Summary
表观遗传标记用于白细胞（WBC）通过DNA甲基化模式的定量亚化。该协议提出了一种多路滴聚合酶链反应（mdPCR）方法，使用基于热塑性弹性体（TPE）的微流体器件进行液滴生成，从而实现WBC差分计数的精确和多路复用甲基化特异性目标定量。
Abstract
介绍了多路复用液滴PCR （mdPCR） 工作流程和用于确定基于表观遗传的白血球 （WBC） 差分计数的详细协议，以及热塑性弹性体 （TPE） 微流体液滴生成装置。表观遗传标记用于WBC亚标，在不同疾病中具有重要的预后价值。这是通过量化基因组中特定CG富产区的DNA甲基化模式（CpG位） 实现的。本文将外周血单核细胞（PBMC）的二硫酮处理DNA封装在液滴中，包括与WBC亚群相关的PPC根酸基点特异性的底土剂和水解荧光探针等mdPCR试剂。多路复用方法允许对许多CpG位点进行检测，而无需单独的mdPCR反应，从而利用甲基化位点表观遗传分析，更准确地对WBC子种群进行参数测定。这种精确的定量可以扩展到不同的应用，并突出临床诊断和后续预后的好处。
Introduction
白血球（WBC）成分分析是血液诊断中要求最多的实验室测试之一。差异白细胞计数是一系列疾病的指标，包括感染、炎症、贫血和白血病，并且作为其他几种疾病的早期预后生物标志物正在接受调查。WBC 子类型的黄金标准涉及免疫污染和/或流式细胞学，这两种均需要昂贵且易不稳定的荧光抗体，而且往往高度依赖于操作者对样品制备的熟练程度。此外，这种方法仅适用于新鲜血液样本，因此不能冷冻样品进行装运或以后分析。
表观遗传标记最近已成为研究表型变异的有力分析工具。随后，人类白细胞群被证明具有细胞系DNA甲基化模式，允许对WBC子集进行精确表征。基于表观遗传标记的亚标提供了一个有希望的替代方案，不依赖于新鲜血液样本收集或昂贵的抗体，并可被利用为疾病发病和易感性,,1，2，3，4，52的生物标志4,物。13
已对白细胞亚型基因组（CpG岛）中甲基化特定CG富产区进行广泛的基因组图谱研究，以确定白细胞亚型特有的候选表观遗传标记。由于甲基化基因区域（如CD3Z和FOXP3，分别对应于CD3+T细胞和CD4 +CD25+调节T细胞）的甲基化基因区域，PCR+协议已经开发出来。Wiencke等人已经证明了双面液滴PCR在T细胞表观遗传亚蒂的效用，结果与流动活性细胞分选（FACS）分析6高度相关。这种定量基因分析方法依靠使用微流体7、8,启用的油水中乳液，将模板核酸分子和PCR试剂分割成数千个离散的、体积定义的亚纳米光基液滴，这些液滴含有零、一个或多个目标核酸拷贝。PCR 扩增在每个单独的液滴内进行，并测量每个液滴的端点荧光强度，从而可以绝对量化样品中存在的目标。与标准 qPCR 更精确、更准确、技术更简单的液滴 PCR 已建立，因此是 T 细胞临床评估的更有利的 DNA 甲基化方法。虽然是一种迅速出现的亚分法，但缺乏多路复用表观遗传分析，以同时探测各种甲基化CpG区域。这是常规白细胞差分计数所必需的。
本文提出了一种热塑性弹性体（TPE）液滴微流体装置，用于甲基化特异性多路复用液滴PCR（mdPCR）。该技术已用于基于细胞系DNA甲基化模式，即CD3Z和FOXP3CpG区域的表观遗传变异，分别描述特定的+白细胞亚型、CD3+T细胞和CD4+CD25+T-Regs。+与TPE液滴生成装置的制造方法一起描述了DNA提取、双硫化转化和mdPCR的详细方案。该方法的代表性结果与免疫荧光染色结果相比，突出了该方法的效用。
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Protocol
本研究中涉及人体样本的所有实验都经过 NRC 道德委员会的批准，并且是按照 NRC 关于遵循适用研究准则并符合加拿大魁北克州法律的人类主题的政策进行的。
1. 细胞制备
- 立即将冷冻的低温在37°C的水浴中放置5分钟，解冻冷冻的人类外周血单核细胞（PBMC）。
- 反转冷冻两次，轻轻重新悬浮细胞，并使用1 mL移液器将细胞悬浮液转移到15 mL锥形管中。
- 将 10 mL 预热 （37 °C） 生长介质与 10% 胎儿牛血清 （RPMI-1640 + 10% FBS） 添加到含有 PBMC 的 15 mL 管中。
- 在室温下以 330 x g 的速度将电池 悬浮液 在室温下离心 10 分钟，快速加速，制动高度。
- 旋转完成后，小心地将上一点液去。通过敲击管的一侧，将细胞颗粒重新吸收在3 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.2中，含有2mM乙酰乙酸（EDTA）。
- 通过将管子倒置，将盖子紧紧闭合，混合细胞。
- 准备两个1.5 mL微管，并使用移液器等分液1.5 mL的细胞悬浮液在每个管，其中一个用于随后的免疫荧光染色，一个用于DNA提取。
2. 免疫荧光染色和成像方案
- 在含有0.1%的酸钠和2%FBS的PBS缓冲液中，重新悬浮细胞（从1.7），将细胞悬浮液的最终浓度调整为2 x 107 细胞/mL。
- 将电池悬浮液通过移液 100 μL 体积分成两个独立的 1.5 mL 微管。
- 将20μL的抗胡CD3/CD4与氟化物同位素（FITC）和植物红素（PE）结合到一管中，将抗胡CD4/CD25与 FITC 和 PE（ 参见材料表）分别添加到第二管中。
- 在每个管中加入1滴蓝色荧光活 细胞污渍（见材料表）。
- 使用管旋转器在室温下孵育2小时。防止光线。
- 在室温下将电池悬架在 330 x g 下离心 10 分钟，快速加速，制动速度高。
- 通过敲击管子，将上一提液和小心地重新暂停细胞颗粒。加入 1 mL 的 PBS，pH 7.2 包含 2 mM EDTA。确保盖子紧闭，通过反转管2倍混合细胞。
- 重复步骤 2.6 和 2.7 三次。
- 在含有2 mM EDTA的20μLPBS pH 7.2中重新发送细胞。
- 滴管 10 μL 滴的细胞悬浮液滴到硅酸盐显微镜幻灯片上，等待 2 分钟，让细胞慢慢沉淀到滴的底部。
- 小心地将玻璃盖滑放在显微镜幻灯片的顶部，然后将幻灯片放在倒置显微镜的舞台上。
- 使用 10 倍目标记录细胞的图像，并使用连接到显微镜的 EMCCD 摄像机记录两个细胞悬浮样品的每个荧光团的图像。
- 手动计数荧光标记的细胞（有关 原始数据， 请参阅补充信息）。
- 以抗胡CD3和抗胡CD4/CD25标记细胞与DAPI染色细胞的比例计算，获得CD3+T细胞和CD4+CD25+T-Regs与总+白细胞的比例。+
3. DNA提取和双硫化转化
- DNA提取
注：按照制造商提供的程序，使用磁性DNA纯化试剂盒（参见 材料表）从第1节中准备的PBMC中提取DNA。- 在1.5 mL管悬浮细胞中100μL的PBS和添加20μL的蛋白酶K和400μL的Lysis/结合缓冲液。通过上下移液10倍混合，然后在室温下进行孵育5分钟。
- 将管放在磁架上 1-2 分钟，然后小心地取出并丢弃上干液，捕获 DNA 珠复合物。
- 从磁架上取出含有DNA珠复合物的管子，将珠子重新悬浮在600μL的洗涤缓冲液#1洗去任何非特异性结合。
- 将管再次放在磁性机架上，小心地取出并丢弃上一液。
- 使用 600 μL 的洗涤缓冲液重复步骤 3.1.3 和 3.1.4，#2。
- 使管子保持开气干燥 1 分钟。
- 从磁架上取下管子，通过分配 100 μL 的洗脱缓冲液来洗脱 DNA，然后上下 20 倍将 DNA/珠复合物移液。
- 将含有洗脱DNA的管子再次放在磁架上，孵育1-2分钟，将磁珠与洗脱DNA分离。
- 将洗脱的纯化DNA溶液转移到新的清洁管中。
- 使用分光光度计测量 260 nm 的吸光度，评估纯化 DNA 样本的浓度。
- 比苏尔菲转换器
注：使用甲基化试剂盒对纯化DNA进行二硫基转化（参见 材料表），按照制造商提供的程序进行。- 到20μL的DNA样品（200-500纳克）在PCR管中加入130μL的转化试剂。混合好，短暂旋转。
- 将 PCR 管转移到热循环器上，执行如下循环方案：98 °C 8 分钟;54 °C 60分钟，在4°C下保持。
- 将 600 μL 的装订缓冲液添加到放入收集管中的离子色谱 （IC） 柱中。
- 将DNA样本添加到包含结合缓冲液的IC柱中，通过多次反转管进行混合。全速离心机30 s。丢弃收集的流式。
- 现在向该列添加 100 μL 的洗涤缓冲液。执行步骤 3.2.4 中所述的离心，并丢弃流式。
- 加入200μl脱硫缓冲液，在室温下孵育15-20分钟。如上述步骤所述，将离心机并丢弃流经。
- 向列中添加 200 μL 的洗涤缓冲液。全速离心 30 s 并丢弃流经。
- 重复步骤 3.2.7。
- 将柱转移到新的 1.5 mL 收集管中，并在柱膜上加入 100 μL 的 PCR 级水。全速离心1分钟，以提取DNA。
- 使用分光光度计测量 260 nm 的吸光度，评估双硫化转化 DNA 样本的浓度。
注：在 260 nm = 1.0 时，使用 40 μg/mL 的值实现吸光。 - 将DNA储存在-20°C，用于短期储存，或在-70°C中长期储存。
4. 液滴生成装置制造
注：用于液滴生成（补充信息中提供的CAD 文件）的微流体装置是在热塑性弹性体（见材料 表）的洁净室（1，000级）环境中制造的，使用以下协议产生的热压花。
- SU-8 模具制造
- 使用标准光刻在 6 英寸硅晶圆上准备 SU-8 模具，详情如下。
- 使用 500 W 的氧等离子体清洁 6 英寸硅片，10 s。
- 旋转涂层SU-8 以 900 rpm 的速度抵抗硅晶圆 40 秒，实现总薄膜厚度 100 μm。
- 将晶圆放在热板上，在65°C下预烘烤15分钟，在95°C下烘烤2小时。
- 使用 1，000 mJ/cm2的曝光剂量，通过高清透明光掩贴，在 365 nm（Hg i-line）处暴露在紫外线下。
- 将晶圆放在热板上，在65°C下烘烤15分钟，随后在95°C下烘烤40分钟。
- 通过浸入丙二醇单甲醚乙酸酯（PGMEA）中5分钟进行开发。
- 用PGMEA和异丙醇冲洗，然后用氮气流干燥。
- 将晶圆放在热板上，在 135 °C 下硬烤 2 小时。
- 将真空干燥器中的晶圆硅化，含有一滴硅化剂（三氟化剂），放置在相邻的玻璃显微镜幻灯片上 2 小时。
注：这样做是使西拉内斯在SU-8主主机的表面形成单层。三氟化硅烷应始终在烟罩中处理，并远离水源。
- 聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 复制品
- 在塑料杯中，以 10：1 的比例（w w 弹性体基座）准备 PDMS 的液体预聚物（参见材料表）。 Table of Materials
- 将杯子放入行星离心真空混合器中，以混合和除气 PDMS 混合物。
- 将 PDMS 混合物倒入放置在定制金属支架中的模具上，防止树脂泄漏，并在 65°C 下固化 2 小时。
- 使用钳子，小心地从 SU-8 主机上剥离 PDMS 模具。
- 环氧模具
注：使用 PDMS 的中间复制工艺，用 SU-8/硅母版制造环氧树脂模具。- 使用树脂/ 硬质的100/83 w/w比准备环氧树脂（参见材料表）。
- 使用真空烘干炉在减压下将混合物除气 30 分钟。
- 将树脂倒在 PDMS 复制品上，并在 80°C 下固化 12 小时。
- 从 PDMS 复制品中取出固化的环氧树脂模具，放在热板上，在 120°C 下硬烤 2 小时。
- TPE 设备
- TPE 的挤出颗粒（ 参见材料表），在 2.0 mm 厚和 7 英寸宽的几米长的纸张中，并作为卷料存放，供将来使用。
- 用剪刀将 TPE 纸张从卷上切成 7" 方形。
- 将 TPE 片放在环氧模具和非模化硅晶片之间（有关晶圆硅化过程，请参阅步骤 4.1.10）。
- 在 125 °C 的温度下进行热压，施加力为 10 kN，压力为 10~2 mbar，为 10 分钟。
- 在室温下小心地使用甲醇喷雾将浮雕 TPE 与硅晶圆和环氧树脂模具分离。
- 再切割 7 英寸方形的 TPE 片，并放在两个非图案硅晶片之间。
- 在 140 °C 的温度下进行热压波，施加的力为 10 kN，压力为 10~2 mbar，10 分钟，形成用于关闭通道和密封设备的平面表面。
- 在室温下小心地使用甲醇喷雾将浮雕 TPE 从两个硅晶片中分离。
- 使用医生刀片将每个浮雕 TPE 纸张切割到设备大小。
- 使用带柱塞的 1 mm 活检冲孔针打孔，打孔结构装置中的入口和出口通道。
- 通过将平面 TPE 设备置于室温下与通道直接接触，封闭通道。
- 可选地，在 70°C 的烤箱中放置 2 小时，以促进设备粘合。
- 使用一次性流体管安装通道（I.D. 0.25 mm，O.D. 0.8 mm）。使用环氧胶水密封接头，以确保防漏操作。
5. 液滴生成和 PCR
注 ：表1 概述了有关正向和反向底因的信息，以及C-LESS、CD3Z和Foxp3基因的双淬火水解探针，这些是脱甲基基因靶点多路复用扩增所需的。
- 准备主组合，如表 2 中所述。
- 解冻主混合物的所有成分，酶混合除外。通过上下移液和短暂旋转，将主混合完全混合。
- 添加适当的体积 （1 μL） 的二硫酸盐转化 DNA（从第 3.2 节）到 PCR 管中掌握混合物。通过上下移液和短暂旋转来混合反应。
- 使用 PEEK 配件将一次性流体管（I.D. 0.25 mm，O.D. 1.6 mm）连接到两个精密玻璃注射器（250 μL 体积）。
- 预填充一个精密玻璃注射器，内含 5% 氟表面活性剂的 250 μL 载波油。
- 在装载 100 μL 的 PCR 混合物之前，用 50 μL 的载波油预填充另一个精密玻璃注射器，以确保在乳化过程中分配整个样品量。
- 在配备高速摄像机的直立光显微镜的舞台上设置液滴微流体装置，以实时观察和记录液滴的形成。
- 将预填充注射器放在可编程注射器泵上，并使用 PEEK 接头（参见 材料表），将注射器的管子连接到液滴微流体装置各进气通道的管子上。
- 将油管从液滴发生器的出口放在 0.5 mL PCR 管内。
- 将注射器泵的流量调整为 2 μL/min，在收集所得乳液之前，使液滴尺寸稳定下来。
- 收集乳液，将 75 μL 转移到 0.2 mL PCR 管中，进行热循环。
- 确保 PCR 管中的含油量与分散相的体积紧密匹配，以防止液滴在热循环过程中凝结。
- 将 0.2 mL PCR 管放在热循环器中，执行如下循环方案：在 95 °C 预热 5 分钟，然后在 95 °C 下加热 45 圈，在 15 s 下退火/延长 60 °C。
- 使用剩余的乳液用矩形轮廓填充硅酸盐毛细管（100 μm 深度），以便对液滴进行成像并评估液滴直径。
- 将充满乳液的硅酸盐管放在显微镜幻灯片上。使用配备 EMCCD 摄像机和 10 倍目标的倒置显微镜记录液滴的明亮场图像。
- 使用如下详细描述的图像分析软件测量液滴直径。
- 通过选择"分析"按钮，然后选择"设置比例"，以微米为单位设置已知距离比例Analyze，以像素数表示。
- 通过选择"图像"按钮，然后选择"键入"将图像转换为灰度。如果需要，调整亮度和对比度。通过选择"图像"按钮，然后选择"调整阈值"，设置手动阈值以描绘和填充圆圈。
- 通过选择"分析粒子"按钮将圆度设置为 0.75 = 1 来分析粒子。
- 获取自动显示在软件中的测量液滴的结果面积和直径。
- 计算平均液滴直径并假设球形液滴，估计分区体积，用于计算绝对目标浓度。
- 通过分析液滴直径（<3%）的标准偏差与平均值（k = 1）的比率，确保液滴是单分散的。
6. 荧光成像和图像分析
- 荧光成像
- 放大后，将 PCR 乳液转移到具有矩形轮廓的硅酸盐毛细管（50 μm 深度），以便将液滴排列成紧密包装的单层进行成像。
- 将填充毛细管固定到显微镜幻灯片上，并使用 UV 丙烯酸粘合剂密封两侧。在紫外线粘合剂上涂抹 UV 光源，小心不要照亮乳液，以免使样品漂白。
- 将玻璃滑梯加载到配备 EMCCD 摄像机和 10 倍目标的倒置显微镜上。
- 使用显微镜成像软件，选择 "获取 | "实时 - 快速启动实时摄像机采集，观察样品，并确保捕捉到毛细管的宽度。
- 将亮度场灯设置为 3.5 V 的立体照明。
- 将广谱 LED 荧光灯设置为 20% 的强度进行显光照明。
- 通过选择校准 ， 手动调整所有波长（亮场、FAM、HEX 和 Cy5）的 捕获设置 |映像软件中的 光学配置命令。对于每个荧光团，需要手动切换相应的荧光滤波立方体。必须使用用于亮场成像的滤波数据集来保持相同的光路。
- 使用"获取"在图像采集之前手动调整 曝光时间 |每个荧 光团的"相机设置"命令，如表 3所示。将读出模式 EM 增益设置为 16 位，在软件的"捕获设置"菜单中增益乘数为 100。
- 在软件的 LUT 窗口中，设置 LUT 比例，使传输信号包含在设置范围内。在这个实验中，比例从500到12，000大约。
- 使用多点采集程序，使用 XY 扫描和多波长选项按该特定顺序自动捕获。确保舞台移动到初始位置，捕获所有不同的波长，然后继续到下一个位置。
- 首先，通过自定义软件的 XY 扫描菜单中的 XY 扫描配置文件来设置 XY 扫描。在"自定义多点定义"中，选择大图像定义框，并设置为大约 40.0 x 1.0 mm（乳液填充的长度）。使用 1% 重叠。
- 启用"使用焦点曲面"选项，并使用显微镜上的对焦旋钮调整样品上不同点的焦点平面，设置对焦曲面曲线。
- 其次，通过选择扫描选项卡设置多波长扫描。添加步骤 6.1.7 中为每种波长创建的每种光学配置。
- 单击该选项以在舞台移动和滤镜更换期间关闭活动快门，以避免漂白样品，然后按"开始运行"按钮运行采集。将每个采集帧导出到 tiff 文件中，并使用拆分多个文件选项和通过应用保存的 LUT 设置将每个通道拆分为分隔的文件。使用点名称和通道名称选项轻松区分每个图像文件。
- 图像分析
- 按亮场和荧光滤镜对获取的所有图像进行排序，以上传到开源图像分析软件。
- 使用图像分析软件创建管道，以便使用亮场图像识别所有液滴，然后测量相关荧光滴的强度。
- 要管道，上传光明场和荧光 tiff 图像，然后添加模块"ColorToGray"，"识别主要对象"， [测量对象"和 [导出到扩展表] 。使用亮场液滴图像识别物体，然后使用对象作为遮罩来测量荧光图像的强度。
- 运行带所选 tiff 图像的管道，以提取荧光滴图像的平均荧光强度。进行三钙化实验，每组由 +5，000 滴组成进行分析。
- 应用 [定义]算法（http://definetherain.org.uk/） 来识别正和负液滴聚类。正数应在均值的 3 个标准差内。这将确定用于计数的正液滴的阈值强度。
- 再次使用图像分析软件实现新的管道，其中每个基因目标的荧光阈值设置如上一步中定义。
- 将亮场和荧光图像上传到管道。添加模块[ColortoGray]，[重新缩放"，[阈值]，[识别主要对象]，[测量对象大小图像]， [过滤器对象]， 和 [导出到扩展表]。为亮场图像创建独特的模块，为液滴创建每个荧光过滤器。
- 每个荧光图像组将图像强度刻度从 0 到 1。然后设置阈值以标识和计数高于既定阈值的对象。如有必要，添加"展开收缩对象"模块以缩小对象，以方便在亮场中计数和识别液滴。
- 仅识别 20-30 像素选定大小的对象，并筛选计数的对象，以仅保留具有特定直径（即直径范围为 75 μm 范围内的液滴）和 0.5 及以下圆球形偏心的对象。
- 将结果导出到表，该表列出来自亮场图像的总液滴计数，以及使用的所有荧光通道的液滴计数;即Cy5表示C-LESS基因，HEX表示甲基化CD3Z基因，FAM表示甲基化FOXP3基因（参见为Supplementary Information提出的mdPCR测定获得的原始实验数据的补充信息）。
- 计算每个基因靶点负滴的比例，并应用泊松分布，使用公式1获取每个液滴（CPD）的各拷贝：
其中 x 表示包含 0、1、2 或更多分子的液滴数，并且 α 表示 CPD 值。 - 计算，绝对目标浓度，通过采取CPD值和液滴体积的比例在步骤5.20与方程2：
其中值 （1-p） 表示负液滴的分数。 - 通过将甲基化 CD3Z 和 FOXP3+基因各自的CPD值除以 C-LESS + 或总细胞 + CPD 值（请参阅原始数据 CPD 计算的补充信息），计算 CD3= T 细胞和 CD4 的百分比。 Supplementary Information
- 将这些百分比值与使用 CD3 + T 细胞抗体和 CD4+ CD25+ T-Reg 计数的免疫荧光成像 值进行比较。
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Representative Results
基于TPE的微流体液滴发生器装置是使用所述协议制造的，如图1所示。在光刻学中使用了透明面膜来获取硅 （Si） 母版。进行软光刻以获得 Si 大师的反向 PDMS 副本，该副本随后用于制造环氧模具。环氧树脂前体被倒入PDMS并固化成交联和硬化。这种模具代表 Si master 的精确复制品，对于使用热压花的热塑性塑料的后续热成型更具弹性。获得环氧树脂模具后，热塑性弹性体被浮雕。压花后，TPE 被脱皮，设备被切断。使用扁平 TPE 基板密封设备。在顶盖上打孔，两个基板粘合。最后，插入了世界到芯片连接所需的管道，设备已准备就绪。图2中显示了制造主模具、TPE材料和压花装置的样本图像。带管互连的组装装置与一对独立的可编程注射器泵一起操作，为 mdPCR 生成乳液。使用从冷冻PBMC中提取的二硫酮处理DNA进行甲基化特异性mdPCR，将CD3Z、FOXP3和C-Less基因的适当底剂和水解探针添加到PCR混合物中进行乳化。在产生适当尺寸（直径约 72 μm）的液滴后，乳液遵循热循环协议。最后，将液滴引入一个宽1毫米、高度为50μm的玻璃毛细管中进行成像。这导致液滴的单层分布是荧光图像采集的理想之选（图3）。记录了四个波长中每个波长的图像。然后进行图像分析，以识别所有水滴（图4），满足通过"定义"算法建立的阈值标准。然后绘制各自荧光团中所有液滴的荧光强度，确定正负液滴的阈值（图5）。随后，对高于所选阈值的液滴进行了识别和计数。然后计算CPD值，并分别根据甲基化CD3Z和FOXP3拷贝，分别根据总细胞的CPD或C-LESS基因（图6）建立了CD3+ T-Cell和CD4+ 25+ T-Regs的百分比。然后，将百分比值与使用适当抗体对T-Cell和T-Reg人群的免疫荧光成像获得的百分比值进行比较。
| FOXP3 转发 | G T TGt Tgt Tat Agt T TG | |
| FOXP3 反向 | TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA | |
| CD3Z 转发 | Gga Tgg Ttg Tgg Tga A Gtg | |
| CD3Z 反向 | Caa A Ctc Ctt Ttc Tcc Taa Cca | |
| C- 无转发 | Ttg Tat Gta Tgt Gag Tgt G Aga Ga Ga | |
| C- 无反向 | T Ctt Cca C C CCt Ctc Ttc C C | |
| FOXP3 探头 | /56-FAM/CA ACA 猫 C/ZEN/C AAC CAC 猫 /3IABkFQ/ | |
| CDZ3 探头 | /56-十六进制/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/ | |
| C-少探头 | /56-CY5/CT CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/ | |
表1：底注和水解探头设计。
| 试剂 | 库存解决方案 | 主混合卷 | 工作集中度 |
| 特里斯 - 赫克 | 1 M | 2 μL | 20 米 |
| 氯化钾 | 1 M | 10 μL | 100 mM |
| Mgcl2 | 25 米 | 16 μL | 4 mM |
| C- 少底片 | 10 μM | 10 μL | 每个 1 μM |
| CD3Z 底片 | 10 μM | 10 μL | 每个 1 μM |
| FOXP3 底裤 | 10 μM | 10 μL | 每个 1 μM |
| C-LESS 探头 | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| CD3Z 探头 | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| FOXP3 探头 | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| HotStarTaq DNA 聚合酶 | 5 单位/μL | 8 μL | 0.4 单位/μL |
| 比苏尔菲特处理的DNA靶点 | 变量 | 变量 | 变量 |
| 无核酶水 | 变量 | ||
| 总体积 | 100 μL |
表 2：mdPCR 的主混合配方。
| 光学配置 | 暴露 | DIA 灯 | 荧光灯 |
| 明亮领域 | 50ms | 打开 | 关闭 |
| Fam | 300 ms | 关闭 | 20% |
| 十六进制 | 300 ms | 关闭 | 20% |
| Cy5 | 400 ms | 关闭 | 20% |
表3：光学配置和图像采集设置。
图1：液滴发生器的快速原型设计。用于制造 （A） 主模具和 （ B ）基于TPE 的微流体乳化装置的工艺的示意图。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2：制造过程中涉及的组件。（A） 硅母版， （B） PDMS复制品， （C） 环氧模具， （D） TPE材料挤出板材并包装成卷， （E） 压花TPE和 （D） 组装装置。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：热循环后液滴的荧光图像采集。（A） 毛细管中飞沫的亮场图像，允许单层图像采集。（B） 代表细胞总数的C-LESS基因靶点Cy5过滤图像。（C） 甲基化CD3Z基因靶基的十六进制过滤图像与CD3+ T细胞计数相关。（D） 甲基化FOXP3基因靶基的 FAM滤镜图像与CD4+CD25+T-Reg计数相关。+ +比例杆为 100 μm。请单击此处查看此图的较大版本。
图 4：用于识别满足阈值强度的液滴的管道。图像首先被组织成适当的荧光过滤器使用文件命名。然后，图像被转换为灰度，相对强度根据最小和最大液滴荧光强度重新缩放。然后根据从"定义"算法获得的值选择阈值，并识别和量化符合定义标准的对象（或液滴）。最后，根据偏心度和大小对物体进行过滤，以获得直径为75μm的球形物体的精制液滴数。然后将量化对象及其强度导出到电子表格软件中进行下游分析。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：mdPCR后液滴 荧光强度的强度散射图。（A） C-LESS基因扩增与Cy5水解探针表示总细胞计数作为目标区域是无细胞素残留物，因此，耐双硫酮治疗。（B） 甲基化CD3Z基因扩增与六角体水解探针，指示CD3+ T细胞种群。（C） 甲基化FOXP3基因扩增与家庭水解探针，代表CD4+ CD25+ T-Reg种群。所有散点图均受"定义"算法的"定义"算法，以设置适当的阈值，其中正值在正聚类均值的 3 个标准差内。还建立了"雨量"量，以便它确实超过正定义液滴的 1%。每个用于分析的数据集由 +5，000 液滴组成，以三倍运行（有关原始数据和分析，请参阅补充信息）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：所有基因靶点的CPD值和白细胞子集百分比的测定。（A） 基于正值液滴计数的泊松分布计算的CPD值为总液滴的比率。输入表示基于 740 ng 的双硫酸盐处理 DNA 的理论 CPD，75 μm 直径液滴，假设 1 基因拷贝为 6.6 pg。输入理论 CPD 为 0.25，与表示总细胞计数的 C-LESS CPD 相关。（B） 然后使用 CD3Z 和 FOXP3 与 C-LESS 的比率分别获得 CD3+ T 细胞和 CD4+ CD25+ T-Regs 的百分比。然后，这些比率作为总白细胞的百分比与免疫荧光成像获得的值进行比较。如所证明，mdPCR和免疫荧光分析的值相关无显著差异，与mdPCR的标准偏差误差明显得多。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
所提出的实验协议和方法允许内部mdPCR使用制造的TPE液滴发生器、热循环器和荧光显微镜。使用软 TPE 到 TPE 粘结的制造设备提供在所有通道壁上均匀的疏水表面特性，因此最终设备不需要任何表面处理，以便后续用作液滴发生器。这种材料经常被用于护理点平台，需要与高吞吐量,制造9、10、11、12、1310,11,129兼容。此外，它还具有光学清晰性，在可见光谱中呈现低荧光背景，对于将来使用 mdPCR 集成完整的采样到应答工作流程来说，这是一个有吸引力的功能。PCR 试剂配方也以自制格式提供，允许简单的多路复用基因定量，同时在整个热循环协议中保持稳定性。因此，所呈现的设备和协议的优点之一是灵活定制用于特定应用的设备设计和试剂，而商业产品和专有配方很难实现。此外，它消除了昂贵的仪器执行实验的必要性。
微流体液滴发生器的适当热塑性材料选择是一个关键参数，可以绕过繁琐的表面处理，使器件疏水，实现有效的液滴形成。此外，选择优化的 mdPCR 缓冲液对于通过热循环过程保持液滴稳定性也至关重要，同时不影响 PCR 效率和水解探头功能。因此，鼓励对 mdPCR 缓冲液进行进一步的修改和优化，以实现选定基因靶点高度特异性和敏感的 PCR 扩增，同时进行荧光探针检测。这可提高信噪比，减少"雨"实例，并简化正液滴群的实验分析和识别。实验的故障排除取决于评估从热塑性材料选择到聚合酶浓度的关键步骤，以调整热循环程序中的温度斜坡，以确保液滴的稳定性。
所述协议的当前限制是，它仍然需要手动样品从液滴发生器转移到热循环器，最后转移到液滴成像设备和仪器，如荧光显微镜。然而，未来的努力是针对mdPCR的小型化和这些步骤的集成，通过这些步骤可以在单个自动化平台上执行液滴生成、PCR和成像。
图 6 中获得 的结果演示了此 mdPCR 方法执行差分白细胞定量的多功能性。与免疫荧光成像（通常受用户操作影响）的免疫荧光成像方法更精确、更可重复，从而产生不必要的测量误差。流式细胞学技术也依赖于高度依赖于细胞生存能力的基于免疫的检测方法，以及容易出现用户错误的多个协议步骤。用于定量的实时定量 PCR （qPCR） 等替代方法通常受到低拷贝数基因靶点的不利影响，这一缺点通过 mdPCR 得到补救，无需专用校准曲线11。因此，提出的mdPCR方法提出了一种独特的分子方法，以特定基因靶点甲基化特征为基础，对白细胞差异计数进行。单个基因靶标的校准曲线也没有必要，因为mdPCR基于使用泊松分布进行CPD计算的二元正负信号的绝对定量。
非甲基基因岛的精确定量，特别是FOXP3等低拷贝数基因的定量，为临床诊断提供了许多机会。这种方法能够识别与疾病发病和进展相关的已知甲基化模式，这一点突出表明。mdPCR，作为一种具有绝对定量的分子方法，可用于甲基化研究之外，并可应用于适当保存的样品，从而消除对新鲜临床样品的依赖，进一步扩大其应用。该技术未来的自动化和小型化对于快速准确的临床诊断和随后的预后具有极大的价值。
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Disclosures
没有要声明的冲突。
Acknowledgments
作者感谢加拿大国家研究理事会的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
- Teitell, M., Richardson, B.
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
- Zouali, M. The Autoimmune Diseases. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
- Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
- Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
- Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).
