Summary
هنا هو بروتوكول لدراسة الأوعية الدقيقة التاجية في أنسجة القلب المورين الحية عن طريق مراقبة الجسم الحي السابق لضغط الأوعية الدموية وتدفق الشرايين التي تحافظ على الضغط ، وكذلك مكونات شجرة الأوعية الدموية بما في ذلك أسرة الشعيرات الدموية و pericytes ، كما يتم رص الشريان الحاجز وضغط.
Abstract
نبرة الشريان التاجي جنبا إلى جنب مع فتح أو إغلاق الشعيرات الدموية إلى حد كبير تحديد تدفق الدم إلى عضلة القلب في ضغط ضخ مستمر. ومع ذلك ، من الصعب مراقبة التغيرات الديناميكية في الشرايين التاجية والشعيرات الدموية في القلب كله ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى حركته وضربه دون توقف. هنا وصفنا طريقة تمكن من رصد معدل الضخ الشرياني والضغط والتغيرات في قطر الشرايين والشعيرات الدموية في عضلات البطين الأيمن الماوس. يتم قذف الشريان الحاجز الماوس و pered في تدفق مستمر أو الضغط مع غيرها يقاس بشكل حيوي. بعد التسريب مع الليكتين المسمى الفلورسنت (على سبيل المثال، اليكسا فلور-488 أو -633 المسمى القمح الجرثوم Agglutinin، WGA)، والشريول والشعيرات الدموية (وغيرها من السفن) في عضلة البطين الحق وصفح يمكن بسهولة صورة. ويمكن بعد ذلك قياس التغيرات في قطر السفينة في وجود أو عدم وجود تقلصات القلب. وعندما يتم التعبير عن البروتينات الفلورية المشفرة وراثياً، يمكن رصد سمات محددة. على سبيل المثال، تم تصور pericytes في قلوب الماوس التي أعرب عن NG2-DsRed. وقد وفرت هذه الطريقة منصة مفيدة لدراسة الوظائف الفسيولوجية من بيريايري بيريكيت في القلب. كما أنها مناسبة لدراسة تأثير الكواشف على تدفق الدم في القلب عن طريق قياس قطر الأوعية الدموية / الشعيرات الدموية وضغط الشريان اللمعان في وقت واحد. هذا الإعداد، جنبا إلى جنب مع أحدث نظام التصوير البصري، يسمح للمرء أن دراسة تدفق الدم ورقابة على المستوى الخلوي والجزيئي في القلب في ظل ظروف شبه فسيولوجية.
Introduction
المناسبة تنظيم ضغط الشريان التاجي تدفق يضمن إمدادات كافية من الدم إلى القلب لتلبية مطالبها الأيضية1. ومع ذلك، إلا أنه أصبح من الواضح كيف يتم تنظيم تدفق الضغط التاجي بشكل حيوي في القلب، على الرغم من الدراسات المستفيضة التي أجريت في الجسم الحي وفي المختبر على مدى العقود الماضية. أحد الأسباب هو صعوبة في إنشاء نموذج عمل الفسيولوجية لمثل هذه الدراسات بسبب النبض المستمر للقلب. بغض النظر عن ذلك، تم وضع مجموعة متنوعة من الطرق لمراقبة الأوعية الدقيقة التاجية في الأنسجة الحية أو الحيوانات، ولكن أيا من هذه الأساليب كانت قادرة على تحقيق التركيز ثابت / مستقر وقياسات الضغط والتدفق وقطر الأوعية الدموية الدقيقة في نفس الوقت2،3. تم تقديم التصور المباشر لأوعية الشرايين التاجية الدقيقة في القلب النابض منذ عقود4،3، ولكن قياسات القطر في الأوعية الصغيرة كانت صعبة وكانت الوظائف المحددة للعديد من أنواع الخلايا المتخصصة المرتبطة بالدوران المجهري أمرًا صعبًا بنفس القدر. حتى طريقة stroboscopic ونظام الهدف العائمة لا يمكن أن توفر المعلومات المذكورة أعلاه في وقت واحد5. ومع ذلك، تم الحصول على كمية كبيرة من المعلومات القيمة باستخدام التكنولوجيات المذكورة أعلاه، والتي ساعدتنا على فهم المزيد حول تنظيم تدفق الدم التاجي6. الطريقة التي نقدمها في هذه الورقة سوف تساعد على التحقيق في المرء وفهم بالتفصيل كيف مكونات الشرايين التاجية, الشرايين وvavasculature تستجيب بشكل مختلف للتحفيز والمطالب الأيضية.
وقد بني نموذج العمل الذي أنشأناه لمتابعة هذه الدراسات على العمل السابق لWesterhof وآخرون2. بعد تحبيب الشريان الحاجز لقلب الماوس ، تم استخدام محلول ملحي فسيولوجي لضخ هذا الشريان للحفاظ على myocytes ومكونات أخرى من أنسجة القلب مغذية. تم رصد ضغط الانسياب الشرياني والتدفق وقطر الأوعية الدموية من بين الوظائف الفسيولوجية الأخرى باستخدام مؤشرات الفلورسنت المناسبة. هذه الطريقة تمكننا من تصور سريري الأوعية الدموية التاجية تحت الضغط الفسيولوجي في الأنسجة الحية ودراسة الآليات الخلوية الكامنة تحت تنظيم دوران الأوعية الدقيقة للمرة الأولى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وكانت جميع أعمال العناية بالحيوان متفقة مع المبادئ التوجيهية لجامعة ماريلاند بالتيمور والبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.
1- إعداد الحلول
ملاحظة: إعداد الحلول مقدماً. يتم استخدام نوعين من الحلول الأساسية في التجارب: (1) حلول ملحية فسيولوجية (PSS) للحمام فائقة و (2) حلول التيرود للتجويف. هناك حاجة إلى محتدماً مستمراً مع CO2 للحفاظ على pH من PSS. يتم استخدام حل التيرود HEPES المخزن في التجويف بدلا من PSS لتجنب فقاعات الخوض في الأوعية، لأن فقاعات من شأنه أن يضر الخلايا البطانية7 وانسداد تدفق.
- PSS الحل: انظر صيغة وتركيبة حل PSS في الجدول 1. جعل 10 لتر من كاليفورنيا2 +خالية من الجلوكوز خالية من محلول الأسهم PSS وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. 1 ساعة قبل أي إجراء، تأخذ بها 1 L من حل الأسهم وفقاعات مع 5٪ CO2 (74٪ N2 و 21٪ O2) للحفاظ على ح H من الحل في ~ 7.4. إضافة 1.8 غرام من الجلوكوز و 1.8 مل CaCl2 (1 M)8.
ملاحظة: أضف Ca2+ فقط بعد فقاعات عندما يكون الرقم الـ 7.4 ~ ، وإلا ، سيتم تعجيل Ca2+. - حل التيرود: انظر صيغة وتكوين حل التيرود في الجدول 1. تصفية الحل (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في 4 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل9.
- حل التيرود مع BDM (2،3-Butanedione monoxime): إضافة BDM كمثبط myofilament عكسها لمنع تقلص myocytes10. تزن 600 ملغ BDM وإضافة إلى 200 مل من حل التيرود. اثارة الحل مع BDM حتى يتم حلها تماما. لا يلزم المزيد من الترشيح.
- قم بتخزين حل التيرود الذي يحتوي على BDM عند 4 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
2- إعداد الغرفة
- معطف كل من غرفة تشريح وغرفة تجريبية في وقت مبكر مع polydimethylsiloxane (PDMS) اتباع التعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
- ملء غرفة تشريح مع حل التيرود التي تحتوي على BDM.
- بدوره على المبرد 1 ساعة قبل الإجراء. تعيين درجة الحرارة عند 4 درجة مئوية.
3- تحضير كانولا
- بدوره على سحب micropipette. حدد الإعدادات حسب إرشادات الشركة المصنعة.
- اتخاذ أنبوب زجاجي بوروسيليكات نظيفة (القطر الخارجي والداخلي من الأنابيب الزجاجية المستخدمة كان 1.2 مم و 0.69 ملم على التوالي).
- إدراج أنبوب زجاجي في المشابك مخدد من سحب ماصة سوتر مع خيوط التدفئة البلاتين على شكل حرف U.
- قم بتنشيط الـ puller لإنتاج اثنين من الـ cannulae، كل منهما مع طرف رفيع طويل.
- قطع غيض من كل كانولا باستخدام زوج غرامة من مقص تحت مجهر تشريح لجعل القطر النهائي للتلميح حول 100 إلى 150 ميكرومتر.
- تلميع النار غيض من cannula قطع لجولة طفيفة حواف حادة.
- ثني كانولا على طول رمح باستخدام سلك البلاتين (ساخنة مع التحكم الدقيق) المتمركزة على جانب رمح ما يقرب من 2 ملم من طرف. زاوية الانحناء في القنية يجب أن تكون حوالي 45 درجة.
- إدراج الطرف المفتوح من القنية في حامل غرفة الضغط myograph وتشديد المناسب. قم بتوصيل حقنة 5 مل مملوءة بحل تيرود إلى الجانب الآخر من التركيب. ربط القنيولا إلى micromanipulator التي شنت على الغرفة (انظر الشكل 1 والشكل 2).
- ملء كانولا مع حل تيرود باستخدام حقنة (5 مل), شطف عليه, أنابيب وموصل من فقاعات الهواء.
- قبل إجراء الزبيب، وقياس ضغط القذف داخل القنية على مدى معين من تدفق (50 إلى 300 ميكرولتر / دقيقة، الشكل 3). القيام بذلك فقط عندما يتم استخدام cannula جديدة.
ملاحظة: ضغط التسريب داخل القنية يتناسب مع التدفق وهو خطي مجهز(الشكل 3).
4. استخراج قلب الماوس
- وضع الماوس C57BL/6 (أي الجنس، 8-16 أسابيع) في مربع التخدير الذي هو متصل إلى خزانات من الأيزوفلوران والأكسجين.
- بدوره على خزان الأكسجين وبدء تدفق ايزوفلوران. انتظر ~5 دقيقة حتى يتم تخدير الماوس بالكامل.
- بعد التخدير، واتخاذ الماوس من مربع التخدير وحقن الهيبارين IP (في تجويف البريتوني، 360 وحدة، 0.5 مل/ فأر) لتجنب تشكيل تجلط الدم في الأوعية الدموية. ثم وضع الماوس مرة أخرى في مربع التخدير.
- 10 دقيقة بعد حقن الهيبارين، حرك الماوس إلى السرير الساخن في وضعية supine وتثبيت الكفوف باستخدام شريط الملصقات. إبقاء الماوس تحت التخدير الكامل مع ايزوفلوران باستخدام مخروط الأنف.
- رفع جلد البطن من الماوس فوق الحجاب الحاجز مع ملقط واستخدام مقص الجراحية لقطع وفضح الحجاب الحاجز.
- قطع الحجاب الحاجز والعظم. افتحي الصدر
- تشريح القلب من تجويف الصدر، وقطع أقرب ما يمكن إلى جدار الصدر الظهري.
- ضع القلب في محلول تيرود البارد الذي يحتوي على 30 mM BDM.
- تنظيف القلب لإزالة الأنسجة الضامة مثل الرئة.
- نقل القلب إلى غرفة تشريح ما قبل المبردة مليئة حل تيرود يحتوي على 30 M BDM.
5. إعداد وتكبيب الشريان الحاجز
- تشغيل مضخة سيرفو. تعيين مضخة سيرفو إلى وضع "تدفق". السماح لها تشغيل بسرعة عالية حتى يتم تعبئة الأنابيب مع حل التيرود التي سيتم استخدامها لتجويف تجويف الأوعية الدموية. تأكد من عدم وجود فقاعات في الأنابيب. ثم خفض السرعة.
- اُلصق القلب على نظام الـ PDMS، متجنبًا أي ضرر في المنطقة الوسطى من القلب.
- إزالة كل من الأذين الأيمن والأيسر. قطع فتح البطين الأيمن وإزالة الجدار الأيمن خالية البطين باستخدام مجهر تشريح.
- كشف وتحديد الشريان الحاجز. ضع خيط النايلون (قطرها 30 ميكرومتر) تحت الشريان الحاجز وربط عقدة فضفاضة للاستخدام في المستقبل.
ملاحظة: يمكن التعرف على الشريان الحاجز بسهولة باستخدام مجهر تشريح. الشريان الحاجز هو شريان رئيسي على الحاجز الذي ينشأ من الشريان التاجي الأيمن في معظم الحالات. - إزالة الجدار الحر البطين الأيسر باستخدام مقص غرامة.
- نقل إعداد العضلات الحليمية إلى غرفة تجريبية التي تم وضعها في القنية. تمتلئ الغرفة مع حل التيرود يحتوي على BDM. يتم طلاء الجزء السفلي من هذه الغرفة بطبقة رقيقة (~2 مم) من PDMS.
- ضبط موقف القنية (باستخدام micromanipulator) لتمكين تحليب الشريان الحاجز. تشديد العقدة.
- تأمين العضلات الحليمة باستخدام دبابيس صغيرة إلى أرضية الغرفة بحيث يكون الهدف المجهر لديه رؤية واضحة للأوعية الدموية. انتبه إلى زاوية وموضع القنية وتأكد من أن طرف القنيولا موازٍ للجدار الشرياني.
- اختبار التكليج عن طريق طرد المحلول تدريجيا من الحقنة من خلال القنية. إذا كانت جميع العناصر تعمل بشكل صحيح، فإن الدم المتبقي في عضلة الحليمة يخرج من الأنسجة في بداية هذه العملية وسيتم رؤية محلول تيرود فقط في وقت لاحق.
6- استقرار الإعداد
- بدوره على مضخة ال peristaltic التي من شأنها أن توفر حل الضخ الفائق. ثم تضخيم باستمرار إعداد في الحمام مع ما قبل الغاز PSS بمعدل 3-4 مل / دقيقة.
- قم بتشغيل وحدة تحكم درجة الحرارة لمحلول الضخ الفائق. ضبط درجة حرارة الغمرة الحمام إلى ~ 35-37 درجة مئوية.
- ربط القنية إلى مضخة سيرفو. قراءة الضغط المعروض على جهاز التحكم في الضغط.
- مراقبة تدفق والضغط. يتم رقمنة التدفق (μL/min) وضغط الضخ الشرياني (مم زئبق) باستخدام جهاز الالتقاط الرقمي وتسجيله باستخدام برنامج مرتبط(الشكل 2).
- ضبط تدفق لضبط الضغط ~ 10 مم زئبق والسماح لها تشغيل ل ~ 10 دقيقة.
- زيادة تدفق حل الإنارة لجعل ضغط الشريان ~ 60 مم زئبق. الحصول على ضغط الضخ النهائي للشريان نفسه عن طريق طرح انخفاض ضغط القنية (الشكل 3).
ملاحظة: إذا تم تحديد وضع "الضغط" على جهاز التحكم في الضغط، يتم تعيين الضغط المُلَيّ ~ 60 مم زئبق لهذه التجارب. ثم مراقبة تغيير تدفق. - السماح للنموذج الاستقرار ل~ 30-60 دقيقة من خلال مراقبة تدفق و / أو مستويات الضغط. عادة ما يتم ملاحظة زيادة تدريجية في ضغط الشرايين في بداية القذف بعد التابيب. وهناك حالة جديدة ثابتة الحصول على تأسيسها في حد ذاته في حوالي 30 دقيقة(الشكل 4).
- بدء تجربة بعد استقرار ضغط الضخ (عند التدفق المستمر).
7. تحميل إعداد مع الفلورسنت الموسومة القمح الجرثومة agglutinin (WGA)
- إعداد حل Tyrode يحتوي على اليكسا فلور-488 مترافق WGA بإضافة 100 ميكروغرام من WGA مترافق في 5 مل من حل تيرود.
- بعناية تبديل perfusate من حل تيرود العادي إلى واحد يحتوي على الفلورسنت الموسومة WGA. من المهم أن التبديل بعناية perfusate بحيث لا يتم إدخال فقاعات.
- بعد ~ 30 دقيقة من اغاء WGA أو عندما حل WGA على وشك أن ينفد ، وتغيير perfusate العودة إلى الحل تيرود العادي.
8. تصوير كونفوكال من الشرايين والشعيرات الدموية
- بدوره على القرص Nipkow المجهر confocal النظام.
- استخدم المجهر لتحديد موقع الشريان الحاجز باستخدام هدف منخفض الطاقة (4x) في وضع الضوء المنقول.
ملاحظة: يمكن أن يكون موجودا الشريان الحاجز باتباع موقف من القنية. - بدء التصوير confocal مع غزل القرص confocal واختيار 488 نانومتر ليزر الإثارة، 40x التكبير الهدف وضبط كثافة الليزر ومعدل أخذ العينات (10 - 500 مللي ثانية لكل صورة).
- قم بإعداد مواضع التصوير العلوية والسفلية للمجهر confocal لتحديد نطاق التصوير وإدخال المعلمات للتصوير المكدس z.
- تعيين حجم الخطوة كما هو مستحسن للنظام الذي يتم استخدامه أو تعيين حجم الخطوة كما هو مطلوب.
- اختر إعداد z-stack و/أو إعدادات السلسلة الزمنية.
- حدد مجلداً جديداً أو قم بتعيينه لتخزين الصورة الجديدة.
- انقر فوق "تشغيل" لبدء تسجيل التصوير للتحليل في المستقبل (الشكل 5).
9 - مثال تجربة توسع الأوعية: توسع الأوعية الناجم عن البينازيل (فيديو 1).
- إعداد pinacidil حل الأسهم (100 mM في DMSO) وتخزينها في 4 درجة مئوية.
- إعداد 10 مل من حل التيرود. إضافة 10 ميكرولتر من pinacidil حل الأسهم لجعل التركيز النهائي من pinacidil 100 μM.
- صورة العضلات الحليمية في التكبير منخفضة (4x الهدف) لتشمل الشريان الحاجز والشريول فرع.
- قم بتبديل الحل المُلّق إلى الحل الذي يحتوي على pinacidil.
10. مثال على تجارب السيطرة على تدفق الدم: vasoconstrictor الناجم عن زيادة ضغط الضخ الشرياني في تدفق مستمر (الشكل 6)
- تحضير محلول الأسهم endothelin-1 (ET-1) (10 ميكرومتر) وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
- إعداد 10 مل من حل التيرود. أضف 10 ميكرولتر من محلول ET-1 (10 ميكرومتر) لجعل التركيز النهائي لـ ET-1 10 nM.
- سجل الضغط اللممَر مع تدفق مستمر وصورة العضلات الحليمية.
- قم بتبديل الحل المُلّق إلى حل إي تي-1 الذي يحتوي على.
11. مثال على صور شعرية مع بيريكيتس (الشكل 7)
- التضحية بماوس NG2DsRedBAC المعدلة وراثيا كما هو موضح في القسم 4 من هذا البروتوكول.
- استخراج القلب، cannulate الشريان الحاجز وتحميل العينة مع اليكسا فلور-488 مترافق WGA التالية البروتوكولات 5-7.
- صورة العضلات الحليمية في 488 نانومتر و 560 نانومتر الإثارة، و510-525 نانومتر، 575-625 نانومتر الانبعاثات باستخدام confocal. ضغط الشريان سيكون حوالي 40 مم زئبق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عندما يتم غرس علامة الأوعية الدموية الفلورية في تجويف الأوعية الدموية (هنا WGA متقارنة مع اليكسا فلور-488)، فمن الممكن لتصور أشجار الأوعية الدموية بأكملها كما هو مبين في الشكل 5 (لوحة اليسار) باستخدام المجهر confocal عالية السرعة. مزيد من التكبير تمكن من تصوير الشعيرات الدموية بالتفصيل (الشكل 5، لوحة الحق). منذ نظام الضغط يدعم الرصد المستمر للضغط اللمعان، ويمكن استخدام هذا الإعداد للتغييرات المرتبطة في القطر الشرياني مع الضغط الشرياني. فيديو 1 يظهر أنه عندما pinacidil، A ATP الحساسة K+ قناة (KATP)تم تقديم ناهض من التجويف، وزاد قطر الشرايين. ويبين الشكل 6 أنه عندما تم تطبيق الأوعية الدموية ET-1 من تجويف، انخفض قطر الشريان، وزاد الضغط اللمبّر عندما تم تعيين التدفق ثابت.
نظرًا لقدرات المجهر الدمجي عالي الدقة بالاقتران مع علامات خلايا محددة ، يمكن أيضًا استخدام هذا الإجراء لتصور العديد من أنواع الخلايا الأخرى المرتبطة بالدوران المجهري. هنا، استخدمنا الماوس (NG2DsRedBAC الفأر المعدلة وراثيا) التي تعبر عن بروتين الفلوريس DsRed تحت المروج بيريك محددة (NG2) ووصفت السفن مع WGA-اليكسا فلور 488. وهذا يسمح لنا صورة في وقت واحد على حد سواء الشعرية (الأخضر) و pericytes (الأحمر) في عضلة الماوس الحليمية(الشكل 7)في ظل الظروف التي تحاكي أفضل علم وظائف الأعضاء في الحيوانات الحية.
الشكل 1: تحبيب الشريان الحاجز الماوس.
(أ)صورة ضوء المنقولة يظهر مثالا على العضلات الحليمية معبّل. Micromanipulator، الكينولا وعينة (الحاجز مع عضلة الحليمات البطين الأيمن) يشار إليها كتسميات. (B) عينة مكبرة في A يظهر العضلات الحليمية والشريان الحاجز معبّل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المعدات التي استخدمت في جميع التجارب.
(أ) المكونات الرئيسية للإعداد المستخدمة في التجربة. (B) الرسم البياني يوضح الصلات بين إعداد العضلات الحليمية والمعدات التجريبية السيطرة الفسيولوجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قياس الضغط داخل القنيّة.
( A) مثال لإظهار كيف تم تحديد مقاومة القنولا بقياس الضغط داخل القنية على مدى تدفق (50-300 ميكرولتر /دقيقة). (ب) علاقة الضغط داخل القنية مع تدفق من 6 cannulae. الضغط داخل كانولا كان متناسبا مع تدفق وكان مناسبا من قبل PC التعبير = 0.08f-12.25، حيث PC الضغط داخل القنية، و كما تدفق. N = 6 cannulae. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تغير ضغط الضخ أثناء الاستقرار عند التدفق المستمر.
(A) تسجيل نموذجي لضغط الضخ أثناء التثبيت في تدفق ثابت (~ 250 ميكرولتر / دقيقة). لاحظ زيادة ضغط الضخ بعد 30 دقيقة من الاستقرار. (ب)وتظهر الإحصاءات ضغط الضخ قبل وبعد الاستقرار عندما تم تطوير لهجة. متوسط تدفق الشرايين للحفاظ على الضغط الأولي (~ 60 مم زئبق) هو 201.7 ± 8.6 ميكرولتر /دقيقة (ن = 45 الفئران). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصوير الشعيرات الدموية والشريول.
(أ) تظهر الصورة الشرايين والشعيرات الشعرية التي كانت محملة بجرثومة القمح agglutinin (WGA). (B) تكبير منطقة محاصر في A. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: ET-1 يزيد الضغط الإنارة ويقلل من قطر الشرايين.
(A) القطر الشرياني تغير مع تطبيق ET-1 (10 nM). (B) المواصفات الفلورية WGA تظهر التغير في القطر بواسطة ET-1. وقد انعكس قطر الشريان من خلال المسافة بين شدة الذروة من الفلوريس على جدار الشريان. (C)زاد الضغط على الأضواء في وجود ET-1 (10 nM) في تدفق مستمر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: الشعيرات الدموية مع بيريكيتس من الماوس NG2-DsRed.
تم تصوير بيريكات القلب (الحمراء) والشعيرات الدموية (الأخضر) في الضغط (40 مم زئبق) والفأر الحق في عضلة الحليمية البطينية. اللوحة اليمنى، صور مكبرة للمناطق المُصنّعة في اللوحات اليسرى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: توسع الأوعية الناجم عن Pinacidil. وقد طبقت بيناسيل (100 ميكرومتر) من تجويف. وشوهد توسع الأوعية في شجرة الشرايين. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
| تكوين محلول ملحي الفسيولوجية (PSS) | |||
| الكواشف | التركيز النهائي (mM) | الوزن الجزيئي | ز/10 ليتر |
| NaCl | 112 | 58.44 | 65.45 |
| KCl | 5 | 74.55 | 3.73 |
| مغس 4 | 1.2 | 120.37 | 1.44 |
| NaH2PO4 | 1.2 | 119.98 | 1.44 |
| NaHCO3 | 24 | 84.01 | 20.16 |
| الجلوكوز | 10 | 180.16 | إضافة 1.8 غرام الجلوكوز إلى 1 لتر PSS قبل الاستخدام |
| CaCl2 | 1.8 | 110.99 | إضافة 1.8 مل 1 م CaCl2 إلى 1 لتر PSS قبل الاستخدام |
| تكوين حل تيرود | |||
| الكواشف | التركيز النهائي (mM) | الوزن الجزيئي | ز/ل |
| NaCl | 140 | 58.44 | 8.18 |
| KCl | 5 | 74.55 | 0.37 |
| NaH2PO4 | 0.33 | 119.98 | 0.04 |
| HEPES | 10 | 238.3 | 2.38 |
| الجلوكوز | 5.5 | 180.16 | 0.99 |
| CaCl2 | 1.8 | 110.99 | إضافة 1.8 مل 1 M CaCl2 الحل |
| MgCl2.6H2O | 0.5 | 203.3 | إضافة 0.5 مل 1 M MgCl2 الحل |
| ملاحظة: ضبط درجة اله إلى 7.4 مع 1 M NaOH. | |||
الجدول 1: تكوين الحلول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في العمل الحالي، قدمنا طريقة بسيطة بشكل ملحوظ ولكن عملية للغاية السابقين فيفو لدراسة دوران الأوعية الدقيقة التاجية في القلب في ظل ظروف فسيولوجية. تم تعديل هذه الطريقة من التحقيقات الميكانيكية باستخدامالفئران 2. وكانت إضافة تحديا تكنولوجيا التصوير مع سرعة عالية ودقة بصرية عالية. لذلك، تمكنا من الاستفادة من أنظمة التصوير البصري المتقدمة المتاحة الآن تجاريا. عن طريق تشريح دقيق ووضع إعداد العضلات الحليمية تعمل في موقف موات, كنا قادرين على تصور الشرايين, الشرايين قبل الشعرية, الشعيرات الدموية, وفيnus, وكذلك البيريات وكانوا قادرين على قياس ضغط الشرايين و / أو تدفق أثناء السيطرة على الآخر. تم رصد التغيرات في قطر الشرايين والشعيرات الدموية باستخدام مجهر القرص الدوار العالي السرعة. إن الجمع بين الصور البصرية والضخ الداخلي للمحلول الفسيولوجي الملحي يجعل هذا الإعداد مفيدًا في تقييم تأثير العلاجات الطبية الحيوية ، وكذلك في دراسة الآليات التي تشارك في التنظيم الفسيولوجي والمرضي لتدفق الدم في القلب1.
وقد استخدمت على نطاق واسع عضلات حليمة القلب في دراسة فسيولوجيا القلب لسنوات عديدة. ومع ذلك، فإن عدم وجود الضخ ينتقص من علم وظائف الأعضاء إذا كان يجري النظر في خصائص "العمل" أو "التمثيل الغذائي" أو "النشاط الكهربائي". من الواضح أن عضلات الحليمات غير المُطعّمة ليست فسيولوجية. ومع ذلك، منذ عقود، جعلت Westerhof وآخرون إعداد الحليمات رقيقة الضغط من الفئران لدراسة تنظيم تدفق الدم2، ولكن هذا الإعداد لم يستخدم في الفئران كما فعلنا هنا، وذلك بسبب صعوبات التعامل. كما لم يتمكن هؤلاء المحققون من تصوير التفاصيل اللازمة لتحديد كيفية تنظيم تدفق الدم. كنا محظوظين أن الشريان الحاجز الماوس حوالي 100 ميكرومتر في القطر في ~ 60 مم زئبق ضغط الضخ، أصغر من ذلك في الفئران، ولكن كبيرة بما يكفي لعملنا. وكملاحظة عملية، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لإعداد القنيولا والأنابيب المتصلة. تجنب أي فقاعات في الأنابيب وقنية. يتم احتجاز الفقاعات بسهولة في المنطقة المتصلة وستمنع أو تشوه تدفق الدم. لذلك، تحقق من هذه المناطق. بالإضافة إلى ذلك ، سيكون من المفيد استخدام قنية مع طرف كبير نسبيًا طالما أنها صغيرة بما يكفي للوصول إلى الشريان ، لأن القنية الأكبر تحافظ على الشريان مفتوحًا وتمكن من التدفق السلس. إذا لوحظت زيادة مفاجئة وغير متوقعة في الضغط (في التدفق المستمر) أثناء التسجيل ، فمن المرجح جدًا أن غيض من القنية قد أصبح عالقًا في جدار الشرايين أو أن القنولا قد تم حظره بواسطة حطام الأنسجة. لذلك ، فإن موقف cannula مهم للغاية للحفاظ على التدفق والضغط مستقر. كلما كان التكيب أسرع، كان ذلك أفضل للأنسجة. وهذا يؤدي إلى انتعاش أسرع من وظيفته الفسيولوجية. نوصي بأن الوقت الذي يقضيه على الزبيب لا تتجاوز ~ 45 دقيقة (من استخراج القلب حتى الانتهاء من الزبيب).
مهما كان حذراً واحدة قد تكون، هذه الطريقة البسيطة على ما يبدو يأخذ الممارسة إلى الكمال. في بعض الأحيان لا يستجيب الإعداد لأي تحفيز ، بغض النظر عن العناية التي يتم اتخاذها أثناء التشريح أو سرعة وكفاءة الإجراء بأكمله. يجب أن تكون درجة حرارة الحمام ثابتة وبين 35 إلى 37 درجة مئوية. شيء آخر مهم هو تشغيل فحص مرجع روتيني لوظيفة الأنسجة (على سبيل المثال، الاستجابة إلى KCl) لكل تجربة، إما قبل أو بعد الانتهاء من التجربة. نحن نستخدم ET-1 أو KCl (70 mM) كمراجع. وأخيراً، من المهم جداً التحقق من أن القنية لا تزال في مكانها عندما يتم إجراء التجربة. تجاهل البيانات إذا كان القنياء خارج المكان أو أن الشريان مكسور أو ملتوية من طرف القنية. هناك أمران هامان جديران بالذكر حول "حركة الإعداد" و"تحليل البيانات". حتى في "quiescence" ، لا يزال الإعداد يتحرك(فيديو 1). حركة طفيفة ليست مشكلة للسرعة عالية الغزل القرص التصوير confocal. يمكن أن يؤدي خفض ضغط الضخ أو استخدام حاصرات Na+ channel إلى منع الحركة أو تقليلها دون التدخل في وظيفة الأوعية الدقيقة الوعائية. فعلنا حاليا تحليل البيانات المكتسبة باستخدام ImageJ-win64 (فيجي) و / أو MATLAB مع برامج مخصصة لقياسات قطر السفينة. نحن لا تفاصيل تحليل قطر هنا لأن أي برنامج (على سبيل المثال، Vasotracker11 ) يجب أن تكون قادرة على تحليل التغيرات قطر.
من خلال الجمع بين التحقيقات الفسيولوجية مع تقنيات التصوير البصري والمجهر confocal عالية السرعة ، يمكن استخدام هذا الإعداد على نطاق واسع إلى 1) اختبار التأثير التنظيمي للأدوية الجديدة على تدفق الدم في القلب ؛ 2) دراسة الاتصالات بين الخلايا (بين وفيما بين cardiomyocytes, الخلايا البطانية الشعرية, بيريه والخلايا العضلية السلسة الشريانية, والليفية); و 3) دراسة التغيير الوظيفي الديناميكي لأنواع الخلايا المختلفة باستخدام الفئران المعدلة وراثيا الفلوريسين الموسومة1. تتضمن هذه الطريقة تصور أجزاء من أنسجة القلب مع شبكات تحت علم وظائف الأعضاء "القريب". على الرغم من أننا قد تكون قادرة على تقليد في ظروف الجسم الحي من خلال سرعة إعداد و / أو بما في ذلك بعض خلايا الدم الحمراء في perfusate، فإنه لا يمكن أن تحل محل صحيح في التصوير الجسم الحي مع مجموعة كاملة من الأعباء الأيضية والعمل. قد لا يكون استعملت على الحيوانات كبيرة إمّا بسبب عمق محدودة من منظرة من مجهرة التقاء. ومع ذلك، ينبغي أن يكون أداة مفيدة في دراسة الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة في تنظيم دوران الأوعية التاجية الدقيقة في الحيوانات الصغيرة بما في ذلك الفئران والفأر. ويمكن توسيع مفاهيم مماثلة واعتمادها في دراسة السيطرة على تدفق الدم في الأنسجة أو الأعضاء الأخرى بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الجهاز الهضمي والبنكرياس والغدة الدرقية والغدد الليمفاوية والكبد والكلى والعضلات والهيكل العظمي والدماغ12، شبكية العين ، الغرغليا ، العظام ، الجلد ، الرحم ، الخصيتين ، المبيضين ، الغدة الكظرية ، الدهون الخ. هذا النهج سوف يحسن ويتقدم فهم السيطرة على تدفق الدم والآليات التنظيمية على المستويين الخلوي والجزيئي في ظل الظروف الفسيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل جزئيا مركز الهندسة والتكنولوجيا الطبية الحيوية؛ المعاهد القومية للصحة (1U01HL116321) و (1R01HL142290) وجمعية القلب الأمريكية 10SDG4030042 (GZ)، 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
