråber for hvert genmål, og anvend Poisson-distribution for at få de respektive kopier pr. dråbe (CPD) ved hjælp af ligning 1:
hvor x repræsenterer antallet af dråber, der indeholder 0, 1, 2 eller flere molekyler, og λ repræsenterer CPD-værdien. - Den absolutte målkoncentration beregnes ved at tage forholdet mellem CPD-værdien og dråbemængden opnået i trin 5.20 med ligning 2:
hvor værdien (1-p) repræsenterer den brøkdel af negative dråber. - Beregn procentdelen af CD3+ T-celler og CD4+ CD25+ T-Regs ved at dividere de respektive CPD-værdier af methylerede CD3Z- og FOXP3-gener med C-LESS- eller totalcelle - CPD-værdien (se Supplerende oplysninger om CPD-beregninger fra rådata).
- Sammenlign disse procentværdier med dem, der opnås ved immunfluorescensbilleddannelse ved hjælp af antistoffer til CD3+ T-Cell og CD4+ CD25+ T-Reg-optælling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den TPE-baserede mikrofluidiske dråbegeneratorenhed blev fremstillet ved hjælp af den beskrevne protokol som vist i figur 1. En gennemsigtighed maske blev brugt i fotolitografi for at opnå silicium (Si) master. Soft litografi blev udført for at opnå en omvendt PDMS kopi af Si master, som derefter blev brugt til at fremstille epoxy skimmel. Epoxy forløber blev hældt på PDMS og hærdet til crosslink og hærde. Denne form, der repræsenterer den nøjagtige kopi af Si master var mere modstandsdygtig for efterfølgende termoformning af termoplast ved hjælp af varm prægning. Når epoxy formen blev opnået, termoplastisk elastomer blev præget. Efter prægning, blev TPE demolded, og enheder blev skåret. Et fladt TPE-underlag blev brugt til at forsegle enheden. Huller blev slået i det øverste dæksel, og de to substrater blev bundet. Endelig blev de nødvendige slanger til jord-til-chip-forbindelser indsat, og enheden var klar til brug. Prøve billeder af fabrikeret master mold, TPE materiale og prægede enheder er vist i figur 2. Samlet enhed med slangesammenkoblinger blev drevet med et par uafhængige programmerbare sprøjtepumper til at generere emulsioner til mdPCR. Methyleringsspecifikke mdPCR blev udført ved hjælp af bisulfitbehandlet DNA udvundet af frosne PBC'er. Efter dråbedannelse af passende størrelse (ca. 72 μm diameter) blev emulsionen underkastet en termisk cykelprotokol. Endelig blev dråberne indført i en glaskapillær med en bredde på 1 mm og 50 μm højde til billeddannelse. Dette resulterer i en monolayer fordeling af dråber ideel til fluorescens billede erhvervelse (Figur 3). Billeder blev optaget for hver af de fire bølgelængder. Der blev derefter udført en billedanalyse for at identificere alle dråber (figur 4), der opfyldte tærskelkriterierne, der blev fastsat ved hjælp af algoritmen »definetherain«. Fluorescensintensiteten for alle dråber i deres respektive fluorophore afbildes derefter, og tærsklen for positive og negative dråber blev fastsat (figur 5). Efterfølgende blev der identificeret og tælling af disse dråber, som var over den valgte tærskel. CPD-værdierne blev derefter beregnet, og procentdelen af CD3+ T-Cellog CD4 + 25+ T-Regs blev fastsat på grundlag af henholdsvis methylerede CD3Z- og FOXP3-kopier i forhold til CPD for totalceller eller C-LESS-genet (figur 6). Procentværdierne blev derefter sammenlignet med dem, der blev opnået ved immunfluorescensscanning af T-Cell- og T-Reg-populationer ved hjælp af passende antistoffer.
| FOXP3 Fremad | GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG | |
| FOXP3 Omvendt | TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA | |
| CD3Z Fremad | GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG | |
| CD3Z omvendt | CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA | |
| C-mindre fremad | TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA | |
| C-MINDRE Omvendt | TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C | |
| FOXP3 Sonde | /56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/ | |
| CDZ3 Sonde | /56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/ | |
| C-mindre sonde | /56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/ | |
Tabel 1: Primer og hydrolysesondedesign.
| Reagens | Lagerløsning | Master Mix-diskenhed | Koncentration |
| Tris-HCl | 1 M. | 2 μL | 20 mM |
| KCl | 1 M. | 10 μL | 100 mM |
| MgCl2 | 25 mM | 16 μL | 4 mM |
| C-MINDRE Primere | 10 μM | 10 μL | 1 μM hver |
| CD3Z Primere | 10 μM | 10 μL | 1 μM hver |
| FOXP3 Primere | 10 μM | 10 μL | 1 μM hver |
| C-LESS sonde | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| CD3Z-sonde | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| FOXP3 sonde | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| HotStarTaq DNA Polymerase | 5 enheder/μL | 8 μL | 0,4 enheder/μL |
| Bisulfit-behandlet DNA-mål | Variabel | Variabel | Variabel |
| Nuklease-frit vand | Variabel | ||
| Samlet volumen | 100 μL |
Tabel 2: Master mix opskrift på mdPCR.
| Optisk konfiguration | Udsættelse | DIA-lampe | Lysslysende lys |
| Lyst felt | kr. | På | Ud |
| Fam | kr. | Ud | 20% |
| Hex | kr. | Ud | 20% |
| Cy5 | kr. | Ud | 20% |
Tabel 3: Indstillinger for optisk konfiguration og anskaffelse af billeder.
Figur 1: Hurtig prototyping af dråbegeneratoren. Skematisk illustration af den proces, der anvendes til fremstilling af (A) master mold og(B)TPE-baserede microfluidic emulgering enhed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Komponenter, der er involveret i fremstillingsprocessen. a) Siliciummester,b) PDMS-replika, (C) epoxyform,(D) TPE-materiale ekstruderet i ark og pakket i ruller, (E) præget TPE og (D) samlet anordning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fluorescensbillede erhvervelse af dråber efter termisk cykling. (A) Brightfield billede af dråberne i en kapillær, der tillod monolayer billede erhvervelse. bB) Cy5-filterbillede af C-LESS-genmål, der repræsenterer det samlede antal celler. (C) HEX filter billede af methyleret CD3Z gen mål korreleret til CD3+ T-Cell antal. dD) FAM-filterbillede af methyleret FOXP3-genmål korreleret med CD4+ CD25+ T-Reg-antal. Skalabaren er 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Pipeline, der bruges til at identificere dråber, der opfylder tærskelintensiteten. Billeder blev først organiseret i passende fluorescensfiltre ved hjælp af navngivning af filer. Billederne blev derefter konverteret til gråtoneskala og relative intensiteter omkaleret baseret på minimum og maksimum dråbefluorescens intensiteter. Tærsklen blev derefter valgt i henhold til værdier, der er opnået fra 'definetherain'-algoritmen, og de objekter – eller dråber – der opfylder de definerede kriterier, blev identificeret og kvantificeret. Endelig blev objekterne filtreret efter excentricitet og størrelse for at opnå det raffinerede dråbetal af sfæriske objekter, der opfylder 75 μm diameterstørrelse. De kvantificerede objekter og deres intensiteter blev derefter eksporteret til et regneark software til downstream analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Intensitetsspr.parceller for fluorescensintensiteten af dråber efter mdPCR. a) C-LESS-genforstærkning med Cy5 hydrolysesonde, der repræsenterede det samlede antal celler, da målregionen var blottet for cytosinrester og derfor resistent over for behandling af bisulfit. (B) Methyleret CD3Z-genforstærkning med HEX-hydrolysesonde, der indikerer CD3+ T-cellepopulation. (C) Methyleret FOXP3 genforstærkning med FAM hydrolysesonde, der repræsenterer CD4+ CD25+ T-Reg-populationen. Alle scatter plots blev udsat for 'definetherain' algoritme til at fastsætte den passende tærskel, hvorved de positive var inden for 3 standardafvigelser af den positive klynge gennemsnit. Mængden af 'regn' blev også fastslået, således at den overstiger 1% af de positive definerede dråber. Hvert datasæt til analyse bestod af ~5.000 dråber og blev kørt i tre eksemplarer (se Supplerende oplysninger for rådata og analyse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: CPD-værdier for alle genmål og bestemmelse af andelen af hvide blodlegemer. (A) De beregnede CPD-værdier baseret på Poisson-fordeling af det positive dråbetal som et forhold mellem de samlede dråber. Inputtet repræsenterer den teoretiske CPD forventes baseret på 740 ng bisulfitbehandlet DNA, 75 μm diameter dråber, under forudsætning af 6,6 pg for 1 genkopi. Den teoretiske CPD for input var 0,25 og korreleret med C-LESS CPD, der repræsenterer det samlede antal celler. (B) Forholdet mellem CPD for CD3Z og FOXP3 med hensyn til C-LESS blev derefter brugt til at opnå procent af CD3+ T-Cells og CD4+ CD25+ T-Regs, hhv. Disse nøgletal som procent af de samlede leukocytter blev derefter sammenlignet med værdier opnået ved immunfluorescens billeddannelse. Som påvist, værdierne fra mdPCR og immunofluorescens analyse korrelerer med nogen væsentlig forskel, med standard afvigelse fejl fra mdPCR er langt mindre udtalt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende oplysninger. Klik her for at downloade disse filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede eksperimentelle protokol og metoder giver mulighed for in-house mdPCR ved hjælp af en fabrikeret TPE dråbe generator, en termisk cycler, og fluorescens mikroskop. Den fabrikerede enhed ved hjælp af blød TPE til TPE limning giver hydrofobiske overfladeegenskaber, der er ensartede på tværs af alle kanalvægge, således at den endelige enhed ikke kræver nogen overfladebehandling til efterfølgende brug som en dråbe generator. Dette materiale er rutinemæssigt anvendt i point-of-care platforme , der kræver kompatibilitet med høj kapacitet fremstilling9,10,11,12,13. Desuden er det også optisk klar og udviser lav fluorescens baggrund i det synlige spektrum, som er et attraktivt træk for fremtidig integration af en komplet prøve-til-svar workflow ved hjælp af mdPCR. PCR reagens opskrifter er også fastsat i en homebrew format for at give mulighed for facile multiplex gen kvantificering, samtidig med at stabilitet i hele den termiske cykling protokol. Som sådan en af fordelene ved de præsenterede enheder og protokoller er fleksibiliteten i at tilpasse enhedens design og reagenser, der anvendes til en bestemt anvendelse, som er vanskeligt at opnå med kommercielle produkter og proprietære formuleringer. Desuden fjerner det nødvendigheden af dyre instrumentering til at udføre eksperimentet.
Passende termoplastisk materiale valg af mikroflugt generator er en kritisk parameter, der kan omgå besværlig overfladebehandling at gøre enheden hydrofob for effektiv dråbedannelse. Derudover er valget af en optimeret mdPCR-buffer også afgørende for at opretholde dråbestabilitet gennem den termiske cykelproces – uden at kompromittere PCR-effektivitets- og hydrolysesondens funktionalitet. Yderligere ændring og optimering af mdPCR bufferen opfordres derfor til at nå frem til meget specifik og følsom PCR-forstærkning af udvalgte genmål kombineret med fluorescensbaseret sondedetektion. Dette har til formål at øge signal-støj-forholdet, reducere tilfældene af "regn" og forenkle den eksperimentelle analyse og identifikation af positive dråbepopulationer. Fejlfinding af eksperimentet afhænger af vurderingen af de kritiske trin fra termoplastisk materialevalg til polymerasekoncentration til tilpasning af temperaturrampen i det termiske cykelprogram for at sikre dråbestabilitet.
Den nuværende begrænsning af den beskrevne protokol er, at den stadig kræver manuel prøveoverførsel fra dråbegeneratoren til den termiske cycler og endelig til en dråbebilleddannelsesanordning og et instrument såsom et fluorescensmikroskop. Fremtidige bestræbelser er dog rettet mod miniaturisering af mdPCR og integration af disse trin, hvorved dråbegenerering, PCR og billedbehandling kan udføres på en enkelt automatiseret platform.
De opnåede resultater i figur 6 viser alsidigheden af denne mdPCR-tilgang til udførelse af differentialantificering af hvide blodlegemer. Den foreslåede metode er mere præcis og reproducerbar end immunfluorescensbilleddannelse, som ofte påvirkes af brugermanipulation, hvilket giver anledning til uønskede målefejl. Dette er også tilfældet for flow cytometri teknikker, der også er afhængige af en immun-baseret metode til påvisning, som er meget afhængig af celle levedygtighed, samt flere protokol trin tilbøjelige til brugerfejl. Alternative metoder såsom real-time kvantitative PCR (qPCR) til kvantificering er ofte negativt påvirket af lav kopi nummer genmål, en ulempe, der afhjælpes gennem mdPCR uden behov for en dedikeret kalibrering kurve11. Den præsenterede mdPCR-tilgang præsenterer derfor en unik molekylær tilgang til forskelle i hvide blodlegemer, der er baseret på methyleringsprofiler af specifikke genmål. Kalibreringskurver for individuelle genmål er heller ikke nødvendige, da mdPCR er baseret på en absolut kvantificering af binære positive og negative signaler ved hjælp af Poisson-distribution til CPD-beregning.
Den præcise kvantificering af ikke-methylerede genøer, især af lav kopi antal gener såsom FOXP3, præsenterer en lang række muligheder for klinisk diagnose. Dette understreges af en sådan tilgangs evne til at identificere kendte methyleringsmønstre korreleret med sygdomsdebut og progression. mdPCR, som en molekylær tilgang med absolut kvantificering kan anvendes ud over methyleringsundersøgelser og kan anvendes på passende konserverede prøver, hvilket fjerner afhængigheden af friske kliniske prøver og udvider dens anvendelser yderligere. Fremtidig automatisering og miniaturisering af denne teknik vil være af stor værdi for hurtig og præcis klinisk diagnose og efterfølgende prognose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen konflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender finansiel støtte fra National Research Council of Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
- Teitell, M., Richardson, B.
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
- Zouali, M. The Autoimmune Diseases. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
- Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
- Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
- Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).
