Summary
Presentert her er en protokoll for å studere koronar mikrosirkulasjon i levende murine hjertevev ved ex vivo overvåking av arteriell perfusjon trykk og flyt som opprettholder trykket, samt vaskulære trekomponenter inkludert kapillære senger og pericytter, som septal arterien er hermetisert og trykksatt.
Abstract
Koronar arteriell tone sammen med åpningen eller lukking av kapillærene bestemmer i stor grad blodstrømmen til kardiomyocytter ved konstant perfusjonstrykk. Det er imidlertid vanskelig å overvåke de dynamiske endringene i koronararteriolene og kapillærene i hele hjertet, først og fremst på grunn av bevegelsen og non-stop juling. Her beskriver vi en metode som muliggjør overvåking av arteriell perfusjonshastighet, trykk og diameterendringer av arteriolene og kapillærer i musen høyre ventrikulære papillære muskler. Musen septal arterien er cannulated og perfused ved en konstant strømning eller trykk med den andre dynamisk målt. Etter perfusjon med fluorescerende merket lectin (f.eks Alexa Fluor-488 eller -633 merket Wheat-Germ Agglutinin, WGA), kan arteriolene og kapillærerne (og andre fartøy) i høyre ventrikkelpapilpionasje og septum lett avbildes. Endringene i kardiameteren kan deretter måles i nærvær eller fravær av hjertesammentrekninger. Når genetisk kodede fluorescerende proteiner ble uttrykt, bestemte funksjoner kan overvåkes. For eksempler ble pericytter visualisert i musehjerter som uttrykte NG2-DsRed. Denne metoden har gitt en nyttig plattform for å studere de fysiologiske funksjonene til kapillære pericytter i hjertet. Det er også egnet for å studere effekten av reagenser på blodstrømmen i hjertet ved å måle den vaskulære / kapillære diameteren og arteriell luminaltrykk samtidig. Dette preparatet, kombinert med et toppmoderne optisk bildebehandlingssystem, gjør det mulig å studere blodstrømmen og dens kontroll på cellulært og molekylært nivå i hjertet under nesten fysiologiske forhold.
Introduction
Passende koronar trykkstrømregulering sikrer tilstrekkelig blodtilførsel til hjertet for å møte sine metabolske krav1. Det har imidlertid bare nylig blitt klart hvordan koronar trykkstrøm er dynamisk regulert i hjertet, til tross for omfattende studier som har blitt utført in vivo og in vitro de siste tiårene. En av årsakene er vanskeligheten med å etablere en fysiologisk arbeidsmodell for slike studier på grunn av konstant juling av hjertet. Uansett er det etablert en rekke metoder for observasjon av koronarmikrokarene i levende vev eller dyr, men ingen av disse metodene var i stand til å oppnå konstant / stabilt fokus og målinger av trykk, strømning og mikrovaskulær diameter samtidig2,3. Den direkte visualiseringen av koronar arterielle mikrokar i bankende hjerte ble introdusertfor flere tiår siden 4,3, men diametermålingene i små fartøy var utfordrende og de spesifikke funksjonene til de mange spesialiserte celletypene forbundet med mikrosirkulasjonen var like vexing. Selv den stroboskopiske metoden og det flytende objektive systemet kunne ikke gi ovennevnte informasjon samtidig5. Likevel er det oppnådd en betydelig mengde verdifull informasjon ved hjelp av de nevnte teknologiene, noe som har hjulpet oss med å forstå mer om reguleringen av koronarblodstrøm 6. Metoden vi beskriver i dette papiret vil hjelpe en undersøke og forstå i detalj hvordan komponenter av koronararterier, arteriolene og mikrovaskulaturen reagerer annerledes på stimuleringer og metabolske krav.
Arbeidsmodellen vi etablerte for å forfølge disse studiene ble bygget på det tidligere arbeidet til Westerhof et al.2. Etter kanylering av septalarterien i musehjertet, ble fysiologisk saltløsning brukt til å perfuse den arterien for å holde myocytter og andre komponenter i hjertevevet næret. Det arterielle perfusjonstrykket, strømmen og den vaskulære diameteren ble overvåket blant andre fysiologiske funksjoner ved hjelp av passende fluorescerende indikatorer. Denne metoden gjør det mulig for oss å visualisere den koronarkrovaskulære sengen under fysiologisk trykk i levende vev og studere cellulære mekanismer underliggende mikrosirkulasjonsregulering for første gang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All dyrepleie var i samsvar med retningslinjene til University of Maryland Baltimore og Institutional Animal Care and Use Committee godkjente protokoller.
1. Utarbeidelse av løsningene
MERK: Klargjør løsninger på forhånd. To typer grunnleggende løsninger brukes i forsøkene: (1) fysiologiske saltvannsløsninger (PSS) for badsuperfusat og (2) Tyrodes løsninger for lumenperfusat. Kontinuerlig boblende med CO2 er nødvendig for å opprettholde pH av PSS. HEPES-bufret Tyrodes løsning brukes i lumen i stedet for PSS for å unngå at bobler går inn i karene, siden bobler vil skade endotelcellene7 og okkludere strømmen.
- PSS-løsning: Se formelen og sammensetningen av PSS-løsningen i tabell 1. Lag 10 L Ca2 +gratis og glukosefri PSS lagerløsning og lagre ved romtemperatur. 1 time før en prosedyre, ta ut 1 L av lagerløsningen og boble med 5% CO2 (74% N2 og 21% O2) for å holde pH-løsningen på ~ 7,4. Tilsett 1,8 g glukose og 1,8 ml CaCl2 (1 M lager)8.
MERK: Legg til Ca2+ bare etter boblende når pH er ~ 7,4, ellers vil Ca2 + bli utfelt. - Tyrodes løsning: Se formelen og sammensetningen av Tyrodes løsning i tabell 1. Filtrer oppløsningen (0,22 μm) og oppbevares ved 4 °C for fremtidig bruk9.
- Tyrodes løsning med BDM (2,3-Butanedione monoksim): Tilsett BDM som en reversibel myofilamenthemmer for å forhindre sammentrekning av myocytter10. Vei 600 mg BDM og legg til 200 ml Tyrodes oppløsning. Rør oppløsningen med BDM til den er fullstendig oppløst. Ingen ytterligere filtrering er nødvendig.
- Oppbevar Tyrodes oppløsning som inneholder BDM ved 4 °C til fremtidig bruk.
2. Kammer forberedelse
- Coat både disseksjon kammer og eksperimentell kammer på forhånd med polydimethylsiloxane (PDMS) følge instruksjonene fra produsenten.
- Fyll disseksjonskammeret med Tyrodes oppløsning som inneholder BDM.
- Slå på kjøleren 1 t før prosedyren. Still inn temperaturen ved 4 °C.
3. Klargjøring av kanyle
- Slå på mikropipettetrekkeren. Velg innstillingene i henhold til produsentens instruksjoner.
- Ta et rent borosilikatglassrør (den ytre og indre diameteren på glassrørene som ble brukt var henholdsvis 1,2 mm og 0,69 mm).
- Sett et glassrør inn i de rillede klemmene på en Sutter pipette avtrekker med en U-formet platinavarmefilament.
- Aktiver avtrekkeren for å produsere to kanyler, hver med en lang tynn spiss.
- Klipp spissen av hver kanyle ved hjelp av en fin saks under et dissekerende mikroskop for å gjøre den endelige diameteren på spissen rundt 100 til 150 μm.
- Brann polere spissen av kuttet kanylen for å litt rundt de skarpe kantene.
- Bøy kanylen langs akselen med en platinatråd (oppvarmet med fin kontroll) plassert på siden av akselen ca. 2 mm fra spissen. Vinkelen på svingen i kanylen skal være rundt 45°.
- Sett den åpne enden av kanylen inn i holderen på trykk myografkammeret og stram til armaturen. Koble en 5 ml sprøyte fylt med Tyrodes oppløsning til den andre siden av armaturen. Koble kanylen til en mikromanipulator montert på kammeret (se figur 1 og figur 2).
- Fyll kanylen med Tyrodes oppløsning ved hjelp av sprøyten (5 ml), spyle den, slangen og kontakten av luftbobler.
- Før hermetuleringsprosedyren måler du perfusjonstrykket inne i kanylen over et gitt strømningsområde (50 til 300 μL/min, figur 3). Gjør det bare når en ny kanyle brukes.
MERK: Perfusjonstrykket inne i kanylen er proporsjonal med strømmen og er lineært montert (figur 3).
4. Ekstraksjon av musehjerte
- Sett en C57BL/6 mus (enten kjønn, 8-16 uker gammel) i anestesiboksen som er koblet til tankene av isofluran og oksygen.
- Slå på oksygentanken og start strømmen av isofluran. Vent ~ 5 min til musen er fullstendig bedøvet.
- Etter at anestesi er etablert, ta musen ut av anestesiboksen og injiser heparin IP (inn i bukhulen, 360 enheter, 0,5 ml / mus) for å unngå blodproppdannelse i vaskulaturen. Sett deretter musen tilbake i anestesiboksen.
- 10 min etter at heparinen er injisert, flytt musen til den oppvarmede sengen i liggende stilling og stabiliser potene ved hjelp av merkingstape. Hold musen under full anestesi med isofluran ved hjelp av en nesekjegle.
- Løft musens bukhud over membranen med tang og bruk kirurgisk saks til å kutte og eksponere membranen.
- Klipp membranen og brystbenet. Åpne brystet.
- Dissekere hjertet ut av thoraxhulen, kutte så nært som mulig til dorsal thorax veggen.
- Legg hjertet i iskald Tyrodes oppløsning som inneholder 30 mM BDM.
- Rengjør hjertet for å fjerne bindevev som lunge.
- Overfør hjertet til det forkjølte disseksjonskammeret fylt med Tyrodes oppløsning som inneholder 30 mM BDM.
5. Forberedelse og hermetikk av septalarterie
- Slå på servopumpen. Sett servopumpen i "flow"-modus. La den kjøre i høy hastighet til slangen er fylt med Tyrodes løsning som skal brukes til å perfuse vaskulære lumen. Pass på at det ikke er bobler i slangen. Senk deretter hastigheten.
- Fest hjertet på PDMS, unngå skade på midten av hjertet.
- Fjern både høyre og venstre atria. Klipp opp høyre ventrikkel og fjern høyre ventrikkelfri vegg ved hjelp av et dissekeringsmikroskop.
- Eksponer og identifiser septalarterien. Plasser en nylontråd (30 μm diameter) under septalarterien og bind en løs knute for fremtidig bruk.
MERK: Septalarterien kan enkelt identifiseres ved hjelp av et dissekerende mikroskop. Septalarterien er en stor arterie på septumet som stammer fra riktig koronararterie i de fleste tilfeller. - Fjern venstre ventrikulær fri vegg ved hjelp av fin saks.
- Overfør papillær muskelpreparat til det eksperimentelle kammeret der kanylen ble plassert. Kammeret er fylt med Tyrodes oppløsning som inneholder BDM. Bunnen av dette kammeret er belagt med et tynt (~ 2 mm) lag med PDMS.
- Juster posisjonen til kanylen (ved hjelp av mikromanipulatoren) for å muliggjøre kanylering av septalarterien. Stram knuten.
- Fest papillær muskel ved hjelp av små pinner til kammergulvet slik at mikroskopmålet har en klar utsikt over vaskulaturen. Vær oppmerksom på vinkelen og posisjonen til kanylen og sørg for at spissen av kanylen er parallelt med arteriellveggen.
- Test hermetikk ved gradvis å utvise oppløsningen fra sprøyten gjennom kanylen. Hvis alle elementene fungerer som de skal, vil gjenværende blod i papillær muskelen gå ut av vevet i begynnelsen av denne prosessen, og bare Tyrodes løsning vil bli sett senere.
6. Stabilisering av preparatet
- Slå på den peristaltiske pumpen som vil gi superfusjonsløsningen. Deretter stadig superfuse preparatet i badekaret med pre-gassed PSS med en hastighet på 3-4 ml / min.
- Slå på temperaturregulatoren for superfusjonsløsningen. Juster temperaturen på badet superfusat til ~ 35-37 °C.
- Koble kanylen til servopumpen. Les trykket som vises på trykkservokontrolleren.
- Overvåk strømningen og trykket. Strømmen (μL/min) og arterielt perfusjonstrykk (mm Hg) digitaliseres ved hjelp av digitalisering og registreres ved hjelp av en tilknyttet programvare (figur 2).
- Juster strømmen for å stille inn trykket ~10 mmHg og la den kjøre i ~10 min.
- Øk strømmen av luminalløsningen for å gjøre trykket av arterie ~ 60 mmHg. Oppnå det endelige perfusjonstrykket i selve arterien ved å trekke fra trykkfallet på kanylen (figur 3).
MERK: Hvis "trykk" -modusen på trykkservoregulatoren er valgt, stilletrykket er satt ~ 60 mmHg for disse eksperimentene. Deretter overvåker du endringen av flyten. - La prøven stabilisere seg i ~30-60 min ved å overvåke strømnings- og/eller trykknivåene. En gradvis økning av arterielt trykk observeres normalt i begynnelsen av perfusjonen etter kanyling. En ny steady state vil få etablere seg i ca 30 min (Figur 4).
- Initier et eksperiment etter at perfusjonstrykket er stabilisert (ved konstant strømning).
7. Laster preparatet med fluorescerende merket hvete-bakterie agglutinin (WGA)
- Forbered Tyrodes løsning som inneholder Alexa-Fluor-488 konjugert WGA ved å tilsette 100 μg konjugert WGA i 5 ml Tyrodes løsning.
- Bytt forsiktig perfusat fra normal Tyrodes løsning til en som inneholder fluorescerende merket WGA. Det er viktig å forsiktig bytte perfusat slik at ingen bobler blir introdusert.
- Etter ~ 30 min WGA perfusjon eller når WGA-løsningen er i ferd med å gå tom, endre perfusate tilbake til normal Tyrodes løsning.
8. Konfokal avbildning av arterioler og kapillærer
- Slå på Nipkow-disken konfokal mikroskopsystem.
- Bruk mikroskopet til å lokalisere septalarterien ved hjelp av et lavt effektmål (4x) i overført lysmodus.
MERK: Septalarterie kan plasseres ved å følge posisjonen til kanylen. - Start konfokal bildebehandling med spinning disk confocal og velg 488 nm excitation laser, 40x objektiv forstørrelse og justere laserintensiteten og samplingsfrekvensen (10 - 500 ms per bilde).
- Sett opp topp- og bunnbildeposisjoner for det konfokale mikroskopet for å definere bildeområdet og angi parameterne for z-stack-avbildningen.
- Angi trinnstørrelsen som anbefalt for systemet som brukes, eller angi trinnstørrelsen etter ønske.
- Velg z-stack-innstillingen og/eller tidsserieinnstillingene.
- Velg eller angi en ny mappe for å lagre det nye bildet.
- Klikk "Kjør" for å starte opptak av bildebehandling for fremtidig analyse (figur 5).
9. Eksempel vasodilatoreksperiment: pinacidil-indusert vasodilatasjon (Video 1).
- Klargjør pinacidil lagerløsning (100 mM i DMSO) og oppbevares ved 4 °C.
- Forbered 10 ml Tyrodes løsning. Tilsett 10 μL pinacidil lagerløsning for å gjøre den endelige konsentrasjonen av pinacidil 100 μM.
- Bilde papillær muskel ved lav forstørrelse (4x mål) for å inkludere septal arterien og grenen arterioler.
- Bytt armaturoppløsningen til den pinacidilholdige oppløsningen.
10. Eksempel på blodprøver: vasokonstrictor-indusert arteriell perfusjonstrykkøkning ved konstant strømning (figur 6)
- Klargjør endothelin-1 (ET-1) lageroppløsning (10 μM) og oppbevares ved -20 °C.
- Forbered 10 ml Tyrodes løsning. Tilsett 10 μL ET-1 lageroppløsning (10 μM) for å gjøre den endelige konsentrasjonen av ET-1 10 nM.
- Registrer luminaltrykket med konstant flyt og bilde papillær muskelen.
- Bytt luminalløsningen til ET-1-oppløsningen.
11. Eksempel bilder av kapillær med pericytter (Figur 7)
- Ofre en NG2DsRedBAC transgen mus som beskrevet i avsnitt 4 i denne protokollen.
- Trekk ut hjertet, kanyler septalarterien og last prøven med Alexa-Fluor-488 konjugert WGA etter protokoller 5-7.
- Bilde papillær muskel ved 488 nm og 560 nm eksitasjon, og 510-525 nm, 575-625 nm utslipp ved hjelp av confocal. Arteriole trykket vil være rundt 40 mmHg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når en fluorescens vaskulær markør er perfused i vaskulær lumen (her WGA konjugert med Alexa Fluor-488), er det mulig å visualisere hele vaskulære trær som vist i figur 5 (Venstre panel) ved hjelp av høyhastighets konfokal mikroskop. Videre forstørrelse gjør det mulig å avbilde kapillær i detalj (figur 5, høyre panel). Siden det trykksatt systemet støtter en konstant overvåking av luminaltrykk, kan dette preparatet brukes til tilknyttede endringer i arteriell diameter med arterielt trykk. Video 1 viser at når pinacidil, en ATP-sensitiv K+ kanal (KATP) agonist ble servert fra lumen, ble diameteren på arteriolene økt. Figur 6 viser at når vasokonstriktor ET-1 ble påført fra lumen, ble diameteren på arteriole redusert, og luminaltrykket ble økt når strømmen ble satt konstant.
På grunn av høyoppløsningsfunksjoner i konfokal mikroskopi i kombinasjon med spesifikke cellemarkører, kan denne prosedyren også brukes til å visualisere mange andre celletyper knyttet til mikrosirkulasjonen. Her brukte vi en mus (NG2DsRedBAC transgen mus) som uttrykker DsRed fluorescensprotein under en pericyte spesifikk promotor (NG2) og merket fartøyene med WGA-Alexa Fluor 488. Dette tillater oss å bilde samtidig både kapillær (grønn) og pericytes (rød) i musen papillære muskel (Figur 7) under forhold som bedre etterligne fysiologi i levende dyr.
Figur 1: Kanyling av musen septal arterie.
(A) Overført lys bilde viser et eksempel på cannulated papillære muskelen. Micromanipulator, kanyle og prøve (septum med høyre ventrikkel papillær muskel) er angitt som etiketter. (B) Zoomet inn prøve i A viser papillær muskel og cannulated septal arterie. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Utstyr som ble brukt i hele eksperimentet.
(A) Hovedkomponentene i oppsettet som brukes i eksperimentet. (B) Diagrammet illustrerer forbindelsene mellom papillær muskel forberedelse og fysiologisk kontroll eksperimentell utstyr. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Måling av trykk inne i kanylen.
(A)Et eksempel for å vise hvordan en kanylemotstand ble bestemt ved å måle trykk inne i kanylen over et område med strømning (50-300 μl/min). (B) Forholdet mellom trykket inne i kanylen med strømning fra 6 kanyler. Trykket inne i kanylen var proporsjonal med strømmen og var egnet av uttrykket Pc = 0.08f-12.25, hvor PC som trykk inne i kanylen, f som flyt. N=6 kanyler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Perfusjonstrykkendring under stabilisering ved konstant strømning.
(A) Et typisk opptak av perfusjonstrykk under stabilisering ved konstant strømning (~250 μL/min). Legg merke til økningen av perfusjonstrykk etter 30 min stabilisering. (B) Statistikk viser perfusjonstrykket før og etter stabiliseringen når tonen ble utviklet. Den gjennomsnittlige strømmen av arteriolene for å opprettholde det opprinnelige trykket (~ 60 mmHg) er 201,7 ± 8,6 μL / min (n = 45 mus). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Avbildning av kapillærer og arterioler.
Bildetviser arteriolene og kapillærene som var lastet med hvetekim agglutinin (WGA). (B) Zoom inn i det boksede området i A. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: ET-1 øker lysstyrketrykket og reduserer arteriell diameter.
(A)Arteriell diameter endret ved bruk av ET-1 (10 nM). (B)WGA fluorescensprofiler som viser diameteren endres med ET-1. Diameteren på arteriole ble reflektert av avstanden mellom toppintensiteten av fluorescensen på arteriole veggen. (C) Luminaltrykket økte i nærvær av ET-1 (10 nM) ved en konstant strømning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Kapillær med pericytter fra NG2-DsRed mus.
Hjertepericytter (rød) og kapillærer (grønn) ble avbildet i trykksatt (40 mmHg) og perfused mus høyre ventrikulær papillær muskel. Høyre panel, de zoomede bildene av de innboksede områdene i de venstre panelene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Pinacidil-indusert vasodilatasjon. Pinacidil (100 μM) ble påført fra lumen. Vasodilatasjon ble sett i arteriell treet. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
| Sammensetningen av fysiologisk saltløsning (PSS) | |||
| Reagenser | Endelig konsentrasjon (mM) | Molekylvekt | g / 10 liter |
| Nacl | 112 | 58.44 | 65.45 |
| KCl (andre | 5 | 74.55 | 3.73 |
| MgSO4 (andre personer) | 1.2 | 120.37 | 1.44 |
| NaH2PO4 Gjestgiveri | 1.2 | 119.98 | 1.44 |
| NaHCO3 Gjestgiveri | 24 | 84.01 | 20.16 |
| Glukose | 10 | 180.16 | tilsett 1,8 g glukose til 1 liter PSS før bruk |
| CaCl2 | 1.8 | 110.99 | tilsett 1,8 ml 1 M CaCl2 til 1 liter PSS før bruk |
| Sammensetningen av Tyrodes løsning | |||
| Reagenser | Endelig konsentrasjon (mM) | Molekylvekt | g/L |
| Nacl | 140 | 58.44 | 8.18 |
| KCl (andre | 5 | 74.55 | 0.37 |
| NaH2PO4 Gjestgiveri | 0.33 | 119.98 | 0.04 |
| HEPES | 10 | 238.3 | 2.38 |
| Glukose | 5.5 | 180.16 | 0.99 |
| CaCl2 | 1.8 | 110.99 | tilsett 1,8 ml 1 M CaCl2-løsning |
| MgCl2.6H2O Leilighet | 0.5 | 203.3 | tilsett 0,5 ml 1 M MgCl2 oppløsning |
| Merk: Juster pH til 7,4 med 1 M NaOH. | |||
Tabell 1: Sammensetningen av løsningene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det nåværende arbeidet har vi introdusert en bemerkelsesverdig enkel, men svært praktisk ex vivo-metode for å studere koronar mikrosirkulasjon i hjertet under fysiologiske forhold. Denne metoden ble endret fra mekaniske undersøkelser ved hjelp av rotter2. Det utfordrende tillegget var bildeteknologien med høy hastighet og høy optisk oppløsning. Vi var derfor i stand til å dra nytte av de avanserte optiske bildesystemene som nå er kommersielt tilgjengelige. Ved forsiktig disseksjon og plassering av det fungerende papillære muskelpreparatet i gunstig posisjon, var vi i stand til å visualisere arterioler, prekapillærarterioler, kapillærer og venler, samt pericytes og var i stand til å måle arterielt trykk og / eller flyt mens du kontrollerer den andre. Arteriole og kapillær diameter endringer ble overvåket ved hjelp av en høyhastighets spinning disk confocal mikroskop. Kombinasjonen av de optiske bildene og den interne perfusjonen av den fysiologiske saltløsningen gjør dette preparatet nyttig i evalueringen av effekten av biomedisinske behandlinger, samt i studiet av mekanismene som er involvert i fysiologisk og patologisk regulering av blodstrømmen i hjertet1.
Hjertepapilary muskler har vært mye brukt i studien av hjertefysiologi i mange år. Fraværet av perfusjon forringer imidlertid fysiologien hvis egenskapene til "arbeid" eller "metabolisme" eller "elektrisk aktivitet" vurderes. Klart, ikke-perfused papillære muskler er åpenbart ikke fysiologisk. Likevel, tiår siden, westerhof et al. gjorde trykksatt tynn papillær forberedelse fra rotte for å studere blodstrømmenregulering 2, men dette preparatet ble ikke brukt i mus som vi gjorde her, på grunn av håndtering vanskeligheter. Disse forskerne var heller ikke i stand til å bilde detaljene som trengs for å avgjøre hvordan blodstrømreguleringen skjedde. Vi var heldige at musen septal arterien er rundt 100 μm i diameter på ~ 60 mmHg perfusjonstrykk, mindre enn hos rotte, men stor nok for vårt arbeid. Som et praktisk notat må spesiell oppmerksomhet gis til utarbeidelsen av kanylen og den tilkoblede slangen. Unngå bobler i slangen og kanylen. Bobler er lett fanget i det tilkoblede området og vil blokkere eller forvrenge blodstrømmen. Derfor dobbeltsjekk disse områdene. I tillegg ville det være nyttig å bruke en kanyle med en relativt stor spiss så lenge den er liten nok til å komme inn i arterien, fordi en større kanyle holder arterien åpen og muliggjør jevn flyt. Hvis en plutselig og uventet økning i trykk (ved konstant strømning) observeres under opptak, er det svært sannsynlig at spissen av kanylen har blitt sittende fast til arteriellveggen eller kanylen har blitt blokkert av vevsrester. Derfor er posisjonen til kanylen svært viktig for å holde strømmen og trykket stabilt. Jo raskere hermetuleringen er, desto bedre for vevet. Dette fører til en raskere gjenoppretting av sin fysiologiske funksjon. Vi anbefaler at tiden brukt på kanyling ikke overstiger ~ 45 min (fra utvinning av hjertet til ferdigstillelse av kanyling).
Uansett hvor forsiktig man måtte være, tar denne tilsynelatende enkle metoden praksis for å perfeksjonere. Noen ganger reagerer preparatet ikke på noen stimulering, uavhengig av forsiktighet tatt under disseksjon eller hurtigheten og effektiviteten av hele prosedyren. Badetemperaturen skal være konstant og mellom 35 og 37 °C. En annen viktig ting er å kjøre en rutinemessig referansekontroll for vevsfunksjon (for eksempel svaret på KCl) for hvert eksperiment, enten før eller etter at eksperimentet er ferdig. Vi bruker ET-1 eller KCl (70 mM) som referanser. Til slutt er det svært viktig å sjekke og bestemme at kanylen fortsatt er på plass når eksperimentet er ferdig. Se bort fra dataene hvis kanylen er ute av sted eller arterien er ødelagt eller vridd av spissen av kanylen. To viktige ting verdt å notere sentrum på "bevegelse av preparatet" og "dataanalyse". Selv i "quiescence", preparatet beveger seg fortsatt (Video 1). Mindre bevegelse er ikke et problem for høyhastighets spinning disk confocal imaging. Senking av perfusjonstrykk eller bruk av Na+ kanalblokkere kan forhindre eller minimere bevegelsen uten å forstyrre mikrovaskulær karfunksjon. Vi gjorde offline analyse av de oppkjøpte dataene ved hjelp av ImageJ-win64 (Fiji) og / eller MATLAB med tilpasset programvare for fartøy diameter målinger. Vi detaljerer ikke diameteranalysen her fordi programvare (f.eks. Vasotracker11 ) skal kunne analysere diameterendringene.
Ved å kombinere fysiologiske undersøkelser med optiske bildeteknikker og høyhastighets konfokal mikroskopi, kan dette preparatet brukes mye til 1) teste den regulatoriske effekten av nye legemidler på blodstrømmen i hjertet; 2) Studie intercellulær kommunikasjon (mellom og blant kardiomyocytter, kapillære endotelceller, pericytes og arterielle glatte muskelceller, og fibroblaster); og 3) Studere dynamisk funksjonell endring av ulike celletyper ved hjelp av fluorescens-merket transgene mus1. Denne metoden inkluderer visualisering av deler av hjertevevet med nettverk under "nær" fysiologi. Selv om vi kanskje kan etterligne in vivo forhold ved pacing preparatet og / eller inkludert noen røde blodlegemer i perfusate, det kan ikke erstatte sann in vivo imaging med et bredt spekter av metabolske og arbeidsbyrder. Det kan ikke brukes på de store dyrene heller på grunn av begrenset dybde av syne på et konfokal mikroskop. Det bør imidlertid være et nyttig verktøy i studiet av molekylære og cellulære mekanismer underliggende koronar mikrosirkulasjon regulering i små dyr, inkludert mus og rotte. Lignende forestillinger kan utvides og vedtas i studiet av blodstrømkontroll i andre vev eller organer, inkludert men ikke begrenset til gastrointestinalt system, bukspyttkjertel, skjoldbruskkjertel, lymfeknuter, lever, nyre, skjelettmuskulatur, hjerne12, retina, ganglia, bein, hud, livmor, testis, eggstokkene, binyrene, fett etc. Denne tilnærmingen vil forbedre og fremme forståelsen av blodstrømkontroll og regulatoriske mekanismer på cellulære og molekylære nivåer under fysiologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av Center for Biomedical Engineering and Technology (BioMET); NIH (1U01HL116321) og (1R01HL142290) og American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
