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Bioengineering

मिथाइलेशन विशिष्ट मल्टीप्लेक्स ड्रॉपलेट पीसीआर हेमेटोलॉजिकल डायग्नोस्टिक्स के लिए पॉलीमर ड्रॉपलेट जेनरेटर डिवाइस का उपयोग कर

Published: June 29, 2020 doi: 10.3791/61421
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Life Sciences Division, National Research Council of Canada, 2Galenvs Sciences, Inc.

Summary

एपिजेनेटिक मार्कर का उपयोग डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न के क्वांटिफिकेशन के माध्यम से सफेद रक्त कोशिका (डब्ल्यूबीसी) उपकरण के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल एक मल्टीप्लेक्स ड्रॉपलेट पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (एमडीपीसीआर) विधि को थर्मोप्लास्टिक इलास्टोमर (टीपीई) आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके प्रस्तुत करता है जो ड्राइल जेनरेशन के लिए सटीक और मल्टीप्लेक्स मिथाइलेशन-विशिष्ट लक्ष्य क्वांटिफिकेशन के लिए अनुमति देता है।

Abstract

थर्मोप्लास्टिक इलास्टोमर (टीपीई) माइक्रोफ्लुइड ड्रॉपलेट जनरेशन डिवाइस के साथ-साथ एपिजेनेटिक बेस्ड वाइट ब्लड सेल (डब्ल्यूबीसी) डिफरेंशियल काउंट का निर्धारण करने के लिए एक मल्टीप्लेक्स ड्रॉपलेट पीसीआर (एमडीपीसीआर) वर्कफ्लो और विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । एपिजेनेटिक मार्कर का उपयोग डब्ल्यूबीसी उपलेखन के लिए किया जाता है जो विभिन्न रोगों में महत्वपूर्ण शकुन मूल्य का है। यह जीनोम (सीपीजी लोकी) में विशिष्ट सीजी-समृद्ध क्षेत्रों के डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न के परिमाणीकरण के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। इस पत्र में, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से बिसल्फी-उपचारित डीएनए को एमडीपीसीआर रिएजेंट्स के साथ बूंदों में समझाया जाता है जिसमें प्राइमर और हाइड्रोलिसिस फ्लोरोसेंट जांच शामिल है जो डब्ल्यूबीसी उप-आबादी के साथ सहसंबंधित है। मल्टीप्लेक्स दृष्टिकोण अलग एमडीपीसीआर प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता के बिना कई सीपीजी लोकी से पूछताछ के लिए अनुमति देता है, जिससे मिथाइलेशन साइटों के एपिजेनेटिक विश्लेषण का उपयोग करके डब्ल्यूबीसी उप-आबादी का अधिक सटीक पैरामेट्रिक निर्धारण सक्षम होता है। इस सटीक मात्राकरण को विभिन्न अनुप्रयोगों तक बढ़ाया जा सकता है और नैदानिक निदान और बाद में पूर्वानुमान के लाभों पर प्रकाश डाला गया है।

Introduction

सफेद रक्त कोशिकाओं (WBCs) संरचना का विश्लेषण हीमेटोलॉजिकल डायग्नोस्टिक्स में सबसे अधिक बार अनुरोध किए गए प्रयोगशाला परीक्षणों में से एक है। अंतर ल्यूकोसिटे गिनती संक्रमण, सूजन, एनीमिया, और ल्यूकेमिया सहित रोगों के एक स्पेक्ट्रम के लिए एक संकेतक के रूप में कार्य करता है, और कई अन्य स्थितियों के लिए एक प्रारंभिक शकुन बायोमार्कर के रूप में भी जांच के अधीन है। डब्ल्यूबीसी सबटाइपिंग में गोल्ड स्टैंडर्ड में इम्यूनोदाता और/या फ्लो साइटोमेट्री शामिल है जिनमें से दोनों को महंगा, अस्थिरता-प्रवण फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है और अक्सर नमूना तैयार करने में ऑपरेटर प्रवीणता पर अत्यधिक निर्भर होते हैं । इसके अलावा, यह विधि केवल ताजा रक्त नमूनों पर लागू होती है, जैसे कि नमूनों को शिपमेंट या बाद में विश्लेषण के लिए फ्रीज नहीं किया जा सकता है।

एपिजेनेटिक मार्कर हाल ही में फेनोटाइपिक विविधताओं के अध्ययन के लिए शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में उभरे हैं। इसके बाद, मानव ल्यूकोसाइट आबादी को सेल-वंश डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न दिखाया गया है जो डब्ल्यूबीसी सबसेट के सटीक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं। एपिजेनेटिक मार्कर पर आधारित सबटाइटिंग एक आशाजनक विकल्प प्रदान करता है जो ताजा रक्त नमूना संग्रह या महंगे एंटीबॉडी पर निर्भर नहीं करता है और रोग की शुरुआत और संवेदनशीलता के लिए बायोमार्कर के रूप में शोषण किया जा सकता है1,2,,3, 4,,5.5

ल्यूकोसिटे उपप्रकारों के लिए विशिष्ट उम्मीदवार एपिजेनेटिक मार्कर की पहचान करने के लिए ल्यूकोसिट उपप्रकारों में जीनोम (सीपीजी द्वीप) में मिथाइलेटेड विशिष्ट सीजी-समृद्ध क्षेत्रों के व्यापक मानचित्रण के लिए जीनोम-व्यापी अध्ययन किए गए हैं। पीसीआर प्रोटोकॉल मेथिलेटेड जीन क्षेत्रों के लिए इस कारण के कारण विकसित किया गया है, उदाहरण के लिए, CD3Z और FOXP3, CD3+ टी-सेल और CD4+ CD25+ नियामक टी-सेल (टी-रेग्स) के अनुरूप, क्रमशः । Wiencke एट अल टी कोशिकाओं के एपीजेनेटिक घटाव के लिए डुप्लेक्स बूंद पीसीआर की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है, परिणाम है कि अत्यधिक प्रवाह सक्रिय सेल छंटाई (FACS) विश्लेषण6के साथ सहसंबंधित उपज । यह मात्रात्मक आनुवंशिक विश्लेषण विधि टेम्पलेट न्यूक्लिक एसिड अणुओं और पीसीआर रिएजेंट्स को हजारों असतत, मात्रात्मक रूप से परिभाषित, शून्य, एक या एक से अधिक लक्षित न्यूक्लिक एसिड प्रतियों वाली बूंदों में विभाजित करने पर निर्भर करती है, जो माइक्रोफ्लुइडिक्स7,,8द्वारा सक्षम पानी-इन-ऑयल पायस का उपयोग करके। पीसीआर प्रवर्धन प्रत्येक व्यक्ति की बूंद के भीतर किया जाता है और प्रत्येक बूंद की अंतिम बिंदु फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापा जाता है, जिससे नमूने में मौजूद लक्ष्यों की पूर्ण मात्राकरण की अनुमति मिलती है। ड्रॉपलेट पीसीआर को मानक क्यूपीसीआर की तुलना में अधिक सटीक, सटीक और तकनीकी रूप से सरल होने के लिए स्थापित किया गया है, जिससे टी-कोशिकाओं के नैदानिक मूल्यांकन के लिए यह अधिक अनुकूल डीएनए मिथाइलेशन-आधारित विधि बन गई है। हालांकि तेजी से उभरती हुई सबटाइपिंग पद्धति, विभिन्न मिथाइलेटेड सीपीजी क्षेत्रों की जांच के लिए मल्टीप्लेक्स एपिजेनेटिक विश्लेषण की कमी है। यह नियमित ल्यूकोसाइट अंतर गिनती के लिए आवश्यक है।

इसके साथ ही, एक थर्मोप्लास्टिक इलास्टोमर (टीपीई) ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को मिथाइलेशन-विशिष्ट मल्टीप्लेक्स ड्रॉपलेट पीसीआर (एमडीपीसीआर) के लिए प्रस्तुत और नियोजित किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग सेल-वंश डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न यानी CD3Z और FOXP3 CpG क्षेत्रों के एपीजेनेटिक वेरिएशन के आधार पर क्रमशः विशिष्ट ल्यूकोसाइट उपप्रकार, सीडी 3+ टी-सेल और सीडी 4+ सीडी25+ टी-रेग्स को चित्रित करने के लिए किया गया है । डीएनए निष्कर्षण, बिसल्फी रूपांतरण और एमडीपीसीआर के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल टीपीई बूंद पीढ़ी डिवाइस के लिए एक निर्माण विधि के साथ संगीत कार्यक्रम में वर्णित है। विधि के प्रतिनिधि परिणामों की तुलना प्रस्तावित दृष्टिकोण की उपयोगिता को रेखांकित करते हुए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने वालों से की जाती है।

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Protocol

मानव नमूनों से जुड़े इस अध्ययन में किए गए सभी प्रयोगों को एनआरसी के एथिक्स बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और एनआरसी की मानव विषयों को नियंत्रित करने वाली नीतियों के अनुसार किया गया था जो लागू अनुसंधान दिशानिर्देशों का पालन करते हैं और कनाडा के क्यूबेक में कानूनों के अनुरूप हैं ।

1. सेल की तैयारी

  1. जमे हुए मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसीएस) को तुरंत 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखकर पिघलाएं।
  2. कोशिकाओं को धीरे-धीरे फिर से खर्च करने के लिए क्रायोवियल को दो बार उलटें और 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके सेल निलंबन को 15 एमएल शंकुपाल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. पीबीएमसीसी युक्त 15 एमएल ट्यूब में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (आरपीएमआई-1640 +10% एफबीएस) के साथ प्री-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) ग्रोथ मीडियम सप्लीमेंट के 10 एमएल जोड़ें।
  4. सेंट्रलाइज एक झूल बाल्टी अपकेंद्रित्र में कमरे के तापमान पर तेजी से त्वरण और उच्च पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए ३३० एक्स जी की गति से अपकेंद्रित्र ।
  5. एक बार स्पिन खत्म हो जाने के बाद, सुपरनिटेंट को सावधानी से डिकंट करें। फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) पीएच 7.2 के 3 एमएल में सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ट करें, जिसमें ट्यूबों के किनारे टैप करके 2 एमएम एथिलेंडियामाइनेट्राएक्टेटिक एसिड (EDTA) होता है।
  6. कसकर बंद टोपी के साथ ट्यूब उलटा द्वारा कोशिकाओं को मिलाएं।
  7. दो 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब तैयार करें और प्रत्येक ट्यूब में सेल सस्पेंशन के एक पिपेट एलिकोट 1.5 एमएल का उपयोग करें, जिनमें से एक का उपयोग बाद में इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए किया जाता है और डीएनए निष्कर्षण के लिए एक।

2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और इमेजिंग प्रोटोकॉल

  1. पीबीएस बफर के 200 माइक्रोन में कोशिकाओं (1.7 से) को 0.1% सोडियम एजाइड और 2% एफबीएस युक्त पुनर्सेपित करें और सेल निलंबन की अंतिम एकाग्रता को अधिकतम 2 x 107 कोशिकाओं/एमएल में समायोजित करें।
  2. दो अलग-अलग 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में 100 माइक्रोल वॉल्यूम को पाइप करके सेल सस्पेंशन को विभाजित करें।
  3. फ्लोरोसीन आइसोथियोसायनेट (फिटसी) और फिलोरेथ्रिन (पीई) के साथ क्रमशः एक ट्यूब और एंटी-हू सीडी 4/सीडी25 के साथ संयुग्मित एंटी-हू सीडी 3/सीडी4 की 20 माइक्रोन मात्रा क्रमशः दूसरीट्यूब में जोड़ें।
  4. प्रत्येक ट्यूब में नीले फ्लोरोसेंट लाइव सेल दाग (सामग्री की तालिकादेखें) की 1 बूंद जोड़ें।
  5. 2 घंटे के लिए एक ट्यूब रोटेटर का उपयोग कर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। प्रकाश से रक्षा करें।
  6. तेजी से त्वरण और उच्च पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 330 x ग्राम पर कमरे के तापमान पर सेल निलंबन अपशंपित करें।
  7. सुपरनेट को डिकेंट करें और ध्यान से ट्यूब को टैप करके सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें। पीबीएस के 1 मिलीएल, पीएच 7.2 जिसमें 2 m EDTA शामिल हैं। यह सुनिश्चित करना कि टोपी कसकर बंद हो गई है, ट्यूब 2x को उलटा करके कोशिकाओं को मिलाएं।
  8. तीन बार के लिए 2.6 और 2.7 कदम दोहराएं।
  9. पीबीएस पीएच 7.2 के 20 माइक्रोन में 20 माइक्रोन में 2 m edTA युक्त कोशिकाओं को फिर से पेंड करें।
  10. एक बोरोसिलिकेट माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सेल निलंबन के पिपेट 10 माइक्रोन ड्रॉप और कोशिकाओं के लिए 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए धीरे से ड्रॉप के नीचे तलछट ।
  11. ध्यान से माइक्रोस्कोप स्लाइड के शीर्ष पर एक ग्लास कवर पर्ची रखें और स्लाइड को उल्टे माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें।
  12. 10x उद्देश्य और दोनों सेल निलंबन नमूनों के लिए फ्लोरोफोरस में से प्रत्येक के लिए माइक्रोस्कोप से जुड़े एक EMCCD कैमरा का उपयोग कर कोशिकाओं की छवियों को रिकॉर्ड करें।
  13. मैन्युअल रूप से फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं की गणना करें (कच्चे डेटा के लिए पूरक जानकारी देखें)।
  14. CD3 + टी-सेल और सीडी 4+ सीडी25+ टी-रेग्स के अनुपात को कुल ल्यूकोसाइट तक प्राप्त करने के+ लिए DAPI-दाग कोशिकाओं के लिए एंटी-हू सीडी 3 और एंटी-हू सीडी 4/सीडी 25 लेबल-कोशिकाओं का अनुपात लें।

3. डीएनए निष्कर्षण और बिसुल्ते रूपांतरण

  1. डीएनए निष्कर्षण
    नोट: निर्माता द्वारा प्रदान की गई प्रक्रियाओं के बाद चुंबकीय डीएनए शुद्धिकरण किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके धारा 1 में तैयार पीबीएमसी से डीएनए निकालें।
    1. पीबीएस के 100 माइक्रोन में 1.5 एमएल ट्यूब सस्पेंड कोशिकाओं में और 20 माइक्रोन के प्रोटीनेज के और 400 माइक्रोन ऑफ लाइसिस/बाइंडिंग बफर जोड़ें। ऊपर-नीचे 10x पाइपिंग द्वारा मिलाएं, फिर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन प्रदर्शन करें।
    2. 1-2 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर ट्यूब रखकर डीएनए-मनका परिसर पर कब्जा करें, फिर ध्यान से हटा दें और सुपरनैंट को त्यागें।
    3. चुंबकीय रैक से डीएनए-मनका परिसर युक्त ट्यूब को हटा दें और किसी भी गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को धोने के लिए वॉश बफर #1 के 600 माइक्रोन में मोतियों को फिर से खर्च करें।
    4. ट्यूब को फिर से चुंबकीय रैक पर रखें और ध्यान से हटा दें और सुपरनैंट को छोड़ दें।
    5. वॉश बफर #2 के 600 माइक्रोन के साथ 3.1.3 और 3.1.4 चरण दोहराएं।
    6. ट्यूब को 1 मिनट के लिए हवा-सूखी के लिए खुला छोड़ दें।
    7. चुंबकीय रैक से ट्यूब निकालें और Elution बफर के १०० μL वितरण और डीएनए/मनका परिसर ऊपर और नीचे 20x के द्वारा डीएनए elute ।
    8. चुंबकीय रैक पर फिर से eluted डीएनए युक्त ट्यूब रखें और eluted डीएनए से चुंबकीय मोतियों को अलग करने के लिए 1-2 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    9. एक नई साफ ट्यूब के लिए eluted शुद्ध डीएनए समाधान हस्तांतरण।
    10. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260 एनएम पर अवशोषण को मापकर शुद्ध डीएनए नमूने की एकाग्रता का आकलन करें।
  2. बिसुलफिट रूपांतरण
    नोट: निर्माता द्वारा प्रदान की गई प्रक्रियाओं के बाद मिथाइलेशन किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके शुद्ध डीएनए पर बिसुल्फिट रूपांतरण करें।
    1. एक पीसीआर ट्यूब में डीएनए नमूना (200-500 एनजी) के 20 माइक्रोन करने के लिए रूपांतरण Reagent के १३० माइक्रोन जोड़ें । अच्छी तरह से मिलाएं और संक्षेप में नीचे स्पिन करें।
    2. पीसीआर ट्यूब को थर्मल साइकिलर में स्थानांतरित करें और इस प्रकार साइकिलिंग प्रोटोकॉल करें: 8 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 60 मिनट के लिए 54 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    3. एक संग्रह ट्यूब में रखा एक आयन क्रोमेटोग्राफी (आईसी) कॉलम के लिए बाध्यकारी बफर के 600 μL जोड़ें।
    4. बाध्यकारी बफर युक्त आईसी कॉलम में डीएनए नमूना जोड़ें और कई बार ट्यूब को उलटा करके मिलाएं। पूरी गति से 30 एस के लिए सेंट्रलाइज । एकत्र प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    5. कॉलम में अब वॉश बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें। चरण 3.2.4 में वर्णित अपकेंद्रित्रण करें और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    6. Desulfonation बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें और 15-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन प्रदर्शन करते हैं। अपकेंद्रित्र और प्रवाह के माध्यम से त्यागने के रूप में ऊपर कदम में वर्णित है ।
    7. कॉलम में वॉश बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें। 30 एस के लिए पूरी गति से अपकेंद्रित्र और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    8. दोहराएं चरण 3.2.7।
    9. कॉलम को एक नए 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें और कॉलम की झिल्ली पर पीसीआर-ग्रेड पानी के 100 माइक्रोन जोड़ें। डीएनए को elute करने के लिए 1 मिनट के लिए पूरी गति से अपकेंद्रित्र ।
    10. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260 एनएम पर अवशोषण को मापकर बिसुल्फिट-परिवर्तित डीएनए नमूने की एकाग्रता का आकलन करें।
      नोट: 260 एनएम = 1.0 पर अवशोषण के लिए 40 μg/mL के मूल्य का उपयोग करें।
    11. शॉर्ट टर्म स्टोरेज के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए स्टोर करें या लॉन्ग टर्म स्टोरेज के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर।

4. बूंद पीढ़ी डिवाइस निर्माण

नोट: बूंद पीढ़ी (पूरक सूचनामें प्रदान की गई सीएडी फाइल) के लिए उपयोग किया जाने वाला एक माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस थर्मोप्लास्टिक इलास्टोमर (सामग्री की तालिकादेखें) में एक स्वच्छ कमरे (कक्षा 1,000) वातावरण में निर्मित किया गया था, जो निम्नलिखित प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न गर्म एम्बॉसिंग का उपयोगकरके।

  1. एसयू-8 मोल्ड निर्माण
    1. नीचे विस्तृत रूप में मानक फोटोलिथोग्राफी का उपयोग करके 6 "सिलिकॉन वेफर पर एक एसयू-8 मोल्ड तैयार करें।
    2. 10 एस के लिए 500 डब्ल्यू पर ऑक्सीजन प्लाज्मा का उपयोग करके एक 6 "सिलिकॉन वेफर को साफ करें।
    3. स्पिन कोट एसयू-8 १०० μm की कुल फिल्म मोटाई प्राप्त करने के लिए ४० एस के लिए ९०० आरपीएम पर सिलिकॉन वेफर पर विरोध करते हैं ।
    4. वेफर को गर्म प्लेट पर रखें और 65 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए प्री-बेक करें, इसके बाद 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे का समय दें।
    5. १,००० mJ/सेमी2की एक्सपोजर डोज का इस्तेमाल करते हुए हाई-डेफिनेशन ट्रांसपेरेंसी फोटोमास्क के जरिए ३६५ एनएम (एचजी आई-लाइन) पर यूवी लाइट को बेनकाब करें ।
    6. वेफर को गर्म प्लेट पर रखें और 65 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पोस्ट-बेक करें, इसके बाद 95 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट का समय दें।
    7. 5 मिनट के लिए प्रोपलीन ग्लाइकोल मोनोमिथाइल ईथर एसीटेट (पीजीएमईए) में विसर्जित करके विकसित करें।
    8. पीजीएमईए और आइसोप्रोपेनॉल के साथ कुल्ला और नाइट्रोजन गैस की एक धारा के साथ सूखी।
    9. वेफर को गर्म प्लेट पर रखें और 135 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए हार्ड बेक करें।
    10. 2 घंटे के लिए एक आसन्न ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखे सिलनाइजिंग एजेंट (ट्राइकोलोरो परफ्लोरोऑक्टिल साइलेन) की एक बूंद वाले वैक्यूम डेसिकेटर में वेफर को सीलनाइज करें।
      नोट: यह एसयू-8 मास्टर की सतह पर एक मोनोलेयर बनाने के लिए किया जाता है। ट्राइकोलोरो पेफ्लोरोऑक्टिल सिलेन को हमेशा धुएं के हुड में संभाला जाना चाहिए और जल स्रोतों से दूर रखा जाना चाहिए।
  2. पॉलीडिमेथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) प्रतिकृति
    1. प्लास्टिक कप में एजेंट के इलाज के लिए इलास्टोमर बेस के 10:1 अनुपात w/w पर पीडीएमएस (सामग्रीकी तालिका देखें) के तरल प्रीपॉलिमर तैयार करें।
    2. पीडीएमएस मिश्रण को मिलाने और डेगास करने के लिए कप को ग्रहों के अपकेंद्रित्र वैक्यूम मिक्सर में रखें।
    3. कस्टम मेटल होल्डर में रखे मोल्ड पर पीडीएमएस मिश्रण डालें जो राल रिसाव को रोकता है और 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इलाज करता है।
    4. चिमटी का उपयोग करना, ध्यान से एसयू-8 मास्टर से पीडीएमएस मोल्ड छील ।
  3. एपॉक्सी मोल्ड
    नोट: एक epoxy मोल्ड एसयू-8/सिलिकॉन मास्टर से पीडीएमएस के साथ एक मध्यवर्ती प्रतिकृति प्रक्रिया का उपयोग कर गढ़े गया था ।
    1. रिसनोल/हार्डनर के 100/83 w/w अनुपात का उपयोग करके एपॉक्सी राल (सामग्रीकी तालिका देखें) तैयार करें ।
    2. 30 मिनट के लिए वैक्यूम सुखाने ओवन का उपयोग कर कम दबाव के तहत मिश्रण Degas ।
    3. पीडीएमएस प्रतिकृति के ऊपर राल डालो और 12 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इलाज।
    4. पीडीएमएस प्रतिकृति से ठीक एपॉक्सी मोल्ड निकालें, एक गर्म प्लेट पर रखें और 120 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए हार्ड-बेक करें।
  4. टीपीई डिवाइस
    1. टीपीई के बाहर निकलने वाले छर्रों (सामग्री की तालिकादेखें) 165 डिग्री सेल्सियस पर 2.0 मिमी मोटी और 7 "लंबाई में कई मीटर की चौड़ी चादरें और उन्हें भविष्य के उपयोग के लिए एक रोल के रूप में स्टोर करें।
    2. एक 7 "वर्ग में कैंची का उपयोग कर रोल से टीपीई शीट काटें।
    3. एपॉक्सी मोल्ड और एक गैर-पैटर्न वाले सिलनाइज्ड सिलिकॉन वेफर के बीच टीपीई शीट रखें (वेफर सिलनाइजेशन प्रक्रिया के लिए चरण 4.1.10 देखें)।
    4. 125 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर गर्म-उभरने, 10 केएन का एक लागू बल, और 10 मिनट के लिए10 -2 मीटर का दबाव करें।
    5. सिलिकॉन वेफर और एपॉक्सी मोल्ड से उभरे टीपीई को अलग करने के लिए मेथनॉल स्प्रे का उपयोग करके कमरे के तापमान पर सावधानी से डेमोल्ड करें।
    6. टीपीई की एक और 7 "स्क्वायर शीट काटें और इसे दो गैर-पैटर्न वाले सिलनाइज्ड सिलिकॉन वेफर्स के बीच रखें।
    7. 140 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर गर्म-उभरने, 10 केएन का एक लागू बल, और चैनलों को बंद करने और डिवाइस को सील करने के लिए एक प्लैनर सतह बनाने के लिए 10 मिनट के लिए 10-2 mbar का दबाव करें।
    8. दो सिलिकॉन वेफर्स से उभरे टीपीई को अलग करने के लिए मेथनॉल स्प्रे का उपयोग करके कमरे के तापमान पर सावधानी से डेमोल्ड करें।
    9. एक डॉक्टर ब्लेड का उपयोग कर डिवाइस आकार के लिए उभरा टीपीई चादरें के प्रत्येक काटें ।
    10. एक प्लंजर के साथ एक 1 मिमी बायोप्सी पंच सुई का उपयोग कर संरचित डिवाइस में इनलेट और आउटलेट चैनलों के लिए उपयोग छेद पंच।
    11. कमरे के तापमान पर चैनलों के साथ सीधे संपर्क में एक प्लैनर टीपीई डिवाइस रखकर चैनलों को संलग्न करें।
    12. वैकल्पिक रूप से, डिवाइस बॉन्डिंग को बढ़ावा देने के लिए 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें।
    13. डिस्पोजेबल फ्लूइड ट्यूबिंग (मैंने 0.25 मिमी, ओडी 0.8 मिमी) के साथ एक्सेस होल फिट करें। रिसाव-प्रूफ हेरफेर सुनिश्चित करने के लिए एपॉक्सी गोंद का उपयोग करके जोड़ों को सील करें।

5. ड्रॉपलेट जनरेशन और पीसीआर

नोट: तालिका 1 सी-लेस, सीडी 3जेड और फॉक्सपी 3 जीन के लिए डबल-शमन हाइड्रोलिसिस जांच के साथ आगे और रिवर्स प्राइमर के बारे में जानकारी रेखांकित करता है, जो डेमेथाइलेटेड जीन लक्ष्यों के मल्टीप्लेक्स प्रवर्धन के लिए आवश्यक हैं ।

  1. टेबल 2में वर्णित मास्टर मिक्स तैयार करें।
  2. एंजाइम मिश्रण को छोड़कर मास्टर मिश्रण के सभी घटकों को पिघलाएं। मास्टर मिक्स को अच्छी तरह से ऊपर-नीचे पाइपिंग करके मिलाएं और संक्षेप में नीचे स्पिन करें।
  3. एक पीसीआर ट्यूब में मास्टर मिश्रण करने के लिए बिसुलफिटे परिवर्तित डीएनए (धारा 3.2 से) की उचित मात्रा (1 μL) जोड़ें। ऊपर-नीचे पाइपिंग करके प्रतिक्रिया मिलाएं और संक्षेप में नीचे स्पिन करें।
  4. PEEK फिटिंग का उपयोग करके डिस्पोजेबल फ्लूइडिक ट्यूबिंग (मैंने 0.25 मिमी, O.D. 1.6 मिमी) को दो सटीक ग्लास सीरिंज (250 माइक्रोल वॉल्यूम) से कनेक्ट करें।
  5. 5% फ्लोरो-सर्फेक्टेंट युक्त वाहक तेल के 250 माइक्रोल के साथ एक सटीक ग्लास सिरिंज को प्रीफिल करें।
  6. पायसीकरण के दौरान पूरे नमूना मात्रा का वितरण सुनिश्चित करने के लिए पीसीआर मिश्रण के 100 माइक्रोन लोड करने से पहले वाहक तेल के 50 माइक्रोन के साथ एक और सटीक ग्लास सिरिंज प्रीफिल करें।
  7. वास्तविक समय में बूंद गठन का निरीक्षण और रिकॉर्ड करने के लिए एक उच्च गति कैमरे से लैस एक ईमानदार प्रकाश माइक्रोस्कोप के एक मंच पर एक बूंद माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस सेट-अप।
  8. प्रोग्रामेबल सिरिंज पंप पर प्रीफिल्ड सिरिंज रखें और फिटिंग के साथ PEEK यूनियन का उपयोग करके (सामग्री की तालिकादेखें), सिरिंज की ट्यूबिंग को बूंद माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के संबंधित इनलेट चैनलों की ट्यूबिंग से जोड़ें।
  9. 0.5 एमएल पीसीआर ट्यूब के अंदर बूंद जनरेटर के आउटलेट से ट्यूबिंग रखें।
  10. सिरिंज पंप की प्रवाह दर को 2 माइक्रोन/मिनट तक समायोजित करें और परिणामी पायस को इकट्ठा करने से पहले बूंद आकार को स्थिर करने की अनुमति दें।
  11. पायस ले लीजिए और थर्मल साइकिलिंग के लिए 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में 75 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
  12. सुनिश्चित करें कि पीसीआर ट्यूब में तेल की मात्रा थर्मल साइकिलिंग के दौरान बूंदों के सामंजस्य को रोकने के लिए फैलाए गए चरण की मात्रा से निकटता से मेल खाती है।
  13. थर्मल साइकिलर में 0.2 मिलीएल पीसीआर ट्यूब रखें और इस प्रकार साइकिलिंग प्रोटोकॉल करें: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीटिंग, फिर 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 45 चक्र और 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग/एक्सटेंशन।
  14. बूंदों की छवि और बूंद व्यास का आकलन करने के क्रम में आयताकार प्रोफ़ाइल के साथ एक बोरोसिलिकेट केशिका ट्यूब (100 माइक्रोन गहराई) को भरने के लिए शेष पायस का उपयोग करें।
  15. पायस से भरी बोरोसिलिकेट ट्यूब को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें। बूंदों की उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए ईएमसीसीडी कैमरे और 10x उद्देश्य से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  16. नीचे विस्तृत के रूप में एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बूंद व्यास को मापने।
  17. 'विश्लेषण'बटन और फिर'सेट स्केल'का चयन करके छवि में पिक्सल की संख्या के अनुरूप माइक्रोन में ज्ञात दूरी का पैमाना निर्धारित करें।
  18. 'इमेज' बटन और फिर'टाइप'चुनकरइमेजको ग्रेस्केल में बदल दें। जरूरत पड़ने पर चमक और कंट्रास्ट को एडजस्ट करें। 'इमेज'बटन और फिर'एडजस्ट थ्रेसहोल्ड'चुनकर सर्कल्स को चित्रित करने और भरने के लिए मैन्युअल थ्रेसहोल्ड सेट करें।
  19. कणों काविश्लेषण कणों काचयन करके और गोलाकारता को 075 -1 पर सेट करके विश्लेषण करें।
  20. परिणामी क्षेत्र और मापी गई बूंदों का व्यास प्राप्त करें जो स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर में प्रदर्शित होता है।
  21. मतलब बूंद व्यास की गणना करें और गोलाकार बूंद संभालने के लिए, विभाजन की मात्रा का अनुमान लगाएं, जिसका उपयोग पूर्ण लक्ष्य एकाग्रता की गणना करने के लिए किया जाएगा।
  22. सुनिश्चित करें कि बूंदों को भिन्नता (सीवी) के गुणांक का विश्लेषण करके मोनोडिस्पर्स हैं, जिन्हें बूंद व्यास (एंड एलटी; 3%) के लिए औसत मूल्यों(k = 1) के लिए मानक विचलन के अनुपात के रूप में लिया जाता है।

6. फ्लोरेसेंस इमेजिंग और छवि विश्लेषण

  1. फ्लोरेसेंस इमेजिंग
    1. प्रवर्धन के बाद, पीसीआर पायस को एक आयताकार प्रोफ़ाइल के साथ बोरोसिलिकेट केशिका ट्यूब (50 माइक्रोन गहराई) में स्थानांतरित करें ताकि इमेजिंग के लिए एक करीबी पैक मोनोलेयर में बूंदों की व्यवस्था की जा सके।
    2. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर भरे हुए केशिकाओं को ठीक करें और यूवी ऐक्रेलिक चिपकने का उपयोग करके दोनों पक्षों को सील करें। नमूना ब्लीचिंग से बचने के लिए पायस को रोशन न करने के लिए सावधान रहने के लिए यूवी चिपकने पर एक यूवी प्रकाश स्रोत लागू करें।
    3. एक ईएमसीसीडी कैमरे और एक 10x उद्देश्य से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर ग्लास स्लाइड लोड करें।
    4. माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, अधिग्रहण का चयन करें । लाइव - रियल-टाइम कैमरा अधिग्रहण शुरू करने के लिए तेजी से, नमूने का निरीक्षण करें, और यह सुनिश्चित करें कि केशिका की चौड़ाई कैप्चर की गई है।
    5. 3.5 वी पर डायस्कोपिक रोशनी के लिए उज्ज्वल क्षेत्र दीपक सेट करें।
    6. 20% तीव्रता पर एपिस्कोपिक रोशनी के लिए व्यापक स्पेक्ट्रम एलईडी फ्लोरोसेंट लैंप सेट करें।
    7. अंशांकन का चयन करके सभी तरंगदैर्ध्य (उज्ज्वल क्षेत्र, एफएएम, हेक्स और Cy5) के लिए कैप्चर सेटिंग को मैन्युअल रूप से समायोजित करें । इमेजिंग सॉफ्टवेयर में ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन कमांड। प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए, संबंधित फ्लोरेसेंस फिल्टर घन को मैन्युअल रूप से बंद करने की आवश्यकता है। उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के लिए एक फिल्टर घन एक ही ऑप्टिकल पथ रखने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
    8. अधिग्रहण का उपयोग कर छवि अधिग्रहण से पहले जोखिम समय मैन्युअल रूप से समायोजित करें । प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए कैमरा सेटिंग कमांड टेबल 3में संक्षेप में। सॉफ्टवेयर के'कैप्चर सेटिंग्स'मेन्यू में 100 के गेन गुणक के साथ 16-बिट पर रीडआउट मोड ईएम गेन 17 मेगाहर्ट्ज सेट करें।
    9. सॉफ्टवेयर की LUT खिड़की में, LUTs पैमाने पर इस तरह सेट करें कि ट्रांसमिशन सिग्नल सेट रेंज के भीतर शामिल हो। इस प्रयोग में, पैमाने को 500 से 12,000 तक लगभग निर्धारित किया गया था।
    10. उस विशिष्ट क्रम में XY स्कैन और कई तरंगदैर्ध्य विकल्पों का उपयोग करके मल्टीपॉइंट अधिग्रहण कार्यक्रम का उपयोग करके कैप्चर को स्वचालित करें। सुनिश्चित करें कि चरण प्रारंभिक स्थिति में जाता है, सभी विभिन्न तरंगदैर्ध्य को कैप्चर करता है, और फिर अगली स्थिति में आगे बढ़ता है।
    11. सबसे पहले, सॉफ्टवेयर के XY स्कैन मेनू में XY स्कैन प्रोफाइल को अनुकूलित करके XY स्कैन को सेट-अप करें। 'कस्टममल्टीपॉइंट डेफिनेशन'में, बड़ी इमेज डेफिनेशन बॉक्स चुनें और इसे लगभग 40.0 x 1.0 मिमी (पायस भरने की लंबाई) में सेट करें। 1% ओवरलैप का उपयोग करें।
    12. 'यूज फोकस सरफेस'विकल्प को सक्षम करें और माइक्रोस्कोप पर फोकस नॉब का उपयोग करते हुए नमूने पर विभिन्न बिंदुओं पर फोकस प्लेन को एडजस्ट करके फोकस सरफेस कर्व सेट करें।
    13. दूसरा, स्कैन टैब का चयन करके मल्टीपल वेवलेंथ स्कैन सेटअप करें। प्रत्येक तरंगदैर्ध्य के लिए चरण 6.1.7 में बनाए गए प्रत्येक ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन जोड़ें।
    14. सैंपल को ब्लीचिंग से बचने के लिए स्टेज मूवमेंट के दौरान एक्टिव शटर बंद करने और स्टार्टरनबटन दबाकर अधिग्रहण चलाने के विकल्प पर क्लिक करें। प्रत्येक अधिग्रहण फ्रेम को झगड़ा फ़ाइलों में निर्यात करें और प्रत्येक चैनल को स्प्लिट मल्टीपल फाइल्स विकल्प का उपयोग करके और सहेजे गए LUTs सेटिंग्स को लागू करके एक अलग फ़ाइल में विभाजित करें। प्रत्येक छवि फ़ाइल को आसानी से अलग करने के लिए बिंदु नाम और चैनल नाम विकल्प का उपयोग करें।
  2. छवि विश्लेषण
    1. एक ओपन सोर्स इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर पर अपलोड करने के लिए ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस फिल्टर द्वारा सभी अधिग्रहीत छवियों को सॉर्ट करें।
    2. ब्राइटफील्ड छवियों का उपयोग करके सभी बूंदों की पहचान करने के लिए एक पाइपलाइन बनाने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, फिर संबद्ध फ्लोरोसेंट बूंदों की तीव्रता को मापें।
    3. पाइपलाइन के लिए ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस टिफ इमेज अपलोड करें फिर मॉड्यूल्स'कलरटूग्रे','पहचानेंरमियोबेक्ट्स','नाप-तौल'और'एक्सपोर्टटोस्प्रेडशीट'जोड़ें। वस्तुओं की पहचान करने के लिए ब्राइटफील्ड ड्रॉपलेट छवियों का उपयोग करें, फिर फ्लोरोसेंट छवियों की तीव्रता को मापने के लिए मुखौटा के रूप में वस्तुओं का उपयोग करें।
    4. फ्लोरेसेंस ड्रॉपलेट छवियों की औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता निकालने के लिए चयनित झगड़ा छवियों के साथ पाइपलाइन चलाएं। प्रत्येक सेट में विश्लेषण के लिए ~ 5,000 बूंदों से मिलकर प्रत्येक सेट के साथ ट्रिपलीकेट में प्रयोग करें।
    5. सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के समूहों की पहचान करने के लिए'परिभाषित'एल्गोरिदम (http://definetherain.org.uk/) लागू करें। सकारात्मक मतलब के 3 मानक विचलन के भीतर होना चाहिए । यह गिनती के लिए उपयोग की जाने वाली सकारात्मक बूंदों की सीमा तीव्रता निर्धारित करता है।
    6. फिर से छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एक नई पाइपलाइन को लागू जहां प्रत्येक जीन लक्ष्य के लिए फ्लोरेसेंस दहलीज पिछले कदम में परिभाषित के रूप में निर्धारित किया गया है लागू करने के लिए ।
    7. पाइपलाइन में ब्राइटफील्ड और फ्लोरोसेंट छवियों को अपलोड करें। इसमें'कलरटोग्रे','रिस्केलेंट','दहलीज','पहचानेंप्रियोबेक्ट्स','नाप-तौल','फिल्टरऑब्जेक्ट्स',और'एक्सपोर्टटोस्प्रेडशीट'जोड़ें। उज्ज्वल क्षेत्र छवियों और बूंदों के लिए प्रत्येक फ्लोरेसेंस फिल्टर के लिए अद्वितीय मॉड्यूल बनाएं।
    8. प्रत्येक फ्लोरेसेंस इमेज ग्रुप के लिए 0 से 1 तक इमेज तीव्रता स्केल को पुनर्स्केल करें। फिर स्थापित सीमा से ऊपर की वस्तुओं की पहचान करने और गिनती करने के लिए दहलीज निर्धारित करें। यदि आवश्यक हो, तो ब्राइटफील्ड में बूंदों की गिनती और पहचान की सुविधा के लिए वस्तुओं को सिकोड़ने के लिए'विस्तारक श्रिंकोबेक्ट्स'मॉड्यूल जोड़ें।
    9. केवल 20-30 पिक्सल के चयनित आकार के भीतर वस्तुओं की पहचान करें और गिने हुए वस्तुओं को फ़िल्टर करें ताकि केवल एक विशिष्ट व्यास (यानी, 75 माइक्रोन व्यास रेंज में बूंदें) और 0.5 और नीचे की गोल गोलाकार सनक के साथ उन वस्तुओं को बनाए रखा जा सके।
    10. परिणामों को एक तालिका में निर्यात करें जो ब्राइटफील्ड छवियों से कुल बूंद गिनती को सूचीबद्ध करता है, साथ ही उपयोग किए जाने वाले सभी फ्लोरेसेंस चैनलों की बूंद गिनती; अर्थात् सी-कम जीन के लिए Cy5, मेथिलेटेड सीडी 3जेड जीन के लिए हेक्स, और मेथिलेटेड FOXP3 जीन के लिए एफएएम (प्रस्तुत एमडीपीसीआर परख के लिए प्राप्त कच्चे प्रयोगात्मक डेटा के लिए पूरक जानकारी देखें)।
    11. प्रत्येक जीन लक्ष्य के लिए नकारात्मक बूंदों के अनुपात की गणना करें और समीकरण 1 का उपयोग करके संबंधित प्रति बूंद (सीपीडी) प्राप्त करने के लिए पॉइसन वितरण लागू करें:
      Equation 1
      जहां एक्स 0, 1, 2 या अधिक अणुओं वाली बूंदों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, और λ सीपीडी मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है।
    12. गणना करें, सीपीडी मूल्य का अनुपात और समीकरण 2 के साथ चरण 5.20 में प्राप्त बूंद मात्रा को लेकर पूर्ण लक्ष्य एकाग्रता:
      Equation 2
      जहां मूल्य (1-पी) नकारात्मक बूंदों के अंश का प्रतिनिधित्व करता है।
    13. सी-कम - या कुल सेल - CPD मूल्य द्वारा मेथिलेटेड सीडी 3जेड और FOXP3 जीन के संबंधित CPD मूल्यों को विभाजित करके CD3+ T-Cells और CD4+ CD25+ T-Regs के प्रतिशत की गणना करें - सीपीडी मूल्य (कच्चे डेटा से सीपीडी गणना के लिए पूरक जानकारी देखें)।
    14. CD3 + टी-सेल और सीडी4 + सीडी 25+ टी-रेग गिनती के लिए+ एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग से प्राप्त लोगों के लिए इन प्रतिशत मूल्यों की तुलना करें।

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Representative Results

टीपीई-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक ड्रॉपलेट जनरेटर डिवाइस को चित्र 1में दिखाए गए वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके गढ़ा गया था। सिलिकॉन (एसआई) मास्टर प्राप्त करने के लिए फोटोलिथोग्राफी में एक ट्रांसपेरेंसी मास्क का उपयोग किया गया था। एसआई मास्टर की एक व्युत्क्रम पीडीएमएस प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए नरम लिथोग्राफी की गई थी जिसका उपयोग तब एपॉक्सी मोल्ड बनाने के लिए किया जाता था। एपॉक्सी अग्रदूत पीडीएमएस पर डाला गया था और क्रॉसलिंक और कठोर करने के लिए ठीक हो गया था। एसआई मास्टर की सटीक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करने वाला यह मोल्ड गर्म उभरने का उपयोग करके थर्मोप्लास्टिक के बाद थर्मोप्लास्टी के बाद के थर्मोफॉर्मिंग के लिए अधिक लचीला था। एक बार एपॉक्सी मोल्ड प्राप्त होने के बाद थर्मोप्लास्टिक इलास्टोमर उभरा हुआ था। उभरा के बाद, टीपीई को डेमोल्ड किया गया था, और उपकरणों को काट दिया गया था। डिवाइस को सील करने के लिए एक फ्लैट टीपीई सब्सट्रेट का इस्तेमाल किया गया था । छेद शीर्ष कवर में मुक्का मारा गया था, और दो सब्सट्रेट्स बंधुआ थे । अंत में, दुनिया के लिए चिप कनेक्शन के लिए आवश्यक टयूबिंग डाला गया और डिवाइस उपयोग के लिए तैयार था । मनगढ़ंत मास्टर मोल्ड, टीपीई सामग्री और उभरे उपकरणों की नमूना छवियां चित्र 2में दिखाई गई हैं। एमडीपीसीआर के लिए पायस उत्पन्न करने के लिए स्वतंत्र प्रोग्रामेबल सिरिंज पंपों की एक जोड़ी के साथ ट्यूबिंग इंटरकनेक्ट्स के साथ इकट्ठे डिवाइस का संचालन किया गया था। मेथिलेशन-विशिष्ट एमडीपीसीआर को जमे हुए पीबीएमएमसी से निकाले गए बिसुलफिट उपचारित डीएनए का उपयोग करके किया गया था । पायसीकरण के लिए पीसीआर मिश्रण में सीडी 3जेड, फॉक्सपी3 और सी-लेस जीन के लिए उपयुक्त प्राइमर और हाइड्रोलिसिस जांच को जोड़ा गया । उपयुक्त आकार (लगभग 72 माइक्रोन व्यास) की बूंद पीढ़ी के बाद, पायस को थर्मल साइकिलिंग प्रोटोकॉल के अधीन किया गया था। अंत में, बूंदों को एक ग्लास केशिका में पेश किया गया जिसमें इमेजिंग के लिए 1 मिमी चौड़ाई और 50 माइक्रोन ऊंचाई थी। इसके परिणामस्वरूप फ्लोरेसेंस इमेज एक्विजिशन(चित्र 3)के लिए आदर्श बूंदों का मोनोलेयर वितरण होता है। छवियों को चार तरंगदैर्ध्य में से प्रत्येक के लिए दर्ज किया गया । इसके बाद सभी बूंदों(चित्रा 4)को 'परिभाषित' एल्गोरिदम के माध्यम से स्थापित दहलीज मानदंडों को पूरा करने के लिए एक छवि विश्लेषण किया गया। इसके बाद उनके संबंधित फ्लोरोफोर में सभी बूंदों की फ्लोरेसेंस तीव्रता को प्लॉट किया जाता है और सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों की दहलीज(चित्र 5) स्थापित कीगई थी । बाद में, इन बूंदों की पहचान और गिनती की गई जो चयनित सीमा से ऊपर थीं। इसके बाद सीपीडी मूल्यों की गणना की गई और सीडी 3+ टी-सेल और सीडी 4+ 25+ टी-रेग्स का प्रतिशत क्रमशः मेथिलेटेड सीडी 3जेड और फॉक्सपी 3 प्रतियों के आधार पर स्थापित किया गया था, जिसमें कुल कोशिकाओं के सीपीडी या सी-कम जीन(चित्रा 6)के संबंध में क्रमशः स्थापित किया गया था । तब प्रतिशत मूल्यों की तुलना उचित एंटीबॉडी का उपयोग करके टी-सेल और टी-रेग आबादी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त की गई थी ।

FOXP3 आगे जीजीजी टीटीटीटी टीजीटी टीजीटी टीटीटी टीटीटी टीटीटी टीजी
FOXP3 रिवर्स टीटीसी टीसीटी टीसीसी टीसीसी एटा एटा टीसीए
CD3Z फॉरवर्ड GGA TGG टीटीजी TGG TGA AAA GTG
CD3Z रिवर्स सीएएए एएए सीटीसी टीटीसी टीटीसी टीसीसी टीएए सीसीए
सी-कम फॉरवर्ड टीटीजी TAT जीटीए टीजीटी गैग टीजीटी जीजीटी जीजीजी जीएए
सी-कम रिवर्स टीटीटी सीटीटी सीसीसी सीटीसी सीटीटी सीटीसी टीटीसी सी
FOXP3 जांच /५६-FAM/CA एसीए कैट सी/जेन/सी एएसी सीएसी कैट/3IABkFQ/
CDZ3 जांच /56-हेक्स/सीसी एएसी सीएसी सी/जेन/ए सीटीए सीसीटी सीएए/3IABkFQ/
सी-कम जांच /56-CY5/CT सीसीसी सीसीटी सी/जेन/T AAC TCT AT/3IABkFQ/

तालिका 1: प्राइमर और हाइड्रोलिसिस जांच डिजाइन।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक समाधान मास्टर मिक्स वॉल्यूम काम एकाग्रता
ट्रिस-एचसीएल 1 मीटर 2 माइक्रोन 20 एमएमएम
केसीएल 1 मीटर 10 माइक्रोल 100 एमएमएम
एमजीसीएल2 25 एमएमएम 16 माइक्रोन 4 एमएमएम
सी-कम प्राइमर 10 माइक्रोन 10 माइक्रोल 1 माइक्रोन प्रत्येक
सीडी3जेड प्राइमर 10 माइक्रोन 10 माइक्रोल 1 माइक्रोन प्रत्येक
FOXP3 प्राइमर 10 माइक्रोन 10 माइक्रोल 1 माइक्रोन प्रत्येक
सी-कम जांच 10 माइक्रोन 5 माइक्रोन 500 एनएम
CD3Z जांच 10 माइक्रोन 5 माइक्रोन 500 एनएम
FOXP3 जांच 10 माइक्रोन 5 माइक्रोन 500 एनएम
हॉटस्टारटाक डीएनए पॉलीमरेज 5 यूनिट/μL 8 माइक्रोन 0.4 यूनिट/μL
बिसुलफिटी-इलाज डीएनए लक्ष्य चर चर चर
नाभिक मुक्त पानी चर
कुल वॉल्यूम 100 माइक्रोल

तालिका 2: एमडीपीसीआर के लिए मास्टर मिक्स नुस्खा।

ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन एक्सपोज़र दीया दीपक फ्लोरोसेंट लाइट
ब्राइट फील्ड 50 एमएस पर बंद
एफएएम 300 एमएस बंद 20%
हेक्स 300 एमएस बंद 20%
Cy5 400 एमएस बंद 20%

तालिका 3: ऑप्टिकल विन्यास और छवि अधिग्रहण के लिए सेटिंग्स।

Figure 1
चित्रा 1: बूंद जनरेटर की तेजी से प्रोटोटाइप। (ए)मास्टर मोल्ड और(बी)टीपीई आधारित माइक्रोफ्लुइडिक इमल्शिफिकेशन डिवाइस के निर्माण के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया का योजनाबद्ध चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: निर्माण प्रक्रिया में शामिल घटक। (A)सिलिकॉन मास्टर,(बी)पीडीएमएस प्रतिकृति,(सी)एपॉक्सी मोल्ड,(डी)टीपीई सामग्री को चादरों में बाहर निकाला गया और रोल में पैक किया गया,(ई)उभरे टीपीई और(डी)असेंबल डिवाइस । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: थर्मल साइकिलिंग के बाद बूंदों की फ्लोरेसेंस छवि अधिग्रहण। (A)एक केशिका में बूंदों की ब्राइटफील्ड छवि जिसने मोनोलेयर छवि अधिग्रहण की अनुमति दी। (ख)सी-लेस जीन की Cy5 फिल्टर छवि कुल सेल काउंट का प्रतिनिधित्व करने वाले लक्ष्य । (ग)मेथिलेटेड सीडी 3जेड जीन लक्ष्य की हेक्स फ़िल्टर छवि सीडी 3+ टी-सेल काउंट से सहसंबद्ध है। (घ)FAM फ़िल्टर छवि मिथाइलेटेड FOXP3 जीन लक्ष्य सीडी 4+ सीडी25+ टी-रेग गिनती से सहसंबद्ध है । स्केल बार 100 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: दहलीज तीव्रता को पूरा करने वाली बूंदों की पहचान के लिए पाइपलाइन का उपयोग किया जाता है। छवियों को पहले फ़ाइल नामकरण का उपयोग करके उपयुक्त फ्लोरेसेंस फ़िल्टर में व्यवस्थित किया गया था। छवियों को तब ग्रेस्केल और सापेक्ष तीव्रता में परिवर्तित किया गया था जो न्यूनतम और अधिकतम बूंद फ्लोरेसेंस तीव्रता के आधार पर पुन: प्राप्त किया गया था। इसके बाद दहलीज का चयन 'परिभाषित' एल्गोरिदम और वस्तुओं - या बूंदों से प्राप्त मूल्यों के अनुसार किया गया था - परिभाषित मानदंडों को पूरा करने की पहचान और मात्रा निर्धारित की गई थी। अंत में, वस्तुओं को 75 माइक्रोन व्यास आकार की बैठक गोलाकार वस्तुओं की परिष्कृत बूंदी गिनती प्राप्त करने के लिए सनक और आकार के अनुसार फ़िल्टर किया गया था। मात्रात्मक वस्तुओं और उनकी तीव्रता को तब डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में निर्यात किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: एमडीपीसीआर के बाद बूंदों की फ्लोरेसेंस तीव्रता के लिए तीव्रता तितर-बितर भूखंड। (क)Cy5 हाइड्रोलिसिस जांच के साथ सी-कम जीन प्रवर्धन कुल सेल काउंट का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि लक्ष्य क्षेत्र साइटोसाइन अवशेषों से रहित था और इसलिए, बिसल्फी उपचार के लिए प्रतिरोधी था । (ख) एचेक्स हाइड्रोलिसिस जांच के साथ मिथाइलेटेड सीडी 3जेड जीन प्रवर्धन, सीडी 3+ टी-सेल जनसंख्या का संकेत । (C)FAM हाइड्रोलिसिस जांच के साथ मिथाइलेटेड FOXP3 जीन प्रवर्धन, CD4+ CD25+ टी-रेग आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं । सभी स्कैटर भूखंडों को उचित सीमा निर्धारित करने के लिए 'परिभाषित' एल्गोरिदम के अधीन किया गया था जिससे सकारात्मक क्लस्टर मतलब के 3 मानक विचलन के भीतर थे। 'बारिश' की मात्रा भी स्थापित की गई थी ताकि यह सकारात्मक परिभाषित बूंदों के 1% से अधिक हो। विश्लेषण के लिए प्रत्येक डेटासेट में ~ 5,000 बूंदें शामिल थीं और इसे ट्रिपलीकेट में चलाया गया था (कच्चे डेटा और विश्लेषण के लिए पूरक जानकारी देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: सभी जीन लक्ष्यों के CPD मूल्यों और सफेद रक्त कोशिका सबसेट प्रतिशत के निर्धारण । (क)कुल बूंदों के अनुपात के रूप में सकारात्मक बूंदों की गिनती के पॉइसन वितरण पर आधारित गणना सीपीडी मूल्य । इनपुट सैद्धांतिक CPD का प्रतिनिधित्व करता है ७४० एनजी के आधार पर बिसुलफिट इलाज डीएनए, ७५ माइक्रोन व्यास की बूंदों, 1 जीन कॉपी के लिए ६.६ स्नातकोत्तर संभालने । इनपुट सैद्धांतिक सीपीडी 0.25 था और कुल सेल गणना का प्रतिनिधित्व करने वाले सी-कम सीपीडी के साथ सहसंबद्ध था। (ख)सी-कम के संबंध में सीडी 3जेड और फॉक्सपी 3 के लिए सीपीडी के अनुपात का उपयोग क्रमशः सीडी 3 + टी-सेल और सीडी 4+ सीडी25+ टी-रेग्स का प्रतिशत प्राप्त करने के लिए किया गया था ।+ कुल ल्यूकोसाइट्स के प्रतिशत के रूप में इन अनुपातों की तुलना इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा प्राप्त मूल्यों से की गई थी। जैसा कि प्रदर्शन किया गया है, एमडीपीसीआर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण से मूल्य कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं हैं, एमडीपीसीआर से मानक विचलन त्रुटियों के साथ बहुत कम स्पष्ट किया जा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रस्तुत प्रायोगिक प्रोटोकॉल और तरीके एक गढ़े हुए टीपीई ड्रॉपलेट जनरेटर, थर्मल साइकिलर और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इन-हाउस एमडीपीसीआर के लिए अनुमति देते हैं। नरम टीपीई से टीपीई बॉन्डिंग का उपयोग करने वाला निर्मित डिवाइस हाइड्रोफोबिक सतह गुणों को प्रदान करता है जो सभी चैनल दीवारों में एक समान हैं, जैसे कि अंतिम डिवाइस को बूंद जनरेटर के रूप में बाद के उपयोग के लिए किसी सतह उपचार की आवश्यकता नहीं होती है। इस सामग्री को नियमित रूप से पॉइंट-ऑफ-केयर प्लेटफार्मों में नियोजित किया गया है, जिन्हें उच्च थ्रूपुट विनिर्माण 9 , 10 ,,11,9,12,,13केसाथ अनुकूलता की आवश्यकता होती है।13 इसके अलावा, यह ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट भी है और दृश्यमान स्पेक्ट्रम में कम फ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि प्रदर्शित करता है जो एमडीपीसीआर का उपयोग करके एक पूर्ण नमूना-टू-उत्तर कार्यप्रवाह के भविष्य के एकीकरण के लिए एक आकर्षक विशेषता है। पीसीआर रिएजेंट व्यंजनों को फेसियल मल्टीप्लेक्स जीन क्वांटिफिकेशन की अनुमति देने के लिए होमब्रू प्रारूप में भी प्रदान किया जाता है, जबकि थर्मल साइकिलिंग प्रोटोकॉल में स्थिरता भी बनाए रखता है। इस तरह के प्रस्तुत उपकरणों और प्रोटोकॉल के फायदों में से एक के रूप में डिवाइस डिजाइन और एक विशेष आवेदन है, जो वाणिज्यिक उत्पादों और मालिकाना योगों के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल है के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्षक में लचीलापन है । इसके अलावा, यह प्रयोग करने के लिए महंगे इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता को हटा देता है।

माइक्रोफ्लुइडिक ड्रॉपलेट जनरेटर का उपयुक्त थर्मोप्लास्टिक सामग्री चयन एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है जो कुशल बूंद गठन के लिए डिवाइस हाइड्रोफोबिक प्रदान करने के लिए बोझिल सतह उपचार को दरकिनार कर सकता है। इसके अलावा, थर्मल साइकिलिंग प्रक्रिया के माध्यम से बूंद स्थिरता बनाए रखने के लिए एक अनुकूलित एमडीपीसीआर बफर का चयन भी महत्वपूर्ण है - जबकि पीसीआर दक्षता और हाइड्रोलिसिस जांच कार्यक्षमता से समझौता नहीं करता है। इसलिए एमडीपीसीआर बफर के आगे संशोधन और अनुकूलन को फ्लोरेसेंस आधारित जांच का पता लगाने के साथ-साथ चयनित जीन लक्ष्यों के अत्यधिक विशिष्ट और संवेदनशील पीसीआर प्रवर्धन पर पहुंचने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है । यह सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाने, ' बारिश ' के उदाहरणों को कम करने और प्रयोगात्मक विश्लेषण और सकारात्मक बूंद आबादी की पहचान को सरल बनाने का कार्य करता है । प्रयोग का समस्या निवारण थर्मोप्लास्टिक सामग्री चयन से पॉलीमरेज एकाग्रता के लिए महत्वपूर्ण चरणों का आकलन करने पर निर्भर करता है ताकि बूंदें स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए थर्मल साइकिलिंग कार्यक्रम में तापमान रैंप को अनुकूलित किया जा सके।

वर्णित प्रोटोकॉल की वर्तमान सीमा यह है कि यह अभी भी बूंद जनरेटर से थर्मल साइकिलर और अंत में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप जैसे ड्रॉपलेट इमेजिंग डिवाइस और उपकरण के लिए मैनुअल नमूना हस्तांतरण की आवश्यकता है। भविष्य के प्रयासों को हालांकि एमडीपीसीआर के लघुकरण और इन चरणों के एकीकरण पर निर्देशित किया जाता है जिससे बूंद पीढ़ी, पीसीआर और इमेजिंग को एक स्वचालित मंच पर किया जा सकता है।

चित्रा 6 में प्राप्त परिणाम अंतर सफेद रक्त कोशिका मात्राकरण प्रदर्शन के लिए इस एमडीपीसीआर दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन करते हैं। प्रस्तावित विधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग की तुलना में अधिक सटीक और प्रजनन योग्य है, जो अक्सर उपयोगकर्ता हेरफेर से प्रभावित होता है, जो अवांछित माप त्रुटियों को जन्म देता है। यह प्रवाह साइटोमेट्री तकनीकों के लिए भी मामला है जो पता लगाने की प्रतिरक्षा-आधारित विधि पर भी भरोसा करते हैं जो सेल व्यवहार्यता पर अत्यधिक निर्भर है, साथ ही उपयोगकर्ता त्रुटि से ग्रस्त कई प्रोटोकॉल कदम भी है। मात्राकरण के लिए वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) जैसे वैकल्पिक तरीके अक्सर कम कॉपी संख्या जीन लक्ष्यों से प्रतिकूल रूप से प्रभावित होते हैं, एक ऐसी खामी जिसे एमडीपीसीआर के माध्यम से समर्पित अंशांकन वक्र11की आवश्यकता के बिना सुधारा जाता है। प्रस्तुत एमडीपीसीआर दृष्टिकोण, इसलिए, सफेद रक्त कोशिका अंतर गिनती के लिए एक अनूठा आणविक दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है जो विशिष्ट जीन लक्ष्यों के मिथाइलेशन प्रोफाइल पर आधारित है। व्यक्तिगत जीन लक्ष्यों के लिए अंशांकन घटता भी आवश्यक नहीं है क्योंकि एमडीपीसीआर सीपीडी गणना के लिए पॉइसन वितरण का उपयोग करके बाइनरी सकारात्मक और नकारात्मक संकेतों के पूर्ण मात्राकरण पर आधारित है।

गैर-मिथाइलेटेड जीन द्वीपों का सटीक मात्राकरण, विशेष रूप से फॉक्सपी 3 जैसे कम कॉपी नंबर जीन का, नैदानिक निदान के लिए अवसरों की एक भीड़ प्रस्तुत करता है । यह बीमारी की शुरुआत और प्रगति से सहसंबद्ध ज्ञात मिथाइलेशन पैटर्न की पहचान करने के लिए इस तरह के दृष्टिकोण की क्षमता से प्रकाश डाला गया है। एमडीपीसीआर, पूर्ण मात्राकरण के साथ एक आणविक दृष्टिकोण के रूप में मिथाइलेशन अध्ययनों से परे नियोजित किया जा सकता है और उचित रूप से संरक्षित नमूनों पर लागू किया जा सकता है, इसलिए ताजा नैदानिक नमूनों पर निर्भरता को हटा दिया जा सकता है, और इसके अनुप्रयोगों का विस्तार किया जा सकता है। भविष्य स्वचालन और इस तकनीक के लघुकरण तेजी से और सटीक नैदानिक निदान और बाद में पूर्वानुमान के लिए महान मूल्य का होगा ।

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Disclosures

घोषणा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं कर रहे हैं ।

Acknowledgments

लेखक कनाडा की राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Rad, Mississauga, ON TFI0201 PCR tube
RAN Biotechnologies, Beverly, MA 008-FluoroSurfactant Fluoro-surfactant
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, UK EMCCD camera
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 22-8425-71
CellProfiler Used for fluorescence image analysis
Nikon, Japan 10x objective
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) p/n 200-U1
Fisher, Canada
Vitrocom, NJ, USA 5015 and 5010 Borosilicate capilary tube
(http://definetherain.org.uk/)
Hamamatsu, Japan LC-L1V5 DEL UV light source
Dolomite 3200063 Disposable fluidic tubing
Dolomite 3200302 Disposable fluidic tubing
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY Upright light microscope
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schärding, Austria
Zymo Research, Irvine, CA D5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, Switzerland SU-8 photoresist
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Germany 203603
Image J Used to assess droplet diameter
Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, USA Broad-spectrum LED fluorescent lamp
Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC DE1010
Hexpol TPE, Åmål, Sweden Thermoplastic elastomer (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 13-400-518
Nikon, Japan Used for image acquisition
3M, St Paul, MN Carrier Oil
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA R37605 Blue fluorescent live cell stain (DAPI)
IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA P-881 PEEK fittings
Sigma-Aldrich, Oakville, ON 806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, USA ARV 310
Ihc world, Maryland, USA IW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA 2607808
Cetoni GmbH, Korbussen, Germany
Sigma-Aldrich, Oakville, ON 484431
Bio-Rad, Mississauga, ON 1861096
Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON
Nikon, Melville, NY Inverted microscope
Nikon, Japan
Loctite AA 352

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References

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जोवे में इस महीने अंक 160 मिथाइलेशन मल्टीप्लेक्स ड्रॉपलेट पीसीआर सफेद रक्त कोशिका सबटाइपिंग एपिजेनेटिक्स ड्रॉपलेट जनरेशन थर्मोप्लास्टिक इलास्टोमर बिसुल्फाइल इलाज डीएनए
मिथाइलेशन विशिष्ट मल्टीप्लेक्स ड्रॉपलेट पीसीआर हेमेटोलॉजिकल डायग्नोस्टिक्स के लिए पॉलीमर ड्रॉपलेट जेनरेटर डिवाइस का उपयोग कर
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Malic, L., Elmanzalawy, A., Daoud, J., Geissler, M., Boutin, A., Lukic, L., Janta, M., Da Fonte, D., Nassif, C., Veres, T. Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics. J. Vis. Exp. (160), e61421, doi:10.3791/61421 (2020).

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