Summary
후성 유전학 마커는 DNA 메틸화 패턴의 정량화를 통해 백혈구 (WBC) 과형을 위해 사용됩니다. 이 프로토콜은 WBC 차동 수의 정밀하고 멀티플렉스 메틸화 특이적 표적 정량화를 허용하는 방울 생성을 위한 열가소성 탄성동체(TPE) 기반 미세 유체 장치를 사용하여 멀티플렉스 액적 폴리머(mdPCR) 방법을 제시한다.
Abstract
후성 유전학 기반 백혈구 (WBC) 차동 수를 결정하기위한 멀티플렉스 액적 PCR (mdPCR) 워크플로우 및 상세한 프로토콜이 열가소성 탄성 동선 (TPE) 미세 유체 액적 발생 장치와 함께 설명된다. 후성 유전학 마커는 다른 질병에 있는 중요한 예후 값의 WBC 분체에 사용됩니다. 이는 게놈(CpG loci)에서 특정 CG-풍부한 영역의 DNA 메틸화 패턴의 정량화를 통해 달성된다. 본 논문에서, 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에서 양성환처리된 DNA는 WBC 하위 집단과 상관관계가 있는 CpG loci에 특정한 프라이머 및 가수분해 형광 프로브를 포함하는 mdPCR 시약으로 액적물에서 캡슐화된다. 멀티플렉스 접근법은 별도의 mdPCR 반응없이 많은 CpG loci의 심문을 허용하여 메틸화 부위의 후성 유전학 분석을 사용하여 WBC 하위 집단의 보다 정확한 파라메트릭 측정을 가능하게합니다. 이 정확한 정량화는 다른 응용 프로그램으로 확장될 수 있고 임상 진단 및 후속 예후를 위한 이점을 강조합니다.
Introduction
백혈구 (WbCs) 조성물의 분석은 혈액학 진단에서 가장 자주 요청되는 실험실 테스트 중 하나입니다. 차동 백혈병 수는 감염, 염증, 빈혈 및 백혈병을 포함한 질병의 스펙트럼에 대한 지표역할을하며, 뿐만 아니라 여러 다른 조건에 대한 초기 예후 바이오 마커로 조사되고 있습니다. WBC 피타이핑의 금 본위제는 면역염색 및/또는 유동 세포측정을 수반하며, 이는 비용이 많이 드는 불안정하기 쉬운 형광 항체를 필요로 하며 종종 샘플 준비에 있어 작업자 의 숙련도에 크게 의존합니다. 더욱이, 이 방법은 선적 또는 나중에 분석을 위해 시료를 동결할 수 없도록 신선한 혈액 샘플에만 적용됩니다.
후성 유전학 마커는 최근에 현상변의 연구 를 위한 강력한 분석 공구로 나타났습니다. 그 후, 인간 백혈구 집단은 WBC 서브세트의 정확한 특성화를 허용하는 세포 계보 DNA 메틸화 패턴을 갖는 것으로 나타났다. 후성 유전학 마커에 기초한 형량은 신선한 혈액 샘플 수집 또는 고가의 항체에 의존하지 않는 유망한 대안을 제공하고 질병 발병 및 감수성1,,2,,3,,4,,5에대한 바이오마커로 악용될 수 있다.
유전체 전체 연구는 백혈구 하위 형에 있는 게놈 (CpG islands)에 있는 메틸화한 특정 CG 부유한 지구의 광대한 매핑을 위해 수행되었습니다 백혈구 하위 형에 특정한 후성 유전학 마커를 확인하기 위하여. PCR 프로토콜은 각각 CD3+ T 세포 및 CD4+ CD25+ 규제 T-셀 (T-Regs)에 대응하는 메틸화 유전자 영역(예: CD3Z 및 FOXP3)에 대한 이러한 이유로 개발되었습니다. Wiencke 등은 T 세포의 후성 유전학 적분화를 위한 듀플렉스 액적 PCR의 유용성을 입증하여 유동 활성화 세포 선별(FACS) 분석6과높은 상관관계를 갖는 결과를 산출하고 있다. 이러한 정량적 유전 분석 방법은미유체액7,,8에의해 활성화된 수유 에멀젼을 사용하여 0, 하나 이상의 표적 핵산 사본을 포함하는 수천 개의 이산, 체적 정의, 하위 나노리터 크기의 액적으로 템플릿 핵산 분자 및 PCR 시약을 분할하는 데 의존한다. PCR 증폭은 각 개별 액적 내에서 수행되며 각 액적의 끝점 형광 강도가 측정되어 샘플에 존재하는 표적의 절대적인 정량화를 허용합니다. 물방울 PCR은 표준 qPCR보다 더 정확하고 정확하며 기술적으로 더 간단하도록 설립되어 T 세포의 임상 평가를위한 DNA 메틸화 기반 방법이 더 유리하게 되었습니다. 급속히 떠오르는 하위 입력 방법론이지만, 다양한 메틸화 CpG 영역을 동시에 조사하기 위한 멀티플렉스 후성 유전학 분석이 부족합니다. 이것은 일상적인 백혈구 차동 수에 필요합니다.
본 명세서에서, 열가소성 탄성동체(TPE) 액적 미세유체 장치는 메틸화 특이적 멀티플렉스 액적 PCR(mdPCR)에 제시되고 사용된다. 이 기술은 특정 백혈구 하위 형, CD3+ T 세포 및 CD4+ CD25+ T-Regs를 묘사하는 데 사용되었으며, 셀 리니지 DNA 메틸화 패턴, 즉 CD3Z 및 FOXP3 CpG 영역의 후성 유전학 적 변이를 각각 기반으로합니다. DNA 추출, 양성환 변환 및 mdPCR에 대한 상세한 프로토콜은 TPE 액적 생성 장치에 대한 제조 방법과 함께 설명된다. 방법의 대표적인 결과는 제안된 접근법의 유용성을 강조하는 면역형광 염색의 것과 비교된다.
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Protocol
인간 샘플과 관련된 이 연구에서 수행된 모든 실험은 NRC 윤리 위원회의 승인을 받았으며, 관련 연구 지침을 따르고 캐나다 퀘벡의 법률을 준수하는 인간 과목을 지배하는 NRC의 정책에 따라 수행되었습니다.
1. 셀 준비
- 냉동 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 37°C의 수조에 5분 동안 배치하여 즉시 동결된 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 해동한다.
- 극저온을 두 번 반전하여 세포를 부드럽게 재보페하고 1mL 파이펫을 사용하여 세포 현탁액을 15mL 원추형 튜브로 옮킨다.
- 10mL의 사전 따뜻해지는(37°C) 성장 배지를 10% 태아소 혈청(RPMI-1640 + 10% FBS)으로 보충하여 PBMC를 함유하는 15mL 튜브에 첨가한다.
- 원심분리기는 330 x g의 속도로 실온에서 스윙 버킷 원심분리기에서 10분 동안 빠른 가속과 높은 브레이크로 셀 서스펜션을 분리합니다.
- 스핀이 끝나면 상체를 신중하게 장식하십시오. 관의 측면을 눌러 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유한 인산염 완충식식염(PBS) pH 7.2의 3mL에서 세포 펠릿을 재연한다.
- 캡을 단단히 닫은 튜브를 반전시켜 세포를 섞는다.
- 2개의 1.5 mL 마이크로튜브를 준비하고 각 튜브에 있는 세포 현탁액의 파이펫 알리쿼트 1.5 mL을 사용하여, 그 중 하나는 후속 면역 형광 염색및 DNA 추출을 위해 하나 이다.
2. 면역 형광 염색 및 이미징 프로토콜
- 0.1% 아지드 나트륨과 2% FBS를 함유하는 PBS 버퍼의 200 μL에서 세포(1.7에서)를 재중단하고 세포 현탁액의 최종 농도를 최대 2 x 107 세포/mL로 조정한다.
- 두 개의 별도 1.5 mL 마이크로 튜브에 100 μL 부피를 파이프팅하여 셀 서스펜션을 분할합니다.
- 플루오레세인 이소티오카네이트(FITC) 및 피코에리스린(PE)이 결합된 20μL 부피를 FITC 및 PE와 결합한 항후 CD4/CD25(재료표 참조)에 각각 1개의 튜브에 추가합니다. Table of Materials
- 각 튜브에 파란색 형광 라이브 셀 얼룩 1 방울(재료 표참조)을 추가합니다.
- 2 시간 동안 튜브 회전을 사용하여 실온에서 배양하십시오. 빛으로부터 보호하십시오.
- 빠른 가속과 높은 브레이크로 실온에서 셀 서스펜션을 330 x g에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
- 상체를 데칭하고 튜브를 눌러 세포 펠릿을 조심스럽게 재중단하십시오. PBS의 1mL를 추가, pH 7.2 포함 2 mM EDTA. 캡이 단단히 닫히도록 하고 튜브 2배를 반전시켜 세포를 섞습니다.
- 세 번 2.6 및 2.7 단계를 반복합니다.
- 2mM EDTA를 포함하는 PBS pH 7.2의 20 μL에서 세포를 재중단합니다.
- 피펫 10 μL 은 보로실리케이트 현미경 슬라이드에 세포 서스펜션의 침하 10 μL 을 떨어뜨리고 세포가 천천히 침전될 때까지 2분 동안 기다립니다.
- 조심스럽게 현미경 슬라이드 위에 유리 커버 슬립을 배치하고 반전 현미경의 무대에 슬라이드를 배치합니다.
- 세포 현탁액 샘플에 대해 각각의 형광에 대해 현미경에 연결된 10배 목표 및 EMCCD 카메라를 사용하여 세포의 이미지를 기록한다.
- 수동으로 형광 표시 셀을 계산합니다(원시 데이터에 대한 보충 정보 참조).
- CD3 + T 세포 및CD4 + CD25+ T-Regs의 비율을 총 백혈구에 얻기 위해 DAPI 염색 셀에 안티 후 CD3 및 안티 후 CD4 / CD25 라벨 세포의 비율을 가져 가라.
3. DNA 추출 및 비설피트 변환
- DNA 추출
참고: 제조사가 제공한 절차에 따라 자기 DNA 정제 키트(재료 표참조)를 사용하여 섹션 1에서 제조된 PBMC에서 DNA를 추출합니다.- 1.5mL 튜브에서 PBS의 100 μL에서 세포를 일시 중단하고 20 μL의 Proteinase K및 400 μL의 리시스/바인딩 버퍼를 추가합니다. 10배 의 위아래로 파이펫을 섞은 다음 실온에서 5분 동안 인큐베이션을 수행합니다.
- 1-2 분 동안 자기 랙에 튜브를 배치하여 DNA 비드 복합체를 캡처 한 다음 신중하게 제거하고 슈퍼 나탄을 폐기하십시오.
- 마그네틱 랙에서 DNA 비드 복합체가 들어 있는 튜브를 제거하고 600μL의 워시 버퍼 #1 구슬을 재보아 비특이적 결합을 씻어냅니다.
- 튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓고 상체를 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.
- 3.1.3 및 3.1.4 단계를 반복하여 600 μL의 세척 버퍼 #2.
- 튜브를 1분 동안 공기 건조상태로 둡니다.
- 자기 랙에서 튜브를 제거하고 용출 버퍼의 100 μL을 분배하고 DNA / 비드 복합체를 20 배 위아래로 피펫하여 DNA를 엘로트하십시오.
- 용출된 DNA를 함유한 튜브를 자기 랙에 다시 놓고 1-2분 동안 배양하여 자기 구슬을 용출된 DNA로부터 분리합니다.
- 용출 된 정제 된 DNA 솔루션을 새로운 깨끗한 튜브로 옮기십시오.
- 분광광계를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 정제 된 DNA 샘플의 농도를 평가합니다.
- 비설피트 변환
참고: 제조자가 제공하는 절차에 따라 메틸화 키트(재료 표참조)를 사용하여 정제된 DNA에서 비설피테 변환을 수행합니다.- PCR 튜브에 DNA 샘플(200-500 ng)의 20 μL에 변환 시약의 130 μL을 추가합니다. 잘 섞어서 짧게 회전합니다.
- PCR 튜브를 열 사이클러로 전송하고 다음과 같이 사이클링 프로토콜을 수행합니다: 98°C 8분; 54 °C60 분 동안 4 °C에서 유지하십시오.
- 결합 버퍼의 600 μL을 수집 튜브에 배치된 I온 크로마토그래피(IC) 컬럼에 추가합니다.
- 결합 버퍼를 포함하는 IC 컬럼에 DNA 샘플을 추가하고 튜브를 여러 번 반전시킴으로써 혼합합니다. 최고 속도로 30 초 원심 분리기. 수집된 흐름을 폐기합니다.
- 이제 열에 100 μL의 워시 버퍼를 추가합니다. 3.2.4 단계에서 설명된 대로 원심분리를 수행하고 흐름을 폐기한다.
- 200 μl의 탈황 버퍼를 추가하고 실온에서 15-20 분 동안 인큐베이션을 수행합니다. 원심분리기및 위의 단계에 설명된 바와 같이 흐름을 폐기한다.
- 열에 워시 버퍼 200 μL을 추가합니다. 30초의 전속력으로 원심분리기를 제거하고 흐름을 폐기합니다.
- 3.2.7 단계를 반복합니다.
- 컬럼을 새로운 1.5mL 수집 튜브로 옮기고 열 막에 PCR 급 수분 100 μL을 추가합니다. DNA를 엘로우하기 위해 1 분 동안 최고 속도로 원심 분리기.
- 분광광계를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 비설피테 변환 된 DNA 샘플의 농도를 평가합니다.
참고: 260nm = 1.0의 흡광도에 40 μg/mL값을 사용합니다. - DNA를 -20°C에서 저장하여 단기 저장또는 장기 보관을 위해 -70°C에 저장합니다.
4. 물방울 생성 장치 제조
참고: 액적 생성에 사용되는 미세유체 장치(보충 정보에제공된 CAD 파일)는 다음 프로토콜에 의해 생성된 핫 엠보싱을 사용하여 열가소성 엘라스토머(재료 표 참조)의 클린룸(클래스 1,000) 환경에서 Table of Materials제조되었다.
- SU-8 금형 제작
- 아래에 설명된 표준 포토리소그래피를 사용하여 6" 실리콘 웨이퍼에 SU-8 금형을 준비합니다.
- 산소 플라즈마를 사용하여 6" 실리콘 웨이퍼를 10s에 500W로 청소하십시오.
- 스핀 코트 SU-8은 실리콘 웨이퍼에 900 rpm으로 40 s로 저항하여 총 필름 두께를 100 μm로 달성합니다.
- 웨이퍼를 핫 플레이트에 놓고 65°C에서 15분 동안 미리 굽고 95°C에서 2시간 씩 구워줍니다.
- 1,000mJ/cm2의노출량을 사용하여 고화질 투명 포토마스크를 통해 365nm(Hg i-line)에서 UV 광에 노출된다.
- 웨이퍼를 핫 플레이트에 놓고 65°C에서 15분 동안 굽고 95°C에서 40분 간 구워줍니다.
- 프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트(PGMEA)에 5분 간 몰입하여 개발합니다.
- PGMEA와 이소프로파놀로 헹구고 질소 가스 스트림으로 건조시다.
- 웨이퍼를 핫 플레이트에 놓고 135 °C에서 2 시간 동안 하드 베이킹하십시오.
- 2시간 동안 인접한 유리 현미경 슬라이드에 배치된 실라닝제(tricholoro perfluorooctyl silane)의 한 방울을 함유한 진공 건조기에서 웨이퍼를 실란화한다.
참고: 이것은 silanes가 SU-8 마스터의 표면에 단층이 형성되도록 하기 위해 수행됩니다. 트리콜로로 퍼플루오로옥틸 실레인은 항상 연기 후드에서 처리되어야 하며 수원에서 멀리 떨어져 있어야 합니다.
- 폴리디메틸실록산(PDMS) 복제본
- 플라스틱 컵에서 경화제에 탄성중합체 베이스의 10:1 비율로 PDMS의 액체 사전 폴리머 (재료의 표참조)를 준비합니다.
- PDMS 혼합물을 혼합하고 탈가스 행성 원심 진공 믹서에 컵을 놓습니다.
- 수지 누설을 방지하고 2 시간 동안 65 °C에서 치료하는 사용자 정의 금속 홀더에 배치 된 금형에 PDMS 혼합물을 붓습니다.
- 핀셋을 사용하여 SU-8 마스터에서 PDMS 금형을 조심스럽게 벗깁니다.
- 에폭시 몰드
참고: PDMS를 사용한 중간 복제 공정을 사용하여 SU-8/실리콘 마스터로부터 에폭시 몰드가 제작되었습니다.- 수지/경화의 100/83 w 비율을 사용하여 에폭시 수지(재료 표참조)를 준비합니다.
- 진공 건조 오븐을 사용하여 30 분 동안 저감 압력하에서 혼합물을 탈가스.
- PDMS 복제본 위에 수지를 붓고 12시간 동안 80°C에서 치료합니다.
- PDMS 복제본에서 경화 에폭시 몰드를 제거하고 핫 플레이트에 놓고 120 °C에서 2 시간 동안 하드 베이크하십시오.
- TPE 장치
- TPE의 펠릿(재료표참조)은 두께 2.0mm, 너비 7인치두께로 165°C로, 앞으로 사용할 롤로 보관합니다.
- 가위를 사용하여 롤에서 TPE 시트를 7" 사각형으로 잘라냅니다.
- 에폭시 몰드와 무늬가 없는 사멸 실리콘 웨이퍼 사이에 TPE 시트를 놓습니다(웨이퍼 사일라화 시술의 경우 4.1.10 단계 참조).
- 125°C의 온도, 10kN의 적용된 힘, 10분 동안10~2mbar의 압력에서 핫 엠보싱을 수행한다.
- 데몰드는 메탄올 스프레이를 사용하여 실온에서 조심스럽게 엠보싱된 TPE를 실리콘 웨이퍼및 에폭시 몰드와 분리합니다.
- TPE의 또 다른 7" 사각형 시트를 잘라 두 개의 무늬 사멸 실리콘 웨이퍼 사이에 배치합니다.
- 140°C의 온도에서 핫 엠보싱을 수행하고, 10kN의 적용된 힘, 10~2mbar의 압력으로 10분 동안10~2mbar의 압력을 수행하여 채널을 닫고 장치를 밀봉하기 위한 평면 표면을 형성한다.
- 두 실리콘 웨이퍼에서 엠보싱 TPE를 분리하는 메탄올 스프레이를 사용하여 실온에서 신중하게 Demold.
- 엠보싱된 각 TPE 시트를 의사 블레이드를 사용하여 장치 크기로 잘라냅니다.
- 플런저를 사용하여 1mm 생검 펀치 바늘을 사용하여 구조화 된 장치에서 입구 및 콘센트 채널에 대한 액세스 구멍을 펀치.
- 평면 TPE 장치를 실온에서 채널과 직접 접촉하여 채널을 둘러싸습니다.
- 선택적으로, 장치 결합을 촉진하기 위해 2 시간 동안 70 °C에서 오븐에 배치합니다.
- 일회용 유체 튜브(I.D. 0.25 mm, O.D. 0.8 mm)로 액세스 홀에 맞춥니다. 에폭시 접착제를 사용하여 관절을 밀봉하여 누출 방지 조작을 보장합니다.
5. 물방울 생성 및 PCR
참고: 표 1은 C-LESS, CD3Z 및 Foxp3 유전자에 대한 이중 담금질 가수분해 프로브와 함께 전방 및 역 프라이머에 대한 정보를 간략하게 설명하며, 이는 분해된 유전자 표적의 멀티플렉스 증폭에 요구됩니다.
- 표 2에설명된 대로 마스터 믹스를 준비한다.
- 효소 믹스를 제외한 마스터 믹스의 모든 성분을 해동합니다. 업다운을 피펫팅하여 마스터 믹스를 완전히 섞고 잠시 아래로 회전합니다.
- 비설피테 변환 된 DNA의 적절한 부피 (1 μL)를 추가 (섹션 3.2에서) PCR 튜브에서 믹스를 마스터. 업다운을 피펫팅하여 반응을 섞고 잠시 아래로 회전합니다.
- PEEK 피팅을 사용하여 일회용 유체 튜브(I.D. 0.25 mm, O.D. 1.6mm)를 두 개의 정밀 유리 주사기(250 μL 부피)에 연결합니다.
- 5% 플루오로 계면활성제를 함유한 250 μL의 캐리어 오일로 정밀 유리 주사기 1개를 미리 채웁니다.
- PCR 믹스의 100 μL을 적재하기 전에 캐리어 오일50 μL로 또 다른 정밀 유리 주사기를 미리 채우고 유화 중에 전체 샘플 부피를 분배합니다.
- 실시간으로 액적 형성을 관찰하고 기록하는 고속 카메라가 장착된 직립 광 현미경 의 단계에 액적 미세 유체 장치를 설치합니다.
- 미리 채워진 주사기를 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 놓고 피팅(재료 표참조)과 PEEK 조합을 사용하여 주사기튜브를 액적 미세 유체 장치의 각 입구 채널의 튜브에 연결합니다.
- 0.5mL PCR 튜브 내부에 액적 발생기의 출구에서 튜브를 놓습니다.
- 주사기 펌프의 유량을 2 μL/min으로 조정하고 액적 크기가 안정화된 후 생성된 에멀젼을 수집합니다.
- 에멀젼을 수집하고 75 μL을 0.2 mL PCR 튜브로 이송하여 열 사이클링을 합니다.
- PCR 튜브의 오일 함량이 열 순환 중 액적의 결합을 방지하기 위해 분산 된 위상의 부피와 밀접하게 일치하는지 확인하십시오.
- 0.2mL PCR 튜브를 열 사이클러에 넣고 다음과 같이 사이클링 프로토콜을 수행하십시오 : 95 °C에서 5 분 동안 예열한 다음 95 °C에서 45 사이클을 15 s에 대한 및 60 °C에서 60 °C에서 30 °C로 연장하십시오.
- 나머지 에멀젼을 사용하여 물방울을 이미지화하고 물방울 직경을 평가하기 위해 직사각형 프로파일로 보로실리케이트 모세관 튜브(100 μm 깊이)를 채웁니다.
- 에멀젼으로 채워진 보로실리케이트 튜브를 현미경 슬라이드에 놓습니다. EMCCD 카메라와 10배 목표를 갖춘 반전 된 현미경을 사용하여 물방울의 밝은 필드 이미지를 기록하십시오.
- 아래 설명과 같이 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 물방울 직경을 측정합니다.
- '분석'버튼을 선택한 다음'설정 배율'을선택하여 이미지의 픽셀 수에 해당하는 미크론에서 알려진 거리의 배율을 설정합니다.
- '이미지'버튼을 선택한 다음'입력'을선택하여 이미지를 회색으로 변환합니다. 필요한 경우 밝기와 대비를 조정합니다. '이미지'버튼을 선택한 다음 '임계값 조정'을 선택하여 수동으로임계값을설정하여 원을 작성하고 채웁니다.
- '입자분석'버튼을 선택하고 순환도를 0.75 - 1로 설정하여 입자를 분석합니다.
- 소프트웨어에 자동으로 표시되는 측정된 액적의 결과 면적과 직경을 가져옵니다.
- 평균 액적 직경을 계산하고 구형 액적을 가정하고 절대 목표 농도를 계산하는 데 사용되는 파티션 볼륨을 추정합니다.
- 액적 직경(&3%)에 대한 표준 편차의 비율로 평균값(k = 1)의 비율로 취해지는 변형계수를 분석하여 액적(CV)을 단량분산시키는지 확인한다.
6. 형광 이미징 및 이미지 분석
- 형광 화상 진찰
- 증폭 후, PCR 에멀젼을 직사각형 프로파일로 보로실리케이트 모세관 튜브(50 μm 깊이)로 이송하여 영상을 위해 가까운 단층으로 방울을 배치합니다.
- 현미경 슬라이드에 채워진 모세 혈관을 수정하고 UV 아크릴 접착제를 사용하여 양쪽을 밀봉합니다. 에멀젼을 비추지 않도록 주의하는 UV 접착력에 UV 광원을 적용하여 시료를 표백하지 않도록 하십시오.
- EMCCD 카메라와 10배 목표를 갖춘 반전된 현미경으로 유리 슬라이드를 로드합니다.
- 현미경 이미징 소프트웨어를 사용하여 획득을 선택 | 라이브 - 실시간 카메라 수집을 빠르게 시작하고 샘플을 관찰하고 모세관의 너비가 캡처되었는지 확인합니다.
- 3.5V에서 횡막 조명을 위한 밝은 필드 램프를 설정합니다.
- 20% 강도로 에피스코픽 조명을 위한 광범위한 LED 형광램프를 설정합니다.
- 교정을 선택하여 모든 파장(밝은 필드, FAM, HEX 및 Cy5)에 대한 캡처 설정을 수동으로 조정 | 이미징 소프트웨어에서 광학 구성 명령입니다. 각 형광에 대해 해당 형광 필터 큐브를 수동으로 전환해야합니다. 밝은 필드 이미징을 위한 필터 큐브를 사용하여 동일한 광학 경로를 유지해야 합니다.
- 이미지 수집 전에 수동으로 노출 시간을 조정 | 표 3에요약된 각 불소호레에 대한 카메라 설정 명령. 소프트웨어의'캡처 설정'메뉴에서 100의 게인 승수로 16비트에서 판독 모드 EM 게인 17MHz를 설정합니다.
- 소프트웨어의 LUT 창에서, 전송 신호가 세트 범위 내에 포괄되는 것을 같은 LUT의 크기를 설정합니다. 본 실험에서 스케일은 약 500에서 약 12,000개까지 설정하였다.
- 특정 순서로 XY 스캔 및 여러 파장 옵션을 모두 사용하여 멀티포인트 획득 프로그램을 사용하여 캡처를 자동화합니다. 스테이지가 초기 위치로 이동하여 다른 파장을 모두 캡처한 다음 다음 위치로 진행합니다.
- 먼저 소프트웨어의 XY 스캔 메뉴에서 XY 스캔 프로파일을 사용자 지정하여 XY 스캔을 설정합니다. '사용자지정 멀티포인트 정의'에서큰 이미지 정의 상자를 선택하고 대략 40.0 x 1.0mm(에멀젼 충전 길이)로 설정합니다. 1% 겹침을 사용합니다.
- '초점표면 사용'옵션을 활성화하고 현미경에 초점 노브를 사용하여 샘플의 다른 지점에서 초점 평면을 조정하여 초점 표면 곡선을 설정합니다.
- 둘째, 스캔 탭을 선택하여 여러 파장 스캔을 설정합니다. 각 파장에 대해 6.1.7 단계에서 생성된 각 광학 구성을 추가합니다.
- 스테이지 이동 중및 필터 변경 중에 활성 셔터를 닫는 옵션을 클릭하여 샘플을 표백하지 않고'시작 실행'버튼을 눌러 획득을 실행합니다. 각 획득 프레임을 tiff 파일로 내보내고 분할된 여러 파일 옵션을 사용하여 각 채널을 분리된 파일로 분할하고 저장된 LUTs 설정을 적용합니다. 포인트 이름과 채널 이름 옵션을 사용하여 각 이미지 파일을 쉽게 구분할 수 있습니다.
- 이미지 분석
- 브라이트필드 및 형광 필터로 획득한 모든 이미지를 정렬하여 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어에 업로드합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 브라이트필드 이미지를 사용하여 모든 물방울을 식별한 다음 관련 형광 액적의 강도를 측정하기 위해 파이프라인을 만듭니다.
- 파이프라인에 밝은 필드와 형광 티프 이미지를 업로드한 다음 모듈'ColorToGray','기본 개체 식별','MeasureObjectIntensity','ExportToSpreadsheet'를 추가합니다. 브라이트필드 액적 이미지를 사용하여 물체를 식별한 다음 개체를 마스크로 사용하여 형광 이미지의 강도를 측정합니다.
- 선택한 tiff 이미지와 파이프 라인을 실행하여 형광 액적 이미지의 평균 형광 강도를 추출합니다. 분석을 위해 ~5,000개의 액적으로 구성된 각 세트로 트리플리케이트에서 실험을 수행합니다.
- 'definetherain'알고리즘(http://definetherain.org.uk/)을 적용하여 양수 및 음수 액적 클러스터를 식별합니다. 긍정은 평균의 3 표준 편차 내에 있어야합니다. 이렇게 하면 계수에 사용할 양액 의 임계값 강도가 결정됩니다.
- 다시 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 유전자 표적에 대한 형광 임계값이 이전 단계에서 정의된 대로 설정된 새로운 파이프라인을 구현합니다.
- 파이프라인에 밝은 필드와 형광 이미지를 업로드합니다. 모듈'ColorToGray','재축강도','임계값','기본 개체 식별','측정오브젝트사이즈셰이프','필터오브젝트','내보내기To스프레드시트'를 추가합니다. 브라이트필드 이미지와 물방울을 위한 각 형광 필터를 위한 고유한 모듈을 만듭니다.
- 각 형광 이미지 그룹에 대해 이미지 강도 배율을 0에서 1로 조정합니다. 그런 다음 임계값을 설정하여 설정된 임계값 이상의 객체를 식별하고 계산합니다. 필요한 경우'ExpandOrShrinkObjects'모듈을 추가하여 물체를 축소하여 브라이트필드에서 액적의 계산 및 식별을 용이하게 합니다.
- 선택한 크기 20-30 픽셀 내에서만 객체를 식별하고 계산된 객체를 필터링하여 특정 직경(즉, 75 μm 직경 범위의 방울)과 0.5 이하의 둥근 구형 편심을 가진 객체만 유지합니다.
- 결과를 브라이트필드 이미지의 총 액적 수를 나열하는 테이블과 사용된 모든 형광 채널의 액적 수를 나열하는 테이블로 내보냅니다. 즉 C-LESS 유전자용 Cy5, 메틸화 된 CD3Z 유전자용 HEX 및 메틸화 FOXP3 유전자에 대한 FAM (제시 된 mdPCR 분석을 위해 얻은 원시 실험 데이터에 대한 보충 정보 참조).
- 각 유전자 표적에 대한 음수 액적의 비율을 계산하고 방정식 1을 사용하여 액적당 각각의 사본을 얻기 위해 푸아송 분포를 적용합니다.
여기서 x는 0, 1, 2 이상의 분자를 포함하는 액적수를 나타내고, λ는 CPD 값을 나타낸다. - CPD 값의 비율과 방정식 2를 사용하여 5.20 단계에서 얻은 액적 부피의 비율을 계산합니다.
값(1-p)이 음수 액적의 분수를 나타내는 위치입니다. - CD3+ T-셀 및 CD4+ CD25+ T-Regs의 백분율을 C-LESS 또는 총 셀 - CPD 값으로 메틸화 CD3Z 및 FOXP3 유전자의 각 CPD 값을 분할하여 계산합니다(원시 데이터에서 CPD 계산을 위한 추가 정보 참조).
- 이러한 백분율 값을 CD3 + T 세포 및 CD4+ CD25+ T-Reg 계수용 항체를 사용하여 면역 형광 이미징에서 얻은 값과 비교하십시오.+
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Representative Results
TPE 기반 미세 유체 액적 발생기 장치는 도 1에도시된 바와 같이 기술된 프로토콜을 사용하여 제조되었다. 투명 도면은 실리콘(Si) 마스터를 얻기 위해 포토리소그래피에 사용되었습니다. 소프트 리소그래피는 에폭시 몰드를 제조하는 데 사용된 시 마스터의 역 PDMS 복제본을 얻기 위해 수행되었다. 에폭시 전구체는 PDMS에 부어 크로스 링크 및 경화경화되었다. Si 마스터의 정확한 복제본을 나타내는 이 금형은 뜨거운 엠보싱을 사용하여 열가소성 열성형에 대해 더 탄력적이었습니다. 에폭시 금형이 얻어지면 열가소성 엘라스토머가 엠보싱되었습니다. 엠보싱 후 TPE가 demolded되고 장치가 절단되었습니다. 평평한 TPE 기판을 사용하여 장치를 밀봉했습니다. 상단 커버에 구멍이 뚫렸고, 두 기판이 결합되었다. 마지막으로, 세계 칩 연결에 필요한 튜브가 삽입되었고 장치를 사용할 준비가 되었습니다. 제작 된 마스터 금형, TPE 재료 및 엠보싱 장치의 샘플 이미지가 그림 2에표시됩니다. 튜브 인터커넥트가 있는 조립 된 장치는 mdPCR에 대한 에멀젼을 생성하기 위해 독립적 인 프로그래밍 가능한 주사기 펌프 한 쌍으로 작동했습니다. 메틸화 특이적 mdPCR은 냉동 PBMC로부터 추출된 양성환 처리 DNA를 사용하여 수행하였다. 적절한 크기의 액적 생성(약 72 μm 직경)에 이어, 에멀젼은 열 순환 프로토콜을 적용하였다. 마지막으로, 액적들은 이미징을 위해 1mm 너비와 50 μm 높이를 갖는 유리 모세관에 도입되었다. 이로 인해 형광 이미지 획득에 이상적인 방울의 단층분포(그림 3)가생성됩니다. 이미지는 4개의 파장의 각각에 대해 기록되었습니다. 그런 다음 이미지 분석을 수행하여 'definetherain' 알고리즘을 통해 설정된 임계값 기준을 충족하는 모든 물방울(그림4)을식별하였다. 각각의 형광에 있는 모든 물방울의 형광 강도는 그 때 플롯되고 양수 및 음수 물방울의 임계값이 설치되었다(그림 5). 그 후, 이러한 물방울의 식별 및 계산이 수행되었으며, 이는 선택한 임계값보다 높았습니다. CPD 값은 그 때 계산되었고 CD3+ T-셀 및 CD4+ 25+ T-Regs의 백분율은 총 세포의 CPD또는 C-LESS 유전자(그림6)에대하여 각각 메틸화 CD3Z 및 FOXP3 사본을 기반으로 확립되었다. 백분율 값은 적당한 항체를 사용하여 T 세포 및 T-Reg 인구의 면역 형광 화상 진찰을 통해 얻은 것과 그 때 비교되었습니다.
| FOXP3 포워드 | GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG | |
| FOXP3 역방향 | TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA | |
| CD3Z 포워드 | GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG | |
| CD3Z 역방향 | CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA | |
| C-LESS 포워드 | TTG TAT GTA TGT 개그 TGT GGG 아가 GA GA | |
| C-LESS 역방향 | TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C | |
| 폭스P3 프로브 | /56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT/3IABkFQ/ | |
| CDZ3 프로브 | /56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA/3IABkFQ/ | |
| C리스 프로브 | /56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/ | |
표 1: 프라이머 및 가수 분해 프로브 설계.
| 시약 | 스톡 솔루션 | 마스터 믹스 볼륨 | 작업 집중 |
| 트리스-HCl | 1 M | 2 μL | 20mM |
| KCl | 1 M | 10 μL | 100mM |
| MgCl2 | 25 mM | 16 μL | 4 mM |
| C-LESS 프라이머 | 10 μM | 10 μL | 각 1 μM |
| CD3Z 프라이머 | 10 μM | 10 μL | 각 1 μM |
| FOXP3 프라이머 | 10 μM | 10 μL | 각 1 μM |
| C-LESS 프로브 | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| CD3Z 프로브 | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| FOXP3 프로브 | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| HotStarTaq DNA 폴리머라제 | 5 단위/μL | 8 μL | 0.4 단위/μL |
| 비설피테 처리 DNA 표적 | 변수 | 변수 | 변수 |
| 뉴클레아제 없는 물 | 변수 | ||
| 총 볼륨 | 100 μL |
표 2: mdPCR마스터 믹스 레시피.
| 광학 구성 | 노출 | DIA 램프 | 플로레스센트 라이트 |
| 밝은 필드 | 50 ms | 에 | OFF |
| Fam | 300 ms | OFF | 20% |
| 16 진수 | 300 ms | OFF | 20% |
| Cy5 | 400 ms | OFF | 20% |
표 3: 광학 구성 및 이미지 수집을 위한 설정입니다.
그림 1: 물방울 발생기의 신속한 프로토타이핑. (A)마스터 몰드와(B)TPE 계 미세 유체 유화 장치의 제조에 사용되는 공정의 회로도 예시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 제조 공정에 관련된 구성 요소입니다. (A)실리콘 마스터,(B)PDMS 복제,(C)에폭시 몰드,(D)TPE 재료는 시트로 압출되어 롤에 포장,(E)엠보싱 TPE 및(D)조립 된 장치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 열 사이클링 후 액적의 형광 이미지 획득. (A)단층 이미지 획득을 허용모세 혈관에서 방울의 브라이트 필드 이미지. (B)총 세포 수를 나타내는 C-LESS 유전자 표적의 Cy5 필터 이미지. (C)CD3+ T 세포 수와 상관관계가 있는 메틸화 CD3Z 유전자 표적의 HEX 필터 이미지. (D)CD4+ CD25+ T-Reg 수와 상관관계가 있는 메틸화 FOXP3 유전자 표적의 FAM 필터 이미지. 스케일 바는 100 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 임계값 강도를 충족하는 물방울을 식별하는 데 사용되는 파이프라인입니다. 이미지는 먼저 파일 이름을 사용하여 적절한 형광 필터로 구성되었습니다. 그런 다음 이미지는 최소 및 최대 방울 형광 강도에 따라 회색 스케일및 상대 적 강도로 재조정되었습니다. 그런 다음 임계값은 'definetherain' 알고리즘에서 얻은 값에 따라 선택되었으며, 정의된 기준을 충족하는 객체 또는 액적(또는 액적)이 확인되고 정량화되었다. 마지막으로, 물체는 75 μm 직경 크기를 충족하는 구형 물체의 정제된 액적 수를 얻기 위해 편심 및 크기에 따라 여과되었다. 정량화된 개체와 그 강도는 다운스트림 분석을 위해 스프레드시트 소프트웨어로 내보냈습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: mdPCR 다음 액적의 형광 강도에 대한 강도 분산 플롯. (A)표적 부위가 시토신 잔류물이 결여되어 비설피테 치료에 내성이 있는 총 세포 수를 나타내는 Cy5 가수분해 프로브를 사용하여 C-LESS 유전자 증폭. (B) HEX 가수분해 프로브를 통해 메틸화 CD3Z 유전자 증폭, CD3+ T 세포 집단을 나타낸다. (C)CD4+ CD25+ T-Reg 인구를 나타내는 FAM 가수분해 프로브를 사용하여 메틸화 FOXP3 유전자 증폭. 모든 분산 플롯은 양성이 양수 클러스터 평균의 3 표준 편차 내에 있는 적절한 임계값을 설정하는 'definetherain' 알고리즘을 적용하였다. '비'의 양은 양성 정의 물방울의 1 %를 초과할 수 있도록 설립되었습니다. 분석을 위한 각 데이터 집합은 ~5,000개의 액적으로 구성되었으며 트리플리케이트에서 실행되었습니다(원시 데이터 및 분석에 대한 보충 정보 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 모든 유전자 표적의 CPD 값및 백혈구 하위 집합 백분율의 결정. (A)양액의 푸아손 분포를 기초로 계산된 CPD 값은 총 액적의 비율로 계산된다. 입력은 1 유전자 복사에 대해 6.6 pg를 가정하여 양성피처리 DNA, 75 μm 직경 의 물방울의 740 ng를 기준으로 예상되는 이론적 CPD를 나타낸다. 입력 이론적 CPD는 0.25이고 총 세포 수를 나타내는 C-LESS CPD와 상관관계가 있었다. (B)C-LESS에 대하여 CD3Z 및 FOXP3에 대한 CPD의 비율은 CD3+ T-셀 및 CD4 + CD25+ T-Regs의 퍼센트를 각각 획득하는 데 사용되었다.+ 총 백혈구의 백분율로 이 비율은 면역 형광 화상 진찰에 의해 얻은 값과 그 때 비교되었습니다. 입증된 바와 같이, mdPCR 및 면역형광 분석에서 값은 mdPCR에서 표준 편차 오류가 훨씬 덜 발음되는 것과 상관 관계가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 실험 프로토콜 및 방법은 제조된 TPE 액적 발생기, 열 사이클러 및 형광 현미경을 사용하여 사내 mdPCR을 허용합니다. 소프트 TPE에서 TPE 접합에 소프트 TPE를 사용하는 제조 된 장치는 최종 장치가 물방울 발생기로 후속 사용하기 위해 표면 처리를 필요로하지 않도록 모든 채널 벽에 걸쳐 균일 한 소수성 표면 특성을 제공합니다. 이 물질은 정기적으로 높은 처리량,제조9,,10,11,12,13과의호환성을 필요로 하는 배려의 포인트 플랫폼에 사용되어 왔다.,, 또한, mdPCR을 이용한 완전한 시료-답변 워크플로우의 향후 통합을 위한 매력적인 기능인 가시 스펙트럼에서 낮은 형광 배경을 광학적으로 선명하게 나타내고 있다. PCR 시약 레시피는 또한 촉진 멀티플렉스 유전자 정량화를 허용하기 위해 홈브루 형식으로 제공되며, 열 순환 프로토콜 전반에 걸쳐 안정성을 유지합니다. 이러한 제시된 장치 및 프로토콜의 장점 중 하나는 상용 제품 및 독점 제형으로는 달성하기 어려운 특정 응용 분야에 사용되는 장치 설계 및 시약을 사용자 지정하는 유연성이다. 더욱이, 실험을 수행하기 위해 고가의 계측의 필요성을 제거한다.
미세 유체 액적 발생기의 적절한 열가소성 재료 선택은 효율적인 액적 형성을 위해 장치 소수성 렌더링을 위해 번거로운 표면 처리를 우회할 수 있는 중요한 매개 변수입니다. 또한 최적화된 mdPCR 버퍼의 선택은 PCR 효율과 가수분해 프로브 기능을 손상시키지 않으면서 열 순환 공정을 통해 액적 안정성을 유지하는 데에도 중요합니다. 따라서 mdPCR 버퍼의 추가 수정 및 최적화는 형광 기반 프로브 검출과 결합된 선택된 유전자 표적의 매우 특이적이고 민감한 PCR 증폭에 도달하는 것이 좋습니다. 이는 신호 대 잡음 비율을 증가시켜 '비'의 인스턴스를 줄이고 양성 물방울 개체수의 실험 분석 및 식별을 단순화하는 역할을 합니다. 실험의 트러블슈팅은 모성가소물 선별에서 폴리머라제 농도에 이르는 중요한 단계를 평가하여 물방울 안정성을 보장하기 위해 열 순환 프로그램의 온도 경사로를 조정하는 데 달려 있습니다.
설명된 프로토콜의 현재 제한은 여전히 방울 발생기에서 열 사이클러로의 수동 시료 전송이 필요하고 마지막으로 형광 현미경과 같은 액적 이미징 장치 및 계측기로 옮겨야 한다는 것입니다. 그러나 향후 노력은 mdPCR의 소형화와 이러한 단계의 통합을 대상으로 하며, 이에 따라 방울 생성, PCR 및 이미징을 하나의 자동화된 플랫폼에서 수행할 수 있습니다.
도 6에서 얻어진 결과는 차동 백혈구 정량화를 수행하기 위한 이러한 mdPCR 접근법의 다재다능함을 입증한다. 제안된 방법은 종종 사용자 조작에 의해 영향을 받는 면역 형광 화상 진찰 보다는 더 정확하고 재현가능합니다, 원치 않는 측정 오류를 초래합니다. 이것은 또한 세포 생존가능성에 크게 의존하는 면역 기반 검출 방법뿐만 아니라 사용자 오류에 취약한 여러 프로토콜 단계에 의존하는 유동 세포 측정 기술의 경우이기도 합니다. 정량화를 위한 실시간 정량적 PCR(qPCR)과 같은 대체 방법은 종종 낮은 카피 수 유전자 표적에 의해 부정적인 영향을 받는데, 전용 교정곡선(11)을위한 필요 없이 mdPCR을 통해 해결되는 단점이다. 제시된 mdPCR 접근은, 그러므로, 특정 유전자 표적의 메틸화 단면도에 근거를 둔 백혈구 차등 수에 독특한 분자 접근을 제시합니다. mdPCR은 CPD 계산을 위한 푸아송 분포를 사용하여 이진 양성 및 음수 신호의 절대적인 정량화를 기반으로 하기 때문에 개별 유전자 표적에 대한 교정 곡선도 필요하지 않습니다.
비 메틸화 유전자 섬의 정확한 정량화, 특히 FOXP3와 같은 낮은 복사 수 유전자의, 임상 진단을위한 기회의 무리를 제시한다. 이것은 질병 개시 및 진행과 상관되는 알려진 메틸화 패턴을 확인하기 위하여 그 같은 접근의 수용량에 의해 강조됩니다. mdPCR은 절대 정량화를 가진 분자 접근법으로서 메틸화 연구를 넘어 서 적절히 보존된 시료에 적용될 수 있으므로 신선한 임상 샘플에 대한 의존도를 제거하고 응용 프로그램을 더욱 확장할 수 있다. 이 기술의 미래 자동화 및 소형화는 신속하고 정확한 임상 진단 및 후속 예후를 위한 큰 가치가 있을 것입니다.
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Disclosures
선언할 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 캐나다 국립 연구위원회의 재정 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
References
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- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
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