Summary
यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल के लिए धमनी परफ्यूजन दबाव और प्रवाह है कि दबाव को बनाए रखता है की पूर्व वीवो निगरानी द्वारा मुरीन दिल के ऊतकों में रहने वाले कोरोनरी माइक्रोसर्कुलेशन का अध्ययन करने के लिए है, साथ ही साथ केशिका बिस्तरों और pericytes सहित संवहनी पेड़ घटकों, के रूप में सेप्टल धमनी cannulated और दबाव है ।
Abstract
कोरोनरी धमनी टोन के साथ-साथ केशिकाओं के उद्घाटन या समापन के साथ काफी हद तक लगातार परफ्यूजन दबाव पर कार्डियोमायोसाइट्स के लिए रक्त प्रवाह निर्धारित करते हैं। हालांकि, मुख्य रूप से इसकी गति और गैर-स्टॉप बीटिंग के कारण, पूरे दिल में कोरोनरी धमनियों और केशिकाओं के गतिशील परिवर्तनों की निगरानी करना मुश्किल है। यहां हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो धमनी परफ्यूजन दर, दबाव और माउस राइट वेंट्रिकुलर पेपिलरी मांसपेशियों में धमनियों और केशिकाओं के व्यास परिवर्तनों की निगरानी करने में सक्षम बनाता है। माउस सेप्टल धमनी को अन्य गतिशील रूप से मापा जाने वाले निरंतर प्रवाह या दबाव पर कैनुलेटेड और छिद्रित किया जाता है। फ्लोरोसेंटी लेबल वाले लेक्टिन (जैसे, एलेक्सा फ्लोर-488 या -633 लेबल गेहूं-रोगाणु एग्लुटिनिन, डब्ल्यूजीए), धमनियों और केशिकाओं (और अन्य जहाजों) के साथ परफ्यूजन के बाद सही वेंट्रिकल पेपिलरी मांसपेशी और सेप्टम में आसानी से इमेज किया जा सकता है। पोत-व्यास परिवर्तन तो उपस्थिति या दिल संकुचन की अनुपस्थिति में मापा जा सकता है । जब आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त किए गए थे, तो विशिष्ट विशेषताओं पर नजर रखी जा सकती थी । उदाहरण के लिए, पेरिसिटस को माउस दिलों में कल्पना की गई थी जिसने NG2-DsRed व्यक्त किया था। इस विधि ने दिल में केशिका पेरिसाइट्स के शारीरिक कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान किया है। यह एक साथ संवहनी/केशिका व्यास और धमनी चमकदार दबाव को मापने के द्वारा दिल में रक्त प्रवाह पर अभिकर्मकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए भी उपयुक्त है । यह तैयारी, एक अत्याधुनिक ऑप्टिक इमेजिंग सिस्टम के साथ संयुक्त, एक के पास शारीरिक परिस्थितियों में दिल में सेलुलर और आणविक स्तर पर रक्त प्रवाह और उसके नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है ।
Introduction
उपयुक्त कोरोनरी दबाव-प्रवाह विनियमन अपनी मेटाबॉलिक मांगों को पूरा करने के लिए दिल को पर्याप्त रक्त आपूर्ति का आश्वासन देता है1। हालांकि, यह हाल ही में स्पष्ट हो गया है कि कैसे कोरोनरी दबाव प्रवाह गतिशील दिल में विनियमित है, व्यापक अध्ययन है कि पिछले दशकों के लिए वीवो और इन विट्रो में प्रदर्शन किया गया है के बावजूद । इसका एक कारण दिल की लगातार धड़कन के कारण इस तरह की पढ़ाई के लिए फिजिकल वर्किंग मॉडल स्थापित करने में दिक्कत होना भी है। भले ही, जीवित ऊतकों या जानवरों में कोरोनरी सूक्ष्म जहाजों के अवलोकन के लिए विभिन्न प्रकार के तरीके स्थापित किए गए हैं, लेकिन इनमें से कोई भी तरीका निरंतर/स्थिर ध्यान और एक ही समय2,3पर दबाव, प्रवाह और सूक्ष्मवस्कुलर व्यास के माप को प्राप्त करने में सक्षम नहीं था। धड़कन दिल में कोरोनरी धमनी सूक्ष्म जहाजों का प्रत्यक्ष दृश्य दशकों पहले पेश किया गया था4,3,लेकिन छोटे जहाजों में व्यास माप चुनौतीपूर्ण था और माइक्रोसर्कुलेशन से जुड़े कई विशेष सेल प्रकारों के विशिष्ट कार्य समान रूप से अप्रिय थे। यहां तक कि स्ट्रोबोस्कोपिक विधि और फ्लोटिंग ऑब्जेक्टिव सिस्टम भी उपरोक्त जानकारी एक साथ नहीं दे सका5. फिर भी, उपरोक्त प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके मूल्यवान जानकारी की एक महत्वपूर्ण राशि प्राप्त की गई है, जिसने हमें कोरोनरी रक्त प्रवाह6के नियमन के बारे में अधिक समझने में मदद की है। इस पेपर में हम जिस विधि का वर्णन कर रहे हैं, उससे एक जांच करने और विस्तार से समझने में मदद मिलेगी कि कोरोनरी धमनियों, धमनियों और माइक्रोवसकुलेचर के घटक उत्तेजनाओं और मेटाबोलिक मांगों के लिए अलग तरह से कैसे प्रतिक्रिया करते हैं।
इन अध्ययनों को आगे बढ़ाने के लिए हमने जो कार्य मॉडल स्थापित किया था, वह वेस्टरहोफ एट अल2के पिछले कार्य पर बनाया गया था । माउस दिल की सेप्टल धमनी के कैनुलेशन के बाद, शारीरिक नमकीन समाधान का उपयोग उस धमनी को छिद्रित करने के लिए किया गया था ताकि मायोसाइट्स और हृदय ऊतक के अन्य घटकों को पोषित किया जा सके। उचित फ्लोरोसेंट संकेतकों का उपयोग करके धमनी पर्फ्यूजन दबाव, प्रवाह और संवहनी व्यास की अन्य शारीरिक कार्यों के बीच निगरानी की गई थी। यह विधि हमें जीवित ऊतकों में शारीरिक दबाव के तहत कोरोनरी माइक्रोवैस्कुलर बिस्तर की कल्पना करने और पहली बार माइक्रोसर्कुलेशन नियमन में अंतर्निहित सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने में सक्षम बनाती है।
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Protocol
सभी पशु देखभाल मैरीलैंड बाल्टीमोर विश्वविद्यालय के दिशा निर्देशों के अनुसार था और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी ।
1. समाधान की तैयारी
नोट: पहले से समाधान तैयार करें। प्रयोगों में दो प्रकार के बुनियादी समाधानों का उपयोग किया जाता है: (1) स्नान सुपरफ्यूसेट के लिए शारीरिक नमकीन समाधान (पीएसएस) और (2) ल्यूमेन परफ्यूसेट के लिए टायरोड के समाधान। पीएसएस के पीएच को बनाए रखने के लिए सीओ2 के साथ लगातार बुदबुदाहट की जरूरत है। HEPES-बफर टायरोड के समाधान का उपयोग पीएसएस के बजाय ल्यूमेन में किया जाता है ताकि जहाजों में जाने वाले बुलबुले से बचा जा सके, क्योंकि बुलबुले एंडोथेलियल कोशिकाओंको नुकसान पहुंचाएंगे 7 और प्रवाह को ऑक्सीलाइड करते हैं।
- पीएसएस समाधान: तालिका 1में पीएसएस समाधान का फार्मूला और संरचना देखें। सीए2 +के 10 एल बनाओ -मुक्त और ग्लूकोज मुक्त पीएसएस स्टॉक समाधान और कमरे के तापमान पर स्टोर। किसी भी प्रक्रिया से पहले 1 घंटे, 5% सीओ2 (74% एन 2 और 21% ओ2) के साथ स्टॉक समाधान और बुलबुले के1एल को ~ 7.4 पर समाधान के पीएच रखने के लिए बाहर निकालें। 1.8 ग्राम ग्लूकोज और 1.8 एमएल सीएसीएल2 (1 एम स्टॉक)8जोड़ें।
नोट: जब पीएच ~7.4 होता है, तो बुदबुदाने के बाद ही सीए 2 + जोड़ें, अन्यथा, सीए2 + को उपजी कर दिया जाएगा। - टायरोड का समाधान: टेबल 1में टायरोड के समाधान का सूत्र और संरचना देखें। समाधान (0.22 माइक्रोन) को फ़िल्टर करें और भविष्य के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत9।
- बीडीएम (2,3-ब्यूटेनेड मोनोक्सीम) के साथ टायरोड का समाधान: मायोसाइट्स10के संकुचन को रोकने के लिए बीडीएम को एक रिवर्सिबल मायोफिलामेंट अवरोधक के रूप में जोड़ें। वजन 600 मिलीग्राम बीडीएम और टायरोड के समाधान के 200 मिलील में जोड़ें। जब तक यह पूरी तरह से भंग न हो जाए तब तक समाधान को बीडीएम के साथ हिलाएं। आगे छानने की जरूरत नहीं है ।
- भविष्य के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बीडीएम युक्त टायरोड के समाधान को स्टोर करें।
2. चैंबर की तैयारी
- निर्माता द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों का पालन करते हुए पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) के साथ पहले से विच्छेदन कक्ष और प्रयोगात्मक कक्ष दोनों को कोट करें।
- बीडीएम युक्त टायरोड के समाधान के साथ विच्छेदन कक्ष भरें।
- प्रक्रिया से पहले चिलर 1 घंटे चालू करें। तापमान 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
3. कैनुला तैयारी
- माइक्रोपिपेट पुलर चालू करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेटिंग्स का चयन करें।
- एक साफ बोरोसिलिकेट ग्लास ट्यूब लें (उपयोग की जाने वाली ग्लास ट्यूब का बाहरी और आंतरिक व्यास क्रमशः 1.2 मिमी और 0.69 मिमी था)।
- यू-आकार के प्लेटिनम हीटिंग फिलामेंट के साथ एक सूटर पिपेट पुलर के ग्रूव क्लैंप में एक ग्लास ट्यूब डालें।
- दो कैनुला का उत्पादन करने के लिए खींचने वाले को सक्रिय करें, प्रत्येक एक लंबी पतली नोक के साथ।
- 100 से 150 माइक्रोन के आसपास टिप का अंतिम व्यास बनाने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत कैंची की एक अच्छी जोड़ी का उपयोग करके प्रत्येक कैनुला की नोक काटें।
- आग तेज किनारों को थोड़ा गोल करने के लिए कट कैनुला की नोक को पॉलिश करें।
- शाफ्ट के किनारे लगभग 2 मिमी टिप से शाफ्ट के किनारे स्थित प्लेटिनम तार (ठीक नियंत्रण के साथ गर्म) का उपयोग करके कैनुला को मोड़ें। कैनुला में मोड़ का कोण 45 डिग्री के आसपास होना चाहिए।
- कैनुला के खुले छोर को दबाव वाले माियोग्राफ कक्ष के धारक में डालें और फिटिंग को कस दें। टाइरोड के समाधान से भरी 5 एमएल सिरिंज को फिटिंग के दूसरी तरफ से कनेक्ट करें। कैनुला को कक्ष पर चढ़कर माइक्रोमैनीपुलेटर से कनेक्ट करें (चित्रा 1 और चित्रा 2देखें)।
- सिरिंज (5 एमएल) का उपयोग करके टायरोड के समाधान के साथ कैनुला भरें, इसे फ्लश करते हैं, हवा के बुलबुले के ट्यूबिंग और कनेक्टर।
- कैनुलेशन प्रक्रिया से पहले, प्रवाह की एक दी गई सीमा (50 से 300 माइक्रोएल/न्यूनतम, चित्रा 3)पर कैनुला के अंदर परफ्यूजन दबाव को मापें। ऐसा तभी करें जब किसी नए कैनुला का इस्तेमाल हो।
नोट: कैनुला के अंदर परफ्यूजन दबाव प्रवाह के आनुपातिक है और रैखिक फिट है(चित्र 3)।
4. माउस दिल की निकासी
- एनेस्थीसिया बॉक्स में एक C57BL/6 माउस (या तो सेक्स, 8-16 सप्ताह पुराना) रखो जो आइसोफ्लाणे और ऑक्सीजन के टैंकों से जुड़ा हुआ है।
- ऑक्सीजन टैंक चालू करें और आइसोफलून का प्रवाह शुरू करें। माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड होने तक ~ 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
- संज्ञाहरण स्थापित होने के बाद, माउस को संज्ञाहरण बॉक्स से बाहर निकालें और वेक्यूलेचर में रक्त के थक्के के गठन से बचने के लिए हेपरिन आईपी (पेरिटोनियल गुहा, 360 यूनिट, 0.5 एमएल/माउस में) इंजेक्ट करें। इसके बाद माउस को वापस एनेस्थीसिया बॉक्स में डाल दें।
- हेपरिन इंजेक्शन लगाने के 10 मिनट बाद, माउस को एक रीढ़ की स्थिति में गर्म बिस्तर पर ले जाएं और लेबलिंग टेप का उपयोग करके अपने पंजे को स्थिर करें। नाक शंकु का उपयोग करके आइसोफलून के साथ माउस को पूर्ण संज्ञाहरण के नीचे रखें।
- माउस की पेट की त्वचा को संदंश के साथ डायाफ्राम के ऊपर उठाएं और डायाफ्राम को काटने और बेनकाब करने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें।
- डायाफ्राम और स्टर्नम को काट लें। छाती खोलें।
- वक्ष गुहा से दिल को विच्छेदन करें, पृष्ठीय छाती की दीवार के जितना संभव हो उतना करीब काटें।
- दिल को बर्फ-ठंडे टायरोड के घोल में रखें जिसमें 30 एमएम बीडीएम होता है।
- फेफड़ों जैसे संयोजी ऊतकों को हटाने के लिए दिल को साफ करें।
- दिल को 30 एमएम बीडीएम वाले टायरोड के समाधान से भरे पूर्व-ठंडा विच्छेदन कक्ष में स्थानांतरित करें।
5. सेप्टल धमनी की तैयारी और कैनुलेशन
- सर्वो पंप चालू करें। सर्वो पंप को "प्रवाह" मोड पर सेट करें। इसे उच्च गति से तब तक चलने दें जब तक कि टयूबिंग टायरोड के समाधान से भर न जाए जिसका उपयोग संवहनी ल्यूमेन को छिद्रित करने के लिए किया जाएगा। सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग में कोई बुलबुले नहीं हैं। इसके बाद स्पीड कम करें।
- दिल को पीडीएमएस पर पिन करें, दिल के मध्य क्षेत्र को किसी भी नुकसान से बचें।
- दाएं और बाएं दोनों अटरिया निकालें। सही वेंट्रिकल को खोलें और विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सही वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार को हटा दें।
- सेप्टल धमनी का पर्दाफाश करें और पहचानें। सेप्टल धमनी के नीचे एक नायलॉन धागा (30 माइक्रोन व्यास) रखें और भविष्य के उपयोग के लिए एक ढीली गाँठ बांधें।
नोट: सेप्टल धमनी को आसानी से विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पहचाना जा सकता है। सेप्टल धमनी ज्यादातर मामलों में सही कोरोनरी धमनी से निकलने वाले पट पर एक प्रमुख धमनी है। - ठीक कैंची का उपयोग कर बाईं वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार निकालें।
- पेपिलरी मांसपेशियों की तैयारी को प्रायोगिक कक्ष में स्थानांतरित करें जिसमें कैनुला तैनात था। चैंबर टाइरोड के समाधान से भरा हुआ है जिसमें बीडीएम होता है। इस कक्ष के नीचे पीडीएमएस की पतली (~ 2 मिमी) परत के साथ लेपित है।
- सेप्टल धमनी के कैनुलेशन को सक्षम करने के लिए कैनुला (माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करके) की स्थिति को समायोजित करें। गाँठ को कस लें।
- चेंबर मंजिल पर छोटे पिनों का उपयोग करके पेपिलरी मांसपेशी को सुरक्षित करें ताकि माइक्रोस्कोप उद्देश्य में वैक्यूलेचर का स्पष्ट दृष्टिकोण हो। कोण और कैनुला की स्थिति पर ध्यान दें और यह सुनिश्चित करें कि कैनुला की नोक धमनी दीवार के समानांतर हो।
- कैनुला के माध्यम से सिरिंज से समाधान को धीरे-धीरे निष्कासित करके कैनुलेशन का परीक्षण करें। यदि सभी तत्व ठीक से कार्य करते हैं, तो पेपिलरी मांसपेशियों में अवशिष्ट रक्त इस प्रक्रिया की शुरुआत में ऊतक से बाहर निकल जाएगा और केवल टायरोड का समाधान बाद में देखा जाएगा।
6. तैयारी का स्थिरीकरण
- परिष्ट पंप चालू करें जो सुपरफ्यूजन समाधान प्रदान करेगा। फिर लगातार 3-4 एमएल/मिनट की दर से प्री-गैस्ड पीएसएस के साथ बाथ में तैयारी को सुपरफयूज करें ।
- सुपरफ्यूजन समाधान के लिए तापमान नियंत्रक चालू करें। स्नान के तापमान को ~35-37 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करें।
- कैनुला को सर्वो पंप से कनेक्ट करें। दबाव सर्वो नियंत्रक पर प्रदर्शित दबाव पढ़ें।
- प्रवाह और दबाव की निगरानी करें। प्रवाह (μL/min) और धमनी परफ्यूजन दबाव (मिमी एचजी) डिजिटाइज़र का उपयोग करके डिजिटाइज्ड किया जाता है और एक संबद्ध सॉफ्टवेयर(चित्रा 2)का उपयोग करके दर्ज किया जाता है।
- दबाव ~ 10 mmHg सेट करने के लिए प्रवाह को समायोजित करें और इसे ~ 10 मिनट के लिए चलाने दें।
- धमनी का दबाव ~ 60 एमएमएचजी बनाने के लिए चमकदार समाधान का प्रवाह बढ़ाएं। कैनुला(चित्रा 3)के दबाव ड्रॉप को घटाकर आर्टेरियोल का अंतिम पर्फ्यूजन दबाव प्राप्त करें।
नोट: यदि दबाव सर्वो नियंत्रक पर "दबाव" मोड का चयन किया जाता है, तो इन प्रयोगों के लिए चमकदार दबाव ~ 60 एमएमएचजी सेट किया जाता है। फिर प्रवाह के परिवर्तन की निगरानी करें। - नमूना प्रवाह और/ कैनुलेशन के बाद परफ्यूजन की शुरुआत में धमनी दबाव की क्रमिक वृद्धि सामान्य रूप से देखी जाती है। एक नया स्थिर राज्य के बारे में 30 मिनट(चित्रा 4)में खुद से स्थापित हो जाएगा ।
- पर्फ्यूजन दबाव स्थिर होने (निरंतर प्रवाह पर) के बाद एक प्रयोग शुरू करें।
7. फ्लोरोसेंटी टैग गेहूं-रोगाणु agglutinin (WGA) के साथ तैयारी लोड
- टायरोड के समाधान के 5 एमएल में 100 माइक्रोग्राम संयुग्मित डब्ल्यूजीए जोड़कर एलेक्सा-फ्लोरर-488 संयुग्मित डब्ल्यूजीए से युक्त टायरोड के समाधान को तैयार करें।
- ध्यान से सामान्य टायरोड के समाधान से फ्लोरोसेंटी टैग किए गए WGA वाले एक परफ्यूसेट को स्विच करें। यह ध्यान से perfusate स्विच करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि कोई बुलबुले शुरू कर रहे हैं।
- WGA perfusion के ~ 30 मिनट के बाद या जब WGA समाधान के बारे में बाहर चलाने के लिए है, सामान्य है Tyrode समाधान करने के लिए वापस perfusate बदल जाते हैं।
8. धमनियों और केशिकाओं की कॉन्फोकल इमेजिंग
- निप्कोई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम चालू करें।
- ट्रांसमिटेड लाइट मोड में कम पावर ऑब्जेक्टिव (4x) का इस्तेमाल करते हुए सेप्टल धमनी का पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करें।
नोट: सेप्टल धमनी कैनुला की स्थिति का पालन करके स्थित किया जा सकता है। - कताई डिस्क कॉन्फोकल के साथ कॉन्फोकल इमेजिंग शुरू करें और 488 एनएम एक्सटिटेशन लेजर, 40x उद्देश्य आवर्धन चुनें और लेजर तीव्रता और नमूना दर (10 - 500 एमएस प्रति छवि) को समायोजित करें।
- इमेजिंग रेंज को परिभाषित करने और जेड-स्टैक इमेजिंग के लिए मापदंडों में प्रवेश करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए ऊपर और नीचे इमेजिंग पदों को सेट करें।
- जिस सिस्टम का उपयोग किया जा रहा है या वांछित रूप से चरण आकार निर्धारित किया जा रहा है, उसके लिए अनुशंसित चरण आकार निर्धारित करें।
- जेड-स्टैक सेटिंग और/या टाइम सीरीज सेटिंग्स चुनें ।
- नई छवि को स्टोर करने के लिए एक नया फ़ोल्डर चुनें या सेट करें।
- भविष्य के विश्लेषण के लिए इमेजिंग रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए"भागो"पर क्लिक करें(चित्रा 5)।
9. उदाहरण वासोडिलेटर प्रयोग: पिनाकिडिल-प्रेरित वासोडिलेशन (वीडियो 1)।
- पिनासिडिल स्टॉक सॉल्यूशन (डीएमएसओ में 100 एमएम) तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
- टायरोड के घोल की 10 एमएल तैयार करें। पिनासिडिल 100 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए पिनाकिडिल स्टॉक समाधान के 10 माइक्रोल जोड़ें।
- सेप्टल धमनी और शाखा धमनी को शामिल करने के लिए कम आवर्धन (4x उद्देश्य) पर पेपिलरी मांसपेशी छवि।
- पिनासिडिल युक्त समाधान में चमकदार समाधान स्विच करें।
10. उदाहरण रक्त प्रवाह नियंत्रण प्रयोग: वैसोकॉन्स्ट्रिक्टर-प्रेरित धमनी परफ्यूजन दबाव निरंतर प्रवाह पर वृद्धि(चित्रा 6)
- एंडोथेलिन-1 (ईटी-1) स्टॉक सॉल्यूशन (10 माइक्रोन) तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
- टायरोड के घोल की 10 एमएल तैयार करें। ईटी-1 10 एनएम की फाइनल कंसंट्रेशन बनाने के लिए ईटी-1 स्टॉक सॉल्यूशन (10 माइक्रोन) के 10 माइक्रोन जोड़ें ।
- लगातार प्रवाह के साथ चमकदार दबाव रिकॉर्ड करें और पेपिलरी मांसपेशी को छवि करें।
- ईटी-1 युक्त समाधान के लिए चमकदार समाधान स्विच करें।
11. पेरिसाइट्स के साथ केशिका की उदाहरणछवियां (चित्र 7)
- इस प्रोटोकॉल की धारा 4 में वर्णित NG2DsRedBAC ट्रांसजेनिक माउस का बलिदान करें।
- दिल निकालें, सेप्टल धमनी को कैनुलेट करें और प्रोटोकॉल 5-7 के बाद एलेक्सा-फ्लोर-488 संयुग्मित डब्ल्यूजीए के साथ नमूना लोड करें।
- छवि 488 एनएम और 560 एनएम उत्तेजन पर पेपिलरी मांसपेशी, और 510-525 एनएम, 575-625 एनएम उत्सर्जन कॉन्फोकल का उपयोग करके। आर्टेरियोल प्रेशर 40 एमएमएचजी के आसपास होगा।
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Representative Results
जब एक फ्लोरेसेंस वैस्कुलर मार्कर को संवहनी ल्यूमेन (यहां डब्ल्यूजीए एलेक्सा फ्लोरर-488 के साथ संयोजित) में व्याप्त किया जाता है, तो उच्च गति वाले कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्र 5 (बाएं पैनल) में दिखाए गए पूरे संवहनी पेड़ों की कल्पना करना संभव है। इसके अलावा आवर्धन विस्तार में केशिका की इमेजिंग(चित्रा 5,सही पैनल) सक्षम बनाता है । चूंकि दबाव प्रणाली चमकदार दबाव की निरंतर निगरानी का समर्थन करती है, इसलिए इस तैयारी का उपयोग धमनी दबाव के साथ धमनी व्यास में सहयोगी परिवर्तनों के लिए किया जा सकता है। वीडियो 1 से पता चलता है कि जब पिनासिडिल, एक एटीपी-सेंसिटिव K+ चैनल (Kएटीपी)एगोनिस्ट को ल्यूमेन से परोसा गया तो धमनियों का व्यास बढ़ गया । चित्रा 6 से पता चलता है कि जब ल्यूमेन से वासोकॉन्स्ट्रिक्टर ईटी-1 लागू किया गया था, तब आर्टेरियोल का व्यास कम हो गया था, और प्रवाह स्थिर होने पर चमकदार दबाव बढ़ गया था।
विशिष्ट सेल मार्कर के साथ संयोजन में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की उच्च-संकल्प क्षमताओं के कारण, इस प्रक्रिया का उपयोग माइक्रोसर्कुलेशन से जुड़े कई अन्य कोशिकाओं के प्रकारों की कल्पना करने के लिए भी किया जा सकता है। यहां, हमने एक माउस (NG2DsRedBAC ट्रांसजेनिक माउस) का उपयोग किया जो एक पेरिसाइट विशिष्ट प्रमोटर (एनजी 2) के तहत डीएसरेड फ्लोरेसेंस प्रोटीन व्यक्त करता है और WGA-एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ जहाजों को लेबल करता है। यह हमें एक साथ दोनों केशिका (हरे) और pericytes (लाल) माउस papillary मांसपेशी(चित्रा 7)में शर्तों के तहत छवि है कि बेहतर जीवित जानवरों में शरीर विज्ञान की नकल करने की अनुमति देता है ।
चित्रा 1: माउस सेप्टल धमनी का कैनुलेशन।
(क)प्रेषित प्रकाश छवि कैनुलेटेड पेपिलरी मांसपेशी का एक उदाहरण दिखाती है। माइक्रोमैनीपुलेटर, कैनुला और नमूना (सही वेंट्रिकल पेपिलरी मांसपेशी के साथ पट) लेबल के रूप में इंगित किए जाते हैं। (ख) ए में जूम-इन सैंपल से पेपिलरी मांसपेशी और कैनुलेटेड सेप्टल आर्टरी का पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: उपकरण है कि सभी प्रयोग में इस्तेमाल किया गया था ।
(A)प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले सेटअप के मुख्य घटक। (ख)आरेख पेपिलरी मांसपेशियों की तैयारी और शारीरिक नियंत्रण प्रयोगात्मक उपकरणों के बीच कनेक्शन दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: कैनुला के अंदर दबाव का माप।
(क)एक उदाहरण यह दिखाने के लिए कि कैसे एक कैनुला प्रतिरोध प्रवाह की एक श्रृंखला (50-300 μl/min) पर कैनुला के अंदर दबाव को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था । (ख)6 कैनुला से प्रवाह के साथ कैनुला के अंदर दबाव का संबंध । कैनुला के अंदर दबाव प्रवाह के आनुपातिक था और अभिव्यक्ति पीसी = 0.08f-12.25 द्वारा फिट था, जहां कैनुला के अंदर दबाव के रूप में पीसी, प्रवाह के रूप में एफ। N= 6 cannulae। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4: एक निरंतर प्रवाह पर स्थिरीकरण के दौरान परफ्यूजन दबाव परिवर्तन।
(क)स्थिरीकरण के दौरान परफ्यूजन दबाव की एक विशिष्ट रिकॉर्डिंग स्थिर प्रवाह (~ 250 μL/min) पर। स्थिरीकरण के 30 मिनट के बाद परफ्यूजन दबाव की वृद्धि पर ध्यान दें। (ख)आंकड़े स्थिरीकरण से पहले और बाद में परफ्यूजन दबाव दिखाते हैं जब टोन विकसित किया गया था । प्रारंभिक दबाव (~ 60 एमएमएचजी) को बनाए रखने के लिए धमनियों का औसत प्रवाह 201.7 ± 8.6 माइक्रोएल/मिनट (एन = 45 चूहों) है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: केशिकाओं और धमनियों की इमेजिंग।
(क)छवि धमनियों और केशिकाओं को दिखाती है जो गेहूं के रोगाणु एग्लुटिनिन (डब्ल्यूजीए) से भरी हुई थीं । (ख) बॉक्स्डएरिया में जूम इन ए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: ईटी-1 चमकदार दबाव बढ़ाता है और धमनी व्यास को कम करता है।
(क)ईटी-1 (10 एनएम) के आवेदन के साथ धमनी व्यास बदल गया। (ख)ईटी-1 द्वारा व्यास परिवर्तन दिखाते हुए डब्ल्यूजीए फ्लोरेसेंस प्रोफाइल । धमनियों का व्यास धमनियों की दीवार पर फ्लोरेसेंस की चरम तीव्रता के बीच की दूरी से परिलक्षित होता था। (ग)ईटी-1 (10 एनएम) की मौजूदगी में लगातार फ्लो पर ल्यूमिनल प्रेशर बढ़ा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7: NG2-DsRed माउस से pericytes के साथ केपिलरी ।
कार्डियक पेरिसाइट्स (लाल) और केशिकाओं (हरे रंग) को दबाव (40 एमएमएचजी) और परफ्यूस्ड माउस राइट वेंट्रिकुलर पेपिलरी मांसपेशी में चित्रित किया गया था। दाएं पैनल, बाएं पैनलों में बॉक्स्ड क्षेत्रों की ज़ूम-इन छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
वीडियो 1: Pinacidil प्रेरित वासोडिलेशन। पिनासिडिल (100 माइक्रोन) लुमेन से लागू किया गया था। धमनी के पेड़ में वासोडिलेशन देखा गया। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
| शारीरिक नमकीन समाधान (पीएसएस) की संरचना | |||
| अभिकर्मकों | अंतिम एकाग्रता (एमएन) | आणविक वजन | जी/10 लीटर |
| नैक | 112 | 58.44 | 65.45 |
| केसीएल | 5 | 74.55 | 3.73 |
| एमजीएसओ4 | 1.2 | 120.37 | 1.44 |
| NaH2PO4 | 1.2 | 119.98 | 1.44 |
| नाहको3 | 24 | 84.01 | 20.16 |
| ग्लूकोज़ | 10 | 180.16 | उपयोग से पहले 1 लीटर पीएसएस में 1.8 ग्राम ग्लूकोज जोड़ें |
| CaCl2 | 1.8 | 110.99 | उपयोग से पहले 1.8 मिलीलीटर 1 एम CaCl2 से 1 लीटर पीएसएस जोड़ें |
| टायरोड के समाधान की संरचना | |||
| अभिकर्मकों | अंतिम एकाग्रता (एमएन) | आणविक वजन | जी/एल |
| नैक | 140 | 58.44 | 8.18 |
| केसीएल | 5 | 74.55 | 0.37 |
| NaH2PO4 | 0.33 | 119.98 | 0.04 |
| हेपेस | 10 | 238.3 | 2.38 |
| ग्लूकोज़ | 5.5 | 180.16 | 0.99 |
| CaCl2 | 1.8 | 110.99 | 1.8 मिलीलीटर 1 एम CaCl2 समाधान जोड़ें |
| MgCl2.6H2O | 0.5 | 203.3 | 0.5 मिलीलीटर 1 एम एमजीसीएल 2 समाधान जोड़ें |
| नोट: पीएच को 1 एम नाओएच के साथ 7.4 पर समायोजित करें। | |||
तालिका 1: समाधानों की संरचना।
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Discussion
वर्तमान कार्य में, हमने शारीरिक परिस्थितियों में दिल में कोरोनरी माइक्रोसर्कुलेशन का अध्ययन करने के लिए एक उल्लेखनीय सरल अभी तक अत्यधिक व्यावहारिक पूर्व वीवो विधि शुरू की है। इस विधि को चूहों का उपयोग करके यांत्रिक जांच से संशोधित किया गया था2. चुनौतीपूर्ण इसके अलावा उच्च गति और उच्च ऑप्टिकल संकल्प के साथ इमेजिंग प्रौद्योगिकी थी । इसलिए हम उन्नत ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम का लाभ उठाने में सक्षम थे जो अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । एक अनुकूल स्थिति में कामकाजी पेपिलरी मांसपेशियों की तैयारी के सावधानीपूर्वक विच्छेदन और प्लेसमेंट से, हम धमनियों, पूर्व-केशिकाओं, केशिकाओं और वेणुओं के साथ-साथ पेरिसाइट्स की कल्पना करने में सक्षम थे और दूसरे को नियंत्रित करते समय धमनी के दबाव और/या प्रवाह को मापने में सक्षम थे । आर्टेरियोल और केशिका व्यास परिवर्तनों की निगरानी एक हाईस्पीड कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके की गई थी। ऑप्टिकल छवियों का संयोजन और शारीरिक खारा समाधान का आंतरिक पर्फ्यूजन इस तैयारी को जैव चिकित्सा उपचारों के प्रभाव के मूल्यांकन में सहायक बनाता है, साथ ही उन तंत्रों के अध्ययन में जो हृदय में रक्त प्रवाह के शारीरिक और रोग विनियमन में शामिल हैं1।
हृदय पेपिलरी मांसपेशियों को कई वर्षों से कार्डियक फिजियोलॉजी के अध्ययन में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। हालांकि, पर्फ्यूजन की अनुपस्थिति शरीर विज्ञान से मुकर जाती है यदि "काम" या "चयापचय" या "विद्युत गतिविधि" की विशेषताओं पर विचार किया जा रहा है। जाहिर है, गैर-पर्फ्यूस्ड पेपिलरी मांसपेशियां स्पष्ट रूप से शारीरिक नहीं हैं। फिर भी, दशकों पहले, वेस्टरहोफ एट अल ने रक्त प्रवाह विनियमन2का अध्ययन करने के लिए चूहे से दबाव वाली पतली पेपिलरी तैयारी की, लेकिन इस तैयारी का उपयोग चूहों में नहीं किया गया था जैसा कि हमने यहां किया था, हैंडलिंग कठिनाइयों के कारण। इन जांचकर्ताओं को भी कैसे रक्त प्रवाह विनियमन हुआ निर्धारित करने के लिए आवश्यक विवरण छवि करने में सक्षम नहीं थे । हम भाग्यशाली थे कि माउस सेप्टल धमनी ~ 60 mmHg perfusion दबाव पर व्यास में लगभग 100 माइक्रोन है, चूहे में है कि छोटे से छोटे है, लेकिन हमारे काम के लिए काफी बड़ा है। प्रैक्टिकल नोट के तौर पर कैनुला और कनेक्टेड ट्यूबिंग को तैयार करने पर विशेष ध्यान देने की जरूरत है। टयूबिंग और कैनुला में किसी भी बुलबुले से बचें। बुलबुले आसानी से कनेक्टेड क्षेत्र में फंस जाते हैं और रक्त प्रवाह को अवरुद्ध या विकृत कर देंगे। इसलिए इन क्षेत्रों की दोहरी जांच कराएं। इसके अलावा, अपेक्षाकृत बड़े टिप के साथ एक कैनुला का उपयोग करना उपयोगी होगा जब तक कि यह धमनी में प्रवेश करने के लिए काफी छोटा है, क्योंकि एक बड़ा कैनुला धमनी को खुला रखता है और चिकनी प्रवाह को सक्षम बनाता है। यदि रिकॉर्डिंग के दौरान दबाव (निरंतर प्रवाह पर) में अचानक और अप्रत्याशित वृद्धि देखी जाती है, तो यह बहुत संभावना है कि कैनुला की नोक धमनी की दीवार में फंस गई है या कैनुला ऊतक मलबे द्वारा अवरुद्ध हो गया है। इसलिए, प्रवाह और दबाव को स्थिर रखने के लिए कैनुला की स्थिति बहुत महत्वपूर्ण है। तेजी से कैनुलेशन, ऊतक के लिए बेहतर है। इससे इसके शारीरिक कार्य में अधिक तेजी से रिकवरी होती है। हम अनुशंसा करते हैं कि कैनुलेशन पर खर्च किया गया समय ~ 45 मिनट से अधिक नहीं है (कैनुलेशन के पूरा होने तक दिल की निकासी से)।
हालांकि सावधान एक हो सकता है, यह प्रतीत होता है सरल विधि सही करने के लिए अभ्यास लेता है । कभी-कभी तैयारी किसी भी उत्तेजना का जवाब नहीं देती है, भले ही विच्छेदन या पूरी प्रक्रिया की तेजी और दक्षता के दौरान देखभाल की परवाह किए बिना। स्नान का तापमान स्थिर और 35 से 37 डिग्री सेल्सियस के बीच होना चाहिए। एक और महत्वपूर्ण बात यह है कि आपके प्रयोग से पहले या बाद में प्रत्येक प्रयोग के लिए ऊतक फ़ंक्शन (उदाहरण के लिए, केसीएल की प्रतिक्रिया) के लिए एक नियमित संदर्भ जांच चलाना है। हम संदर्भ के रूप में ईटी-1 या केसीएल (70 mM) का उपयोग करते हैं। अंत में, यह जांचना और निर्धारित करना बहुत महत्वपूर्ण है कि प्रयोग किए जाने पर कैनुला अभी भी मौजूद है। यदि कैनुला जगह से बाहर है या धमनी को कैनुला की नोक से तोड़ दिया गया है या घुमा दिया गया है तो डेटा की उपेक्षा करें। "तैयारी के आंदोलन" और "डेटा विश्लेषण" पर केंद्र को नोट करने लायक दो महत्वपूर्ण चीजें। यहां तक कि "quiescence" में, तैयारी अभी भी चलता है(वीडियो 1)। मामूली आंदोलन उच्च गति कताई डिस्क कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए एक समस्या नहीं है। परफ्यूजन दबाव कम करना या ना+ चैनल ब्लॉकर्स का उपयोग करके माइक्रोवैस्कुलर पोत समारोह में हस्तक्षेप किए बिना आंदोलन को रोका या कम किया जा सकता है। हमने पोत व्यास मापन के लिए कस्टम सॉफ्टवेयर के साथ इमेजजे-विन64 (फिजी) और/या मैटलैब का उपयोग करके अधिग्रहीत डेटा का ऑफलाइन विश्लेषण किया । हम यहां व्यास विश्लेषण का विस्तार नहीं करते हैं क्योंकि किसी भी सॉफ्टवेयर (जैसे, वासोट्रैकर11) व्यास परिवर्तनों का विश्लेषण करने में सक्षम होना चाहिए।
ऑप्टिक इमेजिंग तकनीकों और उच्च गति कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ शारीरिक जांच के संयोजन से, इस तैयारी को व्यापक रूप से 1 करने के लिए उपयोग किया जा सकता है) दिल में रक्त प्रवाह पर नई दवाओं के नियामक प्रभाव का परीक्षण करें; 2) इंटरसेलुलर संचार का अध्ययन करें (कार्डियोमायोसाइट्स के बीच और बीच में, केशिका एंडोथेलियल कोशिकाएं, पेरिसाइट्स और धमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं, और फाइब्रोब्लास्ट); और 3) फ्लोरेसेंस-टैग किए गए ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके विभिन्न सेल प्रकारों के गतिशील कार्यात्मक परिवर्तन का अध्ययनकरें 1. इस विधि में "निकट" शरीर विज्ञान के तहत नेटवर्क के साथ दिल के ऊतकों के कुछ हिस्सों का दृश्य शामिल है। हालांकि हम तैयारी पेसिंग द्वारा vivo शर्तों में नकल करने में सक्षम हो सकता है और/या perfusate में कुछ लाल रक्त कोशिकाओं सहित, यह मेटाबोलिक और काम के बोझ की एक पूरी श्रृंखला के साथ वीवो इमेजिंग में सच की जगह नहीं कर सकते । यह बड़े जानवरों पर या तो एक कंफोकल माइक्रोस्कोप के दृश्य की सीमित गहराई के कारण इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । हालांकि, यह माउस और चूहे सहित छोटे जानवरों में कोरोनरी माइक्रोसर्कुलेशन विनियमन अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र के अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण होना चाहिए। इसी तरह की धारणाओं का विस्तार किया जा सकता है और अन्य ऊतकों या अंगों में रक्त प्रवाह नियंत्रण के अध्ययन में अपनाया जा सकता है, जिसमें गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल सिस्टम, अग्न्याशय, थायराइड, लिम्फ नोड्स, लिवर, किडनी, कंकाल मांसपेशी, मस्तिष्क12,रेटिना, गंगलिया, हड्डी, त्वचा, गर्भाशय, टेस्टिस, अंडाशय, एड्रेनल, वसा आदि तक सीमित नहीं है। इस दृष्टिकोण से शारीरिक परिस्थितियों में सेलुलर और आणविक स्तर पर रक्त प्रवाह नियंत्रण और नियामक तंत्र की समझ में सुधार और अग्रिम होगा ।
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Disclosures
कोई नहीं।
Acknowledgments
इस काम को सेंटर फॉर बायोमेडिकल इंजीनियरिंग एंड टेक्नोलॉजी (बायोमेट) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था; NIH (1U01HL1116321) और (1R01HL142290) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
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